TWI792442B

TWI792442B - 依特卡肽鹽酸鹽之製造方法

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Publication number: TWI792442B
Application number: TW110127220A
Authority: TW
Inventors: 張雅淳; 李師偉
Original assignee: 建誼生技股份有限公司
Priority date: 2021-07-23
Filing date: 2021-07-23
Publication date: 2023-02-11
Also published as: TW202304950A; US20230043220A1

Abstract

本發明有關於一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其利用第一溶液系統去除第一胜肽的保護基且使第一胜肽脫離固相支持物，接著在第二溶液系統中利用活化的L-Cys-OH對第二胜肽進行偶聯反應，所得的依特卡肽三氟乙酸 (TFA)鹽係不溶或難溶於第二溶液系統。經層析管柱純化後，後續利用不含鹽酸之第三溶液系統進行即時監控置換鹽類步驟，使依特卡肽TFA鹽轉換為依特卡肽鹽酸鹽。此方法不僅簡化製程，提供純度高且產率高之依特卡肽鹽酸鹽，更有利於依特卡肽鹽酸鹽的量產。

Description

依特卡肽鹽酸鹽之製造方法

本發明係有關一種擬鈣劑之製造方法，特別是有關於一種純度高且產率高之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法。

依特卡肽(etelcalcetide)為一種擬鈣劑(sensipar)，用於治療血液透析慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)成年患者之繼發性甲狀旁腺功能亢進(secondary Hyperparathyroidism，SHPT)，藉此抑制甲狀旁腺激素(parathyroid hormone，PTH)的分泌。

依特卡肽的結構具有雙硫鍵，倘若按照傳統二硫鍵構建方法進行反應，最終產品將難以達到理想的回收率和純度。

為此，習知製程提供數種方式試圖解決上述問題。第一種製程是先以固相合成直鏈且含有保護基的七胜肽，在脫離固相支持物(例如樹脂)並切除保護基後，活化七胜肽的D-Cys(Pys)，將活化的七胜肽與L-Cys-OH反應成依特卡肽TFA鹽，並經層析管柱純化。之後，於低溫及溶於異丙醇(IPA)的12M鹽酸中，對依特卡肽TFA鹽進行置換鹽類步驟(或簡稱換鹽步驟)，以獲得依特卡肽鹽酸鹽。這個製程的優點在於可監控合成反應，且最終產品不溶於異丙醇，可降低最終產品降解的風險；然而其缺點在於，此製程需進行二次較耗時的冷凍乾燥步驟(或簡稱凍乾步驟)，且換鹽步驟需在低溫下進行。

第二種製程是先以固相合成直鏈且含有保護基的七胜肽，在切除七胜肽之D-Cys的保護基後，將固定於樹脂的七胜肽與活化的L-Cys-OH[例如Boc-L-Cys(NPys)-OH]反應，再使八胜肽脫離固相支持物(例如樹脂)並切除其餘的保護基，以獲得依特卡肽TFA鹽並經層析管柱純化。之後，於pH≥2的鹽酸水溶液的存在下，對依特卡肽TFA鹽進行換鹽步驟，以獲得依特卡肽鹽酸鹽。這個製程的缺點在於需進行至少三次較耗時的凍乾步驟，且無法即時監控部分的合成步驟及換鹽步驟。

第三種製程是先以固相合成直鏈且含有保護基的七胜肽，在只切除七胜肽之D-Cys的保護基後，活化七胜肽的D-Cys(Pys)，再將固定於樹脂之活化的七胜肽與具有保護基的Boc-L-Cys-OH反應成依特卡肽TFA鹽。接著，使八胜肽脫離固相支持物(例如樹脂)並切除其餘的保護基，以獲得依特卡肽TFA鹽並經層析管柱純化。這個製程的缺點在於無法即時監控部分的合成步驟，且未揭露換鹽步驟如何進行。

第四種製程是先以固相合成直鏈且含有保護基的七胜肽，在脫離固相支持物(例如樹脂)並切除保護基後，活化七胜肽的D-Cys(Scm)，再將活化的七胜肽與L-Cys-OH反應成依特卡肽TFA鹽。另一種方式，將七胜肽與活化的L-Cys(Scm)-OH反應成依特卡肽TFA鹽。然後，依特卡肽TFA鹽經層析管柱純化先換成依特卡肽乙酸(AcOH)鹽，之後，在氯化銨及稀鹽酸的存在下進行沖提，經一次凍乾後獲得依特卡肽鹽酸鹽。這個製程的缺點在於換鹽步驟含有鹽酸水溶液，而鹽酸水溶液對最終產品有降解的風險。

上述習知製程在換鹽步驟時，無可避免需使用鹽酸，鹽酸有導致最終產品脫醯胺化(Deamidation)而降解的風險。即使克服最終產品被降解的風險，但置換鹽類步驟也無法即時監控。因此，亟需改善依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，以提供純度高、產率高、能量產且換鹽步驟能即時監控之製程。

