CN111925415A - 一种维拉卡肽杂质的制备方法 - Google Patents

一种维拉卡肽杂质的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了5个维拉卡肽杂质的制备方法。5个杂质肽序结构分别为：杂质I：D‑Cys(Cys)‑D‑Ala‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Ala‑D‑Arg‑NH2；杂质II：Ac‑D‑Cys(Cys)‑D‑Ala‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Ala‑D‑Arg‑OH；杂质III：Ac‑D‑Cys(Cys(S＝O))‑D‑Ala‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Ala‑D‑Arg‑NH2；杂质IV：Ac‑D‑Cys(S＝O)(Cys)‑D‑Ala‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Arg‑D‑Ala‑D‑Arg‑NH2；杂质V：
Figure DDA0002625141560000011
采用本发明的制备方法可以获得高纯度的杂质样品，HPLC纯度均高于96.0％。本发明涉及的5个维拉卡肽杂质均为潜在降解杂质，为维拉卡肽原料药和维拉卡肽注射剂的质量研究提供可靠的杂质对照品，以确保产品质量。

Description

一种维拉卡肽杂质的制备方法
技术领域
本发明涉及一种活性多肽药物的杂质及其制备方法，尤其涉及杂质的制备方法。
背景技术
维拉卡肽(Etelcalcetide)是由AMGMN INC开发的一种新颖的拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物。2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv。临床数据表明维拉卡肽用于继发性甲状旁腺机能亢进时在降低甲状旁腺素水平方面与西那卡塞一样好，并且因其可在血液透析后静脉给药，优于现有的标准拟钙剂治疗药西那卡塞。
维拉卡肽主链由7个氨基酸组成，但均为非天然氨基酸D-型氨基酸，分别为4个D-Arg、2个D-Ala和1个D-Cys，侧链通过二硫键与L-半胱氨酸相连。维拉卡肽的肽序结构如下所示：
Figure BDA0002625141540000011
维拉卡肽肽序结构中含C端酰胺和N端乙酰基结构，在原料药生产和储存过程中可能水解产生杂质[Des-Ac]-维拉卡肽(杂质I)和[Arg7-OH]-维拉卡肽(杂质II)。维拉卡肽肽序结构通过二硫键将主链和L-Cys连接，在原料药生产和储存过程中可能发生过氧化而产生杂质[D-Cys(Cys(S＝O))]-维拉卡肽(杂质III)、[D-Cys1(S＝O)]-维拉卡肽(杂质IV)；同时，可能发生二硫键错配、聚合进而产生二聚体(杂质V)和胱氨酸(杂质VI)。
杂质研究是药物质量研究的一项重要内容，是药物质量保证的关键因素之一。为了提高临床用药安全，需对合成过程中产生的工艺杂质和储存过程中产生的降解杂质进行详细的研究。由于维拉卡肽化学结构特性，其在储存过程中可能产生降解杂质，而这些杂质可能引起过敏反应、毒性及其他不良反应。因此，需对维拉卡肽潜在的降解杂质进行定向的合成制备，用于维拉卡肽原料药和维拉卡肽注射液的质量研究，从而有效地保障和控制维拉卡肽的质量，为安全用药提供重要的指导意义。
发明内容
本发明所需解决的技术问题是提供一种维拉卡肽杂质的制备方法，该方法操作简单，所得杂质纯度高，能作为杂质对照品用于维拉卡肽原料药及制剂的质量研究，从而有效地保障和控制维拉卡肽产品的质量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
维拉卡肽杂质为杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]，其肽序结构分别为：
杂质I[Des-Ac]：D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质II[Arg7-OH]：Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH；
杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]：Ac-D-Cys(Cys(S＝O))-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质IV[D-Cys1(S＝O)]：Ac-D-Cys(S＝O)(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质V[二聚体]：
Figure BDA0002625141540000021
本发明还提供了上述杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]的制备方法。
具体地说，本发明所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的制备方法包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，即可得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质I粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]。
进一步，步骤1)所述的Rink Amide AM树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；
步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。
采用本发明的方法制得的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。
本发明所述的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的制备方法，包括如下步骤：
1)以Wang树脂为起始物料，溶胀后以DIC/HOBt为缩合试剂，以DMAP为催化剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Wang树脂上的羟基形成酯键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-Wang树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联moc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质II粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]。
进一步，步骤1)所述的Wang树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；
步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。
采用本发明的方法制得的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。
本发明所述的维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的制备方法，包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质III粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]。
进一步，步骤1)所述的Rink Amide AM树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；
步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。
采用本发明的方法制得的维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。
本发明所述的维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的制备方法，包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质IV粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]。
