JP2011506376A - 固相及び溶液相の組み合わせ技術を使用したインシュリン分泌性ペプチド合成 - Google Patents
固相及び溶液相の組み合わせ技術を使用したインシュリン分泌性ペプチド合成 Download PDFInfo
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Abstract
Description
のアミノ酸配列を有する。
の天然の31アミノ酸長のペプチドGLP−1(7−37)はインシュリン分泌性であり、天然GLP−1の7(N末端)から37(C末端)の位置のアミノ酸を有する。GLP−1(7−37)は末端グリシンを有する。このグリシンが存在しない場合、結果として生じるペプチドは依然としてインシュリン分泌的に活性であり、配列番号3:
のGLP−1(7−36)と呼ばれる。
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)(配列番号6)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号6)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)(配列番号6)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号6)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;及び
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程i)により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)N末端保護基を除去して、(配列番号5)
式中、
Zは、H−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを与えること、
c)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
d)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供するために、第3のペプチドフラグメントを溶液中で第2のペプチドフラグメントに結合させること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第4のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)N末端保護基を除去して、(配列番号5)
式中、
Zは、H−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを与えること、
c)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
d)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供するために、第3のペプチドフラグメントを溶液中で第2のペプチドフラグメントに結合させること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第4のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;及び
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程i)により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
a)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
b)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
e)第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
a)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
b)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;及び
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
e)第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む。
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;及び
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程i)により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む、上の方法を提供する。
式中、
Zは、H−及びFmoc−から選択され;
B’は、−OH又は固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
式中、
Zは、H−及びFmoc−から選択され;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
を含む。
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;及び
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。
式中、
B’は、固相樹脂又は−OHであり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;及び
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
を有する上の方法に従って調製されるペプチドを提供する。
a)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
b)工程a)のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである
で産生させること、
を含む。
a)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むペプチドフラグメントを提供すること、
及び
b)工程a)のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、ペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである
で産生させること、
を含む。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
及び
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである
で産生させること、
を含む方法を提供する。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
及び
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである
で産生させること、
を含む方法を提供する。
a)(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを第2のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
及び
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
g)(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
を含む方法を提供する。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
及び
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
g)(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
h)N末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
を含む方法を提供する。
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
及び
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメントを溶液中(配列番号18)
式中、B’は、−OHである;
で産生させること、
g)(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
h)N末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
及び
i)アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;及び
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えるために、工程h)により得られたインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させること、
を含む方法を提供する。
式中、
Zは、H−及びFmoc−から選択され;
B’は、−OH又は固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;及び