因此，本發明之一態樣是提供一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其係利用第一溶液系統去除第一胜肽的側鏈保護基且使第一胜肽脫離醯胺樹脂後，所得的第二胜肽利用第二溶液系統與活化的L-Cys-OH反應，以獲得依特卡肽TFA鹽。經層析管柱純化後，再利用第三溶液系統對依特卡肽TFA鹽進行即時監控置換鹽類步驟，以獲得依特卡肽鹽酸鹽。由於第三溶液系統包括含氯無機鹽但排除鹽酸，不僅簡化製程且回收率高，有利於依特卡肽鹽酸鹽的量產。

其次，本發明之另一態樣是提供一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其係利用第二溶液系統進行偶聯反應，使活化的L-Cys-OH與不具側鏈保護基的第二胜肽反應，所得的依特卡肽TFA鹽經層析管柱純化後，再利用第三溶液系統進行即時監控置換鹽類步驟，以獲得依特卡肽鹽酸鹽。由於依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於第二溶液系統，第三溶液系統包括含氯無機鹽但排除鹽酸，不僅有效降低不純物，有利於依特卡肽鹽酸鹽的量產。

根據本發明之上述態樣，提出一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法。在一實施例中，前述方法包括下述步驟。首先，進行固相合成步驟，以獲得如式(I)所示之第一胜肽，其中第一胜肽之C端可固定於醯胺樹脂，式(I)之Ac代表乙醯基，X代表第一側鏈保護基，且Y代表第二側鏈保護基： Ac-D-Cys(X)-D-Ala-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Ala-D-Arg(Y)-NH-樹脂 (I)。

接著，利用第一溶液系統去除第一胜肽之第一側鏈保護基(X)及第二側鏈保護基(Y)，並使第一胜肽脫離醯胺樹脂，以獲得如式(II)所示之第二胜肽，其中第一溶液系統係由TFA、TIS、EDT及水所組成： Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂(II)。

然後，利用第二溶液系統進行偶聯反應，使L-Cys(Z)-OH耦合至第二胜肽之D-Cys殘基並形成二硫鍵，以獲得依特卡肽TFA鹽，其中依特卡肽TFA鹽為不溶或難溶於第二溶液系統，且Z代表側鏈活化基，例如Pys。經層析管柱純化後，利用第三溶液系統對依特卡肽TFA鹽進行即時監控置換鹽類步驟，以獲得依特卡肽鹽酸鹽，其中第三溶液系統包括含氯無機鹽但排除鹽酸。

在上述實施例中，前述第一側鏈保護基可例如為Trt，且第二側鏈保護基可例如為Pbf。

在上述實施例中，前述第二溶液系統可包含低級烷基醚。在前述例示中，低級烷基醚可包含但不限於甲基第三丁基醚(MTBE)、二乙醚(DEE)、乙基第三丁基醚(ETBE)及叔戊基甲基醚(TAME)。在另一例示中，前述第二溶液系統更包含乙腈(ACN)、低級醇或上述之任意組合。在前述例示中，低級醇可包含但不限於甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇(IPA)、1-丁醇、2-丁醇及第三丁醇(TBA)。

在上述實施例中，前述即時監控置換鹽類步驟之前，更可選擇性對依特卡肽TFA鹽進行層析管柱純化步驟。

在上述實施例中，以第三胜肽[如式(III)]之當量數為1，含氯無機鹽之當量數可例如為至少1500。

在上述實施例中，前述含氯無機鹽可包括但不限於NaCl、KCl、CaCl ₂及NH ₄Cl。

根據本發明之另一態樣，提出一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法。在一實施例中，前述方法包括下述步驟。首先，提供如式(II)所示之第二胜肽，其中式(II)之Ac代表乙醯基，且第二胜肽為游離態。接下來，利用第二溶液系統進行偶聯反應，使L-Cys(Z)-OH耦合至第二胜肽之D-Cys殘基並形成二硫鍵，以獲得依特卡肽TFA鹽，其中依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於第二溶液系統，且Z代表側鏈活化基，例如Pys。然後，利用第三溶液系統對依特卡肽TFA鹽進行即時監控置換鹽類步驟，以獲得依特卡肽鹽酸鹽，其中第三溶液系統包括含氯無機鹽，此含氯無機鹽包括NaCl、KCl、CaCl ₂及NH ₄Cl但排除鹽酸。

在上述實施例中，前述偶聯反應與即時監控置換鹽類步驟之間，更可選擇性對依特卡肽TFA鹽進行固液分離步驟以及層析管柱純化步驟，以去除第二溶劑系統並獲得依特卡肽TFA鹽，其中固液分離步驟可例如過濾步驟。

應用本發明依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中所得的依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於第二溶液系統，後續利用不含鹽酸之第三溶液系統使依特卡肽TFA鹽轉換為依特卡肽鹽酸鹽，不僅簡化製程，提供純度高且產率高之依特卡肽鹽酸鹽，更有利於依特卡肽鹽酸鹽的量產。

