CN1884523A - 一种利用模拟移动床分离制备5'－核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用模拟移动床分离制备5’－核苷酸的方法。该方法采用模拟移动床系统和纳滤的组合技术分离四种混合5’－核苷酸，即将酶解的含四种混合5’－核苷酸的清液泵入装有阳离子交换树脂的模拟移动床系统中进行吸附，采用去离子水洗脱，控制各功能区核苷酸的迁移速度，使相应功能区出口分别流出四种单核苷酸溶液；切换模拟移动床各功能区的进口和出口位置，使各功能区按液体流动方向及原排列顺序切换，重复上述步骤，使相应功能区出口分别流出四种单核苷酸溶液，如此循环往复；将得到的四种单核苷酸溶液分别采用纳滤膜将离子交换洗脱液同步浓缩和脱盐，结晶干燥即可。本发明可连续分离，产品纯度高，投资少，成本低，可规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用模拟移动床分离制备5’-核苷酸的方法，属于生物制品加工领域。
背景技术
核苷酸及其衍生物是重要的生物化工原料，可以作为食品添加剂，保健食品和医药中间体，一般可以通过发酵法获得酵母，然后在从中提取核苷酸，用核酸酶P1酶解后再进行分离，目前已有一些分离方法的报道，如：
中国科学院微生物研究所(核苷酸类物质的生产和应用，1971)的研究结果表明通过阳-阴离子交换树脂结合的方式可以进行核苷酸的分离，但5’-腺苷酸、胞苷酸和尿苷酸的分离效果不理想。同时，该文献同时报道了另一种分离方法，该方法直接采用阴离子交换树脂进行分离，但存在操作步骤多，工艺复杂，分离周期长，耗水量多的缺点，没有什么工业应用价值。邱蔚然(CN 1286259A)等在原有分离的技术基础上，利用两根强酸阳离子交换柱、一根弱碱性大孔阴离子交换树脂和一根强碱性阴离子交换柱进行串联，用不同pH值和离子强度的水溶液进行分批洗脱，分别进行收集得到四种5’-核苷酸；产品的收率和纯度有所提高，但是树脂用量大，且能耗和用水量较大。工业应用空间较小。在他另一篇专利(CN 1408719A)里面提到了另一种分离纯化5’-核苷酸的方法，根据不同pH值条件下四种单核苷酸的电荷特性的不同进行分离，通过两根阴离子树脂柱和四根炭柱的有序排列组合，并通过多步骤，多种洗脱剂顺序洗脱才得到四种核苷酸，总收率为90％，纯度没有提及。
由于单柱吸附分离操作，出料浓度低，耗水量大，只能间歇操作，不适宜工业化生产应用；利用模拟移动床分离装置，可克服单柱装置的上述缺点，在工业生产上得到应用，所得到的出料浓度比单柱出料浓度升高，连续进、出料操作，易于实现自动化控制，所得到组份的纯度和质量也有所提高。
发明内容
本发明的目的在于克服目前5’-核苷酸分离过程中的操作繁琐、多步分离、间歇式、不易规模化的缺陷，提供一种将模拟移动床离子交换色谱与纳滤膜分离相结合的分离制备5’-核苷酸的方法。
本发明是建立在连续分离和一步分离的思想之上的，其特点在于利用溶液中目标产物与共存杂质之间在物理、化学以及生物学性质的差异，使其在分离操作中具有不同的传质速率和(或)平衡状态，以及模拟移动床技术这一新型的分离理念从而实现5’-核苷酸分离的目的。
本发明的目的可以通过下列技术措施来达到：
一种分离制备5’-核苷酸的方法，该方法采用模拟移动床系统和纳滤的组合技术分离四种混合5’-核苷酸，具体步骤为：
a.将酶解的含四种混合5’-核苷酸的清液泵入装有阳离子交换树脂的模拟移动床系统中进行吸附，采用pH 2～14的去离子水溶液进行洗脱，控制各功能区核苷酸的迁移速度，使相应功能区出口分别流出UMP、GMP、CMP、AMP溶液；(吸附区有一个料液出口，该出口在吸附区吸附的同时可收集UMP，而此时脱附区不同部位有三个料液出口，可在三个出口同时分别收集UMP，CMP和AMP)
b.切换模拟移动床各功能区的进口和出口位置，使各功能区按液体流动方向及原排列顺序切换，重复上述上样吸附、洗脱、控制迁移速度的步骤，使相应功能区出口分别流出UMP、GMP、CMP、AMP溶液，如此循环往复；
c.将得到UMP、GMP、CMP、AMP溶液分别采用截留分子量为150～300道尔顿的纳滤膜将离子交换洗脱液同步浓缩和脱盐，结晶干燥，得到四种不同的5’-核苷酸。
所述的方法，其中模拟移动床系统是指由多根相同的离子交换柱串联的模拟移动床系统，即通过离子交换过程中的强弱吸附组份的吸附、精制、脱附和树脂再生不同功能区之间的按顺序切换，根据强弱吸附组份在分离介质上迁移速度不同的原理进行分离，通过组合阀门的切换来改变进料口、出料口及循环进出口位置得到目标产物；其中，切换时间的标准是通过调整各功能区洗脱液流速和离子交换柱的根数，来控制核苷酸的迁移速度；各功能区离子交换柱的数量根据所需要洗脱的核苷酸在此切换时间被洗脱的迁移长度决定，切换时按功能区进行切换。