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のペプチドを提供する。
(式中、位置8、10及び35の記号Xの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する)及びその対応物を合成するための方法論を提供する。X8、X10及び/又はX35残基のいずれかが、場合により、側鎖保護基を含みうる。この化学式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたX8及びX35残基が、位置8及び35で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然GLP−1(7−36)とは異なる。X10残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルX8、X10及びX35アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素のリンカーとしてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム1において示され、以下でさらに記載される本発明の合成経路を促進することも発見した。
(それは好ましくは(示す通り)C末端がアミド化されている)のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸(模式的に略語Aibにより示す)のアキラル残基をX8及びX35の両方として使用し、好ましくはC末端にアミドを有し、10の位置に天然Gの残基を使用し、式(Aib8,35)GLP−1(7−36)−NH2により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Aib」に対応するアミノ酸残基が、8及び35の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号12のペプチドがEP 1137667 B1において記載されている。8及び35の位置でのAib残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然GLP−1(7−36)ペプチドよりもずっと安定にする。
(式中、X8及びX10は上に定義する通りである)のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はX8及びX10残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の1つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント12は、C末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、N末端及び/又はC末端保護基を持ちうる。Fmocは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Trt(トリチル)も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Boc、CBz、DTS、Rdtc(R=アルキル又はアリール)、DBFmoc(2,7−ジ−t−ブチルFmoc)、Alloc、pNZ(p−ニトロベンジルエステル)、Nsc([[2−[(4−ニトロフェニル)スルホニル]エトキシ]カルボニル]−)、Msc(2−メチルスルホニルエトキシカルボニル)、及びMBz(4−メトキシCBz)も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基である。[(1−[1,1’−ビフェニル]−4−イル−1−メチルエトキシ)カルボニル]、[[2,2−ビス(4−ニトロフェニル)エトキシ]カルボニル]、[(フェニルメトキシ)カルボニル]、[(1,1−ジメチルプロポキシ)カルボニル]、[[(4−メトキシフェニル)メトキシ]カルボニル]は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基である。
のグリシンであるか又は10の位置にAib残基を含むその対応物である。配列番号7のペプチドフラグメントは、表示(Aib8)GLP−1(7−10)により表わしてよく、天然GLP−1(7−10)の8の位置の天然アラニンにおけるAibでの置換を記載する。
(式中、記号X17−18により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基(以下でさらに定義する)である)のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又は17及び18の位置にX17−18を含むその対応物である。フラグメント2は、天然GLP−1(7−36)ペプチドの11から22の位置におけるアミノ酸残基に一般的に対応するアミノ酸残基を含む(疑似プロリンジペプチド残基X17−18が、天然GLP−1(7−36)の対応する17及び18位置を占めるSS(Ser−Ser)残基の代わりに使用されることを除く)。
により表わしてよい。
式中、Φは任意のアミノ酸の残基を表わし、R1及びR2の各々は非依存的に適した二価の連結部分である。しばしば、R1は、化学式
(式中、R3及びR4の各々は非依存的に一価の部分(例えばHなど)、又は低級アルキル(例えばメチルなど)である)の二価の部分である。R3及びR4も環状構造の共通メンバーでありうる。望ましくは、R3及びR4の各々はメチルである。オキサゾリジニン(oxazolidinine)環−保護Serの場合において、R2は二価の部分CH2であり、Thrの場合において、R2は二価の部分(CH3)CHである。
(式中、Φ及びR2は上に定義された通りである)のジペプチド残基が提供される。フラグメント2に適用される通り、疑似プロリン残基は、好ましくは、Ser−Ser残基に対応し、ここでC末端により近接したSerは、オキサゾリジン環と共に保護され、以下:
の構造を有する。
(式中、X35は、上に定義する通りである)のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物、又はX35残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の1つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント3は、天然GLP−1(7−36)ペプチドの23から35の位置におけるアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を含む(X35が、35の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く)。フラグメント3は、表示(X35)GLP−1(23−35)により表わしてよい。
のAibであるか、又は35の位置にAibを含むその対応物である。配列番号10のペプチドフラグメントは、表示(Aib35)GLP−1(23−35)により表わしてよく、天然GLP−1(7−36)の35の位置の天然アミノ酸におけるAibでの置換を記載する。
(式中、X35を上に定義した通りであり、好ましくはAibであり、そしてX17−18は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である)にある。中間体フラグメントを表示(X17−18、X35)GLP−1(11−36)により命名してよい。アミノ酸が側鎖保護を持つ範囲では、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。
(式中、位置8、10及び35の記号Xの各々は、非依存的に、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基を表示する)及びその対応物を合成するための方法論を提供する。X8、X10及び/又はX35残基のいずれも、場合により、側鎖保護基を含みうる。この式のペプチドは、少なくとも、アキラル、場合により、立体障害されたX8及びX35残基が、位置8及び35で、天然アミノ酸残基で置換されている点で、天然GLP−1(7−36)とは異なる。X10残基は、天然アキラルグリシン又は別のアキラルアミノ酸に由来しうる。アキラルX8、X10及びX35アミノ酸の使用によって、結果として生じるペプチドの安定化が助けられるだけでなく、構築要素としてのこれらのアミノ酸の使用によって、スキーム1において示され、以下でさらに記載される本発明の容易な合成経路を促進することも発見されている。
(好ましくは(示す通り)C末端がアミド化されている)のペプチド及びその対応物を含む。このペプチドでは、アルファ−アミノイソ酪酸(模式的に略語Aibにより示す)のアキラル残基をX8及びX35の両方として使用し、好ましくはC末端にアミドを有し、10の位置に天然Gの残基を使用し、式(Aib8,35)GLP−1(7−36)−NH2により命名してよい。この表示は、アミノ酸「Aib」に対応するアミノ酸残基が、8及び35の位置で天然アラニンの代わりに現れることを示す。アキラルアルファ−アミノイソ酪酸はまたメチルアラニンとして公知である。配列番号4のペプチドがEP 1137667 B1において記載されている。8及び35の位置でのAib残基の存在によって、身体における代謝的分解が減速し、このペプチドを、身体において、天然GLP−1(7−36)ペプチドよりもずっと安定にする。