可以理解的是，前述的概括說明及下述的詳細說明僅為例示，旨在對要求保護的發明提供進一步的解釋。

倘若引用文獻對一術語的定義或用法，與此處對該術語的定義不一致或相反，則適用此處對該術語的定義，而不適用該引用文獻對該術語的定義。其次，除非上下文另有定義，單數術語可包括複數，而複數術語亦可包括單數。另外，此處使用的縮寫係列於表1。

表1

縮寫	中文名稱	英文名稱
ACN	乙腈	acetonitrile
AcOH	乙酸	acetic acid
Boc	叔丁氧羰基	tert-butyloxycarbonyl
DEE	二乙醚	diethyl ether
DIC	N,N’-二異丙基碳亞醯胺	N,N’-diisopropyl- carbodiimide
DIPEA	N,N-二異丙基乙基胺	N,N-diisopropyl- ethylamine
DMAc	二甲基乙醯胺	N,N-dimethyl acetamide
DTT	二硫蘇糖醇	dithiothreitol
DPDS	2,2'-二硫二吡啶	2,2'-dipyridyl- disulfide
EDT	乙二硫醇	ethanedithiol
eq.	當量	equivalent
ETBE	乙基第三丁基醚	ethyl tert-butyl ether
Fmoc	9-芴甲氧羰基	9-fluorenylmethyloxy- carbonyl
IPA	異丙醇	isopropanol
Mmt	4-甲氧基三苯甲基	4-methoxytrityl
MTBE	甲基第三丁基醚	methyl tert-butyl ether
NPys	3-硝基-2-吡啶亞磺醯基	3-nitro-2-pyridine- sulfenyl
Oxyma	2-肟氰乙酸乙酯	ethyl cyano(hydroxyimino) acetate
Pbf	2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯基	2,2,4,6,7-pentamethyl-dihydrobenzofuran-5- sulfonyl
Pys/SPy	2-吡啶亞磺醯基	2-pyridinesulfenyl
Scm	S-羰基甲氧基亞磺醯基	S‐carbomethoxy- sulfenyl
TAME	叔戊基甲基醚	tert-amyl methyl ether
TBA	第三丁醇	tert-butanol
TFA	三氟乙酸	trifluoroacetic acid
TIS	三異丙基矽烷	triisopropylsilane
TNBS	2,4,6-三硝基苯磺酸	2,4,6-trinitrobenzene-sulfonic acid
Trt	三苯甲基	trityl

此處所稱之「胜肽」、「多肽」及「蛋白質」是可互換的，指的是胺基酸的聚合物，通常藉由肽鍵或二硫鍵連接在一起。「胜肽」亦可用於其中一個或多個胺基酸殘基是天然存在的胺基酸及其聚合物、或者對應於天然存在的胺基酸之類似物或模擬物的胺基酸聚合物。「胜肽」更包括經修飾的胺基酸聚合物，例如，具有碳水化合物殘基之醣蛋白，或被磷酸化的胜肽。胜肽、多肽及蛋白質可利用液相合成、固相合成或利用基因工程或重組細胞產生。

此處所稱之「胺基酸」與「殘基」是可互換的，當與胜肽併用時，指的是天然存在及合成的胺基酸、胺基酸類似物、胺基酸模擬物及化學上與天然存在的胺基酸相似的非天然存在的胺基酸。

此處所稱之「線性片段」、「直鏈」是可互換的，指的是胜肽的主鏈結構為線性或直鏈，在主鏈上亦可包含其他支鏈結構，端視實際需求而定。

此處所稱之「室溫」指的是約25°C的溫度。

如前所述，本發明提供一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其係利用第一溶液系統去除如式(I)所示之第一胜肽的側鏈保護基且使第一胜肽脫離醯胺樹脂後，所得如式(II)所示的第二胜肽利用第二溶液系統使活化之L-Cys(Z)-OH耦合至第二胜肽，以獲得依特卡肽TFA鹽，再利用第三溶液系統對依特卡肽TFA鹽進行即時監控置換鹽類步驟，以獲得式(III)所示之依特卡肽鹽酸鹽： Ac-D-Cys(X)-D-Ala-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Ala-D-Arg(Y)-NH-樹脂 (I)， Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂(II)，

。

申言之，在一實施例中，前述依特卡肽鹽酸鹽之製造方法可包括下述步驟。首先，進行固相合成步驟，以獲得如式(I)所示之第一胜肽。前述固相合成步驟可使用習知製程，將第一胜肽之C端固定於固相支持物，其中固相支持物可例如市售之醯胺樹脂，例如Rink Amide MBHA樹脂、Rink Amide AM樹脂等，惟本發明不限於此處所舉。

