CN101798587B

CN101798587B - 玉米降血压肽的分离纯化方法

Info

Publication number: CN101798587B
Application number: CN2010101287301A
Authority: CN
Inventors: 曹龙奎; 杨健; 刁静静
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: CN101798587A

Abstract

本发明涉及的是玉米降血压肽的分离纯化方法，属于从玉米蛋白粉中分离玉米肽的方法，这种玉米降血压肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，采用板框过滤器过滤去掉杂质，再经膜过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有降血压活性的水解产物，对具有降血压活性的水解产物采用模拟移动床色谱分离系统进行分离纯化，得到玉米降血压肽，分离纯化采用等度洗脱的方式进行，其中进料流速为5ml/min～100ml/min；流动相流速为6.5ml/min～130ml/min，流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为4.5ml/min～90ml/min；循环泵流速为10ml/min～200ml/min，切换时间6min～120min。本发明在达到工业化水平的基础上，可以分离出纯度相对较高的玉米降血压肽。

Description

玉米降血压肽的分离纯化方法

一、技术领域：

本发明涉及的是从玉米蛋白粉中分离玉米肽的方法，具体涉及的是玉米降血压肽的分离纯化方法。

二、背景技术：

玉米蛋白粉是玉米淀粉生产中的主要副产品，含有大约60％的蛋白质，主要为玉米醇溶蛋白(68％)、谷蛋白(22％)和球蛋白(1.2％)。由于玉米蛋白粉组成复杂，水溶性差，赖氨酸和色氨酸含量很低，限制了它在食品工业中的应用，并且由于其价格低廉，当今在国内主要将玉米蛋白粉用于饲料工业，这样浪费了宝贵的蛋白资源。通过酶法有限水解不仅可以提高玉米蛋白的水溶性，便于利用我国有限的蛋白质资源，而且通过进一步分离纯化水解产物得到具有抗氧化、降血压、抗疲劳、醒酒等功能特性。

玉米活性肽来自于玉米蛋白的水解产物，是由分子量很小(一般集中在1000以下)，但活性很高的短肽组成的混合低聚肽。小分子肽比等量氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，而且易于吸收，为此，玉米活性肽的开发具有广泛的应用前景。血管紧张素转换酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，简称ACE)在肾-血管紧张素系统中对调节血压具有重要的生理功能。由于体内ACE活性太高而引起的高血压，可以通过抑制ACE活性，阻止血管紧张素的生成和激肽降解的减少达到治疗高血压的作用。因此ACE抑制剂可作为降血压的药物，玉米蛋白含有高比例的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，很少含有赖氨酸等碱性氨基酸，这种独特的氨基酸组成使玉米醇溶蛋白的水溶性差、营养价值不高，但是这种不平衡的氨基酸组成使玉米蛋白成为降血压肽的来源。其中α-玉米醇溶蛋白和γ-玉米醇溶蛋白的水解产物就具有较为显著的降血压作用。所以将玉米蛋白粉进行水解，可将水溶性差的醇溶蛋白水解成具有较好溶解性、高降血压活性的玉米肽，并将其用于医药、食品领域，发挥其药食同源的作用。

我国是高血压病高发的国家，根据卫生部发布的调查报告显示，我国18岁及以上居民高血压患病率为18.8％，而目前他们所服用的传统合成的降血压药物约有200多种，需终生服用，且具有副作用，因此从天然产物中提取降血压功效成分为新药研制和功能食品开发是研究的热点，我国对降血压肽的研究刚刚起步，但已经引起人们的重视，“十五”期间生物医药研究的重点方向之一就是多肽药物。本产品具有降血压活性，而且属于药食同源性的产品，食用安全性高，而且降血压肽对血压正常者无降压作用。

但是由于从各种蛋白质酶解产物中提取的降血压肽的氨基酸组成和结构差别很大，没有一个固定的氨基酸组成，而且酶解产物成分也非常复杂，因此分离纯化高活性的玉米肽相当困难。目前对于肽类物质分离提纯常用的方法包括：离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等。而在工业化中则应用具有分子筛功能的膜分离技术，但分离膜抗污染能力差，膜通量衰减严重，而且分离过程中对操作参数的控制随意性太大，利用膜分离手段分离后的肽多是一种分子量范围较广的产物，活性和纯度相对比较低，影响产品的质量等。

