CN102268056A

CN102268056A - 一种连续分离环磷腺苷的方法

Info

Publication number: CN102268056A
Application number: CN2010101915264A
Authority: CN
Inventors: 应汉杰; 钱文斌; 柏建新; 陈晓春; 陈勇; 熊健; 林晓清
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2011-12-07

Abstract

本发明提供一种连续分离环磷腺苷的方法，该方法使用一种连续离子交换系统，该连续离子交换系统包括分别位于吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区的5-80根串联的阴离子交换柱；该方法包括将含有环磷腺苷的溶液连续地泵入位于吸附区的阴离子交换柱中进行吸附，使吸附后的阴离子交换柱依次通过洗杂区、洗脱区和再生区，再返回到吸附区再次进行吸附；该方法还包括将洗脱区流出的洗脱液脱盐、结晶、干燥得到环磷腺苷。本发明的分离方法简便易行，效果好，不仅其设备投资、运行成本低廉，而且可以根据分离量的多少，实现从公斤级到吨级的分离，通过本发明所得产品在收率和产品质量方面都获得了极好的结果，保证了产品品质。

Description

一种连续分离环磷腺苷的方法

技术领域

本发明涉及一种连续分离环磷腺苷的方法。

背景技术

环磷腺苷又名3′，5′-环磷酸腺苷(3′，5′cyclic adenosine monophosphate，简称cAMP)，为蛋白激酶致活剂，是核苷酸的衍生物。它是在人体内广泛存在的一种具有生理活性的重要物质，由三磷酸腺苷在腺苷环化酶催化下生成，能调节细胞的多种功能活动。作为激素的第二信使，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢的作用，能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，从而增强心肌收缩，并可促进呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病症状及改善心电图。此外，对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。

关于cAMP的分离纯化，国内外报道的较少，传统的分离工艺普遍存在着工艺冗长、产量收率低，分离成本高，环境污染性大等缺点。如最早工业的化学合成法，大多是以腺苷酸或腺苷为底物，首先合成中间体，然后在一定溶剂内用特定环化剂进行环化，最终合成环磷腺苷。

例如申艳红等于2004年报道了对Genieser等的合成工艺的改进方法。将中间体腺苷-5二氯磷酸酯及时从反应体系中分离出来，减少了过量的三氯氧磷对反应中间体的影响，也相应减少了环化时强碱的使用量，避免了生成大量的磷酸盐和氯化物副产物。制备环磷腺苷时，溶剂选用水和乙腈，由于乙腈中环磷腺苷的含量很低，故可以先通过冷冻使水和乙腈分层，既可以快速地回收乙腈，又能缩短溶剂蒸除消耗的时间，从而提高了工作效率，反应收率约为58％。但是，总体而言，化学法由于反应不完全，工艺总收率仍然不够理由。

另外也有专利报道了从红枣内提取环磷腺苷(CN1702076A)，但实际上并没有产业化的可能，主要是因为红枣中的环磷腺苷太低，而且后续分离纯化工艺亦较复杂，需要经过四道树脂分离，将大枣洗净、晾干、去核，然后按比例添加蒸馏水浸泡24-48小时后匀浆，高速冷冻离心，取上清液反复经离子交换柱层析，进行分离、纯化、冷冻干燥成冻干粉末。

在现有的cAMP生产工艺中，固定床离子交换技术在分离环磷腺苷过程中得到广泛的应用。但固定床离子交换技术存在多种弊端，它是一种分批式作业，吸附、洗杂、洗脱、再生等步骤在同一床内进行，单批作业周期长，不连续，离子交换树脂容量不能充分利用，从而化学试剂消耗量大，不经济，废水排放量大等也是这种分离方式的明显缺点。

发明内容

因此，本发明的目的是克服目前环磷腺苷分离过程成本高、操作繁琐、不易规模化的缺点，提供一种成本低、操作简便，并且能够大规模应用的连续分离环磷腺苷的方法。

本发明提供了一种连续分离环磷腺苷的方法，该方法使用一种连续离子交换系统，该连续离子交换系统包括分别位于吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区的5-80根串联的阴离子交换柱；该方法包括将含有环磷腺苷的溶液连续地泵入位于吸附区的阴离子交换柱中进行吸附，使吸附后的阴离子交换柱依次通过洗杂区、洗脱区和再生区，再返回到吸附区再次进行吸附；该方法还包括将洗脱区流出的洗脱液脱盐、结晶、干燥得到环磷腺苷。

