CN101781671A

CN101781671A - 玉米抗氧化肽的分离纯化方法

Info

Publication number: CN101781671A
Application number: CN201010124668A
Authority: CN
Inventors: 曹龙奎; 刁静静
Original assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Current assignee: Heilongjiang Bayi Agricultural University
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2010-07-21

Abstract

本发明涉及的是玉米抗氧化肽的分离纯化方法，属于从玉米蛋白粉中分离玉米肽的方法，这种玉米抗氧化肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，采用明矾进行絮凝，过滤去掉杂质，再经膜进行过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，得到玉米抗氧化肽，分离纯化采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环进行，其中进料流速为20～40000ml/min；水洗脱流速为10～35000ml/min；醇洗脱浓度为60％乙醇～95％乙醇，流速为20～36000ml/min；水冲洗流速为20～50000ml/min，切换时间3～80min。本发明在达到工业化水平的基础上，可以分离出纯度相对较高的玉米抗氧化肽。

Description

玉米抗氧化肽的分离纯化方法

一、技术领域：

本发明涉及的是从玉米蛋白粉中分离玉米肽的方法，具体涉及的是玉米抗氧化肽的分离纯化方法。

二、背景技术：

玉米蛋白粉是玉米淀粉生产中的主要副产品，含有大约60％的蛋白质，主要为玉米醇溶蛋白(68％)、谷蛋白(22％)和球蛋白(1.2％)。由于玉米蛋白粉组成复杂，水溶性差，赖氨酸和色氨酸含量很低，限制了它在食品工业中的应用，并且由于其价格低廉，当今在国内主要将玉米蛋白粉用于饲料工业，这样浪费了宝贵的蛋白资源。通过酶法水解不仅可以提高玉米蛋白的水溶性，便于利用我国有限的蛋白质资源，而且通过进一步分离纯化水解产物得到具有抗氧化、降血压、抗疲劳、醒酒等功能特性。

玉米活性肽来自于玉米蛋白的水解产物，是由分子量很小(一般集中在1000以下)，但活性很高的短肽组成的混合低聚肽。小分子肽比等量氨基酸具有更高的生物活性和营养价值，肽类和氨基酸几乎均可以通过小肠绒毛上皮细胞完全被吸收利用，进入到血液中，然后输送到生物体的各个部位，为此，玉米活性肽的开发具有广泛的应用前景，而且随着科技的发展，人们意识的提高及保健意识的增强，玉米活性肽的药食同源性将更加显示出其广阔的应用前景。但是由于从各种蛋白质酶解产物中提取的抗氧化肽的氨基酸组成和结构差别很大，没有一个固定的氨基酸组成，而且酶解产物成分也非常复杂，因此分离纯化高活性的玉米肽相当困难。目前对于肽类物质分离提纯常用的方法包括：离子交换层析、凝胶过滤层析、凝胶电泳、高效液相色谱、毛细管电泳等。而在工业化中则应用具有分子筛功能的膜分离技术，但分离膜抗污染能力差，膜通量衰减严重，而且分离过程中对操作参数的控制随意性太大，利用膜分离手段分离后的肽多是一种分子量范围较广的产物，活性和纯度相对比较低，影响产品的质量等。

为此，本发明在前人研究的基础上，进一步探寻高效、先进的提取分离纯化技术，使玉米蛋白水解物更精确在一定的范围内得到分离，提高玉米蛋白肽的抗氧化活性。

三、发明内容：

本发明的一个目的是提供一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，用于解决传统分离玉米肽的方法分离高活性玉米抗氧化肽时纯度低和活性低的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：这种玉米抗氧化肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，得到抗氧化肽粗品；对抗氧化肽粗品采用明矾进行絮凝，过滤去掉杂质，再经膜进行过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有抗氧化活性的水解产物，该水解产物的分子量467；对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，得到玉米抗氧化肽，分离纯化采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环进行，其中进料流速为20ml/min～40000ml/min；水洗脱流速为10ml/min～35000ml/min；醇洗脱浓度为60％乙醇～95％乙醇，流速为20ml/min～36000ml/min；水冲洗流速为20ml/min～50000ml/min，切换时间3min～80min。

上述方案中的碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解时间1h。

上述方案中的明矾选用1％的明矾。

上述方案中的膜的孔径为0.45微米。

更进一步的是在进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环时，采用“6-6-4-4根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇，进料流速为240ml/min，水洗脱流速为150ml/min，乙醇洗脱流速为150ml/min，水冲洗流速为240ml/min。切换时间为75min。“6-6-4-4根”的分区方式为进料区采用6根色谱柱，水洗脱区采用6根色谱柱，醇洗脱区采用4根色谱柱，水洗区采用4根色谱柱；分离用的树脂是：XAD-7HP。

有益效果：

1、本发明采用模拟移动床分离玉米抗氧化肽，将高活性的玉米抗氧化肽从酶解混合物中分离出来，并进行纯化。此方法最大的优势是在达到工业化水平的基础上，通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，筛选得到具有抗氧化活性的水解产物，采用多功能模拟移动床分离系统对目标水解产物进行连续分离纯化，可以分离出纯度相对较高的玉米抗氧化肽，其纯度达到60％以上。

2、本发明进行连续分离纯化过程中的水洗脱是用于将抗氧化肽洗脱下来，由于抗氧化肽是小分子肽类，其极性较低，用水可以直接洗脱下来，而色素及大分子肽类不能被洗脱下来，所以水洗脱是为了得到目的产物，对其流速等进行调整，可以提高其纯度；醇洗脱可以洗脱掉杂质、色素和一些被吸附住的大分子物质；水洗是为了将柱中的醇冲洗干净，防止影响下一周期中原料的吸附。

