CN103517915B - 一种制备布舍瑞林的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过固相合成布舍瑞林树脂并在碱性条件下使肽链与树脂分离而制备布舍瑞林的方法。

Description

一种制备布舍瑞林的方法
技术领域
本发明涉及一种制备瑞林类药物的方法，更具体地，涉及一种固相合成瑞林类药物的方法。
背景技术
布舍瑞林是一种促黄体生成素释放激素类似物，短期小剂量给药用于治疗性功能低下、不排卵、青春期迟缓等；长期大剂量给药时，用于治疗一些激素依赖性疾病，如前列腺癌、子宫肌瘤、乳腺癌、子宫内膜异位症及青春期性早熟等。其不仅易吸收、生物利用度高、生物活性强，而且疗效显著，具有广阔的市场前景。
目前，其合成方法主要有液相合成和固相合成。其中，液相合成的反应和纯化步骤繁杂，造成生产率低，所以应用价值不高。固相合成是用树脂、玻璃等作为载体，使氨基酸以一定的顺序逐一偶联，延长肽链，然后使肽链与载体分离，得到全肽。固相合成克服了液相合成的上述缺点，成为合成肽类化合物的首选方法。传统的固相合成中，使肽链与载体分离通常采用酸裂解法，所用试剂为氢氟酸、三氟乙酸、三氟甲磺酸等，但是该条件通常会引起一些副反应，不仅会降低产率，而且还增加纯化难度，不利于生产。
发明内容
本发明的目的是提供一种通过在碱性条件下使固相合成的肽链与树脂分离而制备布舍瑞林的方法，包括：
1)使Fmoc-Pro-OH与羟基树脂在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中反应，生成Fmoc-Pro-树脂；
2)使Fmoc-Pro-树脂在有机碱的存在下脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中与Fmoc-Arg(R1)-OH偶联，重复脱Fmoc和偶联的步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(R2)-OH、Fmoc-Ser(R3)-OH、Fmoc-Trp(R4)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到肽树脂Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D—Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-树脂；
3)使肽树脂与乙胺在溶剂中反应，生成全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-NHEt；
4)使全保护肽脱除侧链，得到布舍瑞林；
其中
R1为H、NO2或HCl；
R2为H、2-ClTrt、4-NO2Z或Bzl；
R3为H或Trt；
R4为H或2-ClTrt。
本发明方法避免了现有技术中酸裂解法导致的副反应，进而提高了产率并降低了纯化难度。
具体实施方式
本文中，“替代度”指的是单位量的树脂负载的物质(例如苯甲酸或氨基酸等)的数量，单位为“mmol/g”。
本文中，“适量”表示所修饰的物质的用量对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，而且还可以一次添加或分多次添加，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制用量。
本文中，“适当时间”表示所修饰的时间对反应而言不是关键的，只要能达到所需目的即可，无需限于一个具体范围，本领域技术人员可以根据经验结合实际情况进行选择，例如通过检测反应终点来控制时间。
本文中出现的缩写所表示的中文含义列举在表1中。
表1.文中缩写的含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Trt 三苯甲基
tBu 叔丁基
Z 苯甲氧羰基
Bzl 苄基
DIC 二异丙基碳二亚胺
HOBT 1-羟基苯并三唑
TBTU O-苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸酯
HBTU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯
HOAT 1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
DEPBT 3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4-酮
PvBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
DMAP 4，4-二甲氨基吡啶
TMP 2，4，6-三甲基吡啶
DMAP 4-二甲胺基吡啶
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
TEA 三乙胺
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DCM 二氯甲烷
DMSO 二甲基亚砜
NMP N-甲基吡咯烷酮
THF 四氢呋喃
TFA 三氟乙酸
HPLC 高效液相色谱
Wang树脂 4-苄氧基苄基醇树脂
HMBA树脂 4-羟基甲基苯甲酰胺甲基苯基树脂
PAM树脂 4-羟甲基-苯基乙酰氨基甲基树脂
Fmoc-Pro-OH N-α-芴甲氧羰基-脯氨酸
Fmoc-Arg(NO2)-OH N-α-芴甲氧羰基-NO2-精氨酸
Fmoc-Leu-OH N-α-芴甲氧羰基-亮氨酸
Fmoc-D-Ser(tBu)-OH N-α-芴甲氧羰基-N’-叔丁基-丝氨酸
Fmoc-Tyr-OH N-α-芴甲氧羰基-酪氨酸
Fmoc-Ser(Trt)-OH N-α-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-丝氨酸
Fmoc-Trp-OH N-α-芴甲氧羰基-色氨酸
Fmoc-His(Trt)-OH N-α-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-组氨酸
Pvr-OH 焦谷氨酸
本发明提供了一种制备布舍瑞林的方法，包括：
