CN112964704A - 一种防风草内酯检测试纸、比色卡及快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种防风草内酯检测试纸、比色卡及快速检测方法，属于中草药有效成分检测领域，其中，防风草内酯检测试纸是将氢氧化钾水溶液、3,5‑二硝基苯甲酸乙醇溶液混合均匀，得到的混合液中浸泡定性滤纸条，浸泡5mi n后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于4℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸；防风草内酯标准比色卡是利用上述的防风草内酯检测试纸制得。防风草内酯快速检测方法是利用上述标准比色卡进行比色检测，判断大概浓度范围。本发明的检测试纸无需其它设备检测，比色条检测结果直观易辨、制作成本低。
Description
技术领域
本发明属于中草药有效成分检测领域，特别涉及一种防风草内酯检测试纸、比色卡及快速检测方法。
背景技术
防风草，又称鱼针草，为唇形科广防风属植物防风草的全草。防风草是我国西南、东南、长江以南及西藏东南部常见的直立草本药用植物，在甘肃天水、陇南、陕西汉中及四川西南部等有野生及种植。防风草常生于村边、路旁、荒坡地畔、田埂或林区山谷中，在夏秋间采割收取全草，洗净、晒干或鲜用，全草味辛、苦，功效为祛风解表、清热解毒、泻肺除湿、补中益神。
目前，研究人员通过多种光谱学技术共鉴定出了防风草中的33个化合物，包括有生物碱、多酚、三萜、二萜、降倍半萜、倍半萜、单萜、甾体、核苷酸等。现代研究表明，防风草根、叶或花的粗提取物、挥发油以及纯的黄酮和萜类均具有明显的抗菌、抗癌、抗炎、抗HIV、镇痛、抗病毒、抗血小板聚集等活性，以及防治神经退行性疾病的功效；防风草内酯是防风草的重要活性成分。
防风草在《本草纲目》中亦称豨莶草、火杴草。民间亦常被作豨莶草混用，徐必达在植物性状与粉末显微方面对防风草与豨莶草做了鉴别，发现两者的粉末显微特征有显著差异；防风草亦常被作广藿香混用，华强在功效、植物形态等方面对两者进行了鉴别，指出了两者的不同之处；亦有文献报导，防风草与广藿香的显微结构、薄层色谱都不相同，可作为两者鉴定依据。刘文启等对防风草的基源与鉴别进行了系统研究，为防风草的质量标准制定提供了科学依据。
长期以来，我国不少中药材加工饮片质量参差不齐，市场掺假也屡见不鲜，影响着中药临床疗效的发挥。如防风草和豨莶草、广藿香混用，外观极度相似，难以判定，为了有效地杜绝市场掺假情况，也为了让人民群众吃上健康放心的中药饮片，有必要提供一种快速高效鉴定防风草的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测快捷、投入成本低的防风草内酯检测试纸、比色卡及快速检测方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案之一是一种防风草内酯检测试纸，由以下方法制备得到：将碱溶液、3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液混合均匀，得到的混合液中浸泡定性滤纸条，浸泡3-10min后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于1-6℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸。
进一步的，本发明的一些实施方案中，所述碱溶液为包括但不限于氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液中的一种。
进一步的，本发明的一些实施方案中，所述碱溶液的质量浓度为5-15％；所述3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液的质量浓度为3-7％。
进一步的，本发明的一些实施方案中，所述混合液是碱溶液与3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液按2:1-3的体积比混合而成的。
本发明还提供了一种防风草内酯检测比色卡，是利用上述的防风草内酯检测试纸制得，具体制备步骤是配制不同浓度梯度的防风草内酯标准溶液，分别滴加于所述防风草内酯检测试纸上，根据反应颜色的深浅及色阶的变化制作标准比色卡。
本发明还提供了一种防风草内酯快速检测方法，是利用上述标准比色卡进行检测，包括如下步骤：
(1)摘取适量防风草叶片，使用液氮浸泡冷却1-3min后，快速研磨防风草叶片至粉末状，将防风草粉末装入离心管中，备用；
(2)将防风草粉末浸泡在乙醇溶液中2-8h，过滤取上清液，在上清液中加入活性炭粉末，静置5-20min，待溶液中没有绿色即可；若溶液中仍有绿色可补加活性炭粉末，取一次性针式过滤器过滤上述溶液，得到待测液；
(3)取待测液，加入碱溶液和3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液，混匀，在4-10min之内观察颜色变化，和标准色卡比对，判断大概浓度范围。
