JPH0525196A - 環状ペプチドの合成方法 - Google Patents
環状ペプチドの合成方法Info
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- JPH0525196A JPH0525196A JP20234091A JP20234091A JPH0525196A JP H0525196 A JPH0525196 A JP H0525196A JP 20234091 A JP20234091 A JP 20234091A JP 20234091 A JP20234091 A JP 20234091A JP H0525196 A JPH0525196 A JP H0525196A
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- cyclic peptide
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Abstract
(57)【要約】
【目的】主鎖が環状構造を有する環状ペプチドを、高純
度、高収率かつ短時間で合成する。 【構成】オキシム基を導入した樹脂からなる不溶性担体
を用いて固相法でペプチド鎖を形成し、次いで酸類とア
ミン類の存在下にペプチド鎖を不溶性担体から切り離す
と同時にペプチド鎖両末端間でペプチド結合を形成させ
る。
度、高収率かつ短時間で合成する。 【構成】オキシム基を導入した樹脂からなる不溶性担体
を用いて固相法でペプチド鎖を形成し、次いで酸類とア
ミン類の存在下にペプチド鎖を不溶性担体から切り離す
と同時にペプチド鎖両末端間でペプチド結合を形成させ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、主鎖が環状構造を有す
る環状ペプチドを効率的に合成する方法に関する。
る環状ペプチドを効率的に合成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】環状構造を有する環状ペプチドとして
は、環を構成する連鎖内にジスルフィド結合を有する環
状ペプチドと、環を構成する連鎖がペプチド結合のみか
らなる環状ペプチドがある。以下、環状ペプチドとは特
に後者の環状ペプチドをいう。
は、環を構成する連鎖内にジスルフィド結合を有する環
状ペプチドと、環を構成する連鎖がペプチド結合のみか
らなる環状ペプチドがある。以下、環状ペプチドとは特
に後者の環状ペプチドをいう。
【０００３】主鎖が環状構造を有するとは、基本的にα
炭素原子に結合したアミノ基とカルボキシル基のみで形
成されるペプチド結合の連鎖が環状構造を有しているこ
とをいう。従って、主鎖には末端が存在しない。以下、
このような主鎖が環状構造を有する環状ペプチドを「主
鎖環状ペプチド」という。
炭素原子に結合したアミノ基とカルボキシル基のみで形
成されるペプチド結合の連鎖が環状構造を有しているこ
とをいう。従って、主鎖には末端が存在しない。以下、
このような主鎖が環状構造を有する環状ペプチドを「主
鎖環状ペプチド」という。
【０００４】一方、側鎖が環状構造を有するとは、アミ
ノ酸側鎖のアミノ基あるいはカルボキシル基が関与して
形成されるペプチド結合の連鎖が環状構造を有している
ことをいう。従って、側鎖が環状構造を有する環状ペプ
チドは主鎖の少なくとも一方に末端が存在する。以下、
このような側鎖が環状構造を有する環状ペプチドを「側
鎖環状ペプチド」という。
ノ酸側鎖のアミノ基あるいはカルボキシル基が関与して
形成されるペプチド結合の連鎖が環状構造を有している
ことをいう。従って、側鎖が環状構造を有する環状ペプ
チドは主鎖の少なくとも一方に末端が存在する。以下、
このような側鎖が環状構造を有する環状ペプチドを「側
鎖環状ペプチド」という。
【０００５】上記のような種々の環状ペプチドは、生理
活性物質として知られているものがあり、そのような環
状ペプチドの医薬その他の用途の開発も進んでいる。従
って、種々の環状ペプチドの合成法の開発も望まれてい
る。
活性物質として知られているものがあり、そのような環
状ペプチドの医薬その他の用途の開発も進んでいる。従
って、種々の環状ペプチドの合成法の開発も望まれてい
る。
【０００６】従来、環状ペプチドは、まず前駆体となる
鎖状ペプチドを適当な方法で合成し、次いでその鎖状ペ
