JP7351968B2 - チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸をn末端に持つ非環状ペプチド-核酸複合体、そのライブラリー、およびそれから誘導される環状ペプチド-核酸複合体ライブラリーの製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕
2以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、
第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II):
(式中、
R1は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり;
R2、およびR3は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはR2とR3は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し;あるいはR2またはR3は、R4およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しR2が、これが結合するN原子およびSP-1と一緒になってアジド基(-N3)を形成する場合、上記の定義はR2に対して適用されず;
R4は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく;
R11、およびR12は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく;
SP-1は、これが結合するN原子およびR2と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式:
(式中のP1は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである)で表されるか、または以下の式:
(式中のP2は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである)で表される、アミノ基の保護基である)
で表されるアミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成されるペプチド、または当該ペプチドと当該核酸との複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程を含む、方法。
〔2〕
R1が、S-R23(ここで、R23はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい)、スルホネート(-SO3 -)、およびチオスルホネート(-S2O3 -)からなる群より選択される、〔1〕記載の方法。
〔3〕
R23が、メチル、エチル、イソプロピル、tert―ブチル、フェニル、p-トリフルオロメチルフェニル、p-フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、〔2〕に記載の方法。
〔4〕
R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンで置換されてもよいC1-C4アルキル、またはC1-C4アルコキシである、〔1〕~〔3〕のいずれか一項に記載の方法。
〔5〕
R4が、以下:
(式中、R13~R18は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである)からなる群より選択される、〔1〕~〔4〕のいずれか一項に記載の方法。
〔6〕
R13~R18が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、〔5〕に記載の方法。
〔7〕
R11およびR12がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下:
(ここでR13'~R18'は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである)からなる群より選択される、〔1〕~〔6〕のいずれか一項に記載の方法。
〔8〕
R13'~R18'が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、〔7〕に記載の方法。
〔9〕
一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1~R4およびSP-1は、それぞれ〔1〕に記載のR1~R4およびSP-1と同意義を表し、
R13'~R16'は、それぞれ〔7〕に記載のR13'~R16'と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1、R4およびSP-1は、それぞれ〔1〕に記載のR1、R4およびSP-1と同意義を表し、
R13'~R18'は、それぞれ〔7〕に記載のR13'~R18'と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔1〕~〔8〕のいずれか一項に記載の方法。
〔10〕
一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1~R3およびSP-1は、それぞれ〔1〕に記載のR1~R3およびSP-1と同意義を表し;
R13~R16は、それぞれ〔5〕に記載のR13~16と同意義を表し;
R13'~R16'は、それぞれ〔7〕に記載のR13'~R16'と同意義を表し;あるいはR2は、R13、R14、R15またはR16およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しR2が、これが結合するN原子およびSP-1と一緒になってアジド基(-N3)を形成する場合、上記の定義はR2に対して適用されない)のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1およびSP-1は、それぞれ〔1〕に記載のR1およびSP-1と同意義を表し;
R13~R18は、それぞれ〔5〕に記載のR13~R18と同意義を表し;
R13'~R18'は、それぞれ〔7〕に記載のR13'~R18'と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔1〕~〔9〕のいずれか一項に記載の方法。
〔11〕
SP-1が、4-アジドベンジルオキシカルボニル(p-Acbz)、2-アジドベンジルオキシカルボニル(o-Acbz)、アジドメトキシカルボニル(Azoc)、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Phdec)、2-ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Pydec)、もしくは2-(t-ブチルジスルファニル)エチルオキシカルボニル(Tbeoc)であるか、またはSP-1は、これが結合するN原子およびR2と一緒になってアジド基を形成する、〔1〕~〔10〕のいずれか一項に記載の方法。
〔12〕
側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R2"、R3"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはR2"とR3"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し;あるいはR2"またはR3"は、R26およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し;
R25は水酸基であるか、またはそれが結合するCOと共に活性エステルを形成し;
R26は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよい)
で表される、〔1〕~〔11〕のいずれか一項に記載の方法。
〔13〕
R26が、以下:
(式中、R13"~R18"は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである)からなる群より選択される、〔1〕~〔12〕のいずれか一項に記載の方法。
〔14〕
側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R2"は、〔12〕に記載のR2"と同意義を表し;
R3"は、水素原子、または置換されてもよいC1-C4アルキル基であり;
R27は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される)
で表される、〔1〕~〔13〕のいずれか一項に記載の方法。
〔15〕
側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R2"は、〔12〕に記載のR2"と同意義を表し;
R3"は、水素原子、または置換されてもよいC1-C4アルキル基であり;
R28およびR29は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいC1-C6アルキル基、置換されてもよいC2-C6アルケニル基、置換されてもよいC2-C6アルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいアラルキル基、または置換されてもよいシクロアルキル基であり;
R27は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される)
で表される、〔1〕~〔14〕のいずれか一項に記載の方法。
〔16〕
環状部に存在する-SH基を脱硫する工程をさらに含む、〔1〕~〔15〕のいずれか一項に記載の方法。
〔17〕
環状部を有するペプチドと核酸との複合体が、ペプチドと核酸との間にリンカーを有する、〔1〕~〔16〕のいずれか一項に記載の方法。
〔18〕
ペプチドが、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼの少なくとも1つを含まない無細胞翻訳系において翻訳して合成される、〔1〕~〔17〕のいずれか一項に記載の方法。
〔19〕
下記一般式(IA)または下記一般式(IIA)で表される化合物:
(式中、R1~R4、R11、R12、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1~R4、R11、R12、およびSP-1と同意義を表す)。
〔20〕
下記一般式(IB)または下記一般式(IIB)で表される化合物:
(式中、R1~R4、R11、R12、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1~R4、R11、R12、およびSP-1と同意義を表し、R30はHまたは水酸基を表す)。
〔21〕
〔19〕記載の化合物とtRNAが結合してなるアミノアシルtRNA。
〔22〕
第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II)で表される、アミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体:
(式中、R1~R4、R11、R12、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1~R4、R11、R12、およびSP-1と同意義を表す)。
〔23〕
非環状ペプチドが、第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II):
(式中、R1~R4、R11、R12、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1~R4、R11、R12、およびSP-1と同意義を表す)で表されるアミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって得られる、〔22〕記載のペプチド又は複合体。
〔24〕
〔22〕もしくは〔23〕記載のペプチド又は複合体を用いて、2以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを製造する方法。
〔25〕
一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の式:
(式中、R1、R2、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1、R2、およびSP-1と同意義を表す)。
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の式:
(式中、
R1は、-S-R23であり、
R23は、C1-C20アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
SP-1は、p-Acbz、o-Acbz、またはAzocである)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔1〕~〔18〕のいずれか一項に記載の方法。
〔26〕
一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の式:
(式中、R1、およびSP-1は、それぞれ〔1〕のR1、およびSP-1と同意義を表し、R2は水素原子、またはアルキル基であり、アルキル基は置換されていてもよい)
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の式:
(式中、
R1は、-S-R23であり、
R23は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、またはsec-ブチルであり、
SP-1は、p-Acbz、o-Acbz、またはAzocである)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔1〕~〔18〕および〔25〕のいずれか一項に記載の方法。
〔27〕
2以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、以下の(a)および(b)に記載の工程を含む方法:
(a)第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II):
(式中、
R1は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり;
R2、およびR3は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはR2とR3は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し;あるいはR2またはR3は、R4およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しR2が、これが結合するN原子およびSP-1と一緒になってアジド基(-N3)を形成する場合、上記の定義はR2に対して適用されず;
R4は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく;
R11、およびR12は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく;