所述的方法，其中由多根离子交换柱串联的连续操作的离子交换系统是指由6-60根固定床离子交换柱组成，优选由12-36根组成的连续操作的离子交换系统。
所述的方法，其中酶解的含四种混合5’-核苷酸的清液的上样浓度为10-40g/L，优选20-35g/L。
所述的方法，其中整个模拟移动床系统维持整个模拟移动床的温度为10～40℃，进料液进水需控制温度为10～40℃，二者温度保持一致。
所述的方法，其中模拟移动床系统按照进料口及循环口的位置，36根柱4区模拟移动床系统的分区如下：
一区或称吸附区：1号组份出口至料液进口，有2-4根柱；
二区或称精制区：料液进口至2号组份出口，有6-12根柱；
三区或称脱附区：2号组份出口至再生液入口，有6-12根柱；
四区或称清洗区：再生液入口至料液进口，有6-12根柱。
所述的方法，其中模拟移动床系统按照进料口及循环口的位置，24根柱4区模拟移动床系统的分区如下：
一区或称吸附区：1号组份出口至料液进口，有1-3根柱；
二区或称精制区：料液进口至2号组份出口，有6-8根柱；
三区或称脱附区：2号组份出口至再生液入口，有6-8根柱；
四区或称清洗区：再生液入口至料液进口，有6-8根柱。
所述的方法，其中阳离子交换树脂型号是是001×7型、001×6型或001×5型。
本发明所用原料为核苷酸酶解液，尤其是核糖核酸(RNA)酶解液。模拟移动床选用单一的一种强酸性阳离子交换树脂作为吸附剂，以单一洗脱剂进行洗脱，不需要其他吸附剂的组合和不断的调节洗脱剂的离子强度。
本发明中的模拟移动床设备可以通过德国knauer公司的C916型模拟移动床来实现四种5’-核苷酸的分离，不过需要在工艺安排的时候，考虑到本工艺过程的特点，在适当的位置增加两个物料出口和三个洗脱液进口。其他操作方法可根据其设备说明书进行操作。
本发明的有益效果：
本发明突破国内外同行对5’-核苷酸分离纯化方式的模式化，将模拟移动床技术与纳滤膜分离相结合，使得本发明的分离纯化技术简便易行，效果佳，不仅其设备投资、运行成本低廉，而且可以根据分离量的多少，实现从公斤级至吨级的分离。同时，由于模拟移动床是连续分离形式，分离效率提高；在脱附目标产物时，采用的是多柱串联洗脱，所以洗脱液浓度得到了提高；纳滤机与模拟移动床这一高效的分离形式的有机结合更是减小了能耗和水的用量，本发明在保证了产品的高品质的同时，大大的降低了生产成本。
附图说明
图1是用于5’-核苷酸分离的连续离子交换装置示意图。
具体实施方式
通过下列实施例进一步阐述本发明，实施例是为说明而非限制本发明。本领域中任何普通技术人员能够理解这些实施例不以任何方式限制本发明，可做适当的修改而不违背本发明的实质和偏离本发明的范围。
实施例中可以采用德国knauer公司的C916型模拟移动床来实现四种5’-核苷酸的分离，在工艺安排的时候，根据本工艺过程的特点，在适当的位置增加两个物料出口和三个洗脱液进口。其他操作方法可根据其设备说明书进行操作。操作原则是通过离子交换过程中的强弱吸附组份的吸附、精制、脱附和树脂再生不同功能区之间的按顺序切换，根据强弱吸附组份在分离介质上迁移速度不同的原理进行分离，通过组合阀门的切换来改变进料口、出料口及循环进出口位置得到目标产物；其中，切换时间的标准是通过调整各功能区洗脱液流速和离子交换柱的根数(洗脱液流速及离子交换柱数量或离子交换柱树脂装填量都是控制核苷酸迁移快慢的手段，为方便操作，本发明采用的各离子交换柱树脂装填量相等)，来控制各核苷酸的迁移速度；各功能区离子交换柱的数量根据所需要洗脱的核苷酸在此切换时间被洗脱的迁移长度决定，切换时按功能区进行切换。
实施例中整个模拟移动床系统维持整个模拟移动床的温度为室温，进料液温度也保持室温。
实施例1
核苷酸酶解清液上样浓度为30g/L。用湿法装柱法装填24根离子交换柱，每根离子交换树脂柱装填200克001×6型树脂，树脂粒径为100～150目，离交柱的径高比1∶5，并采用下述工艺进行分离，一区2根离子交换柱，二区7根离子交换柱，三区7根离子交换柱，四区7根离子交换柱。然后将核苷酸澄清溶液从吸附区开始上柱吸附，上样流速为10ml/min。以pH 5.0去离子水对各区进行洗脱，流速分别为：一区为10ml/min，二区为18ml/min，三区为17ml/min，四区为35ml/min，从吸附区的一个出口和脱附区的三个出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，离子交换过程采用260nm波长检测；经质谱分析，判定UMP洗脱完全出后立即同步切换，使各区位置沿液体流动方向同步变换，再从切换后的吸附区和脱附区的出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，如此循环往复。以截留分子量为150-300道尔顿的纳滤膜分别对四种单核苷酸洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后分别得到纯度为UMP为90％、GMP为98％、CMP为96％、AMP为98％以上的单核苷酸产品，产品总收率96％以上。