プチドを環化させることにより合成されていた。一般に
ペプチドの環化反応は、末端アミノ基を保護した鎖状ペ
プチドの他端のカルボキシル基を活性エステル化し、次
いでアミノ基を脱保護し、得られた鎖状ペプチド活性エ
ステルを大量の塩基性溶媒中に滴下することにより環化
させていた。
鎖状ペプチドを適当な方法で合成し、次いでその鎖状ペ
プチドを環化させることにより合成されていた。一般に
ペプチドの環化反応は、末端アミノ基を保護した鎖状ペ
プチドの他端のカルボキシル基を活性エステル化し、次
いでアミノ基を脱保護し、得られた鎖状ペプチド活性エ
ステルを大量の塩基性溶媒中に滴下することにより環化
させていた。
【０００７】環状化のための活性エステルとしては、p-
ニトロフェニルエステル（ONp)とN-ヒドロキシルスクシ
ンイミドエステル（ONSu）が用いられている。特にN-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルは、反応性が高く、温
和な条件で反応を行えるため利用例が多い。環化反応を
行う際、分子内縮合を促進するため高希釈条件下で反応
を行うが、二量体などの多量体環化物が副生しやすいこ
とが問題であった。また多くの場合、環化収率は低いの
で、未反応の鎖状ペプチドおよび多量体環化物を除くた
めの煩雑な精製操作を必要としていた。
ニトロフェニルエステル（ONp)とN-ヒドロキシルスクシ
ンイミドエステル（ONSu）が用いられている。特にN-ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルは、反応性が高く、温
和な条件で反応を行えるため利用例が多い。環化反応を
行う際、分子内縮合を促進するため高希釈条件下で反応
を行うが、二量体などの多量体環化物が副生しやすいこ
とが問題であった。また多くの場合、環化収率は低いの
で、未反応の鎖状ペプチドおよび多量体環化物を除くた
めの煩雑な精製操作を必要としていた。
【０００８】一方、固相法により環状ペプチドを合成す
ることができれば上記のような高希釈下の反応を行わな
くても多量体副生の割合は少ないと考えられる。
ることができれば上記のような高希釈下の反応を行わな
くても多量体副生の割合は少ないと考えられる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】固相法として、オキシ
ム基を導入した樹脂を不溶性担体として用いる固相法
（以下、オキシム樹脂法という）が知られている。オキ
シム樹脂法は、カイザー(E.T.Kaiser)により開発された
ペプチド合成法であり（W.F.DeGrado,E.T.Kaiser;J.Or
g.Chem.,45，1295-1300,1980）、アンカーリンケージが
活性エステルであるという特徴を有し、t-ブトキシカル
ボニル基（Boc 基）をα−アミノ基の保護基とするペプ
チド合成法により末端カルボキシル基が遊離型またはア
ミド型などの保護ペプチドフラグメントを得ることがで
きる。
ム基を導入した樹脂を不溶性担体として用いる固相法
（以下、オキシム樹脂法という）が知られている。オキ
シム樹脂法は、カイザー(E.T.Kaiser)により開発された
ペプチド合成法であり（W.F.DeGrado,E.T.Kaiser;J.Or
g.Chem.,45，1295-1300,1980）、アンカーリンケージが
活性エステルであるという特徴を有し、t-ブトキシカル
ボニル基（Boc 基）をα−アミノ基の保護基とするペプ
チド合成法により末端カルボキシル基が遊離型またはア
ミド型などの保護ペプチドフラグメントを得ることがで
きる。
【００１０】従来、オキシム樹脂法は保護ペプチドフラ
グメントを合成する方法として利用されてきたが、テイ
ラー(J.W.Taylor)らによりオキシム樹脂を用いる環状ペ
プチドの合成例が２例報告されている。
グメントを合成する方法として利用されてきたが、テイ
ラー(J.W.Taylor)らによりオキシム樹脂を用いる環状ペ
プチドの合成例が２例報告されている。
【００１１】第１の例（G.Osapay,A.Profit,J.W.Taylo
r;Tetrahedron Letters,31,(43),6121-6124,1990 ）に
おいては、ある環状ペプチドの合成において、オキシム
樹脂のオキシム基の大部分をブロックし、環化−脱離を
