CN101066989A - 四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法，具体步骤为：a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；d、将得到的发酵液粗提物配成浓度为5－60g/l进样液；e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离纯化谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH2的去离子水作为洗脱液，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽。本发明通过模拟移动床系统实现谷胱甘肽分离纯化的目的，产品纯度好、收率高、产量大。
Description
技术领域
本发明属于生物制品加工领域，涉及一种四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法。
背景技术
谷胱甘肽在生物体内有着多种重要的生理功能，特别是对于维持生物体内适宜的氧化还原环境起着至关重要的作用。自从谷胱甘肽被发现以来，它不仅作为试剂广泛用于生物化学、医学、生物学和化学的研究测定中，而且已成为一种重要的生化药物。谷胱甘肽可以迅速增强机体的免疫力，人体内谷胱甘肽增加后对消化系统、呼吸系统和新陈代谢等都有很大帮助。近年来在我国科技人员的努力下，我国发酵法生产谷胱甘肽的上游技术也取得长足进步，基本达到了工业化水平。然而谷胱甘肽发酵过程中的副产物众多且化学性质相近，分离困难。目前国内外谷胱甘肽的分离提取几乎都使用离子交换树脂技术。
20世纪90年代模拟移动床色谱技术的兴起被认为是化工技术中的一次革新，其应用范围也不断扩大，遍及石油、精细化工、生物发酵、医药、食品等很多生产领域，尤其在同系化合物、手性异构体药物、糖类、有机酸和氨基酸等混合物的分离中显示出其独特性能。研究表明，建造具有同等生产能力的模拟移动色谱装置的投资为固定床色谱投资的一倍，模拟移动床色谱仅为固定床树脂、洗脱液等的消耗和设备拆旧的成本的70％左右，而且模拟移动床色谱投资仅占全年运行费用的20％左右。模拟移动床色谱在精制纯化方面与传统分批式色谱柱相比有着巨大优势。
发明内容
本发明的目的在于：提供一种四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法，实现连续化工业生产，克服目前传统的谷胱甘肽制取法制取的成品中谷胱甘肽含量低、杂质多、成本昂贵、产生污染较大的缺陷。
本发明方法采用模拟移动床色谱法分离纯化发酵液中谷胱甘肽的具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为5-60g/L，优选15-50g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离纯化谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽纯品，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统是由多根相同的阳离子交换树脂柱串联，即通过离子交换过程中的强弱吸附组分的吸附、精制、解吸、树脂再生之间不同功能区之间的按顺序切换，根据谷胱甘肽和杂质在分离介质上平衡系数不同的原理进行分离纯品，通过组合阀门的切换来改变进料口、提余液出口、流动相入口、提取液出口的位置得到目标产物；其中，通过切换时间的设置及各功能区洗脱液的流速的配合使目标物得到分离纯品。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，洗脱泵流量200-800ml/min，压力1-10Mpa；进样泵流量10-50ml/min，压力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，压力1-10Mpa；阀切换时间为18-24min；提余液流速为100-500ml/min；整个模拟移动床系统的温度为24-32℃，进样液、洗脱液温度24-32℃，二者温度保持一致。
本发明方法中的模拟移动床系统由4-16根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由1-4根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
本发明是建立在连续分离的思想上，利用溶液中目标产物与共存杂质之间在物理、化学以及生物学性质的差异，使其在分离操作中具有不同的传质速率和平衡状态，通过模拟移动床实现谷胱甘肽分离的目的，产品纯度好、收率高、产量大。
具体实施方式
实例1：选用谷胱甘肽发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷胱甘肽的分离纯化，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为5g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离纯化谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽纯品，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，洗脱液流速为200ml/min，进样液流速为10ml/min，萃取液流速为100ml/min，提余液流速为100ml/min；阀切换时间为18min；整个模拟移动床的温度为24℃，进料液、洗脱液温度为24℃；各泵的压力为1MPa。
本发明方法中的模拟移动床系统由4根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由1根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
成品HPLC法检测：PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Hedera ODS-2(4.6mm×250mm，5μm)，磷酸二氢钾庚磺酸钠溶液，取磷酸二氢钾6.8g和庚烷磺酸钠2.2g加入至100ml溶解后滴加磷酸调节pH值至3.0用0.45μm的微孔滤膜过滤得流动相溶液，磷酸二氢钾庚烷磺酸钠溶液-甲醇(V/V)＝970∶30，流速1ml/mim，进样量20μl，检测温度25℃，使用外标法测定成品谷胱甘肽含量96.8％。
实例2：选用谷胱甘肽发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷胱甘肽的分离纯化，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为15g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离纯化谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽纯品，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，洗脱液流速为200ml/min，进样液流速为10ml/min，萃取液流速为100ml/min，提余液流速为100ml/min；阀切换时间为18min；整个模拟移动床的温度为24℃，进料液、洗脱液温度为24℃；各泵的压力为1MPa。
本发明方法中的模拟移动床系统由8根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由2根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
成品HPLC法检测：PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Hedera ODS-2(4.6mm×250mm，5μm)，磷酸二氢钾庚磺酸钠溶液，取磷酸二氢钾6.8g和庚烷磺酸钠2.2g加入至100ml溶解后滴加磷酸调节pH值至3.0用0.45μm的微孔滤膜过滤得流动相溶液，磷酸二氢钾庚烷磺酸钠溶液-甲醇(V/V)＝970∶30，流速1ml/mim，进样量20μl，检测温度25℃，使用外标法测定成品谷胱甘肽含量96.9％。