为此，本发明在前人研究的基础上，进一步探寻高效、先进的提取分离纯化技术，使玉米蛋白水解物更精确在一定的范围内得到分离，提高玉米蛋白肽的降血压活性。

三、发明内容：

本发明的一个目的是提供一种玉米降血压肽的分离纯化方法，用于解决传统分离玉米肽的方法分离高活性玉米降血压肽时纯度低和活性低的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种玉米降血压肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，得到降血压肽粗品；对降血压肽粗品采用板框过滤器进行过滤去掉杂质，再经膜进行过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有降血压活性的水解产物，该水解产物的分子量773；对具有降血压活性的水解产物采用模拟移动床色谱分离系统进行分离纯化，得到玉米降血压肽，分离纯化是采用等度洗脱的方式进行，其中进料流速为5ml/min～100ml/min；流动相流速为6.5ml/min～130ml/min，流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为4.5ml/min～90ml/min；循环泵流速为10ml/min～200ml/min，切换时间6min～120min。

上述方案中的碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解度为8.4％。

上述方案中的板框过滤器选用300目的滤布。

上述方案中的膜的孔径为0.45微米。

更进一步的是模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为100ml/min；流动相流速为130ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为90ml/min；循环泵流速为200ml/min，切换时间120min；“2-3-4-3根”的分区方式为工作区1段位于进料点与残余液出料口之间的工作区，采用2根色谱柱，；工作区2段位于进料口与产品出口之间的分离区，采用3根色谱柱，；工作区3段位于产品出口与流动相进口之间的解吸区，采用4根色谱柱，；工作区4段位于解吸剂进口和副产品出口之间的阻塞区，采用3根色谱柱；分离用的树脂是：XAD-761。

上述方案中模拟移动床色谱分离系统进行四区循环分离时，其中的进料泵的设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.41～0.43Mpa；流动相泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.40～0.43Mpa；循环泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.48Mpa。

有益效果：

1、本发明采用模拟移动床分离玉米降血压肽，将高活性的玉米降血压肽从酶解混合物中分离出来，并进行纯化。此方法最大的优势是在达到工业化水平的基础上，通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，筛选得到具有降血压活性的水解产物，采用模拟移动床色谱分离系统对目标水解产物进行连续分离纯化，可以分离出纯度相对较高的玉米降血压肽，玉米降血压肽的纯度达到70％以上。

2、本发明进行连续分离纯化方式是用于将高活性的降血压肽洗脱下来，由于降血压肽是小分子肽类，其极性较氨基酸等物质高，用40％乙醇在一定时间内可以将其洗脱下来，而在开始洗脱时氨基酸等小分子物质由于极性较低被先洗脱下来，降血压肽由于有一定的极性仍被吸附，并在工作区2产生一定的富集，所以通过调整流速及循环量可以提高其纯度及得率。

3、本发明分离用的树脂是：XAD-761。此树脂根据分子间作用力的大小进行分离，即根据极性进行分离，从试验中得出降血压肽的分子量比较大，而且分子量的大小与分子间的极性大小呈相对正比的关系，所以极性较大，分离时后出来，而一些小分子量的肽段和氨基酸物质则先出来，另外此树脂对色素也有一定的吸附能力，而且不吸附离子，所以在分离过程中可以达到直接脱色脱盐的目的。

四、具体实施方式：

实施例1：

1、去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉的制作，将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过筛，收集过筛后的淡黄色粉末，再95％乙醇作为浸提剂去掉玉米黄色素，得到酶解底物。

2、在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶为底物的1％(体积比)，pH9.0，水解温度50℃，水解度为8.4％，得到降血压肽粗品。

3、降血压肽粗品采用300目的板框过滤器进行过滤去掉杂质，再经0.45微米的膜进行过滤。

4、利用高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有降血压活性的肽片段，该片段的分子量为773。色谱条件：色谱柱：安捷伦C18；流动相：A液为0.05％三氟乙酸，B液为0.05％三氟乙酸+90％乙腈，在55min内从2％到60％梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；紫外检测；检测波长：214nm。A液中0.05％三氟乙酸，B液中0.05％三氟乙酸+90％乙腈，其中涉及的浓度为质量浓度比，下同。

5、对玉米降血压肽采用模拟移动床色谱分离技术进行分离纯化，其模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为5ml/min；流动相流速为6.5ml/min；流动相浓度为40％乙醇(质量浓度比)；产品出口流速为4.5ml/min；循环泵流速为10ml/min，切换时间6min。循环泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.48Mpa。“2-3-4-3根”的分区方式为工作区1段位于进料点与残余液出料口之间的工作区，采用2根色谱柱，；工作区2段位于进料口与产品出口之间的分离区，采用3根色谱柱，；工作区3段位于产品出口与流动相进口之间的解吸区，采用4根色谱柱，；工作区4段位于解吸剂进口和副产品出口之间的阻塞区，采用3根色谱柱；模拟移动床色谱分离系统进行四区循环分离时，设置了进料泵和流动相泵，其中进料泵的设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.41Mpa；流动相泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.40Mpa；分离用的树脂是：XAD-761。在此条件下，高活性的玉米降血压肽的纯度在76％。