N,N−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下ジ
クロロメタン（DCM ）中で行なっている。即ち、0.5mmo
l 程度のアミノ酸を導入できるオキシム樹脂に0.1mmol
のアミノ酸を導入して残りのオキシム基をアセチル基で
ブロックし、ペプチド鎖を形成した後最終カップリング
アミノ酸の保護基を外し、その後アミノ基に対して1.5
当量のDIEAを加えてペプチドの環化−脱離をDCM 中24時
間で行なっている。その場合のペプチドの粗収率は55％
である。
r;Tetrahedron Letters,31,(43),6121-6124,1990 ）に
おいては、ある環状ペプチドの合成において、オキシム
樹脂のオキシム基の大部分をブロックし、環化−脱離を
N,N−ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の存在下ジ
クロロメタン（DCM ）中で行なっている。即ち、0.5mmo
l 程度のアミノ酸を導入できるオキシム樹脂に0.1mmol
のアミノ酸を導入して残りのオキシム基をアセチル基で
ブロックし、ペプチド鎖を形成した後最終カップリング
アミノ酸の保護基を外し、その後アミノ基に対して1.5
当量のDIEAを加えてペプチドの環化−脱離をDCM 中24時
間で行なっている。その場合のペプチドの粗収率は55％
である。
【００１２】しかし、この例においては、ペプチドの多
量化を抑制するためにオキシム基のブロックを必要と
し、そのためペプチド製造効率が低く、また上記の環化
−脱離条件では鎖状ペプチドアミド体や鎖状ペプチドア
セチル体が生成し易いという問題がある。
量化を抑制するためにオキシム基のブロックを必要と
し、そのためペプチド製造効率が低く、また上記の環化
−脱離条件では鎖状ペプチドアミド体や鎖状ペプチドア
セチル体が生成し易いという問題がある。
【００１３】第２の例(J.Am.Chem.Soc.1990,112,6046-6
051)は、側鎖環状ペプチドを合成した例であり、ペプチ
ド鎖を形成した後最終カップリングアミノ酸の保護基を
外し、その後アミノ基に対して10当量の酢酸を加えてペ
プチドの環化−脱離をDCM 中３日間で行なっている。そ
の場合のペプチドの粗収率は60％である。
051)は、側鎖環状ペプチドを合成した例であり、ペプチ
ド鎖を形成した後最終カップリングアミノ酸の保護基を
外し、その後アミノ基に対して10当量の酢酸を加えてペ
プチドの環化−脱離をDCM 中３日間で行なっている。そ
の場合のペプチドの粗収率は60％である。
【００１４】しかしこの例は環状ペプチドが側鎖環状ペ
プチドであり、しかも医薬原料を合成しようとする場
合、このような反応時間の長さは副反応の抑制という観
点からは望ましくない。さらに反応に長時間費やしてい
るにもかかわらず、収率が余り高くないことが問題であ
る。
プチドであり、しかも医薬原料を合成しようとする場
合、このような反応時間の長さは副反応の抑制という観
点からは望ましくない。さらに反応に長時間費やしてい
るにもかかわらず、収率が余り高くないことが問題であ
る。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこのような
状況に鑑み、オキシム樹脂を不溶性担体として用いた固
相法により主鎖環状ペプチドを合成する方法について検
討した。その結果、不溶性担体上に形成したペプチド鎖
を酸類とアミン類の存在下に環化−脱離させることによ
り、主鎖環状ペプチドを効率よく合成することができる
ことを見出した。本発明はこれを要旨とする下記発明で
ある。
状況に鑑み、オキシム樹脂を不溶性担体として用いた固
相法により主鎖環状ペプチドを合成する方法について検
討した。その結果、不溶性担体上に形成したペプチド鎖
を酸類とアミン類の存在下に環化−脱離させることによ
り、主鎖環状ペプチドを効率よく合成することができる
ことを見出した。本発明はこれを要旨とする下記発明で
ある。
【００１６】オキシム基が導入された樹脂からなる不溶
性担体を用いた固相法で不溶性担体上にペプチド鎖を形
成し、次いで酸類とアミン類の存在下にペプチド鎖を不
溶性担体から切り離すと同時にペプチド鎖両末端間でペ
プチド結合を形成させて環化することを特徴とする、主
鎖が環状構造を有する環状ペプチドの合成方法。