根据本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法，其中，所述连续离子交换系统优选地包括5-40根串联的阴离子交换柱，更优选地包括8-35根阴离子交换柱。所述串联是指位于每个区中的离子交换柱首尾串联。

具体地，这些阴离子交换柱分别位于所述吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区，即每个区至少具有一根阴离子交换柱，例如，每个区的阴离子交换柱的数量可以各自为1-10根，优选为2-8根。各个区的阴离子交换柱的数量可以相同，也可以不同。所述连续离子交换系统通过组合式阀门将所述阴离子交换柱在吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区之间切换，将吸附区的阴离子交换柱在饱和吸附后由吸附区送入洗杂区进行洗杂，洗杂结束后由洗杂区送入洗脱区进行洗脱，洗脱完成后由洗脱区送入再生区进行再生，树脂再生完成后由再生区送入吸附区再进行吸附，如此循环，使得每个区的第1根阴离子交换柱的状态切换同步进行。

例如，在本发明的一种具体的实施方式中，采用吸附区为3根、洗杂区为4根、洗脱区为3根，再生区为4根的工艺形式。图1-14表示了这种工艺形式的连续离子交换系统的运行过程，其中A为吸附区，B为洗杂区，C为洗脱区，D为再生区，图1-14分别表示了该连续离子交换系统的14种状态。在图1中，吸附区的离子交换柱中的第三根离子交换柱(即柱1)能保护整个离子交换柱的吸附区不会被上柱液穿透而造成损失，当第一根离子交换柱即柱3吸附饱和后就会被移出吸附区，进入洗杂区进行洗杂，成为洗杂区的最后一根柱(即图2的状态)，而洗杂区的第一根离子交换柱(柱7)此时在洗杂流速的控制下刚好洗杂完成，进入洗脱区，成为洗脱区的最后一根柱(即图2的状态)，并且通过控制洗脱流速使得洗脱区的第一根(柱10)也洗脱结束，移入再生区的最后一根进行树脂再生(即图2的状态)，再生段的第一根(柱14)也再生完毕，移入吸附区的最后一根进行吸附(即图2的状态)。这样通过控制各区的流速和阀门的切换，可以实现四个区保持同样的节奏进行工作。各区的流速受各工段条件的影响，原则上是保证各工段同步运行，本领域普通技术人员可根据树脂的状态调整流动相的流速。通过控制各区流速及各区离子交换柱的根数来确定进出口切换时间，最终使整个系统各个区达到同步切换。

根据本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法，其中，所述吸附、洗杂、洗脱和再生的概念为本领域技术人员所公知。就本发明而言，在所述洗杂区中将0.05-3摩/升(优选为0.1-2摩/升)的碱性溶液泵入位于洗杂区的阴离子交换柱中进行洗杂；在所述洗脱区中将0.001-2摩/升(优选为0.01-1.2摩/升)的酸性溶液泵入位于洗脱区的阴离子交换柱中进行洗脱；在所述再生区中用0.2-2摩/升的酸性溶液泵入位于再生区的阴离子交换柱中进行再生，然后再用去离子水淋洗。

根据本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法，其中，所述阴离子交换柱的树脂可以为任何常规的阴离子交换树脂，例如，可以为(C2-C4)羟烷化苯乙烯-二乙烯苯共聚得到的亲水性树脂，功能性基团可以为仲胺、叔胺或季铵基团，这些树脂的代表性的例子为Amberlite IRA93(功能性基团为仲胺基团)、Amberlite IRA95(功能性基团为叔胺基团)和AmberliteIRA900RF Cl(功能性基团为季铵基团)；该功能性基团可以优选为叔胺基团，这类树脂的代表性的例子为Amberlite IRA95。

根据本发明提供的方法，其中，所述碱性溶液可以为各种公知的碱性溶液，例如可以为氨水、氢氧化钠溶液和氢氧化钾溶液中的一种或多种，优选为氨水和/或氢氧化钠溶液；用于所述洗脱区的酸性溶液可以优选为盐酸、硫酸和磷酸溶液中的一种或多种；用于所述再生区的酸性溶液优选为盐酸和/或硫酸溶液。