1)使Fmoc—Pro—OH与羟基树脂在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中反应，生成Fmoc—Pro-树脂；
2)使Fmoc—Pro-树脂在有机碱的存在下脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中与Fmoc—Arg(R1)-OH偶联，重复脱Fmoc和偶联的步骤，依次偶联Fmoc—Leu—OH、Fmoc—D—Ser(tBu)-OH、Fmoc—Tyr(R2)-OH、Fmoc—Ser(R3)-OH、Fmoc—Trp(R4)-OH、Fmoc—His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到肽树脂Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D—Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-树脂；
3)使肽树脂与乙胺在溶剂中反应，生成全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D—Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-NHEt；
4)使全保护肽脱除侧链，得到布舍瑞林；
其中
R1为H、NO2或HCl，优选为H或NO2，更优选为NO2；
R2为H、2-ClTrt、4-NO2Z或Bzl，优选为H或2-ClTrt，更优选为H；
R3为H或Trt，优选为Trt；
R4为H或2-ClTrt，优选为H。
步骤1)：
在本发明的一些实施方案中，在步骤1)中，所述羟基树脂可为，但不限于，wang树脂、Pam树脂或HMBA树脂，其替代度可为0.05—2.0mmol/g，优选0.08-1.5mmol/g，更优选0.1-1.2mmol/g；步骤1)结束后，树脂的替代度可为0.05—2.0mmol/g，优选0.08-1.5mmol/g，更优选0.1—0.8mmol/g；可借助本领域技术人员的经验，根据树脂的用量、反应前的替代度以及所需的反应后的替代度来选择Fmoc-Pro-OH的用量；所述偶联剂体系可为本领域内常用的偶联剂体系，例如，但不限于，DIC/HOBT、HBTU/HOBT、TBTU/HOBT、HATU/HOAT、DEPBT/HOBT、PyBOP/HOBT或DIC/HOBT，优选DIC/HOBT、PyBOP/HOBT或TBTU/HOBT及其任意混合物，优选DIC/HOBT，其中基于参与偶联的游离氨基酸的摩尔量计，偶联剂各自的用量为0.05—5当量，优选0.1—3当量，更优选0.8-1.5当量；所述有机碱为常用于此目的的有机碱，例如，但不限于，TEA、TMP、DMAP、DIPEA、吡啶或哌啶及其混合物，优选DIPEA或DMAP，其用量通常为氨基酸摩尔数的0.005-2当量，优选0.01-1.5当量，更优选0.03-1当量；所述溶剂为常用于此目的的溶剂，例如，但不限于，DMF、DCM、DMSO、NMP、THF、乙酸乙酯、甲醇或乙醚及其任意混合物，优选DMF或DCM，溶剂的用量不受限制，适量即可。
在一些实施方案中，在步骤1)中，用适量溶剂使羟基树脂溶胀适当时间(例如，但不限于，5-60分钟，优选10-50分钟，更优选20-40分钟)；并将Fmoc-Pro-OH和偶联剂体系溶解于适量溶剂，优选地冷却至-20℃至20℃，优选-10℃至10℃，更优选-5℃至5℃，然后使其在碱的存在下于室温与经过溶胀的树脂反应适当时间(例如，但不限于，10分钟至10小时，优选30分钟至5小时，更优选1小时至4小时)，之后进行常规纯化处理；然后优选地在适量的上述有机碱的存在下用适量的酸酐(例如，但不限于甲酸酐、乙酸酐、丙酸酐、异丙酸酐或丁酸酐，优选乙酸酐)处理树脂，使酸酐与树脂中未与氨基酸反应的羟基反应适当时间(例如，但不限于，10分钟至5小时，优选20分钟至3小时，更优选30分钟至2.5小时)，抽干反应液，最后将产品干燥(优选真空干燥)。之后优选地通过分光光度法测量替代度。
步骤2)：
在一些实施方案中，在步骤2)中，使Fmoc脱除的试剂为步骤1)中所述的有机碱的溶液，优选体积浓度为5-90％，优选10-70％，更优选15-50％的哌啶的DMF溶液，其用量不受限制，适量即可；基于树脂上所负载的氨基酸的摩尔量计，参与偶联的游离氨基酸各自的用量为1.5-10当量，优选2-5当量，更优选2.5-4当量；步骤2)的偶联中所用的偶联剂体系、有机碱和溶剂及其用量如步骤1)中所述，其中溶剂优选DCM或DMF。
在一些实施方案中，在步骤2)中，用溶剂使Fmoc-Pro-树脂溶胀适当时间，然后用有机碱溶液使Fmoc保护基脱除，反应适当的时间后(优选进行两次以上脱除，每次反应5-60分钟，优选8-50分钟，更优选10-40分钟)，用溶剂洗涤，经茚三酮检测反应完全后，将氨基酸、偶联剂体系和溶剂的混合物置于-20℃至20℃，优选-10℃至10℃，更优选-5℃至5℃的温度下，然后使其于室温与上述经过溶胀的树脂反应适当时间(例如，但不限于0.5-10小时，优选1-5小时，更优选1.5-3小时)；经茚三酮检测反应完全后，交替重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(R1)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(R2)-OH、Fmoc-Ser(R3)-OH、Fmoc-Trp(R4)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-树脂。
步骤3)：
在一些实施方案中，在步骤3)中，乙胺溶液中的溶剂如步骤1)中所述，乙胺的体积浓度为5-95％，优选10-90％，更优选15-85％；其中乙胺溶液的用量为2-20mL/g树脂，优选5-15mL/g树脂，更优选8-12mL/g树脂；该反应在室温下进行适当时间(例如，但不限于，5-36h，优选10-30h，更优选15-25h)；反应之后用常规纯化方法对树脂进行后处理，得到全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-NHEt。
步骤4)：