(式中、X8及びX10は上に定義する通りである)のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメントであるか、又はX8及びX10残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の1つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。一部の実施態様において、ペプチドフラグメント12は、C末端を介して結合された樹脂でよい。このフラグメントは、場合により、N末端及び/又はC末端保護基を持ちうる。Fmocは、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Trt(トリチル)も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基であることが見出されている。Boc(t−ブチルオキシカルボニル)、CBz(ベンジルオキシカルボニル又はZ)、Dts(ジチアスクシノイル(dithiasuccinoyl))、Rdtc(R=アルキル又はアリール、dtc=ジチオカルバメート)、DBFmoc(2,7−ジ−t−ブチルFmoc又は1,7−ジ−t−ブチルフルオレン−9−イルメトキシカルボニル)、Alloc(アリルオキシカルボニル)、pNZ(p−ニトロベンジルオキシカルボニル)、Nsc([[2−[(4−ニトロフェニル)スルホニル]エトキシ]カルボニル])、Msc(2−メチルスルホニルエトキシカルボニル)、及びMBz(4−メトキシCBz)も、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基である。Bpoc[(1−[1,1’−ビフェニル]−4−イル−1−メチルエトキシ)カルボニル]、Bnpeoc[[2,2−ビス(4−ニトロフェニル)エトキシ]カルボニル]、CBz[(フェニルメトキシ)カルボニル]、Aoc[(1,1−ジメチルプロポキシ)カルボニル]、及びMoz[[(4−メトキシフェニル)メトキシ]カルボニル]は、ペプチドフラグメントの固相合成及び溶液相又は固相結合に関して特に有用なN末端ヒスチジン保護基である。
のグリシンである。
又は10の位置にAib残基を含むその対応物である。配列番号28のペプチドフラグメントは、表示(Aib8、X17−18)GLP−1(7−27)により表わしてよく、天然GLP−1(7−36)の8の位置の天然アラニンにおけるAibでの置換を記載する。記号X17−18により表示される残基は、疑似プロリンのジペプチド残基(以下でさらに定義する)、又は17及び18の位置にX17−18を含むその対応物である。
のペプチドフラグメント2は、表示(X17−18)GLP−1(11−27)により呼んでよく、17及び18の位置のSer−Ser残基についてX17−18疑似プロリン残基での置換を記載する。
(式中、X35は、上に定義する通りである)のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はX35残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の1つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント3は、天然GLP−1(7−36)ペプチドの28から35の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む(X35が、35の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く)。配列番号30のフラグメント3は、表示(X35)GLP−1(28−35)により表わしてよい。
のAibである。
又は35の位置にAibを含むその対応物である。配列番号31のペプチドフラグメントは、表示(Aib35)GLP−1(28−35)により表わしてよく、天然GLP−1(7−36)の35の位置の天然アミノ酸におけるAibでの置換を記載する。
(式中、X35は上に定義する通りである)のフラグメント3’は、配列番号32のアミノ酸残基を含むペプチドフラグメント、又はその対応物であるか、又はX35残基を含むその対応物である。アミノ酸残基の1つ又は複数は、従来の実行に従い、側鎖保護基を含んでよい。フラグメント3’は、天然GLP−1(7−36)ペプチドの28から36の位置におけるアミノ酸に対応するアミノ酸残基を含む(X35が、35の位置の天然アミノ酸残基の代わりにその位置にあることを除く)。配列番号32のフラグメント3’は、表示(X35)GLP−1(28−36)により表わしてよい。
(式中、X35は上に定義する通りであり、好ましくはAibである)の中間体フラグメント3’を産生することを示す。好ましくは、この方法でペプチドフラグメントに加えられたArgは、側鎖保護を含まない。
であり、表示(X17−18、X35)GLP−1(11−36)により命名され、次にフラグメント3’に溶液相中で結合させる。他のアミノ酸が側鎖保護を持つ範囲で、この保護は望ましくはこの工程を通じて維持される。フラグメント1+2+3を組み入れる、配列番号26:
の所望のペプチドを次に形成させて、式中、好ましい実施態様において、X8はAibであり、X10は天然Gであり、そしてX17−18は上に定義する疑似プロリンジペプチド残基である。
a)アッセイ(%−mm)*(100−ジベンゾフルベンの量(%面積))/[質(%面積)]又は
b)主成分及び全てのペプチド性不純物の合計(%−(w/w))−ジベンゾフルベン(%−(mm))(ペプチドと同じ応答係数)。
実施例1〜18は、スキーム1において記載される結合反応スキーム及び本明細書におい定義されるフラグメント1、2、3、及び3’に関する。
N末端でのFmos保護、ならびにHis及びGluでの側鎖保護を用いたフラグメント1の固相合成
A.Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂の調製
最初に、Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
この実施例1のパートAにおいて調製された、0.18mmol/gで添加された20.0gのFmoc−Gly−2−CTC樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、DCM(200mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で5容積)。
この実施例のパートBにおいて使用される全ての試薬を、以下の表に列挙する:
上述の構築されたパートBからの樹脂を、DCM(使用された樹脂の重量と比べて12.5容積;12.5mlのDCM/樹脂のg又は12.5リットル/kg)中で30分間、25℃で膨潤させて、そして次に、DCMで2回洗浄し(各々の洗浄で6.25容積)、NMP残基を除去した。樹脂を、最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% TFA/DCMの冷溶液(10容積、−5℃〜−10℃)を加えて、30分間、0℃で撹拌した。ピリジン(TFAの1.3当量)をリアクターに加えて、TFAを中和した。切断溶液をろ過除去して、フラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCMで7回(7.5容積)洗浄した。洗浄液を切断溶液と合わせた。DCM切断溶液を水(7.5容積)と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。ペプチドフラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。合計4.73gのFmoc−(Aib8)GLP−1(7−10)−OHが得られた。
A.Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂の調製
Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
0.54mmol/gで添加された27.59gのFmoc−Gly−2−CTC樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、DCM(300mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂をNMPで3回洗浄した(各々の洗浄で5容積)。
構築された樹脂を、NMP(5容積)で6回、そして次にDCM(6容積)で8回洗浄して、NMP残基を除去した。樹脂を、最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させた後、1% TFA/DCMの冷(−5℃〜−10℃)溶液(10容積)を加えて、結果として生じたポット混合物を30分間、0℃で撹拌した。ピリジン(TFAの1.3当量)をリアクターに充填して、TFAを中和した。切断溶液をフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCM(7.5容積)で11回洗浄し、切断溶液中に排出させた。DCM溶液を水(10容積)と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。合計11.12gのFmoc−(Aib8)GLP−1(7−10)−OH(78.8%収率)が得られた。
A.Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂の調製
Fmoc−Gly−添加2CTC樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
0.72mmol/gで添加された24.43gのFmoc−Gly−2−CTC樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、DCM(250mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂をNMPで3回洗浄した(各々の洗浄で5容積)。