SP-1は、これが結合するN原子およびR2と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式:
(式中のP1は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである)で表されるか、または以下の式:
(式中のP2は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである)で表される、アミノ基の保護基である)
で表されるアミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体を、当該ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程、および
(b)工程(a)で得られる非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体から一般式(I)中のR1およびSP-1を除去し、第一の反応点と第二の反応点とを反応させてアミド結合を形成させる工程を含む、方法。
その結果、アミノ酸類縁体を複数含むドラックライクな環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体、および当該複合体のディスプレイライブラリーが提供される。本発明を用いて構築したディスプレイライブラリーは、従来の手法よりもアミノ酸類縁体を多数含むペプチドを高い効率で翻訳合成できるので、より多彩なドラックライクなヒット化合物を取得する確率がさらに高まる。
本明細書において、「アルキル」とは脂肪族炭化水素から任意の水素原子を1個除いて誘導される1価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素-炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さnは1~20個の範囲である。アルキルとしては、たとえば、「C1-C6アルキル」が挙げられ具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、t-ブチル基、sec-ブチル基、1-メチルプロピル基、1,1-ジメチルプロピル基、2,2-ジメチルプロピル、1,2-ジメチルプロピル、1,1,2-トリメチルプロピル、1,2,2-トリメチルプロピル、1,1,2,2-テトラメチルプロピル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,1-ジメチルブチル、1,2-ジメチルブチル、1,3-ジメチルブチル、2,2-ジメチルブチル、2,3-ジメチルブチル、3,3-ジメチルブチル、1-エチルブチル、2-エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
このようなアルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、1-プロペニル、2-プロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル(シス、トランスを含む)、3-ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル、1-プロピニル、プロパルギル、3-ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、3-フェニル-2-プロピニル、3-(2'-フルオロフェニル)-2-プロピニル、2-ヒドロキシ-2-プロピニル、3-(3-フルオロフェニル)-2-プロピニル、3-メチル-(5-フェニル)-4-ペンチニルなどが挙げられる。
ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
・環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体
本発明において、環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の環状部は、翻訳合成された後のペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体をアミド化反応に供することにより形成される。本発明において、ペプチドと核酸の複合体のペプチドの部分を、「ペプチド部位」と記載する場合がある。また、本発明において、「核酸」にはDNAとmRNAが含まれる。
または一般式(II):
で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
(-C=O-OR)
N-メチルアラニン、N-メチルグリシン、N-メチルフェニルアラニン、N-メチルチロシン、N-メチル-3-クロロフェニルアラニン、N-メチル-4―クロロフェニルアラニン、N-メチル-4-メトキシフェニルアラニン、N-メチル-4-チアゾールアラニン、N-メチルヒスチジン、N-メチルセリン、N-メチルアスパラギン酸、
本発明の環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体(ペプチド-核酸複合体)、またはペプチド-核酸複合体のライブラリーは、例えば以下に記載の工程を含む方法を利用して製造することが可能である。
1)アミノ酸残基により構成される非環状のペプチドまたはペプチド部位を、該ペプチドまたはペプチド部位をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
該非環状のペプチドまたはペプチド部位は、第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II):
で表されるアミノ酸残基をN末端に含み、側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をC末端側に含む、工程;および
2)第一の反応点と、第二の反応点とを反応させ、アミド結合を形成させる工程
を含む、前記方法。
本発明では、チオール基をアミノ基近傍に有し、チオール基とアミノ基がどちらとも保護されているアミノ酸残基(三角ユニット、例えば、保護基によって保護されたシステインやシステイン類縁体)をアミノアシル化した翻訳開始tRNAを用いて翻訳させることによってN末端を所望のアミノ酸として翻訳させることもできる。すなわち本発明は、第一の反応点を有する一般式(I)で表されるアミノ酸残基をN末端に含み、側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をC末端側に含む非環状ペプチドの製造方法をも提供する。
式中のR1~R4は、それぞれ前記R1~R4の定義と同一であり、R13'~R16'はそれぞれ前記R13~R16の定義と同様であり、式中のSP-1は、後述のSP-1の定義と同一である。
式中のR1、R4は、それぞれ前記R1、R4の定義と同一であり、R13'~R18'はそれぞれ前記R13~R18の定義と同様であり、式中のSP-1は、後述のSP-1の定義と同一である。
式中のR1~R3、およびR13~R16は、それぞれ前記R1~R3、およびR13~R16の定義と同一であり、式中のR13'~R16'は、それぞれ前記R13~R16の定義と同様であり、式中のSP-1は、後述のSP-1の定義と同一であり、
あるいはR2は、R13、R14、R15またはR16およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しR2が、これが結合するN原子およびSP-1と一緒になってアジド基(-N3)を形成する場合、上記の定義はR2に対して適用されない
式中のR1、およびR13~R18は、それぞれ前記R1、およびR13~R18の定義と同一であり、式中のR13'~R18'は、それぞれ前記R13~R18の定義と同様であり、式中のSP-1は、後述のSP-1の定義と同一である。
(1)翻訳反応条件下でのアミノアシルtRNAの安定性を向上させること、
(2)翻訳効率を低下させないこと、
(3)脱保護反応時にmRNAには反応せずに望みの官能基のみが選択的に脱保護されること。
で表すことができる。
この場合、P1は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンなどから選択され、これらの基は、ハロゲンやアルコキシなどの置換基によりさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位に位置するメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、SP-1の好ましい例として、4-アジドベンジルオキシカルボニル(p-Acbz)、2-アジドベンジルオキシカルボニル(o-Acbz)、アジドメトキシカルボニル(Azoc)などが挙げられる。
で表すことができる。この場合、P2は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールなどから選択され、これらの基はさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位および/またはγ位のメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、SP-1の好ましい例として、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Phdec)、2-ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Pydec)、2-(t-ブチルジスルファニル)エチルオキシカルボニル基(Tbeoc)などが挙げられる。
式中、
R1は、-S-R23であり
R23は、C1-C20アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
R2は、ドラッグライクネスに寄与する置換基で置換されていてもよいC1-C6アルキルであり、
SP-1は、p-Acbz、o-Acbz、またはAzocである。
式中、
R1は、-S-R23であり
R23は、C1-C20アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
SP-1は、p-Acbz、o-Acbz、またはAzocである。
式中、
R1は、-S-R23であり、
R23は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、またはsec-ブチルであり、
R2は、メチル、エチル、n-プロピル、またはn-ブチルであり、
SP-1は、p-Acbz、またはo-Acbzである。
式中、
R1は、-S-R23であり、
R23は、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、n-ブチル、t-ブチル、またはsec-ブチルであり、
SP-1は、p-Acbz、o-Acbz、またはAzocである。
で表すことができる。式中、第二の反応点である活性エステル部位(-COR25)以外の置換基(即ち、R2"、R3"、R26)は、ドラッグライクなアミノ酸となるような基から選択することができる。本発明では活性エステルとは、三角ユニットのアミノ基部位と反応補助基であるチオールを介して反応することが可能なエステルまたはチオエステルを意味し、そのような性質を有するものであれば特に制限されない。
R27は水素原子、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルキルで置換されていてもよいアラルキルの中から選択される。
R28およびR29はそれぞれ、ドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えば水素原子、置換されてもよいC1-C6アルキル、置換されてもよいC2-C6アルケニル、置換されてもよいC2-C6アルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいC1-C6アルキルで置換されていてもよいアラルキル、置換されてもよいシクロアルキルの中から選択される。
(式III-OH中の、R3"、R25、R26、式III-2-OH中のR3"、R26、R27、式III-3-OH中のR3"、R27、R28、R29は、それぞれ式III中の、R3"、R25、R26、式III-2中のR3"、R26、R27、式III-3中のR3"、R27、R28、R29と同意義である。)
(i)アミノ酸の総数が9~13残基である非環状ペプチド部位を翻訳合成して、当該非環状ペプチド部位とそれをコードする核酸配列がリンカーを介して結合している複合体からなる非環状ペプチド部位-核酸複合体を形成する工程
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド部位をアミド結合によって環化し、環状部のアミノ酸残基数の合計が5~12となる環状化合物を形成する工程
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド部位-核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
あるいは、全長tRNAを用意し、種々のアミノ酸類縁体の活性エステルをtRNAに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。この他にも後述の方法を用いることによってアシル化tRNAを得ることが出来る。
一方、PURE systemは大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームのそれぞれを抽出、精製し、tRNA、アミノ酸、ATP、GTPなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。((i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translationreconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T,Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PUREtechnology.Shimizu Y, Ueda T.)。
A) 式(I)をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、式(I)の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D) 式(III)をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式(III)のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H) プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前(非環状)ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部を形成し、その後脱硫させる工程
本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M) パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N) 逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O) 塩基配列を解析する工程