本发明还提供了上述防风草内酯检测试纸在快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香方面的应用。
本发明还提供了上述防风草内酯检测比色卡在快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香方面的应用。
本发明还提供了一种快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香的方法，采用上述防风草内酯快速检测方法对防风草、豨莶草和/或广藿香分别进行处理，观察颜色变化，和标准色卡比对进行鉴别。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益技术效果是：本发明的检测试纸无需其它设备检测，比色条检测结果直观易辨、制作成本低；能够快速鉴别防风草与豨莶草、广藿香，防止防风草中混杂豨莶草或广藿香，有效地杜绝市场掺假情况发生。
附图说明
图1为本发明一实施例中不同浓度防风草内酯标准比色卡及对应浓度样品颜色显示图；
图2为本发明一实施例中防风草内酯比色检测结果图；
图3为本发明一实施例中防风草全草第一组的液相色谱图；
图4为本发明一实施例中防风草全草第二组的液相色谱图；
图5为本发明一实施例中防风草全草第三组的液相色谱图；
图6为本发明一实施例中豨莶草全草第一组的液相色谱图；
图7为本发明一实施例中豨莶草全草第二组的液相色谱图；
图8为本发明一实施例中豨莶草全草第三组的液相色谱图；
图9为本发明一实施例中豨莶草全草第一组的液相色谱图；
图10为本发明一实施例中豨莶草全草第二组的液相色谱图；
图11为本发明一实施例中防风草全草第三组的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
配制试剂
取1g氢氧化钾溶解在10mL去离子水中制成质量浓度10％的氢氧化钾水溶液；取0.5g的3,5-二硝基苯甲酸溶解在10mL乙醇中制成的质量浓度5％的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液。
制作检测试纸
将氢氧化钾水溶液、3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液按2:3的体积比混合，定容至100ml，得到的混合液中浸泡尺寸为1cm×5cm的定性滤纸条，浸泡5min后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于4℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸。
制作标准比色卡
配制0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml三个浓度梯度的防风草内酯标准溶液，以空白乙醇为对照，分别滴加于所述防风草内酯检测试纸上，根据反应颜色的深浅及色阶的变化制作标准比色卡，如图1所示，防风草内酯色阶为紫红色系列，随着防风草内酯浓度增大，比色卡的颜色由淡紫红色、紫红色、深紫红色加深，且相互间颜色目视时差异明显。
快速检测防风草内酯含量
以未开花的防风草叶子为例，称取1g粉末状样品，浸泡在15mL乙醇中过夜，将浸泡过夜后的溶液过滤浓缩至2mL，加入一药勺活性炭，脱色10min后取一次性针式过滤器过滤得到待测液；取1mL待测液，加入400μL的氢氧化钾水溶液和600μL的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液，混匀，在5分钟之内观察颜色变化，发现溶液颜色变化如图2所示，以空白乙醇为对照，与对照组相比待测样品呈现出较深的紫红色，说明该样品中防风草内酯含量较高。
实施例2
配制试剂
取1.5g氢氧化钠溶解在10mL去离子水中制成质量浓度15％的氢氧化钾水溶液；取0.7g的3,5-二硝基苯甲酸溶解在10mL乙醇中制成的质量浓度7％的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液。
制作检测试纸
将氢氧化钾水溶液、3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液按1:1的体积比混合，定容至100ml，得到的混合液中浸泡尺寸为1cm×5cm的定性滤纸条，浸泡5min后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于6℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸。
制作标准比色卡
配制0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml三个浓度梯度的防风草内酯标准溶液，以空白乙醇为对照，分别滴加于所述防风草内酯检测试纸上，根据反应颜色的深浅及色阶的变化制作标准比色卡，防风草内酯色阶为紫红色系列，随着防风草内酯浓度增大，比色卡的颜色由淡紫红色、紫红色、深紫红色加深，且相互间颜色目视时差异明显。