实施例2
核苷酸酶解清液上样浓度为25g/L。用湿法装柱法装填24根离子交换柱，每根离子交换树脂柱装填200克001×7型树脂，树脂粒径为100～150目，离交柱的径高比1∶5，并采用下述工艺进行分离，一区3根离子交换柱，二区6根离子交换柱，三区7根离子交换柱，四区8根离子交换柱。然后将核苷酸澄清溶液从吸附区开始上柱吸附，上样流速为10ml/min。以pH 5.0去离子水对各区进行洗脱，流速分别为：一区为15ml/min，二区为23ml/min，三区为22ml/min，四区为43ml/min，从吸附区的一个出口和脱附区的三个出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，离子交换过程采用260nm波长检测；经质谱分析，判定UMP洗脱完全出后立即同步切换，使各区位置沿液体流动方向同步变换，再从切换后的吸附区和脱附区的出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，如此循环往复。以截留分子量为150-300道尔顿的纳滤膜分别对四种单核苷酸洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后分别得到纯度为UMP为91％、GMP为97.5％、CMP为96.5％、AMP为98％以上的单核苷酸产品，产品总收率95％以上。
实施例3
核苷酸酶解清液上样浓度为31g/L。用湿法装柱法装填24根离子交换柱，每根离子交换树脂柱装填200克001×5型树脂，树脂粒径为120～150目，离交柱的径高比1∶5，并采用下述工艺进行分离，一区2根离子交换柱，二区7根离子交换柱，三区7根离子交换柱，四区8根离子交换柱。然后将核苷酸澄清溶液从吸附区开始上柱吸附，上样流速为10ml/min。以pH 5.0去离子水对各区进行洗脱，流速分别为：一区为13ml/min，二区为22ml/min，三区为21ml/min，四区为41ml/min，从吸附区的一个出口和脱附区的三个出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，离子交换过程采用260nm波长检测；经质谱分析，判定UMP洗脱完全出后立即同步切换，使各区位置沿液体流动方向同步变换，再从切换后的吸附区和脱附区的出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，如此循环往复。以截留分子量为150-300道尔顿的纳滤膜分别对四种单核苷酸洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后分别得到纯度为UMP为90.5％、GMP为97.5％、CMP为96％、AMP为97.5％以上的单核苷酸产品，产品总收率96.5％以上。
实施例4
核苷酸酶解清液上样浓度为28g/L。用湿法装柱法装填24根离子交换柱，每根离子交换树脂柱装填200克001×7型树脂，树脂粒径为100～120目，离交柱的径高比1∶5，并采用下述工艺进行分离，一区3根离子交换柱，二区7根离子交换柱，三区7根离子交换柱，四区7根离子交换柱。然后将核苷酸澄清溶液从吸附区开始上柱吸附，上样流速为14ml/min。以pH 5.0去离子水对各区进行洗脱，流速分别为：一区为14ml/min，二区为20ml/min，三区为22ml/min，四区为42ml/min，从吸附区的一个出口和脱附区的三个出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，离子交换过程采用260nm波长检测；经质谱分析，判定UMP洗脱完全出后立即同步切换，使各区位置沿液体流动方向同步变换，再从切换后的吸附区和脱附区的出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，如此循环往复。以截留分子量为150-300道尔顿的纳滤膜分别对四种单核苷酸洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后分别得到纯度为UMP为90％、GMP为97％、CMP为95.5％、AMP为97.5％以上的单核苷酸产品，产品总收率95.5％以上。
实施例5
