WO2017150732A1 - チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸をｎ末端に持つ非環状ペプチド－核酸複合体、そのライブラリー、およびそれから誘導される環状ペプチド－核酸複合体ライブラリーの製造方法 - Google Patents

チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸をｎ末端に持つ非環状ペプチド－核酸複合体、そのライブラリー、およびそれから誘導される環状ペプチド－核酸複合体ライブラリーの製造方法 Download PDF

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太田　淳
飯田　健夫
仁 飯倉
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide comprising a plurality of amino acid analogs in which an amino acid having a thiol group in the vicinity of an amino group is arranged at the N-terminus, and an efficient translation technique for the peptide and nucleic acid complex.
  • the present invention also relates to a peptide having a cyclic portion containing a plurality of amino acid analogs, a complex of the peptide and a nucleic acid, and a method for producing a library containing the peptide.
  • Non-Patent Document 6 considering that peptides cyclized by thioether bonds, which are produced by conventional methods, are generally susceptible to oxidative metabolism (Non-Patent Document 6), there remains room for improvement in metabolic stability. Yes.
  • the peptide library cyclized by the amide bond reported in Patent Document 1 is superior in membrane permeability and metabolic stability compared to the peptide library having the thioether cyclization site described above.
  • Patent Document 1 The following three methods have been reported to translate and synthesize peptides having a cysteine or cysteine analog at the N-terminus, which is the cyclized peptide precursor.
  • iRT initiation-read-through
  • Patent Document 1 discloses that when cysteine and a cysteine analog are unprotected, it is difficult to prepare an aminoacyl-tRNA, and a pentenoyl group or 6-nitroveratryloxycarbonyl as a protecting group for an amino group. It has been reported that an aminoacyl-tRNA having a (NVOC) group was used.
  • Non-Patent Documents 5, 8, 9 are methods using aminoacyl-tRNA, an amino acid analog that is directly involved in the translation introduction site.
  • Non-patent Document 10 a phenomenon is known in which peptides that are cut before and after the introduction point of an amino acid analog (these are defined as “cleaved peptides”) are generated.
  • the present invention has been made in view of the above-described problems, and provides an efficient translation technique for a peptide containing a plurality of amino acid analogs in which an amino acid residue having a thiol group in the vicinity of the amino group is arranged at the N-terminus.
  • the purpose is to do.
  • Another object of the present invention is to provide a peptide having a cyclic part containing a plurality of amino acid analogs and having a cyclization site by an amide bond, a complex of the peptide and a nucleic acid, and a library containing the peptide. To do.
  • the present inventors have proposed that the translation initiation method, which has not been directly involved in the translation elongation reaction, is useful for the translation efficiency of amino acid analogues and the purity of the product downstream of translation and the generation of cleaved peptides as impurities. It was made clear that it would have an impact. This fact cannot be detected by the usual evaluation method (that is, evaluation with peptides composed of natural amino acids other than the N-terminal), and is possible only by evaluation with peptides containing multiple amino acid analogs. It became.
  • the present inventors are amino acid residues having a thiol group in the vicinity of an amino group in the presence of various functional groups in a peptide or a complex of a peptide and a nucleic acid, and both the thiol group and the amino group are selective. Moreover, when a peptide having an amino acid residue protected at a specific protecting group capable of quantitative deprotection at the N-terminus is translated by the iSP method, the initiation probability of the translation reaction is improved and a cleavage peptide is generated. It was clarified that translation efficiency and purity were improved.
  • the present inventors are able to efficiently cyclize the peptide obtained by using the iSP method and the peptide site of the peptide-nucleic acid complex, and the peptide having the cyclization site and the peptide-nucleic acid complex. A new production method has been found and the present invention has been achieved.
  • the present invention includes the following.
  • [1] A method for producing a peptide containing two or more amino acid analog residues and having a cyclic part, a complex of the peptide and a nucleic acid, or a library containing the complex,
  • R1 is a thiol protecting group capable of translational synthesis
  • R2 and R3 are each independently a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, an alkynyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an aralkyl group, or a cycloalkyl group, and these groups may be substituted.
  • R2 and R3 together with the atoms to which they are attached form a ring; or R2 or R3 together with R4 and the atoms to which they are attached form a ring, provided that R2
  • R4 is alkylene, arylene, heteroarylene, alkylenearylene, alkyleneheteroarylene, arylenealkylene, or heteroarylenealkylene, and these groups may be substituted
  • R11 and R12 are each independently a single bond, alkylene, arylene, heteroarylene, alkylenearylene, alkyleneheteroarylene, arylenealkylene, or heteroarylenealkylene, and these groups may be substituted
  • SP-1 together with the N atom to which it is attached and R2 form an azide group
  • R1 is S—R23, wherein R23 is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, or aralkyl, and these groups may be substituted, sulfonate (—SO 3 ⁇ ), and thio
  • R23 is methyl, ethyl, isopropyl, tert-butyl, phenyl, p-trifluoromethylphenyl, p-fluorophenyl, benzyl, or phenethyl, and these groups may be substituted, [2] the method of.