A) N-9をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、N-9の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D) 式(III)-2または式(III)-2―OHをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式(III)-2または式(III)-2―OHのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H)プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN-メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前(非環状)ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部を形成し、その後脱硫させる工程
A) N-12またはN-15をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、N-12またはN-15の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D) 式(III)-3または(III)-3-OHをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式(III)-3または(III)-3-OHのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H)プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN-メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前(非環状)ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部を形成し、その後脱硫させる工程
A) N-12-1、N-12-2、N-13-1またはN-14-1をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B) 3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C) 工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、N-12-1、N-12-2、N-13-1またはN-14-1の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D) 式(III)-3をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E) 3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F) 工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式(III)-3のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G) 工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H)プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを1番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その3'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるN-メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I) 工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J) 工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K) 工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前(非環状)ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L) 環状部を形成し、その後脱硫させる工程
アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する場合、C末端側アミノ酸残基直後のアミド結合とチオエステルが反応してアスパルチミドを形成する。そこで、アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する際に直後のアミノ酸残基をN-アルキル基を有するアミノ酸(例えばプロリン)にすることによって望みのチオエステルを含む全長ペプチドを翻訳合成することができる。
上記一般式(IA)および(IB)中、R1~R4、R12、およびSP-1は、一般式(I)のR1~R4、R12、およびSP-1と同意義であり、R30はHまたは水酸基を表す。R30として特に好ましくはOHである。
また、上記一般式(IIA)および(IIB)中、R1、R4、R11、およびSP-1は、一般式(II)のR1、R4、R11、およびSP-1と同意義であり、R30はHまたは水酸基を表す。R30として特に好ましくはOHである。
当該複合体は、第一の反応点を有する上記一般式(I)または一般式(II)で表されるアミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって取得することができる。なお、上記式(I)中、R1~R4、R11、R12、およびSP-1は、本明細書に記載の定義に従う。
なお、実施例中では以下の略号を使用した。
DCM ジクロロメタン
DIPEA N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMF ジメチルホルムアミド
DMSO ジメチルスルホキシド
DTT ジチオスレイロール
FA ギ酸
TFA トリフルオロ酢酸
THF テトラヒドロフラン
TCEP トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
NMP N-メチル‐2‐ピロリドン
DBU 1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]-7-ウンデセン
Acbz 4-アジドベンジルオキシカルボニル基
o-Acbz 2-アジドベンジルオキシカルボニル基
Pen 4-ペンテノイル基
CH2CN シアノメチル基
1-1.Initiation suppression法によりN末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳導入するためのpCpA-アミノ酸の合成
N末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドをInitiationsuppression法により翻訳合成するために、システインまたはシステイン類縁体のアミノアシル化pCpAを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、アミノアシル化pCpA(nk-05、09、14、19、22)を合成した。
LCMS(ESI) m/z = 383 (M-H)-
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 422 (M-H)-
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1087 (M-H)-
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
N,N,N-トリメチルヘキサデカン-1-アミニウム 塩化物(6,40g、20mmol)とイミダゾール(6.81g、100mmol)の水溶液に酢酸を添加し、pH8、20mM N,N,N-トリメチルヘキサデカン-1-アミニウム、100mMイミダゾールの緩衝液A(1L)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 1019 (M+H)+
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 383 (M-H)-
保持時間:0.81分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 422 (M-H)-
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1087 (M-H)-
保持時間:0.59分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1019 (M+H)+
保持時間:0.55分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 224 (M+H)+
保持時間:0.34分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 397 (M-H)-
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 436 (M-H)-
保持時間:0.96分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1101 (M-H)-
保持時間:0.69分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1033 (M+H)+
保持時間:0.65分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 224 (M+H)+
保持時間:0.38分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 397 (M-H)-
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 436 (M-H)-
保持時間:0.96分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1101 (M-H)-
保持時間:0.69分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1033 (M+H)+
保持時間:0.62分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 397 (M-H)-
保持時間:0.91分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 438 (M+H)+
保持時間:1.00分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1033 (M+H)+
保持時間:0.60分(分析条件SQDFA05)
(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物nk23、Pen-MeAla(4-Thz)-OH)の合成
得られた(2S)-2-(メチルアミノ)-3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸を1,4-ジオキサン (40 ml)/水(40ml)に溶解させた後に、ペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル(3.200 g, 16.23 mmol)と、炭酸水素ナトリウム(1.80g、21.43mmol)を加え、反応液を30度で12時間撹拌した。反応が完結した後、反応液に水を加えて酢酸エチルで洗浄し、水層の液性がpH2になるまで1M硫酸水素ナトリウム水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール)にて精製し、(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物nk23、Pen-MeAla(4-Thz)-OH)(0.60g、22%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 269 (M+H)+
保持時間:1.32分(分析条件SMD method1)
LCMS(ESI) m/z = 308 (M+H)+
保持時間:1.61分(分析条件SMD method1)
LCMS(ESI) m/z = 971 (M-H)-
保持時間:0.59分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 903 (M+H)+
保持時間:0.37分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 211 (M+H)+
保持時間:0.72分(分析条件SMDmethod3)
反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル)にて精製し、表題化合物(化合物nk28、Pen-MeGly-pCpA)(37.6mg、13%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 806 (M+H)+
保持時間:0.60分(分析条件SMD method2)
4-(メチルチオ)-4-オキソ-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物nk30、Pen-AspSMe-pCpA)の合成
LCMS(ESI) m/z = 880.4 (M+H)+
保持時間:0.38分(分析条件SQDFA05)
2-1.転写によるtRNA(CA欠損)の合成
鋳型DNA(配列番号D-1)から、RiboMAX Large Scale RNAproduction System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAfMetCAU(-CA)(配列番号R-1)を合成し、RNeasy Minikit(Qiagen社)により精製した。
tRNAfMetCAT(-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
tRNAfMetCAU(-CA) RNA配列:
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA) (配列番号R-1)(20μl)に、10X ligationbuffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2)(4μl)、10mM ATP (4μl)、Nuclease free water (5.6μl)を加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)(2.4μL)および、5mMのアミノアシル化pCpA(nk-05、09、14、19、22)のDMSO溶液 (4μL)を加え、16℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-1、2、3、4、5)は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-1、2、3、4、5)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
