CN116120426A - 一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，该方法将利拉鲁肽溶解于水中，用氨水调节pH值，加入氧化剂高氯酸反应生成利拉鲁肽氧化杂质；以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质中的利拉鲁肽；除去溶剂，得到利拉鲁肽氧化杂质样品溶液；冻干。本发明用利拉鲁肽为原料，加入氧化剂高氯酸反应生成利拉鲁肽氧化杂质；然后再用一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质中的利拉鲁肽本发明方法可以大大去除利拉鲁肽氧化杂质大部份的杂质及片段杂质；收集的样品纯度达95％，有效地提高了该利拉鲁肽氧化杂质成品纯度和收率。

Description

一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法
技术领域
本发明涉及肽纯化的领域，特别是一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法。
背景技术
中文名：利拉鲁肽
英文名：Liraglutide
利拉鲁肽氧化杂质是利拉鲁肽合成过程中产生的主要杂质中的一种，该杂质肽序列为：
H-His（O）-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-palMitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
分子式：C172H265N43O52 分子量：3764.95
结构式如下：
利拉鲁肽:
1智能降血糖，有别于传统口服降糖药和胰岛素的优势首先体现在它的降糖机理上：GLP-1是肠道细胞合成的一种多肽，它能够根据体内葡萄糖水平的高低“按需”调节胰岛素分泌，就像给胰腺装了个“开关”。当体内血糖过高时，它会将这一开关“打开”，释放胰岛素；而当血糖达到正常范围时，则“关闭”开关，使血糖停留在平稳的范围内，将低血糖发生的风险降到最低。
保护β细胞，主要优势还体现在具有保护胰岛β细胞功能的作用。β细胞功能的逐渐衰竭是导致糖尿病不断进展的“罪魁祸首”。现有的口服降糖药都不具备保护β细胞功能的作用，也就无法阻止糖尿病的进一步发展。在全球40多个国家的4000多名糖尿病患者中进行的LEAD研究证明，可以改善β细胞胰岛素分泌的数量和质量，因此有可能延缓糖尿病的发展进程。
每天仅需用药一次，除了在降血糖、减少低血糖事件、保护β细胞功能方面表现优异，还能够降低体重。同时，由于它能够降低收缩压，在降低心血管疾病的风险方面也发挥出优势。这无疑给2型糖尿病患者带来了意外的“惊喜”。此外，提供了最大的治疗灵活性，每天只需用药一次，且可在一天中任何时间给药，不受用餐时间限制，最大程度的方便了患者用药。
研究利拉鲁肽氧化杂质对利拉鲁肽的合成具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术的不足，提供一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，本发明经过一次HPLC纯化，提高了该利拉鲁肽氧化杂质的纯度和收率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特点是，所述利拉鲁肽氧化杂质为：H-His（O）-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-palMitoyl)-Glu-Phe-Ile-
Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，分离纯化方法括如下步骤：
步骤一，将利拉鲁肽溶解于水中，用氨水调节pH值到7.0±0.3，加入氧化剂高氯酸，在温度2-8℃反应生成利拉鲁肽氧化杂质；
步骤二，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质中的利拉鲁肽；
步骤三，除去溶剂，得到利拉鲁肽氧化杂质样品溶液；
步骤四，冻干。
本发明所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤一中在温度2-8℃反应68h，用HPLC和质谱监控反应，得到利拉鲁肽氧化杂质。
本发明所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤一中利拉鲁肽与氧化剂高氯酸的质量体积比为1：8－12g/ml。
本发明所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤二中，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.05%硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为220nm，进行第一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽氧化杂质样品的馏分；所述固定相的粒度为10μm，所述0.05%硫酸的制备方法为：取10L水，加5ml硫酸，混合均匀，用氨水调节pH值至2.5得到0.05%硫酸。
本发明所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤三中，用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到去利拉鲁肽氧化杂质样品溶液，样品溶液为酸性，用10%氨水水溶液调样品溶液pH值到7.0±0.3。
本发明所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤四中，通过冷冻干燥机冻干，冻干条件为：
本发明一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，步骤二中去除利拉鲁肽杂质片段杂质包括：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-palMitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH（即利拉鲁肽）。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：
本发明用利拉鲁肽为原料，加入氧化剂高氯酸反应生成利拉鲁肽氧化杂质；然后再用一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质中的利拉鲁肽；进一步通过优选十八烷基硅烷键合硅胶填料与流动相0.05%硫酸相结合，可以大大去除利拉鲁肽氧化杂质大部份的杂质及片段杂质；收集的样品纯度达95％。提高了该利拉鲁肽氧化杂质成品纯度和收率。
附图说明
图1是本发明利拉鲁肽氧化杂质粗品的HPLC图；
图2是本发明利拉鲁肽氧化杂质粗品的质谱图；
图3是本发明第一次HPLC纯化后利拉鲁肽氧化杂质的HPLC图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例：
一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，包括如下步骤：
步骤一，将5g利拉鲁肽溶解于1L水中，用氨水调节PH值到7.0±0.3，加入氧化剂50ml高氯酸，冷藏温度2-8℃反应68h，用HPLC和质谱监控反应。
步骤二，进行一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质片段杂质；
利拉鲁肽氧化杂质片段杂质包括：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-palMitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.05%硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为220nm，进行一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有去氨加压素杂质样品的馏分；固定相的粒度为10μm，所述0.05%硫酸的制备方法为：取10L水，加5ml硫酸，混合均匀，用氨水调节pH值至2.5得到0.05%硫酸。
步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到去利拉鲁肽氧化杂质样品溶液，样品溶液为酸性，用10%氨水水溶液调样品溶液pH值到7.0±0.3。
步骤四，冻干条件为：
本实施例制得的样品纯度达95％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于，所述利拉鲁肽氧化杂质为：H-His（O）-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(γ-Glu-palMitoyl)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH，分离纯化方法括如下步骤：
步骤一，将利拉鲁肽溶解于水中，用氨水调节pH值到7.0±0.3，加入氧化剂高氯酸，在温度2-8℃反应生成利拉鲁肽氧化杂质；
步骤二，以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，进行一次HPLC纯化，去除利拉鲁肽氧化杂质中的利拉鲁肽；
步骤三，除去溶剂，得到利拉鲁肽氧化杂质样品溶液；
步骤四，冻干。
2.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于：步骤一中在温度2-8℃反应68h，用HPLC和质谱监控反应，得到利拉鲁肽氧化杂质。
3.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于：步骤一中，利拉鲁肽与氧化剂高氯酸的质量体积比为1：8－12g/ml。
4.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于：步骤一中，利拉鲁肽与氧化剂高氯酸的质量体积比为1：10g/ml。
5.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于，步骤二中，以四烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以0.05%硫酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为220nm，进行第一次HPLC线性梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽氧化杂质样品的馏分；所述固定相的粒度为10μm，所述0.05%硫酸的制备方法为：取10L水，加5ml硫酸，混合均匀，用氨水调节pH值至2.5得到0.05%硫酸。
6.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于，步骤三中，用旋转蒸发器水浴温度在30~35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到去利拉鲁肽氧化杂质样品溶液，样品溶液为酸性，用10%氨水水溶液调样品溶液pH值到7.0±0.3。
7.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽氧化杂质的方法，其特征在于，步骤四中，通过冷冻干燥机冻干，冻干条件为：
。
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