进一步，步骤1)所述的Rink Amide AM树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；
步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。
采用本发明的方法制得的维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。
本发明所述的维拉卡肽杂质V[二聚体]的制备方法，包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质V粗品溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质V[二聚体2]。
进一步，步骤1)所述的Rink Amide AM树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；
步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相氧化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
步骤3)中所述的反相高效液相色谱法纯化分离时，采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。
采用本发明的方法制得的维拉卡肽杂质V[二聚体]的HPLC纯度达到96％以上，经结构确认和标定后可作为杂质对照品，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究。
本发明还提供所述的维拉卡肽杂质结构确证方法及检测分析方法，分别采用HPLC和HPLC/MS对杂质进行结构确证和杂质分析分离。
具体地说，所述的杂质I[Des-Ac]的MS碎片峰：504.1(M+2H)/2、1006.3(M+H)，杂质II[Arg7-OH]的碎片峰：525.6(M+2H)/2、1049.2(M+H)，杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)，杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)和杂质V[二聚体]的碎片峰：620.3M+3H)/3、930.0(M+2H)/2。
具体地说，所述的杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]能与维拉卡肽能够有效分离，且各个杂质之间的分离效果较好。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明确定了维拉卡肽5个潜在降解杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]和杂质V[二聚体]，并通过定向合成获得高纯度的杂质样品，并开发分析方法对其进行有效分离，用于维拉卡肽原料药和制剂的质量研究，从而有效地保障和控制产品的质量。
上述描述和实施例中所采用的缩写及其代表如下：
Figure BDA0002625141540000061
Figure BDA0002625141540000071
附图说明：
图1为维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的HPLC纯度谱图；
图2为维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的质谱谱图；
图3为维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的HPLC纯度谱图；
图4为维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的质谱谱图；
图5为维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的HPLC纯度谱图；
图6为维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的质谱谱图；
图7为维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的HPLC纯度谱图；
图8为维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的质谱谱图；
图9为维拉卡肽杂质V[二聚体]的HPLC纯度谱图；
图10为维拉卡肽杂质V[二聚体]的质谱谱图；
图11为维拉卡肽杂质VI[胱氨酸]的HPLC纯度谱图；
图12为各个杂质与维拉卡肽原料药的分离谱图。
具体实施方式
为了更好的说明本发明，列举以下具体实施方式，所述的具体实施方式，在本领域内的技术人员可以借鉴本领域技术，适当改进工艺参数实现，都被视为包括在本发明。
实施例1：杂质I[Des-Ac]的制备
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加90ml DCM溶胀30min，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
偶联反应：称取19.46g Fmoc-Arg(pbf)-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于50mlDMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。
脱保护反应：加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
重复偶联反应和脱保护反应操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，经洗涤干燥后得到20.6g D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，即杂质I[Des-Ac]肽树脂。
将杂质I[Des-Ac]肽树脂加入250ml裂解试剂(三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到2L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，析出粗品固体，离心，洗涤离心，真空干燥后得到8.12g片段肽D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，即杂质I[Des-Ac]线肽。
加入8L纯化水，再入5.27g H-L-Cys-OH·HCl·H2O(3eq)，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～8.0，加入1ml 30％过氧化氢(3eq)，搅拌反应2～4h，即可得到维拉卡肽杂质I[Des-Ac]粗品溶液。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径
Figure BDA0002625141540000081
色谱柱规格为50mm*250mm。采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到1.24g维拉卡肽杂质I[Des-Ac]，HPLC纯度为97.11％，MS碎片峰：504.1(M+2H)/2、1006.3(M+H)。
实施例2：杂质II[Arg7-OH]的制备
称量12.5gWang树脂(10mmol，取代值为0.80mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加90mlDCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。
偶联反应：称取19.46g Fmoc-Arg(pbf)-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)、0.37g DMAP(0.3eq)溶解于50ml DMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应3～4h。抽干，DMF洗涤3次。
脱保护反应：加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