在一些实施方案中，在步骤4)中，可采用本领域内常用于此目的的方法脱除侧链，例如在酸性或碱性条件下脱除侧链，还可优选地采用氢化还原法脱除侧链。采用氢化还原时，可在氢气加压(例如，但不限于，2-20个大气压，优选5-15个大气压，更优选8-12个大气压)下，于10-200℃，优选15-100℃，更优选20-50℃的温度下，在催化量的催化剂(常用于此目的的催化剂，例如铂碳、钯碳或雷尼镍，优选钯碳)的存在下于溶剂(常用于此目的的溶剂，例如水、甲醇或乙醇，优选甲醇)中使全保护肽反应适当时间(例如，但不限于，0.5-15小时，优选1—12小时，更优选3—10小时)；经HPLC检测反应完全之后，用常规纯化方法进行后处理，得到布舍瑞林粗肽。优选地，可采用所有常用于纯化粗肽的方法进一步纯化所得粗肽，例如借助HPLC、凝胶色谱或离子色谱，优选借助HPLC进行纯化，得到布舍瑞林精肽。
本文中，如无相反说明，则所述反应在常温常压下进行。
本发明中的宽泛的、优选的和更优选的定义和范围可以相互组合。
以下实施例用于解释本发明，而不是用于限制本发明。
实施例
Wang树脂、PAM树脂和HMBA树脂均购自天津南开和成(Wang树脂：交联度为1％，目数为100-200目；PAM树脂：交联度为1％，目数为100-200目；HMBA树脂：交联度为1％，目数为100-200目)；氨基酸均购自吉尔生化。
反应柱购自曙光玻璃仪器厂；离心机DR600购自北京京立离心机有限公司；PT600型HPLC，购自创新通恒。
实施例1：Fmoc-Pro-Wang树脂的合成
在50mL的反应柱中加入12.0g替代度为0.2mmol/g的Wang树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h；抽干反应液，优选地用适量DMF洗涤树脂，真空干燥，取样测其替代度为0.15mmol/g。
实施例2：Fmoc-Pro-Wang树脂的合成
在50mL的反应柱中加入4.8g替代度为0.5mmol/g的Wang树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.35mmol/g。
实施例3：Fmoc-Pro-Wang树脂的合成
在50mL的反应柱中加入2.4g替代度为1.0mmol/g的Wang树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.6mmol/g。
实施例4：Fmoc-Pro-HMBA树脂的合成
在50mL的反应柱中加入12.0g替代度为0.2mmol/g的HMBA树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.16mmol/g。
实施例5：Fmoc-Pro-HMBA树脂的合成
在50mL的反应柱中加入4.8g替代度为0.5mmol/g的HMBA树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.38mmol/g。
实施例6：Fmoc-Pro-HMBA树脂的合成
在50mL的反应柱中加入2.4g替代度为1.0mmol/g的HMBA树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.63mmol/g。
实施例7：Fmoc-Pro-PAM树脂的合成
在50mL的反应柱中加入12.0g替代度为0.2mmol/g的PAM树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.16mmol/g。
实施例8：Fmoc-Pro-PAM树脂的合成
在50mL的反应柱中加入4.8g替代度为0.5mmol/g的PAM树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶((13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.37mmol/g。
实施例9：Fmoc-Pro-PAM树脂的合成
在50mL的反应柱中加入2.4g替代度为1.0mmol/g的PAM树脂，加入适量DMF溶胀30分钟后抽干溶剂，再用适量DMF洗涤树脂。搅拌下将Fmoc-Pro-OH(2.13g，6.3mmol)和HOBT(1.02g，7.56mmol)加入DMF(10mL)和DCM(10mL)的混合溶剂，使固体完全溶解，然后加入DIC(0.98mL，6.3mmol)，室温下搅拌20分钟，然后将该混合物转移至反应柱中，并加入DMAP(29.3mg，0.24mmol)，鼓氮气反应3h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂，然后加入乙酸酐(16.2mL，180mmol)、吡啶(13.8mL，180mmol)，室温反应2h。抽干反应液，并用适量DMF洗涤树脂。真空干燥，取样测其替代度为0.65mmol/g。
实施例10：
Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Wang树脂的制备
将28.6g替代度为0.35mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-Wang树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Wang树脂45.2g。
实施例11
Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Wang树脂的制备
将16.7g替代度为0.60mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-Wang树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp—OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr—Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-Wang树脂32.8g。
实施例12：
Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-HMBA树脂的制备