以下の実験で示すとおり、アミノ基にAcbz基、チオール基にStBuをそれぞれ保護されたシステインまたはシステイン類縁体をN末端に翻訳導入することが可能であることが示された。すなわち、L-システインのみならず、D-システインや、LまたはD-Nメチルシステインを含むシステイン類縁体を、N末端に翻訳導入することが可能であることが示された。WO2013/100132A1において、アミノ基の保護基であるAcbz基はRNAが安定に存在できる反応条件下にて選択的に脱保護できることが示されており、アミド環化を有するペプチドライブラリーを効率的に合成するために必要な条件が満たされた。
Initiation suppression法を用いてN末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されているかを確かめるために、システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたtRNAfMetを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNAと、Thr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Glyの各アミノ酸をそれぞれ250μMずつ加え、さらに20μM 翻訳開始用のアミノアシルtRNAfMet(Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-2)、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、MALDI-TOF MSを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4)と各アミノ酸としてThr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、20μM 翻訳開始用のアミノアシルtRNAfMet(Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-2)、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)。
WO2013/100132A1において、Acbz保護基はMALDI測定中または測定前処理の操作中において外れてしまうことが報告されている。そのため、Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-2)、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)、をそれぞれ用いた翻訳実験では、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)による還元的条件によって脱保護を行った後に、MALDI-TOF MSによる質量分析を実施した。具体的には、得られた翻訳反応物に、pH 7.0トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)溶液(最終濃度20mM)を加えた後、37℃で1時間静置した。マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSで翻訳産物を分析した。
その結果N末端にシステインまたはシステイン類縁体が導入されたペプチド(表2、ペプチド配列番号Pep-3,4,5)を示すMSがそれぞれ観測された。また副生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド(表2、ペプチド配列番号Pep-2)を示すMSが観測された。
また対照実験として翻訳開始用アミノアシルtRNAの代わりに250μM Metを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルtRNAを加えないものをそれぞれ調製し、37℃で1時間静置した。翻訳反応物を、MALDI-TOF MSで分析した。MALDI-TOF MSにおけるマトリックスはα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いた。翻訳開始用アミノアシルtRNAの代わりに250μM Metを用いた場合は、N末端がホルミルメチオニン(以下ホルミルメチオニンをfMetと略称する)から開始されたペプチド(表2、ペプチド配列番号Pep-1)を示すMSが観測された。また翻訳開始用アミノアシルtRNAを加えないものでは,initiationread-through(特許文献(WO2013/100132A1))により、1文字目が読み飛ばされたペプチド(表2、ペプチド配列番号Pep-2)を示すMSが観測された。
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUUAAGCUUCG
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGly
N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4D)と各アミノ酸としてThr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)、14C-アスパラギン酸(最終濃度37μM、Moravek Biochemicals社、MC139)を加えた溶液を調製し、20μM システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたtRNAfMet(Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-2)、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
また対照実験として翻訳開始用アミノアシルtRNAの代わりに250μM Metを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルtRNAを加えないものをそれぞれ調製し、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(TEFCO社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動(16%Peptide-PAGE mini、TEFCO社、TB-162)を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(TEFCO社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に24時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
N末端にAcbz-Cys(StBu)、Acbz-D-Cys(StBu)、Acbz-MeCys(StBu)それぞれ翻訳導入した場合においても目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-10、11、12、15)のバンドが主生成物としてそれぞれ観測された(図1において、対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド(ペプチド配列番号Pep-8)の翻訳効率を100としたときの相対的な翻訳効率を示す)。また不純物として1文字目が読み飛ばされたペプチド(ペプチド配列番号Pep-9)を示すバンドが観測された。
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUGACGACGACUAAGCUUCG
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGlyAspAspAsp
上記の通り、Initiation suppression法によるN末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳合成する際に、2番目コドンにコードされるアミノ酸から開始して全長にわたって翻訳されたペプチドが副生成物として確認された。次に副生成物の生成を低減させて目的とするペプチドの翻訳効率を向上させるために、翻訳条件の最適化を行った。具体的には翻訳開始用アミノアシルtRNAの濃度条件(1,2,5,10,25μM)の検討を行い、目的とするペプチドと副生成物の生成比が最も良い翻訳条件を設定するに至った。
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、MALDI-TOF MSを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4)と各アミノ酸としてThr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、さらに2または25μMN-メチルシステイン類縁体がアミノアシル化されたtRNAfMet(Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-4)、o-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-5))を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(最終濃度20mM)を加えた後、37℃で1時間静置した。マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSにより翻訳産物を分析した。
その結果Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-4)をそれぞれ25μM使用した場合、主生成物としてN末端にNMeシステインまたはNMe-D-システインが導入されたペプチド(表4 ペプチド配列番号Pep-5、6)を示すMSがそれぞれ観測された(図2-1,2-2)。またAcbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-3)、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-4)をそれぞれ2μM使用した場合、主生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド(表2、ペプチド配列番号Pep-2)を示すMSが観測された(図2-1,2-2)。N末端にNMeシステインまたはNMe-D-システインが導入されたペプチド(表4 ペプチド配列番号Pep-5、6)を示すMSは観測されたものの、そのMS強度比は1文字目が読み飛ばされたペプチド(表1、ペプチド配列番号Pep-2)の1/10以下であった。
またo-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-5))を25μM用いた場合、主生成物としてN末端にNMeシステインが導入されたペプチド(表4 ペプチド配列番号Pep-5)を示すMSが観測された(図2-3)
N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4D)と各アミノ酸、Thr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)、14C-アスパラギン酸(最終濃度37μM、Moravek Biochemicals社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにシステインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたtRNAfMet(1,2,5,10,25μMの5条件を実施)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルtRNAの代わりに250μM Metを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルtRNAを加えないものを調製し、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(TEFCO社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動(16%Peptide-PAGE mini、TEFCO社、TB-162)を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(TEFCO社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に24時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
Acbz-MeCys(StBu)、Acbz-D-MeCys(StBu)それぞれの翻訳合成において、どちらの場合においてもアミノアシルtRNAの濃度が25μMのときに目的とするペプチドの翻訳効率が最も高く、さらに副生成物の翻訳効率が最も低いことが示された(図3-1)。具体的にはAcbz-MeCys(StBu)の場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-12)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は96:33(対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド(ペプチド配列番号Pep-8)の翻訳効率を100としたときの相対的な翻訳効率を示す)であった。またAcbz-D-MeCys(StBu)の場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-13)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は56:22であった。さらに、o-Acbz-MeCys(StBu)の場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-14)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は109:16であった(図3-2)。
以下の方法に従って、アミノ酸類縁体のアミノアシルtRNAの合成を行った。
4-1-1.転写によるtRNA(CA欠損)の合成
鋳型DNA(配列番号D-2)から、RiboMAX Large Scale RNAproduction System T7(Promega社,P1300)を用いたin vitro の転写により3'端のCAを欠くtRNAGluCUG(-CA)(配列番号R-2)を合成し、RNeasy Mini kit(Qiagen社)により精製した。
tRNAGluCTG(-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluAAG(-CA) DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