性担体を用いた固相法で不溶性担体上にペプチド鎖を形
成し、次いで酸類とアミン類の存在下にペプチド鎖を不
溶性担体から切り離すと同時にペプチド鎖両末端間でペ
プチド結合を形成させて環化することを特徴とする、主
鎖が環状構造を有する環状ペプチドの合成方法。
【００１７】不溶性担体へのオキシム基を導入は、例え
ば下記の文献に記載されているような公知の方法を使用
しうる。具体的には、例えば、フェニルカルボニルクロ
ライドやそのフェニル基に置換基が存在する類似のカル
ボニルクロライド等をポリスチレン系樹脂等からなる不
溶性担体のフェニル基に反応させてカルボニル基を形成
し、このカルボニル基をオキシム基（ケトオキシム基）
に変えて、オキシム基が導入された樹脂からなる不溶性
担体を得る。
ば下記の文献に記載されているような公知の方法を使用
しうる。具体的には、例えば、フェニルカルボニルクロ
ライドやそのフェニル基に置換基が存在する類似のカル
ボニルクロライド等をポリスチレン系樹脂等からなる不
溶性担体のフェニル基に反応させてカルボニル基を形成
し、このカルボニル基をオキシム基（ケトオキシム基）
に変えて、オキシム基が導入された樹脂からなる不溶性
担体を得る。
【００１８】本発明において使用する酸類としては、酢
酸は勿論、ギ酸、プロピオン酸、その他のカルボン酸を
使用することができる。更には、場合によって、カルボ
ン酸以外の酸を用いることもできる。アミン類として
は、１級アミン、２級アミン、３級アミンのいずれを使
用することもできる。例えば、モノアルキルアミン、ジ
アルキルアミン、トリアルキルアミン等（アルキル基と
しては炭素数４以下の低級アルキル基が好ましい）の脂
肪族アミンや、ピリジン、ピペリジン等の複素環状アミ
ンなどを使用することができる。特に好ましいアミン類
はトリアルキルアミン等の３級アミンである。
酸は勿論、ギ酸、プロピオン酸、その他のカルボン酸を
使用することができる。更には、場合によって、カルボ
ン酸以外の酸を用いることもできる。アミン類として
は、１級アミン、２級アミン、３級アミンのいずれを使
用することもできる。例えば、モノアルキルアミン、ジ
アルキルアミン、トリアルキルアミン等（アルキル基と
しては炭素数４以下の低級アルキル基が好ましい）の脂
肪族アミンや、ピリジン、ピペリジン等の複素環状アミ
ンなどを使用することができる。特に好ましいアミン類
はトリアルキルアミン等の３級アミンである。
【００１９】酸類とアミン類の使用量は、それぞれ不溶
性担体上のペプチドに対して１〜10当量が適当である。
特に好ましくは２〜４当量である。また、酸類とアミン
類の使用割合は、ほぼ等当量（特に 0.8〜1.2 当量）が
適当である。これにより、ほぼ中性の反応条件を設定す
ることができ、ペプチドの環化脱離反応速度を向上する
ことができた。
性担体上のペプチドに対して１〜10当量が適当である。
特に好ましくは２〜４当量である。また、酸類とアミン
類の使用割合は、ほぼ等当量（特に 0.8〜1.2 当量）が
適当である。これにより、ほぼ中性の反応条件を設定す
ることができ、ペプチドの環化脱離反応速度を向上する
ことができた。
【００２０】本発明における主鎖環状ペプチドは、前記
のように主鎖に末端を有しない環状のペプチドである。
この主鎖環状ペプチドは側鎖を有していてもよく、その
側鎖は主鎖と環状に結合していてもよい。この主鎖環状
ペプチドにおけるアミノ酸残基はα−アミノ酸、特にＬ
体のα−アミノ酸、の残基のみからなっていることが好
ましい。しかし、一部のアミノ酸残基は、Ｄ体のアミノ
酸残基であってもよく、またα−アミノ酸以外のアミノ
酸（β−アミノ酸やγ−アミノ酸など）のアミノ酸残基
であってもよい。
のように主鎖に末端を有しない環状のペプチドである。
この主鎖環状ペプチドは側鎖を有していてもよく、その
側鎖は主鎖と環状に結合していてもよい。この主鎖環状
ペプチドにおけるアミノ酸残基はα−アミノ酸、特にＬ
体のα−アミノ酸、の残基のみからなっていることが好
ましい。しかし、一部のアミノ酸残基は、Ｄ体のアミノ
酸残基であってもよく、またα−アミノ酸以外のアミノ
酸（β−アミノ酸やγ−アミノ酸など）のアミノ酸残基
であってもよい。
【００２１】主鎖環状ペプチドにおけるアミノ酸残基数
は特に限定されるものではないが、３〜30が適当であ
る。更に、アミノ酸残基数の多いペプチドの化学的合成