在上述實施例中，前述式(I)之Ac代表乙醯基，X代表第一側鏈保護基，且Y代表第二側鏈保護基。在一例示中，第一側鏈保護基(X)可例如為Trt，且第二側鏈保護基(Y)可例如為Pbf。一般而言，前述保護基是在胜肽合成的技術領域中用來保護胺基酸主鏈以及側鏈上胺基、羧基、巰基等干擾合成之基團的保護性基團，避免胺基、羧基、巰基等在製備最終產物過程中發生反應，甚至生成雜質，而被保護基保護的胺基酸則稱為「保護胺基酸」。上述保護的需求端視製備方法的遠端官能基(remote functionality)及條件而異。前述保護基的需求是本發明所屬技術領域中具有通常知識者可以輕易得知的。關於保護基及其使用的一般性敘述，亦可參酌本技術領域的教科書。因此，有關胺基酸的側鏈結構、適合的側鏈保護基、保護基的偶聯方式、具有側鏈保護基的胺基酸之表示方式等不另贅述。舉例而言，在Fmoc-D-Cys(Trt)-OH中，Fmoc代表胺基酸N端保護基，括號中的Trt則代表Cys的側鏈保護基。

上述所得的第一胜肽是作為胜肽前驅物。接下來，利用第一溶液系統去除第一胜肽之第一側鏈保護基(X)及第二側鏈保護基(Y)，並使第一胜肽脫離前述固相支持物，以獲得如式(II)所示之第二胜肽。相對於第一胜肽為固定態(immobilized form)，第二胜肽為游離態(free form)，其中本文所述之游離態是定義為第二胜肽脫離固相支持物，且第二胜肽為不溶或難溶於第二溶液系統。在此實施例中，第一溶液系統係由TFA、TIS、EDT及水所組成，在室溫下反應1小時至5小時，然以反應1.5小時至3小時為較佳，然以2小時為更佳。

接下來，在第二溶液系統中進行偶聯反應，使活化之L-Cys(Z)-OH耦合至第二胜肽之D-Cys殘基並形成二硫鍵，以獲得依特卡肽TFA鹽，其中Z代表側鏈活化基，例如Pys。在此實施例中，第二溶液系統可包含低級烷基醚，可包括但不限於甲基第三丁基醚(MTBE)、二乙醚(DEE)、乙基第三丁基醚(ETBE)及叔戊基甲基醚(TAME)。在其他實施例中，第二溶液系統更可包含乙腈(ACN)、低級醇或上述之任意組合，其中低級醇可包含但不限於甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇(IPA)、1-丁醇、2-丁醇及第三丁醇(TBA)。在一些例示中，第二溶液系統可只包含MTBE。在一些例示中，第二溶液系統可由MTBE及ACN所組成。在其他例示中，第二溶液系統可由MTBE及甲醇所組成。在另外例示中，第二溶液系統可由MTBE及IPA所組成。在上述第二溶液系統中，低級烷基醚與ACN之體積比，或者低級烷基醚與低級醇之體積比，一般可例如1/1至5/1，然以例如3/1至5/1為較佳。由此所得之依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於第二溶液系統，在進行後續即時監控置換鹽類步驟之前，可選擇性對依特卡肽TFA鹽進行固液分離步驟，以輕易去除第二溶劑系統並獲得依特卡肽TFA鹽，其中固液分離步驟可包含過濾步驟。在其他實施例中，在偶聯反應與即時監控置換鹽類步驟之間，亦可選擇性對依特卡肽TFA鹽進行固液分離步驟以及層析管柱純化步驟，以去除第二溶劑系統並獲得依特卡肽TFA鹽。在此說明的是，倘若第二溶液系統使用上述低級烷基醚、ACN及低級醇以外的溶劑進行，則所得的依特卡肽TFA鹽會有過濾效率偏低、增加純化困難等問題。

在上述實施例中，在進行前述偶聯反應前，更可包含對L-Cys-OH進行活化反應，以獲得L-Cys(Z)-OH。在此說明的是，前述的偶聯反應排除對第二胜肽之D-Cys殘基進行活化反應，理由在於，倘若前述偶聯反應修改為先活化第二胜肽之D-Cys殘基，例如形成D-Cys(Z)殘基後，再令L-Cys-OH耦合至第二胜肽之D-Cys(Z)殘基，反而會產生大量副產物，例如部分第二胜肽之D-Cys(Z)殘基會與部分第二胜肽之D-Cys殘基反應，導致最終產物的純度及產率大幅下降，甚至無法達成原有的目的。

上述所得的依特卡肽TFA鹽可利用第三溶液系統進行即時監控置換鹽類步驟，以轉變為藥學上可接受之鹽類，例如鹽酸鹽。在此實施例中，前述第三溶液系統包括含氯無機鹽但排除鹽酸，其中含氯無機鹽包括NaCl、KCl、CaCl ₂及NH ₄Cl。在此實施例中，以第三胜肽之當量數為1，前述含氯無機鹽之當量數可例如以至少1500為較佳。上述即時監控置換鹽類步驟可使用UV偵測元件監測特定吸收波長，例如監測200 nm至240 nm之吸收波長，然以監測210 nm至230 nm之吸收波長為較佳，以同步監控換鹽程度。在此釐清的是，倘若前述第三溶液系統包含鹽酸，則在低pH值環境下，依特卡肽的C端的胺基(NH ₂)容易進行脫醯胺化(Deamidation)而降解為羥基(OH)，反而會生成不純物，降低最終產物的純度。