重复偶联反应和脱保护反应操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。加入50ml封闭试剂(DIEA/乙酸酐/DMF＝1/1/4)，控温20-30℃进行氮端乙酰化反应0.5-1.0小时，洗涤干燥后得到24.5g Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂，即杂质II[Arg7-OH]肽树脂。
杂质II[Arg7-OH]肽树脂加入240ml裂解试剂(三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到2.4L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，析出粗品固体，离心，洗涤离心，真空干燥后即可得到9.62g片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH，即杂质II[Arg7-OH]线肽。
加入10L纯化水，再入5.27g H-L-Cys-OH·HCl·H2O(3eq)，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～8.0，加入1ml 30％过氧化氢(3eq)，搅拌反应2～4h，即可得到维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]粗品溶液。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径
Figure BDA0002625141540000091
色谱柱规格为50mm*250mm。采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到1.12g维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]，HPLC纯度为98.20％，MS碎片峰：525.6(M+2H)/2、1049.2(M+H)。
实施例3：杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的制备
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
偶联反应：称取19.46g Fmoc-Arg(pbf)-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于50mlDMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。
脱保护反应：加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
重复偶联反应和脱保护反应操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH。得到Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink AmideAM树脂，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。加入50ml封闭试剂(DIEA/乙酸酐/DMF＝1/1/4)，控温20-30℃进行氮端乙酰化反应0.5-1.0小时，经洗涤干燥后得到19.8g Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，即杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]肽树脂。
杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]肽树脂加入200ml裂解试剂(三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到2.0L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤离心，真空干燥后即可得到8.5g片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]线肽。
加入8L纯化水，再入5.27g H-L-Cys-OH·HCl·H2O(3eq)，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～8.0，初次加入10ml过氧化氢溶液，之后隔天补加过氧化氢溶液，搅拌反应1～5天，即可得到维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗品溶液。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径
Figure BDA0002625141540000101
色谱柱规格为50mm*250mm。采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到1.04g维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]，HPLC纯度为96.39％，MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)。
实施例4：杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的制备
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
偶联反应：称取19.46g Fmoc-Arg(pbf)-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于50mlDMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。
脱保护反应：加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
重复偶联反应和脱保护反应操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH。得到Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink AmideAM树脂，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。加入50ml封闭试剂(DIEA/乙酸酐/DMF＝1/1/4)，控温20-30℃进行氮端乙酰化反应0.5-1.0小时，经洗涤干燥后得到20.5g Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，即杂质IV[D-Cys1(S＝O)]肽树脂。
将杂质IV[D-Cys1(S＝O)]肽树脂加入200ml裂解试剂(三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到2.0L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤离心，真空干燥后即可得到9.5g片段肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，即杂质IV[D-Cys1(S＝O)]线肽。
加入9L纯化水，再入5.27g H-L-Cys-OH·HCl·H2O(3eq)，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～8.0，初次加入10ml过氧化氢溶液，之后隔天补加过氧化氢溶液，搅拌反应1～5天，即可得到维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]粗品溶液。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径
Figure BDA0002625141540000111
色谱柱规格为50mm*250mm。采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，将用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到0.98g维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]，HPLC纯度为97.30％，MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)。