はきわめて煩雑でありかつ経済的ではないので、その上
限は20程度が好ましい。特に好ましいアミノ酸残基数は
４〜15である。
は特に限定されるものではないが、３〜30が適当であ
る。更に、アミノ酸残基数の多いペプチドの化学的合成
はきわめて煩雑でありかつ経済的ではないので、その上
限は20程度が好ましい。特に好ましいアミノ酸残基数は
４〜15である。
【００２２】なお、有用な主鎖環状ペプチドとしては、
例えば、本発明者らの発明に係わる特開平２-174797 号
公報記載の主鎖環状ペプチドや同特願平３-44386号明細
書記載の主鎖環状ペプチドがあるが、本発明における主
鎖環状ペプチドはこれらに限られるものではない。
例えば、本発明者らの発明に係わる特開平２-174797 号
公報記載の主鎖環状ペプチドや同特願平３-44386号明細
書記載の主鎖環状ペプチドがあるが、本発明における主
鎖環状ペプチドはこれらに限られるものではない。
【００２３】
【実施例】以下、本発明を実施例によって具体的に説明
するが、本発明はこの実施例に限られるものではない。
するが、本発明はこの実施例に限られるものではない。
【００２４】なお、以下の実施例においては、アミノ
酸、保護基、活性基などについてIUPAC-IUB Comission
on Biological Nomenclature に基づく慣用略号で表示
する。それらを例示すると下記の通りである。
酸、保護基、活性基などについてIUPAC-IUB Comission
on Biological Nomenclature に基づく慣用略号で表示
する。それらを例示すると下記の通りである。
【００２５】Asp（又は D）: アスパラギン酸
Arg（又は R）: アルギニン
Gly（又は G）: グリシン
D;F：D-フェニルアラニン
L：ロイシン
Orn：オルニチン
P：プロリン
Phg：フェニルグリシン
V：バリン
【００２６】Boc: t-ブトキシカルボニル
OBzl:ベンジルエステル
OcHex: シクロヘキシルエステル
Tos: p-トルエンスルホニル基
Z：ベンジルオキシカルボニル
Bop: ベンゾトリアゾル -1-イル -オキシ -トリス（ジ
メチルアミン）フォスフォニウムヘキサフルオロフォス
フェイト
メチルアミン）フォスフォニウムヘキサフルオロフォス
フェイト
【００２７】HOBt:p-ヒドロキシルベンゾトリアゾール
DCC:N,N- ジシクロヘキシルカルボジイミド
ONSu:N-ヒドロキシスクシンイミド
WSC・HCl: 1-エチル -3-（3-ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド塩酸塩 TFA: トリフルオロ酢酸 DIEA: N,N−ジイソプロピルエチルアミン HPLC:高性能液体クロマトグラフィー
カルボジイミド塩酸塩 TFA: トリフルオロ酢酸 DIEA: N,N−ジイソプロピルエチルアミン HPLC:高性能液体クロマトグラフィー
【００２８】［参考例］
オキシム樹脂の調製
オキシム樹脂の調製は前記カイザーらの文献に記載され
た方法を用いて下記のように行った。
た方法を用いて下記のように行った。
【００２９】バイオラッド社製 バイオビーズ S-X1
を 200ｇを入れた5000cm3 のナスフラスコに1500cm3 の
ジクロロメタン（DCM ）を加え、膨潤させた。次ぎに、
p-ニトロベンゾイルクロライド34ｇと塩化アルミニウム
34ｇを溶解したDCM 溶液2000cm3 を添加し、振り混ぜ
た。時々撹拌しながら40時間放置後、ガラスフィルター
で樹脂を濾取し、ジオキサン／４Ｎ塩酸（３：１）、ジ
オキサン／水（３：１）、ジメチルホルムアミド（DMF
）、およびメタノール（MeOH）（各4000cm3 ）で洗浄
した。更に、DCM 2000cm3 を加え膨潤させ、2000cm3 の
MeOHで洗浄し、吸引により溶媒を充分に除去した後、減
圧下乾燥させた。樹脂の収量は 221ｇであった。
を 200ｇを入れた5000cm3 のナスフラスコに1500cm3 の
ジクロロメタン（DCM ）を加え、膨潤させた。次ぎに、
p-ニトロベンゾイルクロライド34ｇと塩化アルミニウム
34ｇを溶解したDCM 溶液2000cm3 を添加し、振り混ぜ
た。時々撹拌しながら40時間放置後、ガラスフィルター
で樹脂を濾取し、ジオキサン／４Ｎ塩酸（３：１）、ジ
