CN102786505B - 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法 - Google Patents
斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，该方法包括以下步骤：⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草用酒精进行热回流提取，合并得到提取液；⑵提取液进行减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物；⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液；乙酸乙酯萃取液进行减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分；⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用氯仿-甲醇溶液洗脱，得到洗脱液，该洗脱液蒸干，即得黄酮粗提物；⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中进行分离，即可分别得到木犀草素、芹菜素、柯伊利素三种黄酮类化合物高纯度单体。本发明简便、快速、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及木犀草素、芹菜素、柯伊利素三种黄酮类单体化合物的制备方法，尤其涉及斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法。
背景技术
木犀草素、芹菜素、柯伊利素均属于黄酮类化合物，被发现具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗炎和许多其它药理活性。最近报道芹菜素在许多类型的癌症细胞表现出强烈的细胞毒活性，对神经母细胞瘤肝癌、乳腺癌、食管癌、大肠癌、肺癌和前列腺癌细胞都有明显抑制作用，它的作用机理主要是通过损伤癌细胞的有丝分裂或促进细胞凋亡而达到抑制肿瘤细胞的作用。
斑唇马先蒿（Pedicularis longiflora Rudolph. var. tubiformis（Klotz.）Tsoong）的花呈棕黄色或棕褐色，气微，味微苦、辣。性味微苦、涩，寒，具有清热解毒、强筋利水、固精等功效，可全草入药，用于风热症、肉食中毒、高烧神昏谵语、水肿、遗精等症，具有较高的药用价值，是藏药中的一种传统药材。近年来, 该属植物的药用价值逐渐引起研究者的重视，其中黄酮、环烯醚萜苷、苯丙素苷类化合物是该属的特征性化合物，具有较高的药用价值。
高速逆流色谱(High-speed Countercurrent Chromatography，简称HSCCC)是不使用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，具有应用范围广，适应性好；操作简便，容易掌握；回收率高；重现性好；分离效率高，分离量较大的优点，它克服了固相载体对样品的吸附损失、变性等缺点，样品回收率高，已被广泛应用于天然药物成分的分析鉴定及分离制备。与其它柱色谱相比较，它克服了固定相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形拖尾等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速、成本低廉的斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法。
为解决上述问题，本发明所述的斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为30%~95%的酒精在30~80℃下进行热回流提取，提取1~4次、每次1~4h，合并得到提取液；
⑵将所述提取液在温度为40~80℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物；
⑶将所述斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取2~10次，合并乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液在温度为40~70℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分；
⑷将所述斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用2~50倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为40~80℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物；
⑸所述黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为500~1000r/min、温度为20~50℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
所述步骤⑶中斑唇马先蒿提取物与所述去离子水的质量体积比为1：1~10。
所述步骤⑷氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1~20：1。
所述步骤⑸氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比为1~4：1~4：1~4。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明采用高速逆流色谱（HSCCC）分离技术，与传统柱色谱分离技术相比，不但有效地缩短了分离时间，而且减少了工艺过程中的有机溶剂消耗和能耗。
2、本发明一次分离可以同时得到三种二苯乙烯苷类单体化合物、性质稳定，纯度高（可达到98%以上），可应用于医药、标准物质、保健食品和保健药物等。
3、本发明采用HSCCC分离技术，该方法重现性高、简单、快速、可以有效地减少传统固液分离中的样品损耗问题，成本低廉、简便易行。
具体实施方式
实施例1 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为30%的酒精在50℃下进行热回流提取，提取1次，1h后得到提取液。
⑵将提取液在温度为40℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：1。
乙酸乙酯萃取液在温度为40℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用2倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为40℃、压力为0.05MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为20：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为500r/min、温度为20℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为1：1：1。
实施例2 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为95%的酒精在80℃下进行热回流提取，提取4次、每次4h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为80℃、压力为0.08MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：10。
乙酸乙酯萃取液在温度为70℃、压力为0.08MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用50倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为80℃、压力为0.08MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为1：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为1000r/min、温度为50℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为4：1：4。
实施例3 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为95%的酒精在80℃下进行热回流提取，提取2次、每次3h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为70℃、压力为0.07MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：2。
乙酸乙酯萃取液在温度为50℃、压力为0.07MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用16倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为50℃、压力为0.07MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为5：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为850r/min、温度为40℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为1：4：1。