tRNAGluCUG(-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
tRNAGluAAG(-CA) RNA配列:
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
50μM 転写tRNAGluCUG(-CA) (配列番号R-2)またはtRNAGluAAG(-CA) (配列番号R-3)(20μl)に、10X ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2)(4μl)、10mM ATP (4μl)、Nuclease free water (5.6μl)を加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)(2.4μL)および、5mMのアミノアシル化pCpA(nk-026、28、30)のDMSO溶液 (4μL)を加え、16℃で45分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液40μLに、3M酢酸ナトリウム溶液(4μL)62.5mM ヨウ素(水:THF=1:1溶液)44μLを加え、室温で1時間、脱保護を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-7、8、9)は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-7、8、9)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
MeAla(4-Thz)-tRNAGluCUG
化合物AAtR-8
MeGly-tRNAGluCUG(配列番号:10)
化合物AAtR-9(配列番号:11)
AspSMe-tRNAGluAAG
次に翻訳の開始方法によって、翻訳の伸長反応におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度がどのように影響されるかを確認するための実験を実施した。具体的には、Initiation suppression法とInitiation read-through法の翻訳の開始方法をそれぞれ用いて、アミノ酸類縁体を複数含む同じペプチド化合物(ペプチド配列番号Pep-17)を翻訳合成を実施した。生成物を含む翻訳液のMS分析を行い、同じペプチド化合物である目的物のMS強度を比較し翻訳効率の比較を行った。また生成物の純度を確認するために生成物に含まれる切断ペプチドのMS強度を比較した。
Initiation read-through法を用いてN末端にCysを翻訳導入したペプチドを翻訳合成した後に、MALDI-TOF MSを用いて翻訳合成から得られたペプチドの純度を確認した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA(R-5-2 (配列番号17))と、各アミノ酸Ala,Arg,Cys,Gly,His,Ile,Lys,Pro,Ser,Thr,Trp,Val,3-フルオローL-チロシン(Tyr(3-F))をそれぞれ250μMずつ加え、N-メチルフェニルアラニン(MePhe)を5mM加え、さらに20μM MeAla(4-Thz)-tRNAGluCUG(化合物AAtR-7)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSで翻訳産物を分析した。その結果、N末端にCysが導入された目的物(ペプチド配列番号Pep-17)のMSが観測されたものの、2種類の切断ペプチド(ペプチド配列番号Pep-19、21)のMSも観測された(図4)。またそれぞれのペプチドのMS強度比は、目的物(ペプチド配列番号 Pep-17):切断ペプチド(ペプチド配列番号Pep-19):切断ペプチド(ペプチド配列番号 Pep-21)=1:1:1であった。
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA(R-5-1 (配列番号12))と、各アミノ酸Ala,Arg,Cys,Gly,His,Ile,Lys,Pro,Ser,Thr,Trp,Val,3-フルオローL-チロシン(Tyr(3-F))をそれぞれ250μMずつ加え、N-メチルフェニルアラニン(MePhe)を5mM加え、さらに20μM Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)と20μM MeAla(4-Thz)-tRNAGluCUG(化合物AAtR-7)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(最終濃度20mM)を加えた後、37℃で1時間静置した。マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSで翻訳産物を分析した。
その結果、N末端にCysが導入された目的物(ペプチド配列番号Pep-17)のMSがメインピークとして観測され、initiation read-through法と比べて28倍のMS強度であった(図4)
また4種類の切断ペプチド(ペプチド配列番号Pep-18、19、20、21)のMSは観測されたものの、目的物(ペプチド配列番号Pep-17)のMS強度と比べてそれぞれ1/20以下のMS強度であった。
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
以上の観測された現象が他のペプチドを翻訳合成する際にも観測されるかを確認するために実施した実験を次に記す。対照実験としてAcbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)の代わりに250μM Metを加えて、N末端がfMetで開始されたペプチドの翻訳合成を実施した。翻訳合成に使用した鋳型mRNA配列を以下の表8に記した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA(R-6-2 (配列番号18)、R-7-2 (配列番号19)、R-8-2 (配列番号20)、R-9-2 (配列番号21)、R-5-2 (配列番号17))と、各アミノ酸Arg,Cys,Gly,His,Ile,Lys,Pro,Ser,Thr,Trp,Val,3-フルオローL-チロシン(Tyr(3-F))をそれぞれ250μMずつ加え、N-メチルフェニルアラニン(MePhe)、N-メチルアラニン(MeAla)をそれぞれ5mM加え、さらに20μM MeGly-tRNAGluCUG(化合物AAtR-8)(配列番号:10)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型mRNA配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのMS理論値、MALDI-TOF MSの実測値を示す表9~13に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのMS強度を図5に記した。図5における切断ペプチドのMS強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのMS強度の合計値を表している。
Initiation suppression法を用いてN末端にAcbz-Cys(StBu)を翻訳導入したペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)によってAcbzを脱保護を行った。得られた反応混合物をMALDIによる質量分析を実施し、翻訳合成によって得られるペプチドの純度を確認した。
翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,6mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,1.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNA(R-6-1 (配列番号18)、R-7-1 (配列番号19)、R-8-1 (配列番号20)、R-9-1 (配列番号21)、R-5-1 (配列番号17))と、各アミノ酸Arg,Cys,Gly,His,Ile,Lys,Pro,Ser,Thr,Trp,Val,3-フルオローL-チロシン(Tyr(3-F))をそれぞれ250μMずつ加え、N-メチルフェニルアラニン(MePhe)、N-メチルアラニン(MeAla)をそれぞれ5mM加え、さらに20μM MeGly-tRNAGluCUG(化合物AAtR-8)(配列番号:10)、20μM Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-1)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型mRNA配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのMS理論値、MALDI-TOF MSの実測値を示す表14~18に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのMS強度を図5に記した。図5における切断ペプチドのMS強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのMS強度の合計値を表している。
5―1. N末端に保護基を持つNMeシステインを有し、C末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドの翻訳合成と、翻訳合成したペプチドの保護基を脱保護した後にネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成
以下の反応式に示すようにInitiation suppression法を用いてN末端にAcbz-MeCys(StBu)を持つペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)によってAcbzを脱保護とネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成を実施した。具体的には、MeCysを基質とするネイティブケミカルライゲーションはチオエステル交換から生成するチオラクトン体と、その後のS-N交換から生成するNCLアミド体との間で平衡が存在し、2つの混合物が得られる。その混合物を脱硫反応に付し、NCLアミド体を脱硫させることによって平衡を偏らせて反応を進行させ目的の環状ペプチドが得られた。よって翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し、目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできる反応条件の設定に至った。
得られた反応混合物をMALDIによる質量分析を実施し、それぞれの反応が進行し目的のアミド環化ペプチドが得られたことを確認した。翻訳合成に使用した鋳型mRNA配列を以下の表19に記した。
次に翻訳反応液(8μL)に、150mM TCEP環化反応試薬溶液(2μL)を混合し、37℃で1時間静置した。Acbzの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、MALDI-TOFMSにより確認した(図6)。MALDI-TOF MSの分析には反応液を1μLサンプリングしSPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて実施した。また、150mM TCEP環化反応試薬溶液は、pH 7.0TCEP溶液(500mM,12μL)、pH8.3 Tris溶液(2M,3μL)、pH8.0 EDTA溶液(500mM、nacalai社 製品番号14362-24、5μL)、水酸化カリウム水溶液(200mM、20μL)を混合し調製した。
さらに、環化反応液(7μL)に、pH 7.0TCEP溶液(500mM,7μL)、グルタチオン(GSH)溶液(250mM,1μL)を加え、42℃で1分間静置し、続いて2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩(VA-044)溶液(1M、4μL)、水酸化カリウム水溶液(1M、1μL)を混合し42℃で2時間静置した。
脱硫反応が進行していることを、MALDI-TOF MSにより確認した(図6)。MALDI-TOF MSの分析には、反応液を1μLサンプリングしSPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて実施した。
[MeCys*]Ser[MePhe][MePhe]ValGlnSer[Tyr(3-F)]SerAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-43とPep-44の混合物)
Pep-43
Pep-44
m/z=1477.5 (M+H)+ Calc.1476.7
[MeAla*]Ser[MePhe][MePhe]ValGlnSer[Tyr(3-F)]SerAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-45)
Pep-45
m/z=1445.5 (M+H)+ Calc.1444.7
[MeCys*]Ser[MePhe]ValGlnIle[MePhe]SerValAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-46とPep-47)
Pep-46
Pep-47
m/z=1421.5 (M+H)+ Calc.1420.7
[MeAla*]Ser[MePhe]ValGlnIle[MePhe]SerValAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-48)
Pep-48
m/z=1389.6 (M+H)+ Calc.1388.7
[MeCys*]ThrThrPro[MePhe]GlyGlnSer[Tyr(3-F)]IleValAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-49とPep-50)
Pep-49
Pep-50
m/z=1611.4 (M+H)+ Calc.1610.8
[MeAla*]ThrThrPro[MePhe]GlyGlnSer[Tyr(3-F)]IleValAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-51)
Pep-51
m/z=1579.5 (M+H)+ Calc.1578.8
[MeCys*][MePhe]ValThrGlnAlaThr[Tyr(3-F)]GlyIleAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-52とPep-53)
Pep-52
Pep-53
m/z=1498.4 (M+H)+ Calc.1497.7
[MeAla*][MePhe]ValThrGlnAlaThr[Tyr(3-F)]GlyIleAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-54)
Pep-54
m/z=1466.5 (M+H)+ Calc.1465.7
[MeCys*]Ser[MePhe]ProSerGlnIleVal[Tyr(3-F)]ThrAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-55とPep-56)