構築された樹脂を、NMP(5容積)で6回、そしてDCM(6容積)で7回洗浄して、NMPを除去した。樹脂を、最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、樹脂床を、1% TFA/DCMの冷(−5℃〜−10℃)溶液(11.26容積)で5分間、0℃で洗浄した。切断溶液をフラスコ中に回収して、そこにはピリジン(全TFAの1.3当量)が、TFAを中和するために加えられていた。次に、冷1% TFA/DCM(6.14容積)の第2の部分がリアクターに加えられ、2分間、撹拌された。第2の切断溶液を、再び、回収フラスコ中に排出させた。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCM(8.2容積)で9回洗浄し、切断溶液中に排出させた。DCM溶液を水(8.2容積)と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。合計14.02gの配列番号7のFmoc−(Aib8)GLP−1(7−10)−OH(86.6%収率)が得られた。分析は純度94.3% ANを示した。
Fmoc−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−OH
GPAフラグメント2の固相合成
0.43mmole/gで添加された20.0gのH−Gly−2−CT樹脂を用いて開始し、Fmoc−AA(11−22)−OHの固相合成を行った。樹脂を、DCM(200mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で6容積)。容積の全てのスケーリングは、最初の樹脂重量(20.0g)又は樹脂上の添加アミノ酸のモル数(8.6mmole)と比べてである。
上述の構築された樹脂を、最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% v/v TFA/DCMの冷溶液(10容積、−5℃〜−10℃)を加えて、0℃で撹拌した。ピリジン(TFAと比べて1.38当量)を切断レシーバーに加えて、TFAを中和させた。30分間の撹拌後、切断溶液を切断レシーバー中に回収した。次に、1% TFA/DCMの別の冷溶液(5容積、−5℃〜−10℃)を加えて、30分間、0℃で撹拌した。ピリジン(TFAへ1.38当量)を切断容器に加えて、TFAを中和した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCMで6回(6容積)洗浄し、切断溶液レシーバー中に排出させた。結果として生じるDCM切断及び洗浄溶液を濃縮させて(7.5容積)、そして次に水(5容積)と合わせた。底のDCM層をさらに濃縮させて(1.5容積)、ヘプタン(20容積)中に入れ、産物を析出させた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、残りのDCMを除去した(350〜100トール、25℃)。フラグメント2が、DCM除去時にヘプタンから析出した。フラグメント2をへプタンで洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。合計14.35gのGPA Fmoc−AA(11−22)−OH(純度88.4% AN)が得られた(収率85.5%)。
上のバッチ構築を繰り返した。構築された樹脂からのフラグメント2の切断後、DCM溶液を7.5容積まで濃縮して、水(各々5容積で3回)で洗浄した。底のDCM層を3.75容積まで再び濃縮した。このDCM溶液を水(20容積)と合わせて、残りのDCMを、真空下で、25℃で除去した。析出産物を次にろ過し、真空下で、35℃で乾燥させた。これは、14.95gのフラグメント2(89%収率、93.1% AN純度)を与えた。
側鎖保護されたFmoc−(Aib35)GLP−1(23−35)−OH(フラグメント3)の固相合成:
A.Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂の調製
Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂を調製した。使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
10.01gのFmoc−Aib−2−CTC樹脂(添加係数0.24mmol/g)を反応容器に充填して、DCM(120mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で6容積)。
上述の構築された樹脂6.6gを、10×容積のDCM中で30分間、膨潤させて、そして−10℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% TFA/DCMの冷溶液(12容積、−5℃〜−10℃)を加えて、30分間、0℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン(TFAの2〜3当量)を含むフラスコ中に回収した。25℃まで温めながら、樹脂を1% TFA/DCM(10×容積)と5分間撹拌し、ピリジン(2〜3当量)を加えた。さらに5分後、溶液を回収した。樹脂をDCMで4回(10容積)洗浄した。全てのDCM洗浄液を水と合わせた(水/DCM=1/4)。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを水で洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。切断手順をもう1回繰り返した。合計2.36gのFmoc−(Aib35)GLP−1(23−35)−OHが得られた(92%収率)。
A.Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂の調製
Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂を調製した。この実施例において使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
0.30mmole/gで添加された15.0gのFmoc−Aib−2−CTC樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、DCM(150mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂をDCM(各々の洗浄で6容積)で2回、そしてNMP(各々の洗浄で6容積)で3回洗浄した。
上述の構築された樹脂を、DCMで7回洗浄し(各々の洗浄で6容積)、NMP残基を除去し、樹脂を最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% TFA/DCMの冷溶液(12容積、−5℃〜−10℃)を加えて、30分間、0℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン(TFAの1.3当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCM(10容積)で9回洗浄し、切断溶液中に排出させた。DCM溶液を水(6容積)と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。この実施例では、切断手順をもう1回繰り返した。合計6.78gのFmoc−(Aib35)GLP−1(23−35)−OHが得られた(68.1%収率)(純度87.3% AN)。
A.Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂の調製
Fmoc−Aib−添加2CTC樹脂を調製した。この実施例において使用された試薬の量を以下の表に列挙する:
0.37mmole/gで添加された25.0gのFmoc−Aib−2−CTC樹脂を用いて開始し、固相合成を行った。樹脂を、DCM(250mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂をDCM(各々の洗浄で6容積)で2回、そしてNMP(各々の洗浄で6容積)で3回洗浄した。
上述の構築された樹脂を、DCMで6回洗浄し(各々の洗浄で6容積)、NMPを除去し、樹脂を最後のDCM洗浄液を用いて−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% TFA/DCMの冷溶液(10容積、−5℃〜−10℃)を加えて、30分間、0℃で撹拌した。切断溶液を、ピリジン(TFAの1.3当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCMで7回(6容積)洗浄し、切断溶液中に排出させた。DCM溶液を水(10容積)と合わせた。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350トール、28℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントを洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。この実施例では、切断手順をもう1回繰り返して、完全な切断を達成した。合計12.36gのFmoc−(Aib35)GLP−1(23−35)−OHが得られた(59.35%収率)(純度84.3% AN)。
Fmoc−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−Arg−NH2
GPAフラグメント3’の溶液相合成:
GPAフラグメント3、Fmoc−AA(23−35)−OH、(10.0g、1.0当量)(Lot# BO705P001)及びL−アルギニンアミドジヒドロクロリド(2.14g、2.0当量)を、DMSO(42mL)と混合して、23℃〜25℃で30分間、撹拌した。この溶液に、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(HOBT、2.0当量)及びHBTU(2.0当量)(DMSO 42mL中)ならびにDIEA(5.0当量)を充填した。反応を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。22時間後、反応が完了していた。次に、ピペリジン(5.0当量)を反応溶液に加えた。Fmoc保護基の除去を、95分後に25℃で行った。MTBE(60mL)及びヘプタン(60mL)の溶液を加えて、反応溶液を抽出し、過剰なピペリジンを除去した。次に、この2相の混合物を水(240mL)に加えて、産物を20℃〜22℃で析出させた。沈降後、上のMTBE/ヘプタン層を分離し、底の産物を伴う水性DMSO層をろ過し、追加のMTBE/ヘプタンで洗浄した。35℃での真空乾燥後、フィルタケーキは11.1gのGPAフラグメント3’を与えた。HPLC分析は、72.9% ANフラグメント3’及び17%ジベンゾフルベン(DBF)を示した。
GPAフラグメント2+3’の溶液相合成
GPAフラグメント3’(5.0g)及びフラグメント2(4.35g)をDMF(30mL)中に溶解させた。この溶液に、HOBT水和物(1.55当量)及びHBTU(1.56当量)の溶液(DMF 20mL中)ならびにDIEA(2.55当量)を、DMFリンス(10mL)と共に充填した。反応を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。145分後、追加のフラグメント3’(0.5g)、HBTU(0.5当量)、及びDIEA(1.3当量)を、DMFリンス(5mL)と共に加えた。反応は一晩の撹拌後に完了していた。ピペリジン(1.4g)を反応混合物に充填した。Fmoc除去を3時間後に行った。反応混合物を、水(140mL)を用いて18℃〜26℃でクエンチした。混合物を40℃まで加熱し、次に20℃に冷却した。形成した白色固体をろ過し、水(2回、各々100mL)で洗浄した。フィルタケーキを空気乾燥させ、そして次にMTBE/ヘプタン(1:1、100mL)を用いて40℃で15分間撹拌した。25℃まで冷却後、産物をろ過し、MTBE/ヘプタン(1:1、4×50mL)で洗浄し、そして35℃〜40℃で真空乾燥させた。合計8.64g(97.7%収率)が、純度67.3% ANで得られた。
実施例11
フラグメント1(0.93g)をDCM(20mL)中に溶解させた。この溶液に、フラグメント2+3’(4.02g)を、DCM(20mL)リンスと共に加えた。HOBt水和物(0.23g、1.5当量)及びHBTU(0.57g、1.5当量)をDCM(5mL)と共に充填した。次に、DIEA(0.95mL、2.0当量)を、撹拌した反応混合物(懸濁液である)に充填した。反応を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。16時間後、反応完了チェックによって過剰のフラグメント2+3’が示された。追加のフラグメント1(0.081g)及びHBTU(0.068g)を、DCM(5mL)リンスを使用して加えた。反応を、追加の68時間にわたり撹拌した。結合反応が完了した後、ピペリジン(0.6mL)を反応混合物に充填した。18時間の撹拌後、Fmoc除去は完了していた。DCMを、次に、真空下で、残留容積が〜15mLになるまで、反応混合物から剥がした。濃縮混合物を、TFA(40mL)、DTT(2.1g)、及び水(2.1mL)を含む溶液に15℃で充填し、DCMリンス(2×5mL)が続いた。反応混合物を、6時間の撹拌後、<5℃まで冷却した。冷MTBE(160mL、ドライアイス中で冷却)を、7分にわたり切断溶液に充填した。クエンチした反応混合物を、15℃まで温めた。結果として生じた固体産物をろ過し、MTBE(3×30mL)で洗浄し、そして一晩、周囲温度で空気乾燥させた。3.82gのGPA粗精製物(28.73% wt/wt)が、純度59.7% AN、113%の収率で得られた。
実施例12
フラグメント1(Trt−His(Trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−OH)
7.0gの前添加Fmoc−Gly−O−2−CT樹脂(0.43mmol/g添加)を用いて開始し、標準的Fmoc化学反応を適用した。樹脂を、最初に、10容積(樹脂重量と比べて)のDCM中で30分間、膨潤させた。次に、DCMを排出させて、そして樹脂を10容積のNMPを用いて4回(各々で5分間)洗浄した。
Fmoc−His(trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−OH
2CT樹脂上でのGPAフラグメント3の固相合成
Fmoc−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−2−CT
0.46mmol/gで添加された15.0gのH−Aib−2−CT樹脂を用いて開始し、Fmoc−AA(23−35)−OHの固相合成を行った。樹脂を、DCM(120mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で6容積)。
Fmoc−His(trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−OH
12.0gのFmoc−AA(23−35)−O−2−CT樹脂を用いて開始し、Fmoc−AA(7−35)−OHの固相合成を行った。樹脂を、DCM(120mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で4.16容積)。
フラグメント2(7.83g、1.3当量)及び6−Cl−ヒドロキシベンゾトリアゾール(6−Cl−HOBT;0.69g、1.3当量)を秤量し、DMSO(4.16容積)中に溶解させ、次にNMP中のHBTU溶液(10.7mLの174.07g HBTU/L溶液、1.3当量)及びDIEA(1.9mL)と15℃で、フラスコ中で合わせた。結果として生じた溶液を、樹脂を含む反応容器に加えて、フラスコをDCM(11.1mL)でリアクター中へリンスし、それを25℃で撹拌した。サンプルをHPLCのために引き、反応の完了をチェックした。17時間の撹拌後、分析は、結合反応での73.8%の変換を示した。HBTU(1.58g)及びDIEA(0.706g)のキッカー充填を加えて、ポット混合物を30℃で撹拌した。さらに25.5時間の撹拌後、反応サンプルのHPLC分析は、結合反応が92%完了していることを示した。結合溶液を排出させて、樹脂を、NMPを用いて4回洗浄した(各々の洗浄で4.166容積)。Fmoc基の脱保護は、20%(v/v)ピペリジン及び30%(v/v)DMSO(NMP中)(各々の処理で4.16容積)を用いて2回処理することにより(各30分間)達成された。第2の20%ピペリジン30%DMSO(NMP中)処理後、樹脂を9回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で4.16容積)。
フラグメント1(3.81g、1.3当量)及び6−C1−ヒドロキシベンゾトリアゾール(6−Cl−HOBT;0.70g、1.3当量)を秤量し、DMSO(4.16容積)中に溶解させ、次にNMP中のHBTU溶液(10.7mLの174.07g HBTU/L溶液、1.3当量)及びDIEA(1.9mL)と15℃で、フラスコ中で合わせた。結果として生じた溶液を、反応容器に加えて、フラスコをリアクター中へDCM(11.1mL)でリンスし、それを樹脂と共に25℃で撹拌した。サンプルをHPLCのために引き、反応の完了をチェックした。16.5時間の撹拌後、分析は、結合反応の完全な変換を示した。結合溶液を排出させて、樹脂を、NMPを用いて4回洗浄した(各々の洗浄で4.166容積)。
実施例15a
GPAフラグメント1+2+3(4.48g)をDMSO(50mL)中に溶解させた。この溶液に、H−Arg(2HCl)−NH2(0.99g、4当量)、HOBt水和物(0.61g、4当量)、HBTU(1.52g、4当量)、及びDIEA(0.87mL、5当量)を充填した。反応を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。一晩反応完了チェックは、結合が行われたことを示した。ピペリジン(1mL)を反応混合物に充填した。一晩撹拌後、Fmoc除去が行われた。反応混合物を、次に、水(150mL)を含む容器に15℃で5分間にわたり充填した。クエンチした混合物を40℃まで0.5時間温め、次に15℃まで冷却した。固体をろ過し、水(3×30mL)で洗浄し、空気乾燥させて、4.34gの固体(98%収率)を提供した。4.0gのこの固体をDCM(18mL)中に溶解させた。この溶液に、TFA(40mL)、DTT(2.1g)、及び水(2.1mL)を含む溶液を充填した。結果として生じた混合物を、−1℃に冷却する前に、15℃で6時間撹拌した。冷MTBE(160mL、ドライアイス中で冷却)を、切断溶液に15分間にわたり充填した。クエンチした反応混合物を15℃に温めた。固体産物をろ過し、MTBE(3×30mL)で洗浄し、そして一晩、周囲温度で空気乾燥させた。3.33gのGPA粗精製物が得られ(100%収率)(23.08% wt/wt)、純度は44.9% ANであった。
実施例15b