根据本发明提供的方法，其中，将洗脱区流出的洗脱液脱盐的方法可以为本领域公知的各种方法，优选为将洗脱区流出的洗脱液经纳滤同步浓缩脱盐，在该方法中使用的纳滤膜截留分子量可以为150-300道尔顿。

由于本发明的可以将环磷腺苷与某些理化特性与其相似的化合物分离开，因此本发明的方法对所述含有环磷腺苷的溶液中含有的环磷腺苷的浓度没有特别的限定，一般地，使用本发明的方法分离的含有环磷腺苷的溶液中含有的环磷腺苷的浓度可以为1-20克/升，优选为1-15克/升，更优选为优选2-10克/升。

特别地，可以使用本发明提供的方法对全细胞催化法或发酵法制得的环磷腺苷转化液经离心、超滤处理后得到的清液进行分离，得到环磷腺苷纯品。该环磷腺苷清液离心、超滤处理是将全细胞催化法或发酵法制备的环磷腺苷转化液经过离心处理(转速为4000rpm-10000rpm)，再将离心清液透过超滤膜(截留分子量为2000-10000道尔顿)，使cAMP发酵液中的菌体不溶物以及大分子蛋白质等进行初步的去除。

本发明运用连续离子交换技术提高了树脂的利用率，减少了树脂用量，使用一种阴离子交换树脂进行分离纯化，工艺步骤简单；洗脱液浓度提高，洗杂的效果好，减少了洗脱剂、洗杂剂的用量；酸、碱等再生剂则由于提高了利用率而用量减小，同时也减少了酸、碱的排放。与固定床分离法相比，本发明的方法可以实现树脂用量节约30-50％，酸碱用量节约30-45％，操作费用节约40-60％，投资费用节约50-60％。因此本发明的分离纯化方法简便易行，效果好，不仅其设备投资、运行成本低廉，而且可以根据分离量的多少，实现从公斤级到吨级的分离，通过本发明所得产品在收率和产品质量方面都获得了极好的结果，保证了产品品质。

本发明的一种优选的实施方式还突破了国内同行对环磷腺苷分离纯化方式的模式化，将离子交换与纳滤膜分离相结合，节约了脱盐和浓缩的步骤可以直接进行结晶纯化。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是本发明的连续离子交换系统处于状态1的示意图；

图2是本发明的连续离子交换系统处于状态2的示意图；

图3是本发明的连续离子交换系统处于状态3的示意图；

图4是本发明的连续离子交换系统处于状态4的示意图；

图5是本发明的连续离子交换系统处于状态5的示意图；

图6是本发明的连续离子交换系统处于状态6的示意图；

图7是本发明的连续离子交换系统处于状态7的示意图；

图8是本发明的连续离子交换系统处于状态8的示意图；

图9是本发明的连续离子交换系统处于状态9的示意图；

图10是本发明的连续离子交换系统处于状态10的示意图；

图11是本发明的连续离子交换系统处于状态11的示意图；

图12是本发明的连续离子交换系统处于状态12的示意图；

图13是本发明的连续离子交换系统处于状态13的示意图；

图14是本发明的连续离子交换系统处于状态14的示意图。

注：在图1-14中数字1-14为本发明的连续离子交换系统中的阴离子交换柱的的编号。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

环磷腺苷溶液的制备

以下实施例和对比例所用的环磷腺苷溶液按如下方法制备得到：

用发酵法制备：发酵培养基为在普通培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖5％，K₂HPO₄1％，KH₂PO₄1％，MgSO₄1％，尿素0.5％，蛋白胨0.5％)的基础上每升培养基添加0.1g NaF、0.1g VB1和5g次黄嘌呤。培养方法：将节杆菌A302(于2010年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.3584)接入种子培养基(基于培养基的重量百分比计，包含葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母膏0.5％，牛肉膏1％，NaCl 0.3％)中，初始pH为7.0，在30℃、240rpm下培养18小时。10％的接种量接入5L发酵罐中的发酵培养基中，以NaOH控制pH为7.0，溶氧控制为30％，400rpm、30℃下发酵72小时。放罐时，环磷酸腺苷的产量是8g/L。然后将发酵液通过离心机离心去除菌体，再将离心清液透过截留分子量为6000道尔顿的超滤膜去除大部分蛋白质，可得到浓度约为8g/L的环磷腺苷清液。