3、本发明分离用的树脂是：XAD-7HP。此树脂根据分子间作用力的大小进行分离，即根据极性进行分离，从试验中得出抗氧化肽的分子量比较小，而且分子量的大小与分子间的极性大小呈相对正比的关系，所以极性较小，分离时先出来，而一些末水解的大蛋白和一些分子链较长的肽类物质则后出来，另外此树脂对色素也有一定的吸附能力，而且不吸附离子，所以在分离过程中可以达到直接脱色脱盐的目的。

四、具体实施方式：

实施例1：

1、去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉的制作，将原料玉米蛋白粉经粉碎机粉碎后过筛，收集过筛后的淡黄色粉末，再95％乙醇作为浸提剂去掉玉米黄色素，得到酶解底物。

2、在玉米蛋白粉中加入碱性蛋白酶进行水解，碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解时间1h，得到抗氧化肽粗品。

3、抗氧化肽粗品采用1％的明矾进行絮凝，过滤去掉杂质，再经0.45微米的膜进行过滤。

4、利用高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有抗氧化活性的水解产物，该水解产物的分子量467。色谱条件：色谱柱：安捷伦C18；流动相：乙腈-水-三氟乙酸(浓度比为20％∶80％∶0.02％)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；紫外检测；检测波长：243nm。

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，利用“10-4-4-2根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇。进料流速为30ml/min，水洗脱流速为10ml/min，乙醇洗脱流速为20ml/min，水冲洗流速为20ml/min。切换时间为3min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为60％左右。“10-4-4-2根”的分区方式为进料采用10根色谱柱，柱内装入分离用的树脂：XAD-7HP，水洗脱采用4根色谱柱，醇洗脱采用4根色谱柱，水洗采用2根色谱柱。

实施例2：

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，利用“10-4-4-2根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇。进料流速为60ml/min，水洗脱流速为20ml/min，乙醇洗脱流速为50ml/min，水冲洗流速为40ml/min。切换时间为6min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为62％左右。

实施例3：

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，即“10-4-3-3根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇。进料流速为90ml/min，水洗脱流速为105ml/min，乙醇洗脱流速为107ml/min，水冲洗流速为160ml/min。柱内装入分离用的树脂：XAD-7HP。切换时间为16min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为70％左右。

实施例4：

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，即“10-4-3-3根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为95％乙醇。进料流速为140ml/min，水洗脱流速为210ml/min，乙醇洗脱流速为213ml/min，水冲洗流速为320ml/min。切换时间为33min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为75％左右。

实施例5：

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，即“10-4-3-3根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为90％乙醇。进料流速为275ml/min，水洗脱流速为300ml/min，乙醇洗脱流速为310ml/min，水冲洗流速为480ml/min。切换时间为49min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为70％左右。

实施例6：

3、抗氧化肽粗品采用5％的明矾进行絮凝，过滤去掉杂质，再经0.45微米的膜进行过滤。

5、对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，模拟移动床分离纯化玉米抗氧化肽采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环，即采用“6-6-4-4根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇。进料流速为240ml/min，水洗脱流速为150ml/min，乙醇洗脱流速为150ml/min，水冲洗流速为240ml/min。切换时间为75min，在此条件下，高活性的玉米抗氧化肽的纯度为82％左右。“6-6-4-4根”的分区方式进料采用6根色谱柱，水洗脱采用6根色谱柱，醇洗脱采用4根色谱柱，水洗采用4根色谱柱。柱内装入分离用的树脂：XAD-7HP。

Claims

1.一种玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：这种玉米抗氧化肽的分离纯化方法是将去掉玉米黄色素的玉米蛋白粉用碱性蛋白酶进行水解，得到抗氧化肽粗品；对抗氧化肽粗品采用明矾进行絮凝，过滤去掉杂质，再经膜进行过滤，然后通过高效液相色谱分析确定目标产物分子量，选取出具有抗氧化活性的水解产物，该水解产物的分子量467；对具有抗氧化活性的水解产物采用多功能模拟移动床分离系统进行连续分离纯化，得到玉米抗氧化肽，分离纯化采用进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环进行，其中进料流速为20ml/min～40000ml/min；水洗脱流速为10ml/min～35000ml/min；醇洗脱浓度为60％乙醇～95％乙醇，流速为20ml/min～36000ml/min；水冲洗流速为20ml/min～50000ml/min，切换时间3min～80min。

2.根据权利要求1所述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的碱性蛋白酶为底物的1％，pH9.0，水解温度50℃，水解时间1h。

3.根据权利要求2所述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的明矾选用5％的明矾。

4.根据权利要求3所述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：所述的膜的孔径为0.45微米。

5.根据权利要求4所述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：在所述的多功能模拟移动床分离系统进行进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环时，采用“6-6-4-4根”的分区方式进行梯度洗脱，其中醇浓度为80％乙醇，进料流速为240ml/min，水洗脱流速为150ml/min，乙醇洗脱流速为150ml/min，水冲洗流速为240ml/min，切换时间为75min；“6-6-4-4根”的分区方式为进料区采用6根色谱柱，水洗脱区采用6根色谱柱，醇洗脱区采用4根色谱柱，水洗区采用4根色谱柱；柱内装入分离用的树脂：XAD-7HP。

6.根据权利要求4所述的玉米抗氧化肽的分离纯化方法，其特征在于：在在所述的多功能模拟移动床分离系统进行进料—水洗脱—醇洗脱—水洗四步循环时，采用“10-4-3-3根”或“10-4-4-2根”或“6-6-4-4根”的分区方式进行梯度洗脱，柱内装入分离用的树脂：XAD-7HP。