  • R4 is the following: (Wherein R13 to R18 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, or an optionally substituted alkoxy), selected from the group consisting of [1] to [4] The method according to any one of the above. [6] The method according to [5], wherein R13 to R18 are each independently a hydrogen atom or methyl.
  • R11 and R12 are each independently a single bond, or Wherein R13 ′ to R18 ′ are each independently selected from the group consisting of a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, or an optionally substituted alkoxy.
  • R13 ′ to R18 ′ are each independently a hydrogen atom or a methyl group.
  • the amino acid residue represented by the general formula (I) has the following general formula: (Where R1 to R4 and SP-1 have the same meanings as R1 to R4 and SP-1 described in [1], respectively.
  • R13 ′ to R16 ′ each have the same meaning as R13 ′ to R16 ′ described in [7].
  • the amino acid residue represented by the general formula (II) has the following general formula: (Where R1, R4 and SP-1 have the same meanings as R1, R4 and SP-1 described in [1], respectively. R13 ′ to R18 ′ each have the same meaning as R13 ′ to R18 ′ described in [7].
  • the amino acid residue represented by the general formula (I) has the following general formula: (Where R1 to R3 and SP-1 have the same meanings as R1 to R3 and SP-1 described in [1], respectively; R13 to R16 each represent the same meaning as R13 to 16 described in [5]; R13 ′ to R16 ′ each have the same meaning as R13 ′ to R16 ′ described in [7]; or R2 forms a ring together with R13, R14, R15 or R16 and the atoms to which they are bonded.
  • An amino acid residue, or The amino acid residue represented by the general formula (II) has the following general formula: (Where R1 and SP-1 each have the same meaning as R1 and SP-1 described in [1]; R13 to R18 each have the same meaning as R13 to R18 described in [5]; R13 ′ to R18 ′ each have the same meaning as R13 ′ to R18 ′ described in [7].
  • SP-1 is 4-azidobenzyloxycarbonyl (p-Acbz), 2-azidobenzyloxycarbonyl (o-Acbz), azidomethoxycarbonyl (Azoc), phenyldisulfanylethyloxycarbonyl (Phdec), 2-pyridyldi Sulfanylethyloxycarbonyl (Pydec), or 2- (t-butyldisulfanyl) ethyloxycarbonyl (Tbeoc), or SP-1 together with the N atom to which it is attached and R2 form an azide group
  • SP-1 is 4-azidobenzyloxycarbonyl (p-Acbz), 2-azidobenzyloxycarbonyl (o-Acbz), azidomethoxycarbonyl (Azoc), phenyldisulfanylethyloxycarbonyl (Phdec), 2-pyridyldi Sulfanyleth
  • R 2 ′′ and R 3 ′′ are each independently a hydrogen atom, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, or cycloalkyl, and these groups may be substituted, or R 2 ′′ and R 3 ′ "Is taken together with the atoms to which they are attached to form a ring; or R2" or R3 "is taken together with R26 and to the atoms to which they are attached; R25 is a hydroxyl group or forms an active ester with the CO to which it is attached; R26 is alkylene, arylene, heteroarylene, arylenealkylene, or heteroarylenealkylene, and these groups may be substituted.)
  • R26 is the following: Wherein R13 ′′ to R18 ′′ are each independently selected from
  • An amino acid residue having a second reactive site in one of the side chains is represented by the following general formula: (Where R2 ′′ represents the same meaning as R2 ′′ described in [12]; R3 "is a hydrogen atom or an optionally substituted C1-C4 alkyl group; R27 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkenyl group, an optionally substituted alkynyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted heteroaryl group, substituted A cycloalkyl group which may be substituted or an aralkyl group which may be substituted)
  • An amino acid residue having a second reactive site in one of the side chains is represented by the following general formula: (Where R2 ′′ represents the same meaning as R2 ′′ described in [12]; R3 "is a hydrogen atom
  • the amino acid residue represented by the following general formula (I) or the following general formula (II) having the first reaction point has an N-terminal, and has a second reaction point in one of its side chains.