Pep-55
Pep-56
m/z=1540.4 (M+H)+ Calc.1539.7
[MeAla*]Ser[MePhe]ProSerGlnIleVal[Tyr(3-F)]ThrAsp*ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-57)
m/z=1508.4 (M+H)+ Calc.1507.7
[MeCys*][MePhe][Tyr(3-F)]Trp[MePhe]ProGln[MePhe]LysTrpAsp*ProArg[Tyr(3-F)](2つの*部位にて環化)(Pep-58とPep-59)
Pep-58
Pep-59
m/z=2056.4 (M+H)+ Calc.2055.9
[MeAla*][MePhe][Tyr(3-F)]Trp[MePhe]ProGln[MePhe]LysTrpAsp*ProArg[Tyr(3-F)](2つの*部位にて環化)(Pep-60)
Pep-60
m/z=2024.7 (M+H)+ Calc.2024.0
翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできるそれぞれの反応条件下において、RNAが安定であることを確認する実験を行った。
6-1. 翻訳後修飾条件下における安定性を評価するためのmRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の調製
文献記載(特許文献 WO2013/100132)の方法により調製したDNAライブラリー(配列番号 D-16)を鋳型に、T7RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System(Promega社、P1320)を用いたin vitro転写によりmRNA(配列番号R-16)を調製し、RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製した。
6μM mRNA(配列番号R-16)を、9μMのピューロマイシンリンカー (Sigma社)(配列番号C-1)、 1X T4RNAライゲースリアクションバッファー(New england bio lab.社)、1mM ATP、10% DMSO、0.625unit/μl T4 RNAライゲース(Newengland bio lab.社)の条件で、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MinElute kit(Qiagen社)により精製しmRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を得た。
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(NNN)9TAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGATAGGGCGGCGGGGACAAA
配列中に(NNN)と示した箇所は、TTT,TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, GAA, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTがランダムに出現することを意味する。また、(NNN)9は任意のNNNが9回結合していることを意味しており(ATT)9のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAA
配列中に(PPP)と示した箇所は、UUU,UUG, CUA, AUU, GUU, CCG, ACU, GCU, UAC, CAU, CAG, GAA, UGG, CGG, AGU, AGG, GGUがランダムに出現することを意味する。また、(PPP)9は任意のPPPが9回結合していることを意味しており(AUU)9のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。
[P]CCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]([P]:5'リン酸化)
詳細な部分構造は以下の通りである。
mRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)(配列番号:31)
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAACCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]
前述したAcbz基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応、その後の脱硫反応という一連の反応条件においてRNAが安定に存在するかを確認した。すなわち、mRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を一連の反応条件に付した後、ゲル電気泳動による解析を行った。
その後RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製し、mRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の溶液を得た後、電気泳動による解析を行った。(図7、レーン1)。
さらに標準溶液として、反応条件に付していない0.5μM mRNA-ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)溶液を泳動比較に用いることにした(図7,レーン3)。またマーカーとしてTrackIt 10 bp ladder (Life Technologies社, 製品番号10488-019)を用いた(図7,レーン4)。
2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩(化合物nk31)の合成
LCMS(ESI) m/z = 166 (M+H)+
保持時間:0.36分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸(4-ニトロフェニル)4-アジドベンジル(62.9mg、0.20mmol)の混合物に室温にてDMF(0.40mL)を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン(84μL、0.60mmol)を添加した。反応混合物を25℃で3日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン(化合物nk32)(53.9mg、68%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 397 (M-H)-
保持時間:0.90分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 438 (M+H)+
保持時間:0.99分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1033 (M+H)+
保持時間:0.61分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸(4-ニトロフェニル)4-アジドベンジル(62.9mg、0.20mmol)の混合物に室温にてDMF(0.4mL)を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン(139μL、1.00mmol)を添加した。反応混合物を35℃で1日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸(化合物nk35)(47.5mg、58%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 411 (M-H)-
保持時間:0.91分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 452 (M+H)+
保持時間:1.00分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1047.5 (M+H)+
保持時間:0.63分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 334 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 322 (M-H)-
保持時間:0.79分(分析条件SQDFA05)
窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸(4-ニトロフェニル)4-アジドベンジル(29.2mg、0.093mmol)の混合物に室温にてDMF(0.93mL)を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン(32μL、0.233mmol)を添加した。反応混合物を30℃で3日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸(化合物nk40)(18.8mg、51%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 397 (M-H)-
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 436 (M-H)-
保持時間:0.93分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1033.6 (M+H)+
保持時間:0.58分(分析条件SQDFA05)
反応液を減圧濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.1%ギ酸水溶液/0.1%ギ酸アセトニトリル溶液)にて精製し、(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物nk43)(77.8mg、95%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 416 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 194 (M+H)+
保持時間:0.25分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 367 (M-H)-
保持時間:0.77分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 408 (M+H)+
保持時間:0.88分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 1001 (M-H)-
保持時間:0.53分(分析条件SQDFA05)
得られた濃縮残渣をアセトニトリル(1.6mL)に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(0.14mL、0.80mmol)を添加した。混合物を-20度に冷却後にクロロぎ酸クロロメチル(51.6mg、0.400mmol)を加えた。反応混合物を0度で30分撹拌した後、水(7.2μL、0.40mmol)を加えて反応混合物を室温で10分撹拌した後に反応液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣をアセトニトリル(1.6mL)に溶かし、テトラブチルアンモニウムアジド(569mg、2.00mmol)を添加した。反応混合物を室温で3日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(0.05%トリフルオロ酢酸水溶液/0.05%トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液)にて精製し、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル(化合物nk50)(89.7mg、62%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 365 (M+H)+
保持時間:0.92分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 349 (M-H)-
保持時間:0.78分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 390 (M+H)+
保持時間:0.89分(分析条件SQDFA05)
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物nk53)の合成
LCMS(ESI) m/z = 985.5 (M+H)+
保持時間:0.54分(分析条件SQDFA05)
8-1. アミノ酸類縁体をN末端に導入するためのアミノアシルtRNA合成
50μM 転写tRNAfMetCAU(-CA) (配列番号R-1)(20μl)に、10X ligationbuffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2)(4μl)、10mM ATP (4μl)、Nuclease free water (5.6μl)を加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)(2.4μL)および、5mMのアミノアシル化pCpA(nk-34、37、42、47、53)のDMSO溶液 (4μL)を加え、16℃で45分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-10、11、12、13、14)は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化tRNA(化合物AAtR-10、11、12、13)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
9-1. Initiation suppression法を用いてN末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸を有するペプチドの翻訳合成