实施例4 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为70%的酒精在65℃下进行热回流提取，提取3次、每次2h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为65℃、压力为0.06MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：3。
乙酸乙酯萃取液在温度为60℃、压力为0.06MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用12倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为60℃、压力为0.06MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为10：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为850r/min、温度为35℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为4：1：1。
实施例5 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为60%的酒精在70℃下进行热回流提取，提取3次、每次3h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为60℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：5。
乙酸乙酯萃取液在温度为60℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用4倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为60℃、压力为0.05MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为3：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为750r/min、温度为30℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为3.5：2：2.5。
实施例6 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为65%的酒精在65℃下进行热回流提取，提取2次、每次3h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为60℃、压力为0.08MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取7次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：6。
乙酸乙酯萃取液在温度为55℃、压力为0.07MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用20倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为75℃、压力为0.07MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为4：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为950r/min、温度为35℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为2：1：2。
实施例7 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为50%的酒精在70℃下进行热回流提取，提取1次、每次4h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为55℃、压力为0.07MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：8。
乙酸乙酯萃取液在温度为55℃、压力为0.06MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用10倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为55℃、压力为0.06MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为5：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为750r/min、温度为30℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为4：2：2.5。
实施例8 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为60%的酒精在70℃下进行热回流提取，提取4次、每次1h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为65℃、压力为0.08MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：9。
乙酸乙酯萃取液在温度为65℃、压力为0.08MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用2倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为65℃、压力为0.08MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为8：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为700r/min、温度为25℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为3：2：2.5。
实施例9 斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为60%的酒精在30℃下进行热回流提取，提取3次、每次2h，合并得到提取液。
⑵将提取液在温度为45℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物。
⑶将斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取5次，合并乙酸乙酯萃取液；其中斑唇马先蒿提取物与去离子水的质量体积比（kg/ml）为1：4。
乙酸乙酯萃取液在温度为45℃、压力为0.05MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分。
⑷将斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用50倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为45℃、压力为0.06MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物。
其中：氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比（ml/ml）为10：1。
⑸黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为1000r/min、温度为45℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素（Luteolin）、芹菜素（apigenin）、柯伊利素（chrysoeriol）三种黄酮类化合物高纯度单体。
其中：氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比（ml/ml）为1：4：1。
Claims (1)
1.斑唇马先蒿中分离三种黄酮类单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
⑴将粉碎的斑唇马先蒿全草采用质量浓度为30%~95%的酒精在30~80℃下进行热回流提取，提取1~4次、每次1~4h，合并得到提取液；
⑵将所述提取液在温度为40~80℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下减压蒸干，得到斑唇马先蒿提取物；
⑶将所述斑唇马先蒿提取物先用去离子水溶解，再依次用石油醚、乙酸乙酯萃取2~10次，合并乙酸乙酯萃取液；所述乙酸乙酯萃取液在温度为40~70℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下减压蒸干，即得斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分；所述斑唇马先蒿提取物与所述去离子水的质量体积比为1：1~10；
⑷将所述斑唇马先蒿乙酸乙酯萃取部分上硅胶柱，用2~50倍柱床体积的氯仿-甲醇溶液洗脱，得到含有木犀草素、芹菜素和柯伊利素的洗脱液，该洗脱液在温度为40~80℃、压力为0.05~0.08MPa的条件下蒸干，即得黄酮粗提物；所述氯仿-甲醇溶液中氯仿与甲醇的体积比为1~20：1；
⑸所述黄酮粗提物采用高速逆流色谱设备，在氯仿-甲醇-水体系中以转速为500~1000r/min、温度为20~50℃的条件对其进行分离，即可分别得到木犀草素、芹菜素、柯伊利素三种黄酮类化合物单体；所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇、水的体积比为1~4：1~4：1~4。
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