实施例2：

2、在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解度为8.4％，得到降血压肽粗品。

4、利用高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有降血压活性的肽片段，该片段的分子量为773。色谱条件：色谱柱：安捷伦C18；流动相：A液为0.05％三氟乙酸，B液为0.05％三氟乙酸+90％乙腈，在55min内从2％到60％梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；紫外检测；检测波长：214nm。

5、对玉米降血压肽采用模拟移动床色谱分离技术进行分离纯化，其模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为5ml/min；流动相流速为6.5ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为4.5ml/min；循环泵流速为11ml/min，切换时间6min。“2-3-4-3根”的分区方式为工作区1段位于进料点与残余液出料口之间的工作区，采用2根色谱柱，；工作区2段位于进料口与产品出口之间的分离区，采用3根色谱柱，；工作区3段位于产品出口与流动相进口之间的解吸区，采用4根色谱柱，；工作区4段位于解吸剂进口和副产品出口之间的阻塞区，采用3根色谱柱；分离用的树脂是：XAD-761。本实施例中，进料泵实际压力为0.42Mpa；流动相泵实际压力为0.41Mpa；在此条件下，高活性的玉米降血压肽的纯度为82％左右。

实施例3：

5、对玉米降血压肽采用模拟移动床色谱分离技术进行分离纯化，其模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为5ml/min；流动相流速为6.5ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为4.5ml/min；循环泵流速为11ml/min，切换时间6.4min。分离用的树脂是：XAD-761。本实施例中，进料泵实际压力为0.42Mpa；流动相泵实际压力为0.42Mpa；在此条件下，高活性的玉米降血压肽的纯度为86％左右。

实施例4：

5、对玉米降血压肽采用模拟移动床色谱分离技术进行分离纯化，其模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为50ml/min；流动相流速为65ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为45ml/min；循环泵流速为110ml/min，切换时间6.5min。分离用的树脂是：XAD-761。本实施例中，进料泵实际压力为0.42Mpa；流动相泵实际压力为0.42Mpa；在此条件下，高活性的玉米降血压肽的纯度为89％左右。

实施例5：

5、对玉米降血压肽采用模拟移动床色谱分离技术进行分离纯化，其模拟移动床分配系数采用“2-3-4-3根”的分区方式进行等度度洗脱，其中进料流速为100ml/min；流动相流速为130ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为90ml/min；循环泵流速为200ml/min，切换时间120min。分离用的树脂是：XAD-761。本实施例中，进料泵实际压力为0.43Mpa；流动相泵实际压力为0.43Mpa；在此条件下，高活性的玉米降血压肽的纯度为92％左右。

Claims

1.一种玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：这种玉米降血压肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，得到降血压肽粗品；对降血压肽粗品经板框过滤器进行过滤，再经微孔滤膜过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有降血压活性的水解产物，该水解产物的分子量773；对具有降血压活性的水解产物采用模拟移动床色谱分离系统进行连续分离纯化，得到玉米降血压肽，分离纯化是采用“2-3-4-3根”的分配方式进行等度洗脱，柱内装入分离用的树脂：XAD-761，其中进料流速为5ml/min～100ml/min；流动相流速为6.5ml/min～130ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为4.5ml/min～90ml/min；循环泵流速为10ml/min～200ml/min，切换时间6min～120min；“2-3-4-3根”的分区方式为工作区1段位于进料点与残余液出料口之间的工作区，采用2根色谱柱；工作区2段位于进料口与产品出口之间的分离区，采用3根色谱柱；工作区3段位于产品出口与流动相进口之间的解吸区，采用4根色谱柱；工作区4段位于解吸剂进口和副产品出口之间的阻塞区，采用3根色谱柱。

2.根据权利要求1所述的玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解度为8.4％。

3.根据权利要求2所述的玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的微孔滤膜的孔径为0.45微米。

4.根据权利要求3所述的玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的板框过滤器选用300目的滤布。

5.根据权利要求4所述的玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：在在所述的模拟移动床色谱分离系统进行四区循环分离时，进料泵的设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.41～0.43Mpa；流动相泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.40～0.43Mpa；循环泵设定压力为1.0Mpa，实际压力为0.48Mpa。

6.根据权利要求5所述的玉米降血压肽的分离纯化方法，其特征在于：在在所述的模拟移动床色谱分离系统进行四区循环分离时，其中进料流速为100ml/min；流动相流速为130ml/min；流动相浓度为40％乙醇；产品出口流速为90ml/min；循环泵流速为200ml/min，切换时间120min。