  • the amino acid residue represented by the general formula (I) is represented by the following formula: (Wherein R1, R2, and SP-1 are the same as R1, R2, and SP-1 in [1], respectively). Or an amino acid residue represented by the general formula (II) is represented by the following formula: (Where R1 is -S-R23; R23 is C1-C20 alkyl, optionally substituted phenyl, or optionally substituted benzyl; SP-1 is p-Acbz, o-Acbz, or Azoc) The method according to any one of [1] to [18], wherein the amino acid residue is represented by any one of the following: [26] The amino acid residue represented by the general formula (I) is represented by the following formula: (Wherein R1 and SP-1 are the same as R1 and SP-1 in [1], respectively, R2 is a hydrogen atom or an alkyl group, and the alkyl group may be substituted) Or an amino acid residue represented by: The amino acid residue represented by the general formula (II
  • a peptide containing a plurality of amino acid analogs, a complex of the peptide and a nucleic acid can be translationally synthesized with high yield and purity while suppressing the formation of a cleaved peptide, and can be efficiently cyclized.
  • a peptide having a drug-like cyclic portion containing a plurality of amino acid analogs, a complex of the peptide and a nucleic acid, and a display library of the complex are provided. Since the display library constructed using the present invention can translate and synthesize peptides containing many amino acid analogs with higher efficiency than conventional methods, the probability of obtaining more diverse drug-like hit compounds is further increased.
  • amino acid residues having a thiol group in the vicinity of an amino group including not only L-cysteine but also D-cysteine, L or DN methylcysteine, can be introduced into the N-terminus by translation. It becomes possible. Therefore, it is possible to provide a more diverse drag-like display library.
  • the hit compound obtained from the mRNA display library according to the present invention already has excellent membrane permeability and metabolic stability, it can be efficiently optimized as a pharmaceutical product.
  • FIG. 1 is a diagram showing confirmation by electrophoresis of a translational synthetic peptide having a p-Acbz-protected cysteine analog at the N-terminus.
  • FIG. 2-1 is a diagram showing confirmation of p-Acbz-protected N-methylcysteine translational synthesized peptide by MALDI TOF ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ MS.
  • FIG. 2-2 is a diagram showing confirmation by p-Acbz-protected N-methyl-D-cysteine translation synthesis peptide by MALDI TOF MS.
  • FIG. 1 is a diagram showing confirmation by electrophoresis of a translational synthetic peptide having a p-Acbz-protected cysteine analog at the N-terminus.
  • FIG. 2-1 is a diagram showing confirmation of p-Acbz-protected N-methylcysteine translational synthesized peptide by MALDI TOF ⁇ ⁇ ⁇
  • FIG. 2-3 is a diagram showing confirmation of o-Acbz or p-Acbz protected N-methylcysteine translation synthesized peptide by MALDIMALTOF MS.
  • FIG. 3A is a diagram showing confirmation by electrophoresis of a translation-synthesized peptide of Acbz-protected N-methylcysteine.
  • FIG. 3-2 is a diagram showing confirmation by electrophoresis of a translational synthetic peptide of N-methylcysteine protected with o-Acbz or p-Acbz.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of MALDI-TOF MS analysis when the same peptide was translationally synthesized using the translation initiation methods of the initiation suppression method and the initiation read-through method.
  • the MS intensity of the target was observed stronger in the Initiation suppression method.
  • the MS intensity of the cleaved peptide was observed to be weaker, and each MS intensity was 1/20 or less as compared with the target product.
  • FIG. 5 is a view showing the MS intensity of the target product and by-product cleaved peptide obtained when translation synthesis of a peptide containing a plurality of amino acid analogs by each translation initiation method.
  • the graph showing the cleaved peptide MS intensity represents the total value of the MS intensities when a plurality of cleaved peptides are observed. Comparing the Initiationthroughread-through method and the Initiation suppression method, the MS intensity of the target product was observed to be stronger and the MS intensity of the cleaved peptide was observed to be weaker.
  • Fig. 6-1 shows the deprotection of the N-methylcysteine protecting group after translation synthesis of a peptide having an N-methylcysteine having a protecting group at the N-terminus and an active ester in the side chain of the C-terminal amino acid.
  • FIG. 2 is a diagram showing mass spectra of a compound obtained by a cyclization reaction by native chemical ligation and an amide cyclized peptide obtained by a subsequent desulfurization reaction.
  • FIG. 6B is a diagram showing a continuation of FIG. 6A.
  • FIG. 6C is a diagram showing a continuation of FIG.
  • FIG. 6-4 is a diagram showing a continuation of FIG. 6-3.
  • FIG. 6-5 is a continuation of FIG. 6-4.
  • FIG. 6-6 is a diagram showing a continuation of FIG. 6-5.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of electrophoretic evaluation of RNA stability under Acbz deprotection reaction, cyclization reaction by native chemical ligation, and desulfurization reaction conditions.
  • alkyl is a monovalent group derived by removing one arbitrary hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon, and contains a heteroatom or an unsaturated carbon-carbon bond in the skeleton. It has a subset of hydrocarbyl or hydrocarbon group structures containing hydrogen and carbon atoms. The length n of the carbon chain is in the range of 1-20.