上述所得的依特卡肽鹽酸鹽可選擇性進行冷凍乾燥步驟(或簡稱凍乾步驟)，即可獲得最終產品，如式(III-1)所示，其中m為4至5(即4≤m≤5)：

。

惟需說明的是，本發明方法合成依特卡肽鹽酸鹽僅需進行一次凍乾步驟，即可獲得純度高且產率高之依特卡肽鹽酸鹽，可有效改善習知製程需進行多次凍乾而耗時的缺點。

本發明之依特卡肽鹽酸鹽可以水合物或溶劑化物的形式存在。在其他實施例中，前述依特卡肽鹽酸鹽可應用於醫藥組成物中，或與現有藥物併用。

可以理解的是，下述特定配置、觀點、例示及實施例僅供舉例說明，並非做為本發明的限制條件。在不脫離本發明之精神和範圍內，本發明的主要特徵可用於各種實施例。因此本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可輕易確定本案的必要技術特徵，對本發明作各種更動及潤飾，以適用不同的用途及條件。實施例 1-1：第二胜肽主鏈線性片段的合成 (Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂)

此實施例係利用Rink 醯胺(Amide) MBHA 樹脂，以逐步Fmoc-固相胜肽合成策略進行合成。

Rink醯胺(Amide) MBHA 樹脂 (10.00g，取代值 0.92 mmol/g) 以DMAc (1g/10mL)浸泡膨潤15 分鐘，濾掉DMAc。加入20%哌啶[piperidine，溶於 DMAc (v/v) (1g/6mL)]，反應至少10 分鐘後移除溶液，然後重複一次。以TNBS 試劑檢測，正向結果為Fmoc代表移除反應完成。接著，以DMAc清洗樹脂一次，再以IPA清洗樹脂二次，然後再以DMAc清洗樹脂二次，以清洗掉殘留的哌啶。保護胺基酸 Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (1.5 eq.) 和Oxyma (1.5 eq.) 與DIC (2.0 eq.)溶在DMAc 中活化後，與樹脂於室溫下反應。以TNBS 試劑檢測，直到負向結果代表接合反應完成。反應結束後以DMAc 清洗樹脂四次。依照以上Fmoc 移除與保護胺基酸接合的操作步驟，進行序列中其他保護胺基酸反應。使用的保護胺基酸依序是Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-DArg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH。

最後一次移除Fmoc後，以乙酸酐(4 eq.)和DIPEA (6 eq.)於DMAc 中進行N端乙醯化，以TNBS 試劑檢測，直到負向結果代表接合反應完成。反應結束後依序以DMAc 一次、IPA 二次、MTBE 二次清洗樹脂，於減壓空乾燥得到連於樹脂的第一胜肽 (29.29 g)，如式(I-1)所示： Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink醯胺(Amide) MBHA 樹脂 (I-1)。

於第一胜肽 (28.72g) 中，加入TFA 180mL / TIPS 6mL / EDT 10mL / H ₂O 4mL，室溫下反應2小時，以切除側鏈保護基和樹脂。過濾收集濾液，以TFA 68 mL 潤洗樹脂後過濾，合併濾液。待濾液冷卻到0 °C至10 °C 後，加入MTBE 540 mL 沉澱出固體。過濾後以MTBE 清洗固體二次，減壓乾燥得到第二胜肽的線性片段白色固體(9.72g)，純度 76 %，如式(II-1)所示： Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂(II-1)。實施例 1-2：第二胜肽主鏈線性片段的合成(Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂)

此實施例係利用Rink醯胺(Amide) AM 樹脂，以逐步Fmoc-固相胜肽合成策略進行合成。

Rink醯胺(Amide) AM 樹脂 (4.00g, 取代值 0.66 mmol/g) 以DMAc (1g/10mL)浸泡膨潤15 分鐘，濾掉DMAc。加入20%哌啶[piperidine，溶於 DMAc (v/v) (1g/6mL)]，反應至少10 分鐘後移除溶液，重複一次。以TNBS 試劑檢測，正向結果為Fmoc移除反應完成。之後，以DMAc 清洗樹脂一次，再以IPA 清洗樹脂二次，再以DMAc 清洗樹脂二次，以清洗掉殘留的哌啶。保護胺基酸Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH (1.5 eq.)、Oxyma (1.5eq) 與DIC (2.0 eq)溶在DMAc 中活化後，與樹脂於室溫下反應。以TNBS 試劑檢測，直到負向結果代表接合反應完成。反應結束後以DMAc 清洗樹脂四次。依照以上Fmoc 移除與保護胺基酸接合的操作步驟，進行序列中其他保護胺基酸反應。

上述使用的保護胺基酸依序為Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trtr)-OH。

最後一次移除Fmoc 後，以乙酸酐 (4 eq.) 和DIPEA (6 eq.)於DMAc 中進行N端乙醯化，以TNBS 試劑檢測，直到負向結果代表接合反應完成。反應結束後依序以DMAc 一次、IPA 二次、MTBE 二次清洗樹脂，於減壓空乾燥得到連於樹脂的第一胜肽 (10.81g)，如式(I-2)所示： Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-Rink醯胺(amide) AM樹脂 (I-2)。