快速检测防风草内酯含量
以未开花的防风草叶子为例，称取2g粉末状样品，浸泡在20mL乙醇中过夜，将浸泡过夜后的溶液过滤浓缩至2mL，加入一药勺活性炭，脱色20min后取一次性针式过滤器过滤得到待测液；取2mL待测液，加入500μL的氢氧化钾水溶液和500μL的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液，混匀，在4分钟之内观察颜色变化，以空白乙醇为对照，与对照组相比若待测样品呈现出较深的紫红色，说明该样品中防风草内酯含量较高。
实施例3
配制试剂
取0.5g氢氧化钾溶解在10mL去离子水中制成质量浓度5％的氢氧化钙水溶液；取0.3g的3,5-二硝基苯甲酸溶解在10mL乙醇中制成的质量浓度3％的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液。
制作检测试纸
将氢氧化钾水溶液、3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液按2:1的体积比混合，定容至100ml，得到的混合液中浸泡尺寸为1cm×5cm的定性滤纸条，浸泡10min后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于2℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸。
制作标准比色卡
配制0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml三个浓度梯度的防风草内酯标准溶液，以空白乙醇为对照，分别滴加于所述防风草内酯检测试纸上，根据反应颜色的深浅及色阶的变化制作标准比色卡，防风草内酯色阶为紫红色系列，随着防风草内酯浓度增大，比色卡的颜色由淡紫红色、紫红色、深紫红色加深，且相互间颜色目视时差异明显。
快速检测防风草内酯含量
以未开花的防风草叶子为例，称取1.5g粉末状样品，浸泡在20mL乙醇中过夜，将浸泡过夜后的溶液过滤浓缩至1.5mL，加入一药勺活性炭，脱色5min后取一次性针式过滤器过滤得到待测液；取1mL待测液，加入400μL的氢氧化钾水溶液和200μL的3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液，混匀，在5min之内观察颜色变化，以空白乙醇为对照，与对照组相比若待测样品呈现出较深的紫红色，说明该样品中防风草内酯含量较高。
实施例4
分别称取开花根、未开花根、开花茎、未开花茎、开花叶、大浦县样品1g，浸泡在15mL乙醇中过夜，将浸泡过夜后的溶液过滤浓缩至2mL，加入一药勺活性炭，脱色10min后取一次性针式过滤器过滤得到待测液；取1mL待测液，滴加在检测试纸上，在5分钟之内观察颜色变化，发现开花根和未开花根的颜色几乎无变化，说明两者几乎不含防风草内酯，开花茎颜色变化也不大，但溶液稍微有向红色变化的趋势；未开花茎呈现较浅的紫红色；大浦县样品呈现紫红色；开花叶样品呈现更深的紫红色；并且结合实施案例1发现，未开花叶样品的紫红色最深，说明样品中防风草内酯的含量有以下的变化趋势：开花茎＜未开花茎＜大浦县＜开花叶＜未开花叶。
实验例防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量检测
1.实验目的
通过测定防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量，确定防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量的高低。
2.实验方法
2.1色谱条件与系统适用性实验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，0.1％的甲酸溶液为流动相B，按下表规定进行梯度洗脱，检测波长为210nm。
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0-10 | 10.0 | 90.0 |
| 10 | 20.0 | 80.0 |
| 20 | 60.0 | 40.0 |
| 30 | 80.0 | 20.0 |
| 40 | 10.0 | 90.0 |
2.2对照品溶液的制备取防风草内酯对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含有1.0mg的溶液。
2.3供试品溶液的制备
分别称取防风草、豨莶草、广藿香全草5g，置250ml锥形瓶中，加甲醇40ml，密塞，浸泡24h，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品按原草计算，含防风草内酯按千分含量计算。
3.实验记录
3.1对照品溶液的制备
a.取对照品10.0mg，用甲醇定容至10ml，制成1mg/ml的对照品溶液；
b.取a溶液4ml,用甲醇至5ml，制成0.8mg/ml的对照品溶液；