  • alkyl examples include “C1-C6 alkyl”, specifically, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, isopropyl, t-butyl group, sec-butyl group, 1-methylpropyl group, 1,1-dimethylpropyl group, 2,2-dimethylpropyl, 1,2-dimethylpropyl, 1,1,2-trimethylpropyl, 1,2,2-trimethylpropyl, 1,1,2,2-tetramethyl Propyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,1-dimethylbutyl, 1,2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2 , 2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, isopent Le, methyl
  • alkenyl is a monovalent group having at least one double bond (two adjacent SP2 carbon atoms). Depending on the arrangement of the double bonds and substituents (if present), the geometry of the double bond can take the Enthogen (E) or Tuzanmen (Z), cis or trans configurations. Examples of alkenyl include straight chain or branched chain, and include straight chain containing internal olefin. C2-C10 alkenyl is preferable, and C2-C6 alkenyl is more preferable.
  • alkenyl examples include vinyl, allyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl (including cis and trans), 3-butenyl, pentenyl, hexenyl and the like. It is done.
  • alkynyl is a monovalent group having at least one triple bond (two adjacent SP carbon atoms). Examples include linear or branched alkynyl, including internal alkylene. Preferred is C2-C10 alkynyl, and more preferred is C2-C6 alkynyl.
  • alkynyl examples include ethynyl, 1-propynyl, propargyl, 3-butynyl, pentynyl, hexynyl, 3-phenyl-2-propynyl, 3- (2′-fluorophenyl) -2-propynyl, 2- Examples include hydroxy-2-propynyl, 3- (3-fluorophenyl) -2-propynyl, 3-methyl- (5-phenyl) -4-pentynyl and the like.
  • cycloalkyl means a saturated or partially saturated cyclic monovalent aliphatic hydrocarbon group, and includes a monocyclic ring, a bicyclo ring, and a spiro ring.
  • C3-C10 cycloalkyl is used.
  • Specific examples of cycloalkyl include cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, bicyclo [2.2.1] heptyl, and the like.
  • aryl means a monovalent aromatic hydrocarbon ring, preferably C6-C10 aryl.
  • aryl include phenyl, naphthyl (for example, 1-naphthyl, 2-naphthyl) and the like.
  • heteroaryl means a monovalent group of an aromatic ring which preferably contains 1 to 5 heteroatoms in the atoms constituting the ring, and is partially saturated. May be.
  • the ring may be monocyclic or two fused rings (eg, bicyclic heteroaryl fused with benzene or monocyclic heteroaryl).
  • the number of atoms constituting the ring is preferably 5 to 10 (5-membered to 10-membered heteroaryl).
  • heteroaryl examples include furyl, thienyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, oxadiazolyl, thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl, pyridyl, pyrimidyl, pyridazinyl, pyrazinyl, triazinyl, benzofuranyl, benzofuranyl Thienyl, benzothiadiazolyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzooxadiazolyl, benzimidazolyl, indolyl, isoindolyl, indazolyl, quinolyl, isoquinolyl, cinnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, benzodioxolyl, indolizinyl, imidazopyr
  • arylalkyl is a group containing both aryl and alkyl.
  • it means a group in which at least one hydrogen atom of the alkyl is substituted with aryl, preferably “C5 -C10 aryl C1-C6 alkyl ".
  • aryl preferably “C5 -C10 aryl C1-C6 alkyl ".
  • benzyl and the like can be mentioned.
  • alkylene means a divalent group derived by removing one arbitrary hydrogen atom from the “alkyl”, and the alkylene is preferably C1-C2 alkylene, C1-C3 alkylene, C1-C4 alkylene, C1-C5 alkylene, C1-C6 alkylene may be mentioned.
  • alkylene include methylene, 1,2-ethylene, 1,1-ethylene, 1,3-propylene, tetramethylene, pentamethylene, hexamethylene and the like.
  • arylene means a divalent group derived by further removing one arbitrary hydrogen atom from the aryl.
  • Arylene may be a single ring or a condensed ring.
  • the number of atoms constituting the ring is not particularly limited, but is preferably 6 to 10 (C6-10 arylene).
  • Specific examples of the arylene include phenylene and naphthylene.
  • heteroarylene means a divalent group derived by removing any one hydrogen atom from the heteroaryl.
  • the heteroarylene may be a single ring or a condensed ring.
  • the number of atoms constituting the ring is not particularly limited, but is preferably 5 to 10 (5-membered to 10-membered heteroarylene).
  • heteroarylene examples include pyrrole diyl, imidazole diyl, pyrazole diyl, pyridine diyl, pyridazine diyl, pyrimidine diyl, pyrazine diyl, triazole diyl, triazine diyl, isoxazole diyl, oxazole diyl, oxadiazole diyl, isothiazole diyl, thiazole Examples include diyl, thiadiazole diyl, flangedyl, and thiophene diyl.