於第一胜肽 (10.80 g) 中，加入TFA 63 mL / TIPS 2.1 mL / EDT 3.5 mL / H ₂O 1.4 mL，室溫下反應2小時，以切除側鏈保護基和樹脂。過濾收集濾液，以TFA 30 mL 潤洗樹脂後過濾，合併濾液。待濾液冷卻到0 °C至10 °C 後，加入MTBE 200 mL 沉澱出固體。過濾後以MTBE 清洗固體二次，減壓乾燥得到第二胜肽的線性片段白色固體(2.87 g)，如式(II-1)所示： Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH ₂(II-1)。實施例 2-1：製備依特卡肽三氟乙酸鹽粗產物

於第二胜肽 (7.44g) 中加入 1.38g L-Cys(Pys)-OH，加入59 mL的MTBE/ACN之體積比為4/1 的第二溶液系統，於室溫下攪拌至少30分鐘。以HPLC 監控反應至第二胜肽消失，過濾後收集到的固體以MTBE 清洗二次，減壓乾燥得到白色固體7.27g，為粗產物依特卡肽。實施例 2-2：製備依特卡肽三氟乙酸鹽粗產物

於第二胜肽(5.12g)中加入 0.86g L-Cys(Pys)-OH，加入20mL 的乙酸，於室溫下攪拌至少30 分鐘。以HPLC監控反應至第二胜肽消失，將反應液於室溫下加入125 mL MTBE之的第二溶液系統，過濾後收集到的固體以MTBE 清洗二次，減壓乾燥得到白色固體5.98g，為粗產物依特卡肽。實施例 2-3：製備依特卡肽三氟乙酸鹽粗產物

於第二胜肽(10.06g) 中加入1.78g L-Cys(Pys)-OH，加入80mL 的MTBE/IPA 體積比為4/1的第二溶液系統，於室溫下攪拌至少30分鐘。以HPLC監控反應至第二胜肽消失，過濾後收集到的固體以MTBE清洗二次，減壓乾燥得到白色固體9.70g，為粗產物依特卡肽。實施例 2-4：製備依特卡肽三氟乙酸鹽粗產物

實施例 2-4係根據實施例2-1的方法進行，不同之處在於實施例 2-4之第二溶液系統為MTBE/甲醇，其體積比為4/1。比較例2-1及比較例2-2

比較例2-1及比較例2-2係根據實施例2-1的方法進行，不同之處在於比較例2-1之第二溶液系統為MTBE/DMAc，其體積比為4/1；比較例2-2之第二溶液系統為MTBE/ AcOH，其體積比為4/1。

關於實施例 2-1至實施例 2-4以及比較例2-1至比較例2-2的第二溶液系統之比較，如表2所示。

表2

第二溶液系統	產物狀態	過濾效能
實施例 2-1	固體均勻分散，不黏	容易傳送過濾
實施例 2-2	固體均勻分散，不黏	容易傳送過濾
實施例 2-3	固體均勻分散，不黏	容易傳送過濾
實施例 2-4	固體均勻分散，不黏，但較細	可傳送過濾，過濾速度較慢
比較例2-1	固體黏如麥芽糖	難以傳送過濾
比較例2-2	固體黏如口香糖	難以傳送過濾

實施例3：純化步驟

將實施例2 得到的粗產物依特卡肽 (2.3 g) 溶於水中，以0.45 μm微孔濾膜過濾後，以製備級高效液相層析設備進行純化，其中管柱填料為反相C18 矽膠，流動相系統為0.1% TFA 水溶液與0.1% TFA 乙腈溶液，以梯度系統沖提純化。收集純度大於90.0 %的樣品，將有機溶劑以減壓蒸餾移除，得到依特卡肽三氟乙酸鹽純化水溶液(體積約890 mL)，純度大於99.5%。實施例4-1：換鹽步驟(NaCl)

於實施例3 得到的純化溶液(體積205 mL，濃度0.56 mg/mL)，加入氯化鈉( molar ratio NaCl /第三胜肽= 1536 / 1)，溶解後進入反相C18矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體(116 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量2509 ppm，氯離子(Chloride)含量 12%(w/w)，從固相合成到換鹽及凍乾的總產率約為30%至35%。實施例4-2：換鹽步驟(NaCl)

於實施例3 得到的純化溶液 (體積 210 mL，濃度0.56 mg/mL)，加入氯化鈉(molar ratio NaCl/第三胜肽 = 2093 / 1)，溶解後進入反相C18 矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體 (113 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量為3650 ppm，氯離子(Chloride)含量為13%(w/w)。實施例4-3：換鹽步驟(NaCl)

於實施例3 得到的純化溶液 (體積 210 mL，濃度0.56 mg/mL)，加入氯化鈉 ( molar ratio NaCl / 第三胜肽 = 3178/1)，溶解後進入反相C18 矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體 (110 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量為1764 ppm，氯離子含量為13%(w/w)。實施例4-4：換鹽步驟(KCl)