实施例5：杂质V[二聚体]的制备
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
偶联反应：称取19.46g Fmoc-Arg(pbf)-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于50mlDMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性，抽干，DMF洗涤3次。
脱保护反应：加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。
重复偶联反应和脱保护反应操作步骤，依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH。得到Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink AmideAM树脂，加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次，直至洗涤液的pH值＝6.5～7.0。加入50ml封闭试剂(DIEA/乙酸酐/DMF＝1/1/4)，控温20-30℃进行氮端乙酰化反应0.5-1.0小时，经洗涤干燥后得到18.6g Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂。
将上述肽树脂加入200ml裂解试剂(三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到2L0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤离心，真空干燥后即可得到线肽8.40g Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2。
加入1.5L纯化水，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～8.0，加入1ml过氧化氢溶液，搅拌反应1～4h，即可得到维拉卡肽杂质V[二聚体]粗品溶液。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径
Figure BDA0002625141540000122
色谱柱规格为50mm*250mm。采用20mmol/L磷酸二氢钠作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为220nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到6％，在60min内从6％升到20％直到洗脱结束，收集20min～30min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到0.89g维拉卡肽杂质V[二聚体]，HPLC纯度为98.02％，MS碎片峰620.3M+3H)/3、930.0(M+2H)/2。
试验例1、裂解试剂的选择
1、不同的裂解试剂对杂质I[Des-Ac]粗肽纯度及收率的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例1的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质I肽树脂。采用不同的裂解试剂对维拉卡肽杂质I肽树脂进行裂解反应，考察对其粗品质量及收率的影响，具体的实验数据如表1-1所示。
表1-1：不同的裂解试剂对杂质I[Des-Ac]粗品质量及收率的影响
Figure BDA0002625141540000121
从表1-1中可以发现：采用不同的裂解试剂体系对维拉卡肽杂质I[Des-Ac]肽树脂进行裂解，所得的杂质I[Des-Ac]粗品的质量和收率有明显的区别，本发明中选择的裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)裂解得到的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]粗品的纯度和收率均最高。
2、不同的裂解试剂对杂质II[Arg7-OH]粗肽纯度及收率的影响
本试验例以取代值为0.80mmol/g的Wang树脂为起始树脂，按照实施例2的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]肽树脂。采用不同的裂解试剂对维拉卡肽杂质II肽树脂进行裂解反应，考察对其粗品质量及收率的影响，具体的实验数据如表1-2所示。
表1-2：不同的裂解试剂对杂质II[Arg7-OH]粗品质量及收率的影响
Figure BDA0002625141540000131
从表1-2中可以发现：采用不同的裂解试剂体系对维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]肽树脂进行裂解，所得的杂质II[Arg7-OH]粗品的质量和收率有明显的区别，本发明中选择的裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)裂解得到的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]粗品的纯度和收率均最高。
3、不同的裂解试剂对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗肽纯度及收率的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例1的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质III肽树脂。采用不同的裂解试剂对维拉卡肽杂质III肽树脂进行裂解反应，考察对其粗品质量及收率的影响，具体的实验数据如表1-1所示。
表1-1：不同的裂解试剂对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗品质量及收率的影响
Figure BDA0002625141540000132
从表1-3中可以发现：采用不同的裂解试剂体系对维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]肽树脂进行裂解，所得的杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗品的质量和收率有明显的区别，本发明中选择的裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)裂解得到的维拉卡肽杂质粗品III[D-Cys(Cys(S＝O))]的纯度和收率均最高。
试验例2、反应溶液pH的影响
1、不同的反应溶液pH对杂质I[Des-Ac]粗肽质量的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例1的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质I肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质I线肽，考察反应pH对粗品质量的影响，具体的实验数据如表2-1所示。
表2-1：不同的反应溶液pH对杂质I[Des-Ac]粗品质量的影响
Figure BDA0002625141540000141
从表2-1中可以发现：采用双氧水对维拉卡肽杂质I[Des-Ac]构建二硫键反应时，不同的反应溶液pH值对杂质I[Des-Ac]粗品的质量有明显的影响，本发明中选择的反应溶液pH值＝7.0～8.0，氧化反应后所得的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]粗品的纯度最高。
2、不同的反应溶液pH对杂质II[Arg7-OH]粗肽质量的影响
本试验例以取代值为0.80mmol/g的Wang树脂为起始树脂，按照实施例2的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质II肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质II线肽，考察反应pH对粗品质量的影响，具体的实验数据如表2-2所示。
表2-2：不同的反应溶液pH对杂质II[Arg7-OH]粗品质量的影响
Figure BDA0002625141540000142