将26.3g替代度为0.38mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-HMBA树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp—OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr—Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-HMBA树脂43.0g。
实施例13：
Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-HMBA树脂的制备
将15.9g替代度为0.63mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-HMBA树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp—OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr—Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-HMBA树脂32.7g。
实施例14：
Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-PAM树脂的制备
将27.0g替代度为0.37mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-PAM树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D—Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp—OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr—Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-PAM树脂43.5g。
实施例15：
Pyr-His(Trt)-Trp—Ser(Trt)-Tyr-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-PAM树脂的制备
将15.4g替代度为0.65mmol/g(10mmol)的Fmoc-Pro-PAM树脂加入反应器中，用适量DCM溶胀0.5小时，再用适量的20％哌啶/DMF脱除Fmoc适当时间，反应终点用茚三酮检测；用适量DCM洗涤后，将12.9gFmoc-Arg(NO2)-OH、4.9gHOBT和6.1mLDIC溶解于适量DCM(可以加入少量DMF助溶)，将所得混合物于冰水浴中冷却5分钟后，加入固相反应器中，室温反应2小时，反应终点用茚三酮检测。重复以上脱Fmoc和偶联步骤，依次偶联Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Ser(Trt)-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到Pyr-His(Trt)-Trp-Ser(Trt)-Tyr-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-PAM树脂32.1g。
实施例16：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为50％的乙胺/四氢呋喃溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，12.37g，收率89.5％。
实施例17：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为60％的乙胺/二氯甲烷溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，11.68g，收率84.8％。
实施例18：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为20％的乙胺/DMF溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，9.2g，收率67.2％。
实施例19：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为70％的乙胺/甲醇溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，8.52g，收率61.9％。
实施例20：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为60％的乙胺/乙醚溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，7.87g，收率57.2％。
实施例21：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为80％的乙胺/二氯甲烷溶液和实施例10中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，11.8g，收率86.2％。
实施例22：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为50％的乙胺/四氢呋喃溶液和实施例12中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，12.64g，收率92.1％。
实施例23：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为50％的乙胺/二氯甲烷溶液和实施例12中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，12.31g，收率89.6％。