在以下各实施例中，环磷腺苷纯度是通过高效液相色谱检测到的3’，5’-环腺苷单磷酸峰面积除以所有峰的总面积，再乘以100％计算得到。

用高效液相色谱检测环磷腺苷的条件为：汉邦Lichrospher-5-C18色谱柱(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；流动相：甲醇-6‰(体积分数)磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为25∶75)；流速0.8mL/min；检测波长255nm；柱温为室温；进样体积20μL。采用外标一点法定量。

实施例1

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由13根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为4根，洗杂区为2根，洗脱区为3根，再生区为4根。每根离子交换柱装填50g树脂(Amberlite IRA95)，柱的直径为4.0厘米，高度为30厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度7g/L，吸附流速为2mL/min，吸附容量为0.087g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.1mol/L氨水，流速为2.7mL/min，洗杂到无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根阴离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.02mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为2mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为1mol/L的盐酸溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.0％的环磷腺苷，收率为96.0％。

实施例2

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由13根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为5根，洗杂区为2根，洗脱区为3根，再生区为3根。每根离子交换柱装填1.5Kg树脂(Amberlite IRA95)，柱的直径为10厘米，高度为55厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度10g/L，吸附流速为65mL/min，吸附容量为0.073g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.05mol/L氨水，流速为50mL/min，洗杂到无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.4mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为60mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；向位于再生区的离子交换柱中泵入浓度为1.2mol/L的盐酸溶液进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.3％的环磷腺苷，收率为96.2％。

实施例3

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由14根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为5根，洗杂区为3根，洗脱区为2根，再生区为4根。每根离子交换柱装填3Kg树脂(Amberlite IRA900RF Cl)，柱的直径为22厘米，高度为100厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度8g/L，吸附流速为140mL/min，吸附容量为0.078g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.2mol/L氢氧化钠水溶液，流速为160mL/min，洗杂到无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.6mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为140mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为1.2mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为200道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.5％的环磷腺苷，收率为95.8％。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由13根阴离子交换柱构成连续离子交换系统，吸附区为3根，洗杂区为3根，洗脱区为3根，再生区为4根。每根离子交换柱装填10Kg树脂(Amberlite IRA93)，柱的直径为30厘米，高度为130厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度8g/L，吸附流速为350mL/min，吸附容量为0.083g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.45mol/L氨水溶液，流速为400mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.8mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为400mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为1.5M的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为100道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.4％的环磷腺苷，收率为96.1％。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由15根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为6根，洗杂区为3根，洗脱区为3根，再生区为3根。每根离子交换柱装填20Kg树脂(Amberlite IRA900RF Cl)，柱的直径为40厘米，高度为160厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度8g/L，吸附流速为600mL/min，吸附容量为0.082g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.2mol/L氨水溶液，流速为650mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为1.1mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为600mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为2.0mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.0％的环磷腺苷，收率为96.2％。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由8根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为2根，洗杂区为2根，洗脱区为2根，再生区为2根。每根离子交换柱装填200g树脂(Amberlite IRA95)，柱的直径为3厘米，高度为12.5厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度10g/L，吸附流速为3.0mL/min，吸附容量为0.084g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.2mol/L氨水溶液，流速为3.3mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为1.0mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为3.0mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为2.0mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.0％的环磷腺苷，收率为97.1％。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由20根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为5根，洗杂区为4根，洗脱区为4根，再生区为7根。每根离子交换柱装填2.2Kg树脂(Amberlite IRA93)，柱的直径为21厘米，高度为87厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度6g/L，吸附流速为100mL/min，吸附容量为0.082g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.4mol/L氨水溶液，流速为120mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.08mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为100mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为1.5mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.4％的环磷腺苷，收率为96.5％。

实施例8

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由27根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为6根，洗杂区为8根，洗脱区为4根，再生区为9根。每根离子交换柱装填2.2Kg树脂(Amberlite IRA93)，柱的直径为21厘米，高度为87厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度7g/L，吸附流速为140mL/min，吸附容量为0.082g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.2mol/L氨水溶液，流速为150mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.005mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为150mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为2.0mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.6％的环磷腺苷，收率为95.9％。