  • alkylene arylene means a divalent group in which the alkylene and the arylene are bonded at an arbitrary position, and an alkylene is bonded to the basic skeleton side.
  • Specific examples of the alkylene arylene include -C1-C6 alkylene-C6-C10 arylene.
  • arylene alkylene means a divalent group in which the arylene and the alkylene are bonded at an arbitrary position, and an arylene is bonded to the basic skeleton side.
  • Specific examples of the arylene alkylene include -C6-C10 arylene-C1-C6 alkylene.
  • alkylene heteroarylene means a divalent group in which the alkylene and the heteroarylene are bonded at an arbitrary position, and an alkylene is bonded to the basic skeleton side.
  • alkylene heteroarylene include —C1-C6 alkylene-5-membered to 10-membered heteroarylene.
  • heteroarylene alkylene means a divalent group in which the heteroarylene and the alkylene are bonded at an arbitrary position, and the heteroarylene is bonded to the basic skeleton side.
  • Specific examples of the heteroarylene alkylene include -5-membered to 10-membered heteroarylene-C1-C6 alkylene.
  • the “active ester” is a group containing a carbonyl that reacts with an amino group to form an amide bond, and a group in which, for example, OBt, OAt, OSu, OPfp, SR1, and the like are bonded to the carbonyl. And is a group capable of promoting the reaction with an amine.
  • reaction auxiliary group is a group that is introduced in the vicinity of a functional group to be bonded in order to selectively cause a reaction at a desired position and activates the functional group with respect to the bonding reaction.
  • a reaction auxiliary group can be introduced on either or both sides of carbonyl and amine. Such a reaction assisting group can be removed together with the binding reaction or after the binding reaction.
  • ⁇ Peptide, Peptide and Nucleic Acid Complex -Peptide having a cyclic part, complex of the peptide and nucleic acid
  • the cyclic part of the peptide having a cyclic part, the complex of the peptide and nucleic acid is the peptide after translation synthesis, the complex of the peptide and the nucleic acid It is formed by subjecting the body to an amidation reaction.
  • the peptide portion of the complex of peptide and nucleic acid is sometimes referred to as “peptide site”.
  • “nucleic acid” includes DNA and mRNA.
  • a peptide having a cyclic part formed by amidation after translation synthesis a peptide obtained by further chemically modifying the peptide site of the complex of the peptide and nucleic acid, and a complex of peptide and nucleic acid are also peptides of the present invention. Included in the complex of peptide and nucleic acid.
  • the peptide of the present invention may have a linear part.
  • the number of amide bonds (number and length of amino acids) at the peptide and peptide sites is not particularly limited, but when it has a linear part, it is preferably within 30 residues including the cyclic part and the linear part.
  • the number of straight chain parts is not particularly limited, it may have one or more straight chain parts.
  • the total number of amino acids including the cyclic part and the linear part is preferably 13 residues or less. In order to obtain high metabolic stability, the total number of amino acids is preferably 9 or more.
  • the number of amino acids constituting the cyclic portion is preferably 5 to 12, more preferably 5 to 11, and more preferably 7 to 11. More preferably, it is particularly preferably 9 to 11.
  • the number of amino acids in the straight chain portion is preferably 0 to 8, and more preferably 0 to 3.
  • Scheme A is a scheme illustrating peptide sites (before and after cyclization) in the peptide-nucleic acid complex of the present invention.
  • White circle ( ⁇ ) unit crossing unit
  • black circle ( ⁇ ) unit annular part main chain unit
  • square ( ⁇ ) unit straight chain part main chain unit
  • triangular ( ⁇ ) unit cyclized N-terminal unit
  • Each means an amino acid constituting the peptide site.
  • Each unit may be the same amino acid or a different amino acid.
  • the unit means any one of the amino acid after translation synthesis before cyclization, the amino acid after cyclization, and the amino acid at the time when the chemical modification after cyclization is completed.
  • the amino acid at the time when the chemical modification after cyclization is completed includes an amino acid translated from one tRNA by chemical conversion or skeleton conversion by post-translational chemical modification.
  • the annular portion is a portion composed of one triangular unit, eight black circle units, and one white circle unit, and the linear portion is a portion composed of six square units.
  • the curve part of Scheme A is a site to be cyclized after translation (post-translational cyclization part), and this part is bonded by an amide bond.
  • the peptide or peptide portion of the present invention requires a reactive functional group for the triangular unit or the crossing unit described in Scheme A, a drug-like amino acid is not necessarily selected for the triangular unit or the crossing unit.
  • the cyclic portion preferably contains two or more amino acid analog residues.
  • the peptide of the present invention a complex of a peptide and a nucleic acid, can be converted into two linear chains by, for example, further performing an intramolecular cyclization reaction after cyclization of a triangular unit and a crossing unit according to Scheme A.
  • a cyclic peptide having a part (linear part 1 and linear part 2) can be obtained (see WO2013 / 100132).