从表2-2中可以发现：采用双氧水对维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]构建二硫键反应时，不同的反应溶液pH值对杂质II[Arg7-OH]粗品的质量有明显的影响，本发明中选择的反应溶液pH值＝6.5～7.0，氧化反应后所得的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]粗品的纯度最高。
试验例3、纯化流动相体系对杂质纯度的影响
1、不同的纯化流动相体系对杂质I[Des-Ac]纯度的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例1的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质I肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对主链肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质I线肽，反应溶液pH＝7.0～8.0的条件下和H-L-Cys-OH·HCl·H2O采用双氧水进行氧化形成二硫键后得到杂质I[Des-Ac]粗品溶液，考察不同的纯化流动相体系对杂质I[Des-Ac]纯度的影响，具体的实验数据如表3-1所示。
表3-1：不同的纯化流动相体系对杂质I[Des-Ac]纯度的影响
Figure BDA0002625141540000151
从表3-1中可以发现：在20mm色谱柱上采用不同的流动相体系对杂质I[Des-Ac]粗品进行纯化，本发明中选择的纯化流动相体系(流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈)，经纯化后所得的杂质I[Des-Ac]的纯度最高，满足质量研究要求。
2、不同的纯化流动相体系对杂质II[Arg7-OH]纯度的影响
本试验例以取代值为0.80mmol/g的Wang树脂为起始树脂，按照实施例2的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质II肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质II线肽，反应溶液pH＝7.0～8.0的条件下和H-L-Cys-OH·HCl·H2O采用双氧水进行氧化形成二硫键后得到杂质II[Arg7-OH]粗品溶液，考察不同的纯化流动相体系对杂质II[Arg7-OH]纯度的影响，具体的实验数据如表3-2所示。
表3-2：不同的纯化流动相体系对杂质II[Arg7-OH]纯度的影响
Figure BDA0002625141540000152
Figure BDA0002625141540000161
从表3-2中可以发现：在20mm色谱柱上采用不同的流动相体系对杂质II[Arg7-OH]粗品进行纯化，本发明中选择的纯化流动相体系(流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈)，经纯化后所得的杂质II[Arg7-OH]的纯度最高，满足质量研究要求。
3、不同的纯化流动相体系对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]纯度的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例3的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质III肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质III线肽，反应溶液pH＝7.0～8.0的条件下和H-L-Cys-OH·HCl·H2O采用双氧水进行氧化后，得到杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗品溶液，考察不同的纯化流动相体系对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]纯度的影响，具体的实验数据如表3-3所示。
表3-3：不同的纯化流动相体系对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]纯度的影响
Figure BDA0002625141540000162
从表3-3中可以发现：在20mm色谱柱上采用不同的流动相体系对杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]粗品进行纯化，本发明中选择的纯化流动相体系(流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈)，经纯化后所得的杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的纯度最高，满足质量研究要求。
4、不同的纯化流动相体系对杂质IV[D-Cys1(S＝O)]纯度的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例4的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质IV肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质主IV线肽，反应溶液pH＝7.0～8.0的条件下和H-L-Cys-OH·HCl·H2O采用双氧水进行氧化后，得到杂质IV[D-Cys1(S＝O)]粗品溶液，考察不同的纯化流动相体系对杂质IV[D-Cys1(S＝O)]纯度的影响，具体的实验数据如表3-4所示。
表3-4：不同的纯化流动相体系对杂质IV[D-Cys1(S＝O)]纯度的影响
Figure BDA0002625141540000171
从表3-4中可以发现：在20mm色谱柱上采用不同的流动相体系对杂质IV[D-Cys1(S＝O)]粗品进行纯化，本发明中选择的纯化流动相体系(流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈)，经纯化后所得的杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的纯度最高，满足质量研究要求。
5、不同的纯化流动相体系对杂质V[二聚体]纯度的影响
本试验例以取代值为0.95mmol/g的Rink Amide AM树脂为起始树脂，按照实施例5的方法逐步偶联得到维拉卡肽杂质V肽树脂，采用裂解试剂体系(TFA:EDT:苯甲硫醚:H2O＝90:3:5:2)对肽树脂进行裂解后得到维拉卡肽杂质主V线肽，反应溶液pH＝7.0～8.0的条件下和H-L-Cys-OH·HCl·H2O采用双氧水进行氧化后，得到杂质V[二聚体]粗品溶液，考察不同的纯化流动相体系对杂质V[二聚体]纯度的影响，具体的实验数据如表3-5所示。
表3-5：不同的纯化流动相体系对杂质V[二聚体]纯度的影响
Figure BDA0002625141540000172
从表3-5中可以发现：在20mm色谱柱上采用不同的流动相体系对杂质V[二聚体]粗品进行纯化，本发明中选择的纯化流动相体系(流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈)，经纯化后所得的杂质V[二聚体]的纯度最高，满足质量研究要求。
试验例4、HPLC和HPLC/MS检测
1、HPLC检测
色谱条件：分析型高效液相色谱仪，流动相A：磷酸盐缓冲液：乙腈＝9：1。磷酸盐缓冲液的配制：称取磷酸二氢钾6.36g，二水合磷酸氢二钠3.56g(折算为无水磷酸氢二钠2.85g)，加水溶解至1000ml，用氢氧化钠或醋酸调节pH至6.5；流动相B：乙腈；色谱柱：选择phenomenex C18 3.6μm
Figure BDA0002625141540000183
4.6*150mm或效能相等的色谱柱；流速1.0ml/min，检测波长220nm；柱温40℃。按下表进行梯度洗脱。
Figure BDA0002625141540000181
按以上色谱条件进行加标实验，5个杂质、胱氨酸和维拉卡肽原料药之间有良好的分离效果(见附图12)
2、HPLC/MS检测
色谱柱：C18，waters 2.1*5mm；流速：0.3ml/min；波长：190-400nm；进样量2μl；流动相A：0.1％甲酸水，流动相B：0.1％甲酸乙腈；质谱条件：选择正离子化模式，运行时间为10min，质量数范围50-1250，推电压为15V，探头温度设定600℃，毛细管电压为0.8KV。按以下表进行梯度洗脱。
Figure BDA0002625141540000182