实施例9

本实施例用于说明本发明提供的连续分离环磷腺苷的方法。

采用由32根阴离子交换柱构成的连续离子交换系统，吸附区为7根，洗杂区为9根，洗脱区为7根，再生区为9根。每根离子交换柱装填200g树脂(Amberlite IRA95)，柱的直径为3厘米，高度为12.5厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度8g/L，吸附流速为80mL/min，吸附容量为0.078g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.08mol/L氨水溶液，流速为100mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂区的第一根离子交换柱无杂质流出)；洗脱液为0.3mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为100mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱区的第一根离子交换柱洗脱完全)；泵入浓度为2.0mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为99.0％的环磷腺苷，收率为96.8％。

对比例1

本对比例用于与本发明提供的分离环磷腺苷的方法进行对比。

与实施例1对比，进行单柱固定床吸附，洗杂和洗脱实验，树脂(Amberlite IRA95)填充量285g，柱的直径为8厘米，高度为34厘米。环磷腺苷清液上柱，上柱浓度7g/L，吸附流速为34mL/min，吸附容量为0.074g/g湿树脂；洗杂区洗杂溶液为0.1mol/L氨水溶液，流速为35mL/min，洗杂至无杂质为止(用HPLC检测确定洗杂无杂质流出)；洗脱液为0.02mol/L盐酸水溶液，洗脱流速为35mL/min，洗脱完全(用HPLC检测确定洗脱无环磷腺苷流出)；泵入浓度为1.0mol/L的盐酸溶液到需再生的离子交换柱进行再生，再生完成后用去离子水淋洗。洗脱液用截留分子量为150道尔顿的纳滤膜同步浓缩脱盐后结晶、干燥，得到纯度为96.0％的环磷腺苷，收率为95.5％。而且实施例1树脂再生用去1.0mol/L的盐酸为185ml，对比例用去266ml。

通过实施例1-9与对比例1的对比可以看出，本发明的分离方法简便易行，产品纯度和收率均高于对比例，而且采用连续分离的方式运行成本低廉，处理量大。

Claims

1.一种连续分离环磷腺苷的方法，该方法使用一种连续离子交换系统，该连续离子交换系统包括分别位于吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区的5-80根串联的阴离子交换柱；该方法包括将含有环磷腺苷的溶液连续地泵入位于吸附区的阴离子交换柱中进行吸附，使吸附后的阴离子交换柱依次通过洗杂区、洗脱区和再生区，再返回到吸附区再次进行吸附；该方法还包括将洗脱区流出的洗脱液脱盐、结晶、干燥得到环磷腺苷。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述连续离子交换系统包括5-40根串联的阴离子交换柱，优选为8-35根；所述串联是指位于每个区中的阴离子交换柱首尾串联。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，位于所述吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区的阴离子交换柱各自为1-10根，优选为2-8根。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述连续离子交换系统通过组合式阀门将所述阴离子交换柱在吸附区、洗杂区、洗脱区和再生区之间切换，将吸附区的阴离子交换柱在饱和吸附后由吸附区送入洗杂区进行洗杂，洗杂结束后由洗杂区送入洗脱区进行洗脱，洗脱完成后由洗脱区送入再生区进行再生，树脂再生完成后由再生区送入吸附区再进行吸附，如此循环，使得每个区的第1根阴离子交换柱的状态切换同步进行。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，在所述洗杂区中将0.05-3摩/升的碱性溶液泵入位于洗杂区的阴离子交换柱中进行洗杂；在所述洗脱区中将0.001-2摩/升的酸性溶液泵入位于洗脱区的阴离子交换柱中进行洗脱；在所述再生区中用0.2-2摩/升的酸性溶液泵入位于再生区的阴离子交换柱中进行再生，然后再用去离子水淋洗。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，所述阴离子交换柱的树脂是C2-C4羟烷化苯乙烯-二乙烯苯共聚得到的亲水性树脂，功能性基团为仲胺、叔胺或季铵基团，优选为叔胺基团。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述碱性溶液为氨水、氢氧化钠溶液和氢氧化钾溶液中的一种或多种；用于所述洗脱区的酸性溶液为盐酸、硫酸和磷酸溶液中的一种或多种；用于所述再生区的酸性溶液为盐酸和/或硫酸溶液。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，将洗脱区流出的洗脱液脱盐的方法为将洗脱区流出的洗脱液经纳滤同步浓缩脱盐，使用的纳滤膜截留分子量为150-300道尔顿。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述含有环磷腺苷的溶液中含有的环磷腺苷的浓度为1-20克/升。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，所述环磷腺苷溶液是将全细胞催化法或发酵法制得的环磷腺苷转化液经离心、超滤处理后得到的清液。