  • translation synthesis means to synthesize a peptide or peptide moiety by translating the peptide or peptide moiety from a nucleic acid (eg, DNA, RNA) encoding the peptide or peptide moiety.
  • Translation is a process of obtaining a linear peptide by repeating an amide bond reaction using mRNA as a template by the action of ribosomes.
  • post-translational modification means a chemical reaction that occurs after translation automatically or by addition of a reagent other than the action of ribosome, and includes, for example, a cyclization reaction, a desulfurization reaction, and a deprotection reaction. Can do.
  • the triangular unit (N-terminal unit before cyclization) in the peptide or peptide site before cyclization is an amino acid residue having a thiol group in the vicinity of the amino group, and both the thiol group and the amino group are protected. Those protected by groups can be used.
  • an amino acid residue specifically, the general formula (I): Or general formula (II): The amino acid residue represented by these is mentioned.
  • the cross-unit in the peptide or peptide site before cyclization includes a functional group (first reaction point) possessed by the amino acid of the triangular unit and a functional group (second reaction point) that can be cyclized by an amide bond.
  • first reaction point possessed by the amino acid of the triangular unit
  • second reaction point a functional group that can be cyclized by an amide bond.
  • the side chain In the crossover unit, the amino group and carboxyl group of the main chain are used for covalent bond formation with other amino acid residues in translation synthesis, and the third functional group is necessary for post-translational cyclization, so that a total of 3 It must have at least one functional group.
  • the functional group of the side chain part of an intersection unit is used for the cyclization reaction after translation.
  • the crossing unit can be incorporated at any position in the peptide site before cyclization as long as it is a cyclizable position, but the cyclization or post-translational modification after cyclization is performed. It is preferably incorporated at a position where the number of amino acids in the part is 5 to 12, and more preferably incorporated at a position where it is 5 to 11. That is, in the present invention, the crossing unit is preferably incorporated at a position on the C-terminal side of at least 4 amino acid residues (for example, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 amino acid residues) from the triangular unit.
  • Such a crossing unit include the following general formula (III) or (III-OH): The amino acid residue represented by these is mentioned.
  • the black circle unit and the square unit are selected from amino acids, preferably selected from drug-like amino acids.
  • drug-like amino acid refers to an amino acid constituting a drug-like peptide site, and means the same skeleton as the “amino acid”, that is, the same skeleton as ⁇ , ⁇ and ⁇ -amino acids. .
  • the drug-like amino acids are selected from L-type amino acids, D-type amino acids, ⁇ , ⁇ -dialkyl amino acids and the like.
  • one in which two hydrogen atoms of the main chain amino group (NH 2 group) are substituted with methyl, and one or two of the methyl hydrogen atoms are further alkyl, cycloalkyl, alkenyl.
  • Alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl and the like may be substituted.
  • one or two hydrogen atoms of the main chain methylene (—CH 2 —) are substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl or the like, or “drug-likeness Also included are those in which “contributing substituents” are directly substituted.
  • substituents of “drug-like amino acid” may be further substituted with “substituents contributing to drug-likeness”.
  • the “substituent that contributes to drug likeness” includes, for example, hydroxyl (—OH), oxy (—OR), amide (—NR—CO—R ′ or —CO—NRR ′), sulfonyl (— SO 2 —R), sulfinyl (—SO—R), halogen, oxyamino (—NR—OR ′), aminooxy (—O—NRR ′), oxycarbonyl (—CO—OR), thiocarbonyl (—CO —SR), thiol (—SH), thio (—SR), primary amino (—NH 2 ), secondary amino (—NHR) or tertiary amino (—NRR ′), sulfonylamino (—NH—SO 2) -R), boryl (-BRR '), Jiokishiboriru
  • the “drug-like amino acid” includes a side chain portion of a peptide (for example, when a hit compound is obtained with D-tyrosine, a D-type amino acid chemically modified therefrom, and a hit compound with ⁇ -alanine. Is obtained from the chemically modified ⁇ -amino acids), or all chemically synthesizeable amino acids optimized for the structure of the N-terminal substitution moiety by chemical conversion of N-methyl amino acids. .
  • drug-likeness or “drug-like” means that the peptide site targets at least an oral agent, an intracellular region of an intracellular protein, a nucleic acid, a membrane protein, or a transmembrane domain of a membrane protein. In addition, it means having membrane permeability and metabolic stability that can be used as a pharmaceutical product.
  • the peptide or peptide part of the present invention may not have a linear part, but by having a linear part, it is possible to enhance the function of the peptide or peptide part having a cyclic part.
  • the peptide or peptide moiety when used to inhibit the binding of a certain receptor to a ligand, the peptide or peptide moiety has a linear portion, so that the peptide Alternatively, the binding activity of the peptide site to the receptor or ligand can be increased. And the binding inhibitory effect of a receptor and a ligand can be heightened by the enhancement of the binding activity (see WO2013 / 100132).