オキサン／水（３：１）、ジメチルホルムアミド（DMF
）、およびメタノール（MeOH）（各4000cm3 ）で洗浄
した。更に、DCM 2000cm3 を加え膨潤させ、2000cm3 の
MeOHで洗浄し、吸引により溶媒を充分に除去した後、減
圧下乾燥させた。樹脂の収量は 221ｇであった。
【００３０】得られた樹脂を 1800cm3のピリジン／エタ
ノール(EtOH)（１：５）に添加し、これにヒドロキシル
アミン塩酸塩 200ｇを加え、22時間還流した。ガラスフ
ィルターで濾取した樹脂を、MeOH／水（３：１）で２
回、DMF で１回、DCM で１回、MeOHで１回、DCM で１
回、MeOHで２回、各々1500cm3 の洗浄剤で順次洗浄し、
減圧下乾燥させてオキシム基が導入された樹脂（オキシ
ム樹脂）を得た。その樹脂の収量は 223ｇであった。
ノール(EtOH)（１：５）に添加し、これにヒドロキシル
アミン塩酸塩 200ｇを加え、22時間還流した。ガラスフ
ィルターで濾取した樹脂を、MeOH／水（３：１）で２
回、DMF で１回、DCM で１回、MeOHで１回、DCM で１
回、MeOHで２回、各々1500cm3 の洗浄剤で順次洗浄し、
減圧下乾燥させてオキシム基が導入された樹脂（オキシ
ム樹脂）を得た。その樹脂の収量は 223ｇであった。
【００３１】［実施例１］
オキシム樹脂法による環状ペプチド合成
Boc-Phg(0.5mmol)をDCM に溶解し、0.5mmol の DCCを加
えて氷冷下20分間撹拌した。生じたウレアを濾去し、あ
らかじめDCM で膨潤した 0.5ｇのオキシム樹脂を入れた
反応容器に入れ、一晩振とうした。DCM、 DCM/EtOH(1:
1)、 DCMで各２回ずつ洗浄し、減圧下溶媒を充分に除去
した。Gisin テストによりオキシム樹脂に導入されたBo
c-Phg の量を測定した結果、１ｇの樹脂当り0.5mmol で
あった。
えて氷冷下20分間撹拌した。生じたウレアを濾去し、あ
らかじめDCM で膨潤した 0.5ｇのオキシム樹脂を入れた
反応容器に入れ、一晩振とうした。DCM、 DCM/EtOH(1:
1)、 DCMで各２回ずつ洗浄し、減圧下溶媒を充分に除去
した。Gisin テストによりオキシム樹脂に導入されたBo
c-Phg の量を測定した結果、１ｇの樹脂当り0.5mmol で
あった。
【００３２】アミノ酸カップリングは以下のような方法
で行った。Boc基の除去は樹脂を25％ TFA/DCMで30分間
振とうすることにより行った。30分後、DCM ２回、ジイ
ソプロピルアルコール１回、DCM ４回の洗浄を行い、カ
イザーテストにより Boc基の除去を確認した。次に、カ
ップリングするアミノ酸３当量をDMF に溶解し、 Bop試
薬３当量を加え溶解させた。この DMF溶液を反応容器に
入れ、撹拌後、 6.5当量のDIEAを加えてさらに撹拌後、
30分間振とうして反応させた。反応後、 DMFで４回、DC
M で２回洗浄し、カイザーテストにより反応終了を確認
した。
で行った。Boc基の除去は樹脂を25％ TFA/DCMで30分間
振とうすることにより行った。30分後、DCM ２回、ジイ
ソプロピルアルコール１回、DCM ４回の洗浄を行い、カ
イザーテストにより Boc基の除去を確認した。次に、カ
ップリングするアミノ酸３当量をDMF に溶解し、 Bop試
薬３当量を加え溶解させた。この DMF溶液を反応容器に
入れ、撹拌後、 6.5当量のDIEAを加えてさらに撹拌後、
30分間振とうして反応させた。反応後、 DMFで４回、DC
M で２回洗浄し、カイザーテストにより反応終了を確認
した。
【００３３】上記の方法により、順に、Boc-Asp(OcHe
x)、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)をカップリングし、最後にB
oc-Arg(Tos)の Boc基を同様に除去し、カイザーテスト
によりその Boc基除去を確認した。オキシム樹脂上に形
成されたペプチドに対して酢酸とトリエチルアミンを２
当量(0.6mmol) ずつ DMFに加え、この DMF溶液を反応容
器に加えて15時間振とうした。
x)、Boc-Gly、Boc-Arg(Tos)をカップリングし、最後にB
oc-Arg(Tos)の Boc基を同様に除去し、カイザーテスト