实例3：选用谷胱甘肽发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷胱甘肽的分离纯化，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为30g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，进样液流速为30ml/min，洗脱液流速为500ml/min，萃取液流速为300ml/min，提余液流速为300ml/min；阀切换时间为22min；整个模拟移动床的温度为28℃，进料液、洗脱液温度28℃。
本发明方法中的模拟移动床系统由12根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由3根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
成品HPLC法检测：PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Hedera ODS-2(4.6mm×250mm，5μm)，磷酸二氢钾庚磺酸钠溶液，取磷酸二氢钾6.8g和庚烷磺酸钠2.2g加入至100ml溶解后滴加磷酸调节pH值至3.0用0.45μm的微孔滤膜过滤得流动相溶液，磷酸二氢钾庚烷磺酸钠溶液-甲醇(V/V)＝970∶30，流速1ml/mim，进样量20μl，检测温度25℃，使用外标法测定成品谷胱甘肽含量97.1％。
实例4：选用谷胱甘肽发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷胱甘肽的分离纯化，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为50g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，进样液流速为30ml/min，洗脱液流速为500ml/min，萃取液流速为300ml/min，提余液流速为300ml/min；阀切换时间为22min；整个模拟移动床的温度为28℃，进料液、洗脱液温度28℃。
本发明方法中的模拟移动床系统由12根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由3根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
成品HPLC法检测：PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Hedera ODS-2(4.6mm×250mm，5μm)，磷酸二氢钾庚磺酸钠溶液，取磷酸二氢钾6.8g和庚烷磺酸钠2.2g加入至100ml溶解后滴加磷酸调节pH值至3.0用0.45μm的微孔滤膜过滤得流动相溶液，磷酸二氢钾庚烷磺酸钠溶液-甲醇(V/V)＝970∶30，流速1ml/mim，进样量20μl，检测温度25℃，使用外标法测定成品谷胱甘肽含量97.2％。
实例5：选用谷胱甘肽发酵液，在江苏汉邦科技有限公司的模拟移动床上实现谷胱甘肽的纯化，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液、谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为60g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，由pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽，从提取液出口处得到杂质。
本发明方法中的模拟移动床系统由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，进样液流速为50ml/min，洗脱液流速为800ml/min，萃取液流速为500ml/min，提余液流速为500ml/min；阀切换时间为24min；整个模拟移动床的温度为32℃，进料液、洗脱液温度32℃。
本发明方法中的整个模拟移动床系统由16根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由4根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
成品HPLC法检测：PerkinElmer Series 200高效液相色谱系统，二极管阵列检测器，Hedera ODS-2(4.6mm×250mm，5μm)，磷酸二氢钾庚磺酸钠溶液，取磷酸二氢钾6.8g和庚烷磺酸钠2.2g加入至100ml溶解后滴加磷酸调节pH值至3.0用0.45μm的微孔滤膜过滤得流动相溶液，磷酸二氢钾庚烷磺酸钠溶液-甲醇(V/V)＝970∶30，流速1ml/mim，进样量20μl，检测温度25℃，使用外标法测定成品谷胱甘肽含量97.5％。
Claims (4)
1.一种四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法，具体步骤为：
a、采用普通过滤和超滤处理谷胱甘肽酵母发酵液，去除菌体、蛋白质和多糖，降低料液的粘度；
b、将超滤过的发酵液通过活性炭脱色；
c、将脱色后的谷胱甘肽发酵液通过减压浓缩、结晶除盐得发酵液粗提物；
d、将得到的发酵液粗提物配成一定浓度的进样液，谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为5-60g/L；
e、采用装填有阳离子交换树脂的模拟移动床系统分离谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液，采用pH 2的去离子水作为洗脱液，控制模拟移动床各功能区的流动相流速和柱切换时间，将谷胱甘肽和杂质分离，从提余液出口处收集得到谷胱甘肽纯品，从提取液出口处得到杂质。
2.根据权利要求1所述的四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法，其特征在于：谷胱甘肽发酵液粗提物的进样液浓度为15-50g/l。
3.根据权利要求1所述的四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法中的模拟移动床，其特征是该模拟移动床由洗脱泵、进样泵、萃取泵、色谱柱、电磁阀、信号采集器、系统控制器和计算机连接组成，洗脱泵流量200-800ml/min，压力1-10Mpa；进样泵流量10-50ml/min，压力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，压力1-10Mpa；进样液流速为10-50ml/min，洗脱液流速为200-800ml/min，萃取液流速为100-500ml/min，提余液流速为100-500ml/min；阀切换时间为18-24min；模拟移动床的温度为24-32℃，进料液、洗脱液温度为24-32℃。
4.根据权利要求1所述的四区模拟移动床分离纯化发酵液中谷胱甘肽的方法中的模拟移动床其特征是模拟移动床由4-16根固定床离子交换柱组成，按照四个口的位置分4区，每区由1-4根离子交换柱，其中，一区位于洗脱液入口处与提取液出口处之间，在此区内实现发酵液中的杂质的解吸；二区位于提取液出口处与进料口之间，在此区内使发酵液中的杂质反复吸附、解吸而浓缩；三区位于进料口与提余液出口之间，在此区内使谷胱甘肽吸附在固定相上，从相应出口得到谷胱甘肽纯品；四区位于提余液出口与洗脱液入口之间，一方面，液相中的谷胱甘肽被固定相吸附，其洗脱液与新鲜的洗脱液一起进入一区，可循环利用；另一方面将三区与一区隔开，防止提余液中的谷胱甘肽进入一区而污染。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20071107 |