  • amino acid constituting the peptide or peptide site may be a “natural amino acid” or an “amino acid analog”.
  • amino acid”, “natural amino acid”, and “amino acid analog” may be referred to as “amino acid residue”, “natural amino acid residue”, and “amino acid analog residue”, respectively.
  • Natural amino acid is ⁇ -aminocarboxylic acid ( ⁇ -amino acid), and refers to 20 types of amino acids contained in proteins. Specifically, Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, His, Glu, Asp, Gln, Asn, Cys, Met, Lys, Arg, and Pro.
  • Amino acid analog includes non-natural amino acids (eg, non-natural ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids, ⁇ -amino acids).
  • an ⁇ -amino acid it may be a D-type amino acid or an ⁇ , ⁇ -dialkyl amino acid.
  • ⁇ and ⁇ -amino acids any configuration is allowed as in the case of ⁇ -amino acids.
  • the side chain (main chain methylene) of the amino acid analog is not particularly limited, but may have, for example, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl in addition to a hydrogen atom.
  • C1-C6 alkyl optionally having halogen as a substituent means “C1-C6 alkyl” substituted with one or more halogen atoms, specifically, For example, trifluoromethyl, difluoromethyl, fluoromethyl, pentapuroethyl, tetrafluoroethyl, trifluoroethyl, difluoroethyl, fluoroethyl, trichloromethyl, dichloromethyl, chloromethyl, pentachloroethyl, tetrachloroethyl, trichloroethyl , Dichloroethyl, chloroethyl and the like.
  • optionally substituted C5-C10 aryl C1-C6 alkyl means that at least one hydrogen atom of aryl and / or alkyl of “C5-C10 aryl C1-C6 alkyl” is substituted. Means a group substituted by a group.
  • substituents include, for example, having a functional group containing an S atom and further having a functional group such as amino or halogen. .
  • the main chain amino group of the amino acid analog may be unsubstituted (NH 2 group), substituted (ie, NHR group: R is an optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl And a carbon chain bonded to the N atom and a carbon atom at the ⁇ -position may form a ring, such as proline, and the substituent is the same as the substituent on the side chain, For example, halogen, oxy, hydroxy, etc. may be mentioned.
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl applies the above definition of the functional group correspondingly.
  • alkoxy means a group in which a hydrogen atom of a hydroxyl group is substituted with the alkyl, and preferred examples include “C1-C6 alkoxy”.
  • the “amino acid analog” also includes hydroxycarboxylic acids in which the amino group of “amino acid” is replaced with a hydroxyl group.
  • the hydroxycarboxylic acid may have various substituents like other amino acid analogs.
  • the configuration of the hydroxycarboxylic acid may correspond to either the L-type or D-type amino acid.
  • the side chain is not particularly limited, but is selected from, for example, optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, and the like.
  • halogen-derived substituent examples include fluoro (—F), chloro (—Cl), bromo (—Br), iodo (—I) and the like.
  • Examples of the substituent derived from the O atom include hydroxyl (—OH), oxy (—OR), carbonyl (—C ⁇ O—R), carboxyl (—CO 2 H), oxycarbonyl (—C ⁇ O—OR), Carbonyloxy (—O—C ⁇ O—R), thiocarbonyl (—C ⁇ O—SR), carbonylthio group (—S—C ⁇ O—R), aminocarbonyl (—C ⁇ O—NHR), carbonyl Amino (—NH—C ⁇ O—R), oxycarbonylamino (—NH—C ⁇ O—OR), sulfonylamino (—NH—SO 2 —R), aminosulfonyl (—SO 2 —NHR), sulfa Examples include moylamino (—NH—SO 2 —NHR), thiocarboxyl (—C ( ⁇ O) —SH), and carboxylcarbonyl (—C ( ⁇ O) —CO 2 H).
  • oxy examples include alkoxy, cycloalkoxy, alkenyloxy, alkynyloxy, aryloxy, heteroaryloxy, aralkyloxy and the like.
  • carbonyl examples include formyl (—C ⁇ O—H), alkylcarbonyl, cycloalkylcarbonyl, alkenylcarbonyl, alkynylcarbonyl, arylcarbonyl, heteroarylcarbonyl, aralkylcarbonyl and the like. .
  • Examples of oxycarbonyl include alkyloxycarbonyl, cycloalkyloxycarbonyl, alkenyloxycarbonyl, alkynyloxycarbonyl, aryloxycarbonyl, heteroaryloxycarbonyl, aralkyloxycarbonyl and the like.