按以上质谱条件对5个杂质进行HPLC/MS检测，得到如下结果。
(1)维拉卡肽杂质I[Des-Ac]，MS碎片峰：504.1(M+2H)/2、1006.3(M+H)(见图1、图2)；
(2)维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]，MS碎片峰：525.6(M+2H)/2、1049.2(M+H)(见图3、图4)；
(3)维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]，MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)(见图5、图6)；
(4)维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]，MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)(见图7、图8)；
(5)维拉卡肽杂质V[二聚体]，MS碎片峰620.3M+3H)/3、930.0(M+2H)/2(见图9、图10)。

Claims (10)

1.维拉卡肽杂质，其特征在于，所述的维拉卡肽杂质为杂质I[Des-Ac]、杂质II[Arg7-OH]、杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]、杂质IV[D-Cys1(S＝O)]、和杂质V[二聚体]，其肽序结构分别为：
杂质I：D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质II：Ac-D-Cys(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH；
杂质III：Ac-D-Cys(Cys(S＝O))-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质IV：Ac-D-Cys(S＝O)(Cys)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2；
杂质V：
Figure FDA0002625141530000011
2.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质I[Des-Ac]的制备方法包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，即可得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到维拉卡肽杂质I直链肽肽：D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质I粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质I[Des-Ac]。
3.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]的制备方法包括如下步骤：
1)以Wang树脂为起始物料，溶胀后以DIC/HOBt为缩合试剂，以DMAP为催化剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Wang树脂上的羟基形成酯键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-OH-Wang树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联moc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Wang树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-OH，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质II粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离、再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质II[Arg7-OH]。
4.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的制备方法包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质III粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]。
5.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的制备方法包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，再与H-L-Cys-OH·HCl·H2O在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质IV粗肽溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质IV[D-Cys1(S＝O)]。
6.权利要求1所述的维拉卡肽杂质的制备方法，其特征在于，维拉卡肽杂质V[二聚体]的制备方法包括如下步骤：
1)以Rink Amide AM树脂为起始物料，溶胀、脱除Fmoc保护后以DIC/HOBt为缩合试剂，Fmoc-D-Arg(pbf)-OH的羧基与Rink Amide AM树脂上的氨基形成酰胺键，得到Fmoc-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护，以DIC/HOBt为缩合试剂，按照固相多肽合成法Fmoc/tBu合成策略依次偶联Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Arg(pbf)-OH、Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Cys(Trt)-OH，得到D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂，脱除Fmoc保护后，以DIEA/乙酸酐为封闭试剂进行氮端乙酰化，得到Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Rink Amide AM树脂；
2)用裂解试剂(三氟乙酸/苯甲硫醚/EDT/H2O)裂解切割肽树脂，用甲基叔丁基醚作为沉降试剂，得到直链肽Ac-D-Cys-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2，在液相中采用过氧化氢直接氧化偶联，得到维拉卡肽杂质V粗品溶液；
3)用反相高效液相色谱法纯化分离。再经浓缩、冻干后即得所述的维拉卡肽杂质V[二聚体]。
7.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述的Rink Amide AM树脂、Wang树脂的取代值为0.5～1.2mmol/g，优选0.8～1.0mmol/g；步骤2)中所述的裂解试剂为：三氟乙酸：乙二硫醇：苯甲硫醚：水＝90:3:5:2；液相环化反应时溶液pH值的范围为5.0～9.0，优选6.5～8.0，进一步优选为7.0～8.0。
8.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤3)流动相A：20mmol/L磷酸二氢钠，流动相B：乙腈。
9.根据权利要求1所述的维拉卡肽杂质，其特征在于，采用质谱对其进行结构确证，杂质I[Des-Ac]的MS碎片峰：504.1(M+2H)/2、1006.3(M+H)，杂质II[Arg7-OH]的碎片峰：525.6(M+2H)/2、1049.2(M+H)，杂质III[D-Cys(Cys(S＝O))]的MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)，杂质IV[D-Cys1(S＝O)]的MS碎片峰：533.1(M+2H)/2、1064.2(M+H)和杂质V[二聚体]的碎片峰：620.3M+3H)/3、930.0(M+2H)/2。
10.权利要求1所述的维拉卡肽杂质作为杂质对照品用于检测维拉卡肽原料药及制剂的质量。
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