於實施例3 得到的純化溶液(體積96 mL，濃度1.26 mg/mL)，加入氯化鉀(molar ratio KCl/第三胜肽 = 1978/1)，溶解後進入反相C18矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體(112 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量為2424 ppm，氯離子(Chloride)含量 13%(w/w)。實施例4-5：換鹽步驟(NH ₄Cl)

於實施例3 得到的純化溶液(體積210 mL，濃度0.54 mg/mL)，加入氯化銨(molar ratio NH ₄Cl/第三胜肽= 2003/1)，溶解後進入反相C18矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體(112 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量2868 ppm，氯離子(Chloride)含量為13%(w/w)。實施例4-6：換鹽步驟(CaCl ₂)

於純化後溶液(體積205 mL，濃度0.6 mg/mL)，加入氯化鈣( molar ratio CaCl ₂/第三胜肽 = 2123/1)，溶解後進入反相C18矽膠管柱，以100%水沖提，利用UV220 nm的偵測元件監控收集沖提出的樣品，凍乾後得到白色固體(124 mg)為依特卡肽鹽酸鹽，其純度大於99.5%，單一不純物含量均小於0.1%，三氟乙酸殘留量1669 ppm。氯離子(Chloride)含量為12%(w/w)。比較例4-1至比較例4-3：換鹽步驟

比較例4-1至4-3係根據實施例4-1的方法進行，不同之處在於比較例4-1對於實施例3 得到的純化溶液並未加入含氯無機鹽進行換鹽步驟。比較例4-2對於實施例3得到的純化溶液則加入氯化鈉(molar ratio NaCl/第三胜肽 = 187/1)進行換鹽步驟。比較例4-3對於實施例3得到的純化溶液則加入氯化鈉(molar ratio NaCl/第三胜肽 = 1029/1)進行換鹽步驟。

實施例4-1至實施例4-6以及比較例4-1至比較例4-3換鹽步驟之比較如表3所示，其中TFA殘留量低於5000 ppm者，代表氯離子含量符合相關規範。

表3

換鹽步驟	換鹽後凍乾固體	產率
TFA殘留量(ppm)	Cl含量(wt.%)	式(III-1)的HCl數(m值)	換鹽及凍乾
比較例4-1	N/A	N/A	N/A	0%
比較例4-2	N/A	N/A	N/A	60%
比較例4-3	49557	11%	3.7	89%
實施例4-1	2509	12%	4.1	100%
實施例4-2	3650	13%	4.4	96%
實施例4-3	1764	13%	4.4	94%
實施例4-4	2424	13%	4.4	93%
實施例4-5	2868	13%	4.4	99%
實施例4-6	1669	12%	4.1	100%

實施例4-7：即時監控換鹽步驟

請參閱圖1A至圖1C，其係分別顯示本發明實施例4-2 (圖1A)、比較例4-1 (圖1B)及比較例4-2 (圖1C)進行即時監控換鹽步驟的HPLC圖譜，其中圖號101之箭頭所指波峰代表依特卡肽鹽酸鹽，圖號103之箭頭所指波峰代表依特卡肽TFA鹽，圖號105之箭頭所指波峰代表不純物，AU代表任意單位(arbitrary unit)。

由圖1A至圖1C的結果顯示，本發明方法確實能利用UV220 nm的偵測元件即時監控置換鹽類步驟，而且實施例可獲得產率高之依特卡肽鹽酸鹽(圖號101)，有利於量產。相較之下，比較例4-1幾乎偵測不到依特卡肽鹽酸鹽，只有大量的依特卡肽TFA鹽(圖號103)；而比較例4-2雖有部分的依特卡肽鹽酸鹽(圖號101)，但仍有大量依特卡肽TFA鹽(圖號103)。

請參閱圖2，其係顯示本發明實施例4-2經層析管柱純化步驟後之依特卡肽鹽酸鹽的HPLC圖譜，其中圖號201之箭頭所指代表依特卡肽鹽酸鹽的吸收波峰，圖2的相關數值則如表4所示。由圖2及表4的結果顯示，本發明方法所得的依特卡肽鹽酸鹽確實具有高純度(99.93%)。

表4

名稱	滯留時間(分鐘)	波峰高	面積	面積%
依特卡肽	22.392	698,055	13,532,688	99.93

綜言之，上述特定的胺基酸、特定的保護基、特定的處理步驟、特定組成的溶液系統、特定的分析模式或特定的評估方法僅用於例示說明依特卡肽鹽酸鹽之製造方法。然而，本發明所屬技術領域中具有通常知識者應可理解，在不脫離本發明的精神及範圍內，其他的胺基酸、其他的保護基、其他的處理步驟、其他組成的溶液系統、其他的分析模式或其他的評估方法亦可用於依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，並不限於上述。舉例而言，可使用其他方法製得之游離態第二胜肽進行偶聯反應以及即時監控換鹽步驟，以利於簡化製程及量產。