マグネチックスターラ及びアルゴン下の温度計を伴う100mLフラスコに、1.40gのフラグメント1(30.0mLのTHF中)を加えた。232mgのHOBt及び917.3mgのHBTUを次に加えた。436.5μLのDIEAを次に加え、反応はわずかに発熱性であり、温度は約1℃上昇した。3.00gのフラグメント2+3’(THF中)を次に加えた。別の3.00gのフラグメント2+3’(THF中)を次に加えた。1.2mLのピペリジンを次に加え、反応はわずかに発熱性であり、温度は約1.5℃上昇し、透明な黄色溶液を形成し、それを一晩撹拌した。溶液を次に、42℃/200−100mbarで、250mLフラスコ中で蒸留した。26.25mLのDCMを次に加えて、溶液を42℃/400−100mbarで蒸留した。22.5mLのDCMを次に20分間にわたり除去した。500〜1000mLのダブルジャケットフラスコ中へ、4.313gのDTTを、4.313mLの水及び76.9mLのTFA溶液と共に加えた。溶液を次に15℃に冷却させ、そしてDCM溶液を次に滴下して10分間にわたり加えた。反応は発熱性であり、温度は17℃に上昇し、白色の煙が発生し、そして溶液は強い黄色になった。3.75mLのDCMを次に加えてリンスした。混合物を次に15℃で6時間撹拌した。析出が生じ、混合物を次にろ過し、0.237gのほとんど白色のペーストを与えた。360mLのMTBEを次に滴下して5分間にわたりフィルタケーキに加えて、白色の懸濁液を形成させ、温度は18℃に上昇した。懸濁液を次に30分間撹拌し、そして次にろ過した。225mLのMTBEを次にペーストに加え、再びろ過し、そして14時間にわたり42℃/20mbarで乾燥させ、合計5.787gの産物を白色粉末として産生した。HPLC(分析):51.2%(m/m%)、79.8%(面積%)水::2.0%;エタノール:<100%、DCM:<60ppm;MTBE:3.2%;THF:<70ppm;TFA:8.4%。
H−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−Arg−NH2
GPAフラグメント2+3の固相合成:
Fmoc−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−OH
GPAフラグメント2+3’の溶液相合成:
H−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(OtBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(OtBu)−Ser(ψMe,Me)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−Arg−NH2
実施例18
フラグメント2(15.0g、7.211mmol)(7.211mmolの全ペプチド、1.0当量)を、HOBT(0.1104g、0.721mmol)を7.23mLのDMF中に含む7.32mLの溶液を用いてリアクター中で処理し、150mLの2−メチル−テトラヒドロフラン(MeTHF)中に室温で溶解させる。リアクターは、1000mLの二重壁リアクター(底部に栓、スターラー、PT−100温度計、ジャケットコイルコンデンサー、窒素ブランケット、滴下漏斗、及びサーモスタットを伴う)である。結果として生じた溶液を内部温度0℃〜5℃に冷却させ、撹拌し続ける。
GPA代替フラグメント3、Fmoc−AA(28−35)−OHの固相合成
Fmoc−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−OH
GPA代替フラグメント3、Fmoc−AA(28−35)−O−2CT樹脂の固相合成:
Fmoc−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−2−CT樹脂
Fmoc−AA(28−35)−O−2CT樹脂の固相合成をRoche Peptide Synthesizer上で行った。Fmoc−Aib−2−CT樹脂(15.02g)(0.36mmol/g添加)を反応容器に充填し、DCM(150mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、DMFで洗浄した(各々の洗浄で90mL)。
構築された樹脂からのGPA中間体フラグメントFmoc−AA(28−35)−OHの切断:
構築された樹脂19.0g(実施例19から)をDCM(150mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。次に混合物を−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、2% TFA/DCMの冷溶液を用いて2回(2×7.5容積)、30分間、0℃で撹拌しながら処理した。切断溶液を、ピリジン(使用した全TFAと比べて1.3当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCMで6回(150mL)洗浄して、レシーバー容器中に排出させた。DCM溶液を合わせて、濃縮し、水(150mL)と混合した。結果として生じた混合物を再び減圧下で蒸留して、残りのDCMを除去した(350−50トール、25℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。92.7%収率のGPA代替フラグメント3(Fmoc−AA(28−35)−OH)が純度95.2% ANで得られた。
GPA代替フラグメント3 Fmoc−AA(28−35)−O−2CT樹脂の固相合成:
Fmoc−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−O−2CT樹脂
Fmoc−AA(28−35)−O−2CT樹脂の固相合成をRoche Peptide Synthesizer上で行った。H−Aib−2−O−CT樹脂(25.01g)(0.59mmol/g(バッチ # BO06010051)添加)を反応容器に充填し、DCM(250mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。DCM溶媒を排出させて、樹脂を3回、NMPで洗浄した(各々の洗浄で150mL)。
実施例21からの構築された樹脂をDCM(150mL)中で30分間にわたり−5℃に冷却した。次に、DCMを排出させて、樹脂を2回、2% TFA/DCM(2×250mL)の冷溶液を用いて、撹拌しながら30分間、0℃で処理した。切断溶液を、ピリジン(全TFAと比べて1.3当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCMで6回洗浄し(各々の洗浄で150mL)、洗浄液を切断溶液と合わせた。合わせたDCM溶液を真空下で濃縮し、水(150mL)と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350〜50トール、25℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。96.9%収率のGPA代替フラグメント3(Fmoc−AA(28−35)−OH)が純度96.1% ANで得られた。
Fmoc−His(trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(tBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(tBu)−Ser(ψMe,Me pro)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−OH
GPA代替フラグメント1+2、Fmoc−AA(7−27)−O−2CT樹脂の固相合成:
Fmoc−His(trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(tBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(tBu)−Ser(ψMe,Me pro)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−O−2CT樹脂
構築された樹脂からのGPA中間体フラグメント1+2 Fmoc−AA(7−27)−OHの切断:
構築された樹脂(18.24g)(実施例22から)をDCM(200mL)中で30分間、25℃で膨潤させた。次に混合物を−5℃に冷却させた。DCMを排出させて、1% TFA/DCMの冷溶液を用いて3回(3×100mL)、30分間、0℃で撹拌することにより樹脂を処理した。切断溶液を、ピリジン(全TFAと比べて1.4当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCM(100mL)で3回洗浄した。全てのDCM溶液を合わせ、濃縮し、そして水(100mL)と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350〜50トール、25℃)。フラグメントが、DCM除去時に水から析出した。フラグメントをろ過し、水で洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。67.6%収率のGPA代替フラグメント1+2(Fmoc−AA(7−27)−OH)が純度85.3% ANで得られた。
GPA代替フラグメント1+2、Fmoc−AA(7−27)−O−2CT樹脂の固相合成:
Fmoc−His(trt)−Aib−Glu(OtBu)−Gly−Thr(tBu)−Phe−Thr(tBu)−Ser(tBu)−Asp(OtBu)−Val−Ser(tBu)Ser(ψMe,Me pro)−Tyr(tBu)−Leu−Glu(OtBu)−Gly−Gln(trt)−Ala−Ala−Lys(Boc)−Glu(OtBu)−O−2CT