によりその Boc基除去を確認した。オキシム樹脂上に形
成されたペプチドに対して酢酸とトリエチルアミンを２
当量(0.6mmol) ずつ DMFに加え、この DMF溶液を反応容
器に加えて15時間振とうした。
【００３４】反応後、樹脂を DMFで洗浄し、洗液を集め
て減圧濃縮した。残渣に水を加えて固化させ、これを濾
取して充分乾燥した。全収率は70％であった。これをHF
により脱保護してHPLC分析を行った。HPLC分析の結果の
チャートを図１に示す。この分析により、主ピークは主
鎖環状ペプチド(-R-G-D-Phg-) であり、その純度は約80
％であることを確認した。
て減圧濃縮した。残渣に水を加えて固化させ、これを濾
取して充分乾燥した。全収率は70％であった。これをHF
により脱保護してHPLC分析を行った。HPLC分析の結果の
チャートを図１に示す。この分析により、主ピークは主
鎖環状ペプチド(-R-G-D-Phg-) であり、その純度は約80
％であることを確認した。
【００３５】［比較例１］実施例１においてオキシム樹
脂上に形成されたペプチドの環化−脱離を、前記テイラ
ーらの報文に記載された方法で行なった。即ち、ペプチ
ドが結合しているオキシム樹脂を含む反応容器に、
（１）ペプチドに対し1.5 当量のDIEAを添加し15時間反
応させたところ、環状ペプチドの粗収率は10％であり、
また、（２）ペプチドに対し10当量の酢酸を添加し15時
間反応させたところ、環状ペプチドは得られなかった。
脂上に形成されたペプチドの環化−脱離を、前記テイラ
ーらの報文に記載された方法で行なった。即ち、ペプチ
ドが結合しているオキシム樹脂を含む反応容器に、
（１）ペプチドに対し1.5 当量のDIEAを添加し15時間反
応させたところ、環状ペプチドの粗収率は10％であり、
また、（２）ペプチドに対し10当量の酢酸を添加し15時
間反応させたところ、環状ペプチドは得られなかった。
【００３６】［比較例２］
液相法による環状ペプチド合成
比較のため液相法により主鎖環状ペプチド(-R-G-D-Phg
-) を合成した。カップリングは、 WSC・HClとHOBtを用
いて行い、反応後の後処理は常法に従い行った。また、
Boc基は、 TFAにより除去した。
-) を合成した。カップリングは、 WSC・HClとHOBtを用
いて行い、反応後の後処理は常法に従い行った。また、
Boc基は、 TFAにより除去した。
【００３７】まず、 Boc-Arg(Tos)1.5mmolとGly-OBzl
1.8mmolをカップリングした（収率75％）。さらにBoc-P
hg 、Boc-Asp(OcHex)を順にカップリングし、Boc-Asp(O
cHex)-Phg-Arg(Tos)-Gly-OBzlを得た（収率46％) 。
1.8mmolをカップリングした（収率75％）。さらにBoc-P
hg 、Boc-Asp(OcHex)を順にカップリングし、Boc-Asp(O
cHex)-Phg-Arg(Tos)-Gly-OBzlを得た（収率46％) 。
【００３８】Pd炭素を用いた接触還元によりベンジル基
を除去し（収率84％）、さらに WSC・HClによりカルボキ
シル基をONSu化した（収率77％）。 TFAにより Boc基を
除去した後、 DMFに溶解して55℃のピリジン（500cm3）
中に滴下した。滴下終了後、55℃で８時間反応させた。
反応終了後、減圧下溶媒を除去し、残渣に水を加え固化
した。水で洗浄、濾取した後充分に乾燥させた。全収率
は23.8％であった。
を除去し（収率84％）、さらに WSC・HClによりカルボキ
シル基をONSu化した（収率77％）。 TFAにより Boc基を
除去した後、 DMFに溶解して55℃のピリジン（500cm3）
中に滴下した。滴下終了後、55℃で８時間反応させた。
反応終了後、減圧下溶媒を除去し、残渣に水を加え固化
した。水で洗浄、濾取した後充分に乾燥させた。全収率
は23.8％であった。
【００３９】HFにより脱保護した後、得られたペプチド
のHPLC分析を行った。このHPLC分析の結果のチャートを
図２に示す。この分析により、主鎖環状ペプチド(-R-G-
D-Phg-) のピ−クは認められたが（ピ−ク２）、その純
度は50％以下であった。またピ−ク１を分取して、アミ
ノ酸分析と質量分析を行なった結果、これは直鎖状ペプ
チド（D-Phg-R-G ）であることが確認された。