根據上述實施例，本發明的依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於第二溶液系統，後續利用不含鹽酸之第三溶液系統可使依特卡肽TFA鹽轉換為依特卡肽鹽酸鹽，不僅簡化製程，提供純度高且產率高之依特卡肽鹽酸鹽，更有利於依特卡肽鹽酸鹽的量產。

雖然本發明已以數個特定實施例揭露如上，但其他實施例亦有可能。因此，本發明後附請求項之精神及範圍不應限於這裡包含的實施例所述。

101、103、105、201：波峰

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之詳細說明如下： [圖1A]至[圖1C]係分別顯示本發明實施例4-2 (圖1A)、比較例4-1 (圖1B)及比較例4-2 (圖1C)進行即時監控換鹽步驟的HPLC圖譜。 [圖2]係顯示本發明實施例4-2經層析管柱純化步驟後之依特卡肽鹽酸鹽的HPLC圖譜。

201：波峰

Claims

一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，包含：進行一固相合成步驟，以獲得如式(I)所示之一第一胜肽，其中該第一胜肽之C端係固定於一固相支持物，式(I)之Ac代表乙醯基，X代表一第一側鏈保護基，且Y代表一第二側鏈保護基：Ac-D-Cys(X)-D-Ala-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Arg(Y)-D-Ala-D-Arg(Y)-NH-樹脂 (I)；利用一第一溶液系統去除該第一胜肽之該第一側鏈保護基(X)及該第二側鏈保護基(Y)，並使該第一胜肽脫離該固相支持物，以獲得如式(II)所示之一第二胜肽，其中該第一溶液系統係由三氟乙酸(TFA)、三異丙基矽烷(TIS)、乙二硫醇(EDT)及水所組成：Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH₂ (II)；在一第二溶液系統中使L-Cys(Z)-OH耦合至該第二胜肽之該D-Cys殘基並形成二硫鍵，以獲得依特卡肽TFA鹽，其中該依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於該第二溶液系統，且Z代表一側鏈活化基；以及利用一第三溶液系統對該依特卡肽TFA鹽進行一即時監控置換鹽類步驟，以獲得該依特卡肽鹽酸鹽，其中該第三溶液系統包括含氯無機鹽但排除鹽酸。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該第一側鏈保護基(X)為Trt，且該第二側鏈保護基(Y)為Pbf。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該固相支持物包括醯胺樹脂，且該第一胜肽之C端係固定於該醯胺樹脂之胺基。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該第二溶液系統包含低級烷基醚，且該低級烷基醚包含甲基第三丁基醚(MTBE)、二乙醚(DEE)、乙基第三丁基醚(ETBE)及叔戊基甲基醚(TAME)。
如請求項4所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該第二溶液系統更包含乙腈(ACN)、低級醇或上述之任意組合。
如請求項5所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該低級醇包含甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇(IPA)、1-丁醇、2-丁醇及第三丁醇(TBA)。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，在該即時監控置換鹽類步驟之前，更至少包含對該依特卡肽TFA鹽進行一層析管柱純化步驟。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中以該第三胜肽之當量數為1，該含氯無機鹽之當量數為至少1500。
如請求項1所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該含氯無機鹽包括NaCl、KCl、CaCl₂及NH₄Cl。
一種依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，包含：提供如式(II)所示之一第二胜肽，其中式(II)之Ac代表乙醯基，且該第二胜肽為游離態：Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH₂ (II)；利用一第二溶液系統進行一偶聯反應，使L-Cys(Z)-OH耦合至該第二胜肽之該D-Cys殘基並形成二硫鍵，以獲得依特卡肽TFA鹽，其中該依特卡肽TFA鹽係不溶或難溶於該第二溶液系統，且Z代表一側鏈活化基；以及利用一第三溶液系統對該依特卡肽TFA鹽進行一即時監控置換鹽類步驟，以獲得該依特卡肽鹽酸鹽，其中該第三溶液系統包括含氯無機鹽，該含氯無機鹽包括NaCl、KCl、CaCl₂及NH₄Cl但排除鹽酸。
如請求項10所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該第二溶液系統包含低級烷基醚，且該低級烷基醚包含甲基第三丁基醚(MTBE)、二乙醚(DEE)、乙基第三丁基醚(ETBE)及叔戊基甲基醚(TAME)。
如請求項11所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該第二溶液系統更包含乙腈(ACN)、低級醇或上述之任意組合。
如請求項12所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該低級醇包含甲醇、乙醇、1-丙醇、異丙醇(IPA)、1-丁醇、2-丁醇及第三丁醇(TBA)。
如請求項10所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中以該第三胜肽之當量數為1，該含氯無機鹽之當量數為至少1500。
如請求項10所述之依特卡肽鹽酸鹽之製造方法，其中該偶聯反應與該即時監控置換鹽類步驟之間，更包含對該依特卡肽TFA鹽進行一固液分離步驟以及一層析管柱純化步驟，以去除該第二溶劑系統並獲得該依特卡肽TFA鹽，其中該固液分離步驟包含一過濾步驟。