c.取a溶液1ml,用甲醇至5ml，制成0.5mg/ml的对照品溶液；
d.取a溶液1.5ml,用甲醇至5ml，制成0.3mg/ml的对照品溶液；
e.取a溶液0.1ml,用甲醇至5ml，制成0.1mg/ml的对照品溶液；
分别取a.b.c.d.e对照品溶液，做标准曲线。
3.2供试品溶液的制备
3.2.1防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量测定实验
第一组：分别取防风草、豨莶草、广藿香全草5g，置250ml锥形瓶中，加甲醇40ml，密塞，浸泡24h，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
第二组：分别取防风草、豨莶草、广藿香全草5g，置250ml锥形瓶中，加甲醇40ml，密塞，浸泡24h，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
第三组：分别取防风草、豨莶草、广藿香全草5g，置250ml锥形瓶中，加甲醇40ml，密塞，浸泡24h，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.实验结果与结论
4.1检测结果记录
防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量测定结果见表1及图3-11。
表1防风草、豨莶草、广藿香中防风草内酯含量测定
4.2检测结果表明，豨莶草和广藿香中的防风草内酯含量均远远小于防风草中的防风草内酯含量，通过测定防风草内酯含量可以鉴别防风草与豨莶草、广藿香；同时，实施例1和实施例2已表明防风草内酯含量不同，采用本发明的检测试纸、标准比色卡及快速检测防风草内酯含量的方法可以应用于鉴别防风草与豨莶草、广藿香。
以上所述为本发明的较佳实施例，本领域技术人员在本发明的精神和原则之内还可以做出合理的修改、等同替换和改进。
Claims (10)
1.一种防风草内酯检测试纸，其特征在于，由以下方法制备得到：
将碱溶液、3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液混合均匀，得到的混合液中浸泡定性滤纸条，浸泡3-10min后取出滤纸条，在阴凉干燥处自然晾干，置于棕色瓶中于1-6℃下避光保存，即得防风草内酯检测试纸。
2.根据权利要求1所述防风草内酯检测试纸，其特征在于：所述碱溶液为包括但不限于氢氧化钾溶液、氢氧化钠溶液中的一种。
3.根据权利要求2所述防风草内酯检测试纸，其特征在于：所述碱溶液的质量浓度为5-15％；所述3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液的质量浓度为3-7％。
4.根据权利要求1所述防风草内酯检测试纸，其特征在于：所述混合液是碱溶液与3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液按2:1-3的体积比混合而成的。
5.一种防风草内酯检测比色卡，其特征在于，利用权利要求1所述的防风草内酯检测试纸制得，具体制备步骤是配制不同浓度梯度的防风草内酯标准溶液，分别滴加于所述防风草内酯检测试纸上，根据反应颜色的深浅及色阶的变化制作标准比色卡。
6.根据权利要求6所述的防风草内酯检测比色卡，其特征在于：所述防风草内酯标准溶液选用0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml三个浓度梯度，色阶为紫红色系列，随着防风草内酯浓度增大，比色卡的颜色由淡紫红色、紫红色、深紫红色加深，且相互间颜色目视时差异明显。
7.一种防风草内酯快速检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)摘取适量防风草叶片，使用液氮浸泡冷却1-3min后，快速研磨防风草叶片至粉末状，将防风草粉末装入离心管中，备用；
(2)将防风草粉末浸泡在乙醇溶液中2-8h，过滤取上清液，在上清液中加入活性炭粉末，静置5-20min，待溶液中没有绿色即可；若溶液中仍有绿色可补加活性炭粉末，取一次性针式过滤器过滤上述溶液，得到待测液；
(3)取待测液，加入碱溶液和3,5-二硝基苯甲酸乙醇溶液，混匀，在4-10min之内观察颜色变化，和标准色卡比对，判断大概浓度范围。
8.权利要求1所述的防风草内酯检测试纸在快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香方面的应用。
9.权利要求5所述的防风草内酯检测比色卡在快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香方面的应用。
10.一种快速鉴别防风草与豨莶草或广藿香的方法，其特征在于：采用权利要求7的防风草内酯快速检测方法对防风草、豨莶草和/或广藿香分别进行处理，观察颜色变化，和标准色卡比对进行鉴别。
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