のHPLC分析を行った。このHPLC分析の結果のチャートを
図２に示す。この分析により、主鎖環状ペプチド(-R-G-
D-Phg-) のピ−クは認められたが（ピ−ク２）、その純
度は50％以下であった。またピ−ク１を分取して、アミ
ノ酸分析と質量分析を行なった結果、これは直鎖状ペプ
チド（D-Phg-R-G ）であることが確認された。
【００４０】［実施例２］
グラミジンＳの合成
Boc-L をオキシム樹脂に0.42mmol/g導入し、実施例１と
同様に保護されたアミノ酸を順次カップリングして Boc
-(D;F-P-V-Orn(Z)-L)2−オキシム樹脂を合成した。 Boc
基を除去した後、DMF に各２当量のTEA と酢酸を加えて
反応容器に入れ、室温で15時間反応させた。反応終了後
樹脂をDMF で洗浄し、洗液を集めて減圧濃縮した。残渣
に水を加えて固化させ、これを濾取して十分乾燥した。
全収率は67％、HPLC分析の結果、その純度は約70％であ
った。
同様に保護されたアミノ酸を順次カップリングして Boc
-(D;F-P-V-Orn(Z)-L)2−オキシム樹脂を合成した。 Boc
基を除去した後、DMF に各２当量のTEA と酢酸を加えて
反応容器に入れ、室温で15時間反応させた。反応終了後
樹脂をDMF で洗浄し、洗液を集めて減圧濃縮した。残渣
に水を加えて固化させ、これを濾取して十分乾燥した。
全収率は67％、HPLC分析の結果、その純度は約70％であ
った。
【００４１】
【発明の効果】固相法を用い、高純度の主鎖環状ペプチ
ドを、高収率かつ短時間で合成することができる。
ドを、高収率かつ短時間で合成することができる。
【図１】実施例１で得られたペプチドのHPLC分析のチャ
ート
ート
【図２】比較例で得られたペプチドのHPLC分析のチャー
ト
ト
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 三原 久和
福岡県北九州市小倉北区城野町３−８−
406
Claims (4)
- 【請求項１】オキシム基が導入された樹脂からなる不溶
性担体を用いた固相法で不溶性担体上にペプチド鎖を形
成し、次いで酸類とアミン類の存在下にペプチド鎖を不
溶性担体から切り離すと同時にペプチド鎖両末端間でペ
プチド結合を形成させて環化することを特徴とする、主
鎖が環状構造を有する環状ペプチドの合成方法。 - 【請求項２】酸類とアミン類の使用量が、不溶性担体上
のペプチドに対してそれぞれ１〜10倍当量である、請求
項１の方法。 - 【請求項３】酸類とアミン類の使用割合が、ほぼ等当量
である、請求項２の方法。 - 【請求項４】環状ペプチドのアミノ酸残基数が３〜15で
ある、請求項１の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20234091A JPH0525196A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | 環状ペプチドの合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20234091A JPH0525196A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | 環状ペプチドの合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0525196A true JPH0525196A (ja) | 1993-02-02 |
Family
ID=16455921
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20234091A Withdrawn JPH0525196A (ja) | 1991-07-17 | 1991-07-17 | 環状ペプチドの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0525196A (ja) |
-
1991
- 1991-07-17 JP JP20234091A patent/JPH0525196A/ja not_active Withdrawn
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19981008 |