上からのDCM中の構築された樹脂のリアクター温度が−5℃に達した後、DCMを排出させて、樹脂を、1% TFA/DCMの冷溶液で3回(3×200mL)、30分間、0℃で撹拌しながら処理した。切断溶液を、ピリジン(使用した全TFAに基づく1.4当量)を含むフラスコ中に回収した。容器を25℃まで温めながら、樹脂をDCM(各々200mL)で5回洗浄した。全てのDCM溶液を合わせ、濃縮し、そして水(200mL)及びイソプロパノール(80mL)と混合した。結果として生じた混合物を減圧下で蒸留して、DCMを除去した(350〜50トール、25℃)。フラグメントが、DCM除去時に析出した。フラグメントをろ過し、洗浄し、そして30℃〜35℃で、真空下で乾燥させた。77.7%収率のGPA代替フラグメント1+2(Fmoc−AA(7−27)−OH)が純度86.4% ANで得られた。
H−Phe−Ile−Ala−Trp(Boc)−Leu−Val−Lys(Boc)−Aib−Arg−NH2
代替フラグメント3(Fmoc−AA(28−35)−OH、6.11g、4.42mmole 実施例20及びアルギニンアミドジヒドロクロリド(H−Arg(2HCl)−NH2、2.18g、8.84mmole、2当量)をDMF(42mL)中に溶解させた。この溶液に、HOBt.H2O(0.67g、1当量)及びHBTU(3.38g、2当量)の溶液(DMF 42mL中)、ならびにDIEA(3.44mL、4当量)を、15mLのDMFと共に連続的に充填した。反応混合物を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。反応は21時間の撹拌後に完了していた。次に、ピペリジン(2.26g、6当量)を反応混合物に加えた。Fmoc除去は、35℃で1時間の撹拌後に未完了であった。追加のピペリジン(2.33g、6.2当量)を加えて、撹拌をさらに1.75時間継続させた。反応混合物を水(240mL)でクエンチし、白色固体を形成させた。ピリジンヒドロクロリド(8.33g、16.3当量)を、析出した反応混合物に加え、ピペリジンを中和した。白色固体をろ過し、水(400mL)で洗浄し、そして一晩、部分的に乾燥させた。湿ったフィルタケーキを100mLのMTBE/n−ヘプタン(1:1=容積:容積)で再スラリーさせ、ろ過し、MTBE/n−ヘプタン(1:1=容積:容積;2×25mL)で洗浄し、そして真空乾燥させ、GPA代替フラグメント3’H−AA(28−36)−NH2(6.22g、収率106.9%)を得た。HPLC分析は純度87% ANを示した。
代替フラグメント3(Fmoc−AA(28−35)−OH、6.12g、4.42mmole 実施例21)及びアルギニンアミドジヒドロクロリド(H−Arg(2HCl)−NH2、2.19g、8.84mmole、2当量)をDMF(42mL)中に溶解させた。この溶液に、HOBt.H2O(0.67g、1当量)及びHBTU(3.38g、2当量)の溶液(DMF 42mL中)、ならびにDIEA(3.44mL、4当量)を連続的に、15mLのDMFと共に加えた。反応を25℃で撹拌し、HPLCによりモニターした。反応を一晩(16.3時間)行った。次に、ピペリジン(4.52g、12当量)を反応混合物に加えた。Fmoc除去は、25℃で35分間の撹拌後に完了した。反応混合物を水(200mL)でクエンチした。DCM(180mL)を加え、析出産物を抽出した。底のDCM層を水で2回洗浄し(2×100mL)、容積50mLに濃縮した。この濃縮DCM溶液を、ヘプタン150mLに滴下して送り、産物を析出させた。DCMを真空下で蒸留した。MTBE(120mL)を析出混合物に加えた。形成した白色固体をろ過し、MTBE/n−ヘプタン(1:1=容積:容積;2×50mL)で洗浄し、そして真空乾燥させて、GPA代替フラグメント3’H−AA(28−36)−NH2を得た(6.54g、重量収率112.4%)。HPLC分析は純度92.1% ANを示した。
実施例27
実施例23からのGPAフラグメント1+2(Fmoc−AA(7−27)−OH)(0.383g)及び実施例24からのフラグメント3’(H−AA(28−36)−NH2)(0.203g)を、DMSO(2mL)及びNMP(4mL)の溶液に溶解させ、1時間撹拌した。この溶液に、HOBt水和物(0.040g)及びHBTU(0.092g)を加えた。次に、DIEA(0.080mL)を反応混合物に加えた。反応を周囲温度で撹拌し、HPLCによりモニターした。68時間の撹拌後、反応完了チェックは、反応が行われたことを示した。ピペリジン(0.1mL)を反応混合物に加えた。16時間の撹拌後、Fmoc除去を行った。反応混合物を、次に、水(40mL)中に加えることによりクエンチした。30分間の撹拌後、固体をろ過、水(20mL)での洗浄、及び一晩の乾燥により単離した。単離固体を、次に、TFA(4mL)、DCM(1.5mL)、ジチオスレイトール(DTT)(0.2g)、及び水(0.2mL)を含む溶液に周囲温度で加えた。6時間の撹拌後、反応混合物を、冷(−20℃)MTBE(40mL)を加えることによりクエンチした。クエンチした反応混合物を30分間撹拌した。固体産物をろ過し、MTBE(2×10mL)で洗浄し、そして一晩、周囲温度で乾燥させた。0.42gのGPA粗精製物(28.2% wt/wt)が、純度49.5% AN(D−Glu−27アイソマー、7.9%)で得られた。
バッチ実施例23からのGPAフラグメント1+2(Fmoc−AA(7−27)−OH)(0.382g)及び実施例25からのフラグメント3’(H−AA(28−36)−NH2)(0.202g)を、DMSO(2mL)及びNMP(4mL)の溶液中に溶解させ、0.5時間撹拌した。この溶液に、HOBt水和物(0.041g)及びDEPBT(0.085g)を加えた。次に、DIEA(0.080mL)を反応混合物に加えた。反応を周囲温度で撹拌し、HPLCによりモニターした。一晩反応完了チェックは、反応が完了したことを示した。ピペリジン(0.1mL)を反応混合物に加えた。68時間の撹拌後、Fmoc除去を行った。反応混合物を、次に、水(40mL)中に加えることによりクエンチした。15分間の撹拌後、固体をろ過、水(20mL)での洗浄、及び一晩の乾燥により単離した。単離固体を、次に、TFA(4mL)、DCM(1.5mL)、DTT(0.2g)、及び水(0.2mL)を含む溶液に周囲温度で加えた。6時間の撹拌後、反応混合物を、冷(−20℃)MTBE(40mL)を加えることによりクエンチした。クエンチした反応混合物を30分間撹拌した。固体産物をろ過し、MTBE(2×10mL)で洗浄し、そして一晩、周囲温度で乾燥させた。重量0.43gのGPA粗精製物(31.4% wt/wt)が、純度51.3% AN(D−Glu−27エピマー、4.5%)で得られた。
工程A.フラグメント1+2とフラグメント3’(THF中)とHOBt、HBTU及びDIEAの結合反応:
37.5mLのTHFを伴う100mLの4ネックフラスコ(22℃〜27℃内部温度)中へ、フラグメント1+2(6.20g、2.32mmol)を3部分に分けて10分以内に加えた。20mLの丸底フラスコ中へ、HOBt水和物(309mg、1.98mmol)及びHBTU(1223mg、3.16mmol)を加えた。10.0mLのTHFを加えて、反応混合物を22℃〜27℃の内部温度で10分間撹拌した。この結合試薬懸濁液をペプチド溶液に加えて、フラスコを3.0mLのTHFでリンスし、そして反応混合物を10分間撹拌した。DIEA(0.582mL、3.31mmol)を次に加えて、10分間撹拌した。1時間以内に、フラグメント3’(6.10g、2.72mmol)を3部分に分けて加えた。フラグメントの残りを10.0mLのTHFでリンスした。反応混合物を、強く、25℃〜27℃の内部温度で24時間、撹拌した。
ピペリジン(1.60mL、16.0mmol)を次に加えて、反応混合物を強く6時間、25℃〜27℃の内部温度で撹拌した。反応混合物を、次に、250mL丸底フラスコに移し、溶媒を真空中で、42℃の浴槽温度/200−100mbarで除去した。
残さを次に35.0mLのメチレンクロリド中に溶解させて、それを次に真空中で、42℃の浴槽温度/400−100mbarで除去した。残さを次に30.0mLのメチレンクロリド中に溶解させた。
1000mLのダブルジャケットフラスコ中へ、5.75g(37.1mmol)のDTT、5.75mLのH2O、及び102.5mL(1220mmol)のTFAを加えて、溶液を15℃の内部温度に冷却した。ペプチド溶液を次に10〜15分以内に加えて、添加漏斗を5.0mLのメチレンクロリドでリンスした。強い黄色の反応溶液を14℃〜16℃の内部温度で10.5時間撹拌した。
反応混合物を次に0℃の内部温度に冷却し、480mLのMTBE(0〜5℃に予備冷却)を継続的に10分以内に加え、内部温度を22℃に上昇させた。懸濁液を次に2時間、16℃〜18℃の内部温度で撹拌し、次にろ過した。依然として湿ったフィルタケーキを3回、300mLのMTBEで洗浄した(3×100mL)。次に、フラスコをリンスし、フィルタケーキをスラリーとし、ろ過した。フィルタケーキを次に、最後の洗浄後に吸引乾燥させ、残さを一晩38℃〜42℃/20〜30mbarで乾燥させた(化学収率:58〜65%。アッセイ:39〜43%)。
Claims (30)
- インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)(配列番号6)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号6)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号14)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項1記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)(配列番号6)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号6)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項1又は請求項2記載の方法であって、以下の工程:
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35 X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)工程i)により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;そして
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。 - インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)N末端保護基を除去して、(配列番号5)
式中、
Zは、H−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを与えること、
c)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
d)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供するために、第3のペプチドフラグメントを溶液中で第2のペプチドフラグメントに結合させること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第4のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項5記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号5)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)N末端保護基を除去して、(配列番号5)
式中、
Zは、H−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを与えること、
c)(配列番号7)
式中、
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを溶液中で提供すること、
d)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供するために、第3のペプチドフラグメントを溶液中で固相中で第2のペプチドフラグメントに結合させること、
e)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第5のペプチドフラグメントを提供するために、第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から除去して、第4のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
f)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第6のペプチドフラグメントを与えること、
g)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第7のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
h)第7のペプチドフラグメントを第6のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項5又は請求項6記載の方法であって、以下の工程:
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35 X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)工程i)により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;及び
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。 - インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
b)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
e)第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項9記載のインシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号13)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基が、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメント又はその対応物を提供すること、
b)(配列番号8)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
c)N末端保護基を除去して、(配列番号8)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
d)(配列番号9)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、−OHであり;そして
H及びEの各々は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
e)第4のペプチドフラグメントを第3のペプチドフラグメントに溶液中で結合させて、(配列番号10)
式中、
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを提供すること、
を含む方法。 - 請求項9又は請求項10記載の方法であって、以下の工程:
i)インシュリン分泌性ペプチドのN末端保護基を除去して、(配列番号10)
式中、
Zは、H−であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
X35 X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含むインシュリン分泌性ペプチドを与えること、
及び
j)工程i)により得られるインシュリン分泌性ペプチドを酸と接触させ、アミノ酸側鎖を脱保護させて、(配列番号11)
式中、
Zは、H−であり;そして
X8、X10及びX35は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基である
のアミノ酸配列を含む脱保護インシュリン分泌性ペプチドを与えること、
をさらに含む方法。 - 疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのSer−Ser残基である、請求項13記載のペプチド。
- 疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのSer−Ser残基である、請求項15記載のペプチド。
- インシュリン分泌性ペプチドを作る方法であって、以下の工程:
a)(配列番号16)
式中、
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
Zは、N末端保護基であり;
B’は、固相樹脂であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第1のペプチドフラグメントを提供すること、
b)工程a)の第1のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第1のペプチドフラグメント(配列番号16)
式中、B’は、−OHである;
を溶液中で産生させること、
c)(配列番号17)
式中、
Zは、N末端保護基であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第2のペプチドフラグメントを提供するために、第1のペプチドフラグメントを溶液中でアルギニンアミドに結合させること、
d)N末端保護基を除去して、(配列番号17)
式中、
Zは、H−であり;
X35は、アキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む
のアミノ酸配列を含む第3のペプチドフラグメントを与えること、
を含む方法。 - 請求項17記載の方法であって、以下の工程:
e)(配列番号18)
式中、
X8及びX10は、各々が非依存的にアキラル、場合により、立体障害されたアミノ酸残基であり;
X17−18は、疑似プロリンのジペプチド残基であり;
Zは、N末端保護基Fmoc−であり;
B’は、固相樹脂であり;そして
前記配列の1つ又は複数の残基は、場合により、側鎖保護を含む;
のアミノ酸配列を含む第4のペプチドフラグメントを提供すること、
及び
f)工程e)の第4のペプチドフラグメントを固相樹脂から切断して、第4のペプチドフラグメント(配列番号18)
式中、B’は、−OHである
を溶液中で産生させること、
をさらに含む方法。 - 疑似プロリンのジペプチド残基が、疑似プロリンのSer−Ser残基である、請求項24記載のペプチド。
- X35が、Aibである、請求項26記載のペプチド。
- X35が、Aibである、請求項28記載のペプチド。
- インシュリン分泌性ペプチドを作る方法及び本明細書において先に定義されたペプチド。
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