实施例24：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为50％的乙胺/四氢呋喃溶液和实施例14中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，10.78g，收率78.5％。
实施例25：
Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的制备
将450mL体积浓度为50％的乙胺/二氯甲烷溶液和实施例14中得到的肽树脂45.2g加入到500mL圆底烧瓶中，室温搅拌24h，过滤树脂，收集滤液。用少量DCM洗涤树脂，合并滤液。滤液减压浓缩到60mL，将浓缩液缓慢加入600mL冰乙醚中沉淀。离心，用适量冰乙醚洗涤，减压干燥得到Pyr-His-Trp-Ser-Tyr(Bzl)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt，9.95g，收率72.4％。
实施例26：布舍瑞林粗肽的制备
将1g实施例24得到的全保护肽溶于10mL甲醇中，加入0.1mL甲酸和1g的10％钯碳，容器抽真空并用氮气置换空气，用氢气加压到10个大气压，室温反应6小时，用HPLC检测原料消失后，停止反应，滤掉钯碳，将滤液浓缩至2mL，加入到20mL冰乙醚中沉淀，离心，干燥，得到布舍瑞林粗肽0.85g，HPLC纯度84.3％。
实施例27：布舍瑞林精肽的制备
将12.0g布舍瑞林粗肽溶解于10％乙腈水溶液，过滤不溶物，采用创新通恒的PT600型HPLC(色谱柱：C18，10μ，5cm*25cm，检测波长：220nm，流动相A相：0.1％TFA水溶液，流动相B相：乙腈；梯度：10-40％，时间为30分钟)进一步纯化，用0.1％的醋酸体系转盐，得到6.0g精肽。纯度为99.8％，总收率为47.3％，ESI，m/z，C60H86N16O13Na+([M+Na]+)的计算值为1261.43，实测值为1261.56。

Claims (24)

1.一种制备布舍瑞林的方法，包括：
1)使Fmoc-Pro-OH与羟基树脂在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中反应，生成Fmoc-Pro-树脂；
2)使Fmoc-Pro-树脂在有机碱的存在下脱除Fmoc，然后使其在偶联剂体系和有机碱的存在下于溶剂中与Fmoc-Arg(R1)-OH偶联，重复脱Fmoc和偶联的步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(R2)-OH、Fmoc-Ser(R3)-OH、Fmoc-Trp(R4)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和Pyr-OH，得到肽树脂Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-树脂；
3)使肽树脂与乙胺在溶剂中反应，生成全保护肽Pyr-His(Trt)-Trp(R4)-Ser(R3)-Tyr(R2)-D-Ser(tBu)-Leu-Arg(R1)-Pro-NHEt；
4)使全保护肽脱除侧链，得到布舍瑞林；
其中
R1为NO2；
R2为H；
R3为Trt；
R4为H；
其中在步骤3)中，乙胺溶液中乙胺的体积浓度为5-95％；乙胺溶液的用量为2-20mL/g树脂。
2.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，乙胺溶液中乙胺的体积浓度为10-90％。
3.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，乙胺溶液中乙胺的体积浓度为15-85％。
4.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，乙胺溶液中乙胺溶液的用量为5-15mL/g树脂。
5.权利要求1的方法，其中在步骤3)中，乙胺溶液中乙胺溶液的用量为8-12mL/g树脂。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中步骤3)在室温下进行。
7.权利要求1至5任一项的方法，其中在步骤4)中，采用氢化还原法脱除侧链，其中所用催化剂为铂碳、钯碳或雷尼镍，反应在加压下于室温进行。
8.权利要求1至5任一项的方法，其中步骤4)中的布舍瑞林采用以下方法进行纯化：不良溶剂沉淀法、HPLC、凝胶色谱或离子色谱。
9.权利要求8的方法，其中所述方法为先用不良溶剂沉淀，再借助HPLC进一步纯化。
10.权利要求1至5任一项的方法，其中所用羟基树脂为Wang树脂、Pam树脂或HMBA树脂，其替代度为0.05-2.0mmol/g。
11.权利要求10的方法，其中所用羟基树脂的替代度为0.08-1.5mmol/g。
12.权利要求10的方法，其中所用羟基树脂的替代度为0.1-1.2mmol/g。
13.权利要求1至5任一项的方法，其中步骤1)结束后，树脂的替代度为0.05-2.0mmol/g。
14.权利要求13的方法，其中步骤1)结束后，树脂的替代度为0.08-1.5mmol/g。
15.权利要求13的方法，其中步骤1)结束后，树脂的替代度为0.1-0.8mmol/g。
16.权利要求1至5任一项的方法，其中在步骤1)中，Fmoc-Pro-OH与羟基树脂反应之后，用酸酐处理树脂。
17.权利要求16的方法，其中所述酸酐为甲酸酐、乙酸酐、丙酸酐、异丙酸酐或丁酸酐。
18.权利要求17的方法，其中所述酸酐为乙酸酐。
19.权利要求16的方法，其中在步骤1)中，Fmoc-Pro-OH与羟基树脂反应之后，在所述有机碱的存在下用酸酐处理树脂。
20.权利要求19的方法，其中所述酸酐为甲酸酐、乙酸酐、丙酸酐、异丙酸酐或丁酸酐。
21.权利要求20的方法，其中所述酸酐为乙酸酐。
22.权利要求1至5任一项的方法，其中在步骤2)中，使Fmoc脱除的试剂为体积浓度为5-90％的哌啶的DMF溶液。
23.权利要求22的方法，其中在步骤2)中，使Fmoc脱除的试剂为体积浓度为10-70％的哌啶的DMF溶液。
24.权利要求22的方法，其中在步骤2)中，使Fmoc脱除的试剂为体积浓度为15-50％的哌啶的DMF溶液。
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