核苷酸酶解清液上样浓度为30.5g/L。用湿法装柱法装填24根离子交换柱，每根离子交换树脂柱装填200克001×6型树脂，树脂粒径为100～150目，离交柱的径高比1∶5，并采用下述工艺进行分离，一区3根离子交换柱，二区6根离子交换柱，三区7根离子交换柱，四区8根离子交换柱。然后将核苷酸澄清溶液从吸附区开始上柱吸附，上样流速为12ml/min。以pH 5.0去离子水对各区进行洗脱，流速分别为：一区为11ml/min，二区为19ml/min，三区为18ml/min，四区为38ml/min，从吸附区的一个出口和脱附区的三个出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，离子交换过程采用260nm波长检测；经质谱分析，判定UMP洗脱完全出后立即同步切换，使各区位置沿液体流动方向同步变换，再从切换后的吸附区和脱附区的出口分别收集UMP、GMP、CMP和AMP溶液，如此循环往复。以截留分子量为150-300道尔顿的纳滤膜分别对四种单核苷酸洗脱液进行纳滤浓缩脱盐；最后分别得到纯度为：UMP为91％、GMP为96％、CMP为97％、AMP为98％以上的单核苷酸产品，产品总收率95％以上。
Claims (8)
1、一种分离制备5’-核苷酸的方法，其特征在于该方法采用模拟移动床系统和纳滤的组合技术分离四种混合5’-核苷酸，具体步骤为：
a.将酶解的含四种混合5’-核苷酸的清液泵入装有阳离子交换树脂的模拟移动床系统中进行吸附，采用pH2～14的去离子水溶液进行洗脱，控制各功能区核苷酸的迁移速度，使相应功能区出口分别流出UMP、GMP、CMP、AMP溶液；
b.切换模拟移动床各功能区的进口和出口位置，使各功能区按液体流动方向及原排列顺序切换，重复上述上样吸附、洗脱、控制迁移速度的步骤，使相应功能区出口分别流出UMP、GMP、CMP、AMP溶液，如此循环往复；
c.将得到的UMP、GMP、CMP、AMP溶液分别采用截留分子量为150～300道尔顿的纳滤膜将离子交换洗脱液同步浓缩和脱盐，结晶干燥，得到四种不同的5’-核苷酸。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于模拟移动床系统是指由多根相同的离子交换柱串联的模拟移动床系统，即通过离子交换过程中的强弱吸附组份的吸附、精制、脱附和树脂再生不同功能区之间的按顺序切换，根据强弱吸附组份在分离介质上迁移速度不同的原理进行分离，通过组合阀门的切换来改变进料口、出料口及循环进出口位置得到目标产物；其中，切换时间的标准是通过调整各功能区洗脱液流速和离子交换柱的根数，来控制核苷酸的迁移速度；各功能区离子交换柱的数量根据所需要洗脱的核苷酸在此切换时间被洗脱的迁移长度决定，切换时按功能区进行切换。
3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于由多根离子交换柱串联的连续操作的离子交换系统是指由6-60根固定床离子交换柱组成的离子交换系统。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于酶解的含四种混合5’-核苷酸的清液的上样浓度为10-40g/L。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于整个模拟移动床系统维持整个模拟移动床的温度为10～40℃，进料液进水需控制温度为10～40℃，二者温度保持一致。
6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于模拟移动床系统按照进料口及循环口的位置，36根柱4区模拟移动床系统的分区如下：
一区或称吸附区：1号组份出口至料液进口，有2-4根柱；
二区或称精制区：料液进口至2号组份出口，有6-12根柱；
三区或称脱附区：2号组份出口至再生液入口，有6-12根柱；
四区或称清洗区：再生液入口至料液进口，有6-12根柱。
7、根据权利要求1所述的方法，其特征在于模拟移动床系统按照进料口及循环口的位置，24根柱4区模拟移动床系统的分区如下：
一区或称吸附区：1号组份出口至料液进口，有1-3根柱；
二区或称精制区：料液进口至2号组份出口，有6-8根柱；
三区或称脱附区：2号组份出口至再生液入口，有6-8根柱；
四区或称清洗区：再生液入口至料液进口，有6-8根柱。
8、根据权利要求1所述的方法，其特征在于阳离子交换树脂型号是001×7型、001×6型或001×5型。
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|---|---|---|---|---|
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2006
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