上記3-2と同様に、Initiation suppression法を用いて、アミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたtRNAfMetを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、無細胞翻訳液(1%(v/v)RNaseinRibonuclease inhibitor(Promega社,N2111),1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,10mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),0.1mM 10-HCO-H4folate、4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.6μM メチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ,0.26μM EF-G、0.24μM RF2、0.17μM RF3、0.5μM RRF,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,0.73μM AlaRS,0.03μM ArgRS,0.38μM AsnRS,0.13μM AspRS,0.02μM CysRS,0.06μM GlnRS,0.23μM GluRS,0.09μM GlyRS,0.02μM HisRS,0.4μM IleRS,0.04μM LeuRS,0.11μM LysRS,0.03μM MetRS,0.68μM PheRS,0.16μM ProRS,0.04μM SerRS,0.09μM ThrRS,0.03μM TrpRS,0.02μM TyrRS,0.02μM ValRS(自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した))に、1μM 鋳型mRNAと、Thr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Glyをそれぞれ250μMずつ加え、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたtRNAfMetを翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、MALDI-TOF MSを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4)と各アミノ酸としてThr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたtRNAfMet(Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-10)、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-11)、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-12)、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-13)、Azoc-(tBuSSEt)GABA -tRNAfMetCAU(化合物AAtR-14))(最終濃度25μM)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)(最終濃度20mM)を加えた後、37℃で1時間静置した。マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて、MALDI-TOF MSにより翻訳産物を分析した。
その結果N末端にチオール基を有するアミノ酸が導入されたペプチド(表21 ペプチド配列番号Pep-61、Pep-62、Pep-63,Pep-64,Pep-65)を示すMSが観測された。
N末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μM 鋳型mRNA(R-4D)と各アミノ酸、Thr,Arg,Lys,Ala,Tyr,Trp,Ser,Leu,Pro,Gly(各々最終濃度250μM)、14C-アスパラギン酸(最終濃度37μM、Moravek Biochemicals社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたtRNAfMet(Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-10)、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-11)、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-12)、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-13)、Azoc-(tBuSSEt)GABA-tRNAfMetCAU(化合物AAtR-14)(最終濃度25μM)を翻訳液混合物に加えて、37℃で1時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルtRNAの代わりに250μM Metを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルtRNAを加えないものを調製し、37℃で1時間静置した。
得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(TEFCO社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動(16%Peptide-PAGE mini、TEFCO社、TB-162)を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(TEFCO社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に24時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
その結果Acbz-(tBuSSEt)Glyの場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-66)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は96:10(対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド(ペプチド配列番号Pep-8)の翻訳効率を100としたときの相対的な翻訳効率を示す)であった(図8)。また、Acbz-(tBuSSEt)βAlaの場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-67)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は92:12であり、Acbz-βhCys(StBu)の場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-68)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は104:11であった。
また、Acbz-Pro(SSMe)の場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-69)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は93:9、Azoc-(tBuSSEt)GABAの場合、目的物であるペプチド(ペプチド配列番号Pep-70)と副生成物(ペプチド配列番号Pep-9)の生成比は108:10であった(図9)。
10-1. 翻訳産物から分枝ペプチドの生成を可能とするアシルpCpAの合成
2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物nk48、DMT-HOGly-pCpA)の合成
LCMS(ESI) m/z = 1081.6 (M-H)-
保持時間:0.84分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 709 (M-H)-
保持時間:0.13分(分析条件SQDFA05)
50μM 転写tRNAGluCUG(-CA) (配列番号R-2)(20μl)に、10X ligationbuffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2)(4μl)、10mM ATP (4μl)、Nuclease free water (5.6μl)を加え、95℃で2分間加熱した後、室温で5分間放置し、tRNAのリフォールディングを行った。10unit/μl T4 RNAリガーゼ(New england bio lab.社)(2.4μL)および、5mMのHOGly-pCpA(nk-49)のDMSO溶液 (4μL)を加え、16℃で45分間ライゲーション反応を行った。アシル化tRNA(化合物AAtR-15)は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アシル化tRNA(化合物AAtR-15)は、翻訳混合物に添加する直前に1mM酢酸ナトリウムに溶解した。
鋳型mRNA 配列番号R-18 (配列番号:37)
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUUGCCCGCAGAUUAAAUACGUUGGUCUUCCGCGUUAAGCUUCG
次に翻訳反応液(7.8μL)に、pH 7.0TCEP溶液(500mM,1.2μL)、N-メチルー2-ピロリドン(NMP)(10μL) 、pH8.0 EDTA溶液(500mM、nacalai社 製品番号14362-24、0.5μL)、Nucleasefree water(0.5μL)を
をそれぞれ混合し、37℃で30分間静置した。Acbzの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、MALDI-TOFMSにより確認した(図10-1)。MALDI-TOF MSの分析には反応液を1μLサンプリングしSPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて実施した。
[Cys*]Ser[MePhe]CysProHOGlyIleLys[Tyr(3-F)]ValGly[Asp*]ProArg(2つの*部位にて環化)(Pep-71)
Pep-71
m/z=1556.4 (M+H)+ Calc.1555.7
HOGlyIleLys[Tyr(3-F)]ValGly[Asp(SMe)]ProArg(Pep-72)
Pep-72
m/z=1053.3 (M+H)+ Calc.1052.5
前述のPep-71を含む環化反応液(10μL)に、N-メチルー2-ピロリドン(NMP)(20μL)、pH 7.0TCEP溶液(500mM,5μL)、pH9.2 ビシン溶液(2M、9μL)、水酸化カリウム水溶液(5M、6μL)、4-(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(6.8μL、50μL)をそれぞれ混合し、30℃で24時間静置した。
分枝ペプチドが生成していることを、MALDI-TOF MSにより確認した(図10-2、上図)。その結果目的物である分枝ペプチド(Pep-73)と副生成物(Pep-74)と環状ペプチド(Pep-71)のMS強度比は20:6:74であった。
MALDI-TOF MSの分析には、反応液を2μLサンプリングしSPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて実施した。
m/z=1356.3 (M+H)+ Calc.1355.6
m/z=1005.3 (M+H)+ Calc.1004.5
前述のPep-71を含む環化反応液(10μL)に、N-メチル-2-ピロリドン(NMP)(20μL)、TCEP溶液(1M,5μL)、pH9.2 ビシン溶液(2M、8μL)、水酸化カリウム水溶液(5M、7μL)、4-(トリフルオロメチル)ベンゼンチオール(6.8μL、50μL)をそれぞれ混合し、45℃で14時間静置した。
TCEP溶液(1M)は、TCEP塩酸塩(73.2mg、0.256mmol)、水酸化カリウム水溶液(8M、128μL)を混合しNucleasefree waterを用いて調製した。
分枝ペプチドが生成していることを、MALDI-TOF MSにより確認した(図10-2、下図)。その結果目的物である分枝ペプチド(Pep-73)と副生成物(Pep-74)と環状ペプチド(Pep-71)のMS強度比は85:9:6であった。MALDI-TOF MSの分析には、反応液を2μLサンプリングしSPE C-TIP(日京テクノス社)で精製し、マトリックスとしてα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用いて実施した。
以上の結果から、分枝化反応の条件を改良することによって翻訳産物から一連の反応を経て目的とする分枝ペプチドを良好な収率で進行することが示された。
一方、文献(WO2013/100132A)からこれらの一連の反応条件はRNAが十分安定な範囲であるため、ペプチド-RNA複合体においてもRNAを分解させることなく良好な収率で分枝反応を進行させることが可能である。
initiation suppression法を利用して環状ペプチドのディスプレイライブラリを作製しパニングを実施してGTPase KRas(KRAS)に対する結合ペプチドを取得するための実験を行った。
3-(4-クロロフェニル)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物nk56、Pen-MePhe(4-Cl)-OCH 2 CN)の合成
下記のスキームにしたがって合成を行った。
窒素雰囲気下、前工程にて得られた(S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸(化合物nk54、Boc-MePhe(4-Cl)-OH)(1.50g、4.78mmol)のジクロロメタン(80mL)溶液にN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(1.24g、9.59mmol)および2-ブロモアセトニトリル(2.28g、19.0mmol)を加えて25℃で16時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル)にて精製し、(S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸シアノメチル(化合物nk55、Boc-MePhe(4-Cl)-OCH2CN)(1.45g、86%)を得た。
前工程にて得られた(S)-2-((tert-ブトキシカルボニル)(メチル)アミノ)-3-(4-クロロフェニル)プロパン酸シアノメチル(化合物nk55、Boc-MePhe(4-Cl)-OCH2CN)(1.30g、3.68mmol)をジクロロメタン(50mL)に溶解し、塩酸ガスを吹き付け20℃にて1時間撹拌した。反応液を濃縮し、混合物として(S)-3-(4-クロロフェニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸シアノメチルを(1.06g)得た。
前工程にて得られた(S)-3-(4-クロロフェニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸シアノメチルの混合物(0.96g)をジクロロメタン(50mL)に溶解し、0℃にてトリエチルアミン(840mg、8.30mmol)を加えた後、塩化ペンタ-4-エノイル(472mg、3.98mmol)のジクロロメタン溶液(10mL)を滴下しながら加えた。反応液を20℃で2時間撹拌した後、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル)にて精製し、3-(4-クロロフェニル)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物nk56、Pen-MePhe(4-Cl)-OCH2CN)(0.918g、83%、2工程)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 335 (M+H)+
保持時間:2.21分(分析条件SMD method5)
LCMS(ESI) m/z = 1000 (M+H)+
保持時間:0.58分(分析条件SQDFA05)
LCMS(ESI) m/z = 928 (M-H)-
保持時間:0.52分(分析条件SQDFA05)
水(40mL)と1,4-ジオキサン(40mL)の混合溶媒に、得られた粗生成物である(S)-2-アミノ-4-(メチルスルホニル)ブタン酸(H―Met(O2)-OH)(2.88g)とペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル (3.76g、19.1mmol)、炭酸水素ナトリウム(2.68g、31.9mmol)を加えた後、反応液を25℃で4時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで2回洗浄した後、水層を1Mの塩酸水溶液でpH2になるまで調整し、ジクロロメタンで4回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール)にて精製し、(S)-4-(メチルスルホニル)-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸(化合物nk59、Pen-Met(O2)-OH)(2.4g、74%、2工程)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 264 (M+H)+
保持時間:1.00分(分析条件SMD method4)
LCMS(ESI) m/z = 303 (M+H)+
保持時間:0.50分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 968.5 (M+H)+
保持時間:0.44分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 898 (M+H)+
保持時間:0.29分(分析条件SQDFA05)
水(28mL)と1,4-ジオキサン(28mL)の混合溶媒に、得られた粗生成物である(S)-2-アミノ-3-(3-クロロフェニル)プロパン酸(H―Phe(3-Cl)-OH)(2.22g)とペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル (2.62g、13.3mmol)、炭酸水素ナトリウム(1.86g、22.1mmol)を加えた後、反応液を25℃で16時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで2回洗浄した後、水層を1Mの塩酸水溶液でpH2になるまで調整し、ジクロロメタンで3回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン/メタノール)にて精製し、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-(ペンタ-4-エンアミド)プロパン酸(Pen-Phe(3-Cl)-OH)(1.5g、45%、2工程)を得た。
窒素雰囲気下、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-(ペンタ-4-エンアミド)プロパン酸(Pen-Phe(3-Cl)-OH)(1.50g、5.32mmol)およびN-エチル-イソプロピルプロパン-2-アミン(DIPEA)(1.37g、10.6mmol)をジクロロメタン(24ml)に溶解し、2-ブロモアセトニトリル(2.55g、21.3mmol)を加えて25℃で16時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル)にて精製し、(S)-3-(3-クロロフェニル)-2-(ペンタ-4-エンアミド)プロパン酸シアノメチル(化合物nk63、Pen-Phe(3-Cl)-OCH2CN)(0.767g、45%)を得た。
LCMS(ESI) m/z = 321 (M+H)+
保持時間:0.87分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 986 (M+H)+
保持時間:0.77分(分析条件SQDAA05)
LCMS(ESI) m/z = 914 (M―H)―
保持時間:0.47分(分析条件SQDFA05)
特許文献(WO2013/100132A1)に記載の手法でパニングに使用するアシル化tRNAを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表23に示した。表24に示すElongatorアミノアシル化tRNA混合物を調製した。以降、翻訳で使用する際には、表24示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。Initiatorアミノアシル化tRNAの調製は、ライゲーション反応後、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。表25に示す三種類を個別に調整し、翻訳で使用する際にもいずれか一つを表に示す最終濃度で翻訳液に添加した。
特許文献(WO2013/100132A1)に記載の手法で、DNAライブラリを構築した。 TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG,AGT, AGG, GGTのいずれかのコドンが9回繰り返しで出現するもの用意した。
パニングに使用する標的タンパク質として、大腸菌で発現・精製したGTPase KRas(KRAS)を用いた。非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、および非特許文献ProteinScience,1999,8,921-929の方法を用いてビオチン化タンパクを調製した。
パニングに使用した翻訳液は以下の組成で構成される。1mM GTP,1mM ATP,20mMクレアチンリン酸,50mM HEPES-KOH pH7.6,100mM 酢酸カリウム,10mM 酢酸マグネシウム,2mMスペルミジン,1mM ジチオスレイトール,0.5mg/ml E.coli MRE600(RNaseネガティブ)由来tRNA(Roche社),4μg/ml クレアチンキナーゼ,3μg/ml ミオキナーゼ,2unit/ml 無機ピロフォスファターゼ,1.1μg/ml ヌクレオシド二リン酸キナーゼ,0.26μM EF-G,2.7μM IF1,0.4μM IF2,1.5μM IF3,40μM EF-Tu,44μM EF-Ts,1.2μM リボソーム,2.73μM AlaRS,0.09μM GlyRS,0.4μM IleRS,0.5μM 変異体PheRS05(特許文献WO2016/148044),0.16μM ProRS,1μM 変異体SerRS37(特許文献WO2016/148044),0.09μM ThrRS,0.01μM TrpRS,0.02μM TyrRS,1μM 変異体ValRS13(特許文献WO2016/148044),0.11μM LysRS,0.33μM HisRS,3μM in vitro転写大腸菌tRNA Ala1B,3μM 精製大腸菌tRNA His QUG(非特許文献Nucleic Acids Res. 2010 Apr;38(6):e89.の手法に習い精製。),250μMグリシン、250μMイソロイシン、250μMプロリン、250μMスレオニン、250μMトリプトファン、250μMリジン、5mM N-メチルバリン、5mM N-メチルセリン、5mM N-メチルアラニン、5mM N-メチルフェニルアラニン、250μM 3-フルオロチロシン、5mM N-メチルヒスチジン、表23に示すElongatorアミノアシル化tRNA混合物。さらにInitiatorアミノアシル化tRNA(表24)のなかのいずれか一つを加えて調製した。
前述の二本鎖DNAライブラリと翻訳液を使用し、特許文献(WO2013/100132A1)に倣ってパニングを実施した。
パニング後のDNAプールの塩基配列解析を行い、出現頻度の高かった配列について、特許文献(WO2013/100132A1)に倣ってペプチドの固相合成を実施した。標的タンパク質に対する結合能をBiacoreで確認した。その結果複数の配列で標的に結合することが示された。
これらの標的に結合する配列は複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチドであった。以上の結果よりinitiation suppression法を用いて、GTPase KRas(KRAS)に対して結合するアミノ酸類縁体を複数含む環状ペプチドを取得できたことが示された。
Claims (10)
- (i)第一の反応点を有する下記一般式(I)または下記一般式(II):
(式中、
R1は、S-R23(ここで、R23はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい)、スルホネート(-SO3 -)、およびチオスルホネート(-S2O3 -)からなる群より選択される基であり;
R2、およびR3は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはR2とR3は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し;あるいはR2またはR3は、R4およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し;
R4は、置換されていてもよいアルキレンであり;
R11、およびR12は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく;
SP-1は、以下の式:
(式中のP1は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである)で表される)アミノ酸残基をN末端に有し、かつその側鎖の1つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をN末端から少なくとも4残基C末端側に有する非環状ペプチド、または該非環状ペプチドと該非環状ペプチドをコードする核酸との複合体を合成する工程であって、該非環状ペプチドは、該非環状ペプチドをコードする核酸からイニシエーションサプレッション法により翻訳して合成される工程、および
(ii)該非環状ペプチド、または該複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程であって、第一の反応点はアミノ基であり、第二の反応点は活性エステルである工程
を含む、2以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、該ペプチドと該核酸との複合体または該複合体を含むライブラリーの製造方法。 - R23が、メチル、エチル、イソプロピル、tert―ブチル、フェニル、p-トリフルオロメチルフェニル、p-フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、請求項1に記載の方法。
- R2、R3は、それぞれ独立して、水素原子、またはハロゲンで置換されてもよいC1-C4アルキルである、請求項1または2に記載の方法。
- R4が、以下:
(式中、R13~R18は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである)からなる群より選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。 - R13~R18が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、請求項4に記載の方法。
- R11およびR12がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下:
(ここでR13’~R18’は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである)からなる群より選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法。 - R13’~R18’が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、請求項6に記載の方法。
- 一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1~R4およびSP-1は、それぞれ請求項1に記載のR1~R4およびSP-1と同意義を表し、
R13’~R16’は、それぞれ請求項6に記載のR13’~R16’と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1、R4およびSP-1は、それぞれ請求項1に記載のR1、R4およびSP-1と同意義を表し、
R13’~R18’は、それぞれ請求項6に記載のR13’~R18’と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。 - 一般式(I)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1~R3およびSP-1は、それぞれ請求項1に記載のR1~R3およびSP-1と同意義を表し;
R13~R16は、それぞれ請求項4に記載のR13~16と同意義を表し;
R13’~R16’は、それぞれ請求項6に記載のR13’~R16’と同意義を表し;あるいはR2は、R13、R14、R15またはR16およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する)
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
一般式(II)で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式:
(式中、
R1およびSP-1は、それぞれ請求項1に記載のR1およびSP-1と同意義を表し;
R13~R18は、それぞれ請求項4に記載のR13~R18と同意義を表し;
R13’~R18’は、それぞれ請求項6に記載のR13’~R18’と同意義を表す。)
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。 - SP-1が、4-アジドベンジルオキシカルボニル(p-Acbz)、2-アジドベンジルオキシカルボニル(o-Acbz)、アジドメトキシカルボニル(Azoc)、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Phdec)、2-ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル(Pydec)、もしくは2-(t-ブチルジスルファニル)エチルオキシカルボニル(Tbeoc)であるか、またはSP-1は、これが結合するN原子およびR2と一緒になってアジド基を形成する、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
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