  • (-C O-OR)
  • carbonyloxy examples include alkylcarbonyloxy, cycloalkylcarbonyloxy, alkenylcarbonyloxy, alkynylcarbonyloxy, arylcarbonyloxy, heteroarylcarbonyloxy, aralkylcarbonyloxy and the like.
  • thiocarbonyl examples include alkylthiocarbonyl, cycloalkylthiocarbonyl, alkenylthiocarbonyl, alkynylthiocarbonyl, arylthiocarbonyl, heteroarylthiocarbonyl, aralkylthiocarbonyl and the like.
  • carbonylthio examples include alkylcarbonylthio, cycloalkylcarbonylthio, alkenylcarbonylthio, alkynylcarbonylthio, arylcarbonylthio, heteroarylcarbonylthio, aralkylcarbonylthio and the like. .
  • aminocarbonyl examples include alkylaminocarbonyl, cycloalkylaminocarbonyl, alkenylaminocarbonyl, alkynylaminocarbonyl, arylaminocarbonyl, heteroarylaminocarbonyl, aralkylaminocarbonyl and the like.
  • compounds in which the H atom bonded to the N atom in —C ⁇ O—NHR is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl are exemplified.
  • Examples of carbonylamino include alkylcarbonylamino, cycloalkylcarbonylamino, alkenylcarbonylamino, alkynylcarbonylamino, arylcarbonylamino, heteroarylcarbonylamino, aralkylcarbonylamino and the like. .
  • compounds in which the H atom bonded to the N atom in —NH—C ⁇ O—R is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl or aralkyl.
  • Examples of oxycarbonylamino include alkoxycarbonylamino, cycloalkoxycarbonylamino, alkenyloxycarbonylamino, alkynyloxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, heteroaryloxycarbonylamino, aralkyloxy And carbonylamino.
  • alkoxycarbonylamino cycloalkoxycarbonylamino
  • alkenyloxycarbonylamino alkynyloxycarbonylamino
  • aryloxycarbonylamino heteroaryloxycarbonylamino
  • aralkyloxy And carbonylamino aralkyloxy And carbonylamino.
  • sulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • alkylsulfonylamino examples include alkylsulfonylamino, cycloalkylsulfonylamino, alkenylsulfonylamino, alkynylsulfonylamino, arylsulfonylamino, heteroarylsulfonylamino, aralkylsulfonylamino and the like.
  • H atom bonded to the N atom in —NH—SO 2 —R is further substituted with alkyl, cycloalkyl,
  • aminosulfonyl examples include alkylaminosulfonyl, cycloalkylaminosulfonyl, alkenylaminosulfonyl, alkynylaminosulfonyl, arylaminosulfonyl, heteroarylaminosulfonyl, aralkylaminosulfonyl and the like.
  • compounds in which the H atom bonded to the N atom in —SO 2 —NHR is further substituted with alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl are exemplified.
  • sulfamoylamino examples include alkylsulfamoylamino, cycloalkylsulfamoylamino, alkenylsulfamoylamino, alkynylsulfamoylamino, arylsulfamoylamino, hetero Arylsulfamoylamino, aralkylsulfamoylamino and the like can be mentioned.
  • the two H atoms bonded to the N atom in —NH—SO 2 —NHR are substituents independently selected from the group consisting of alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, and aralkyl. They may be substituted, and these two substituents may form a ring.
  • Substituents derived from S atoms include thiol (—SH), thio (—S—R), sulfinyl (—S ⁇ O—R), sulfonyl (—S (O) 2 —R), sulfo (—SO 3 H). ).
  • thio examples are selected from alkylthio, cycloalkylthio, alkenylthio, alkynylthio, arylthio, heteroarylthio, aralkylthio and the like.
  • sulfinyl examples include alkylsulfinyl, cycloalkylsulfinyl, alkenylsulfinyl, alkynylsulfinyl, arylsulfinyl, heteroarylsulfinyl, aralkylsulfinyl and the like.
  • sulfonyl examples include alkylsulfonyl, cycloalkylsulfonyl, alkenylsulfonyl, alkynylsulfonyl, arylsulfonyl, heteroarylsulfonyl, aralkylsulfonyl and the like.
  • azide (—N 3 , also referred to as “azido group”), cyano (—CN), primary amino (—NH 2 ), secondary amino (—NH—R), tertiary amino (—NR (R ′)), amidino (—C ( ⁇ NH) —NH 2 ), substituted amidino (—C ( ⁇ NR) —NR′R ′′), guanidino (—NH—C ( ⁇ NH) —NH 2 ), substituted guanidino (—NR—C ( ⁇ NR ′ ′′) — NR′R ′′), and aminocarbonylamino (—NR—CO—NR′R ′′).
  • secondary amino examples include alkylamino, cycloalkylamino, alkenylamino, alkynylamino, arylamino, heteroarylamino, aralkylamino and the like.
  • tertiary amino are independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl and the like, for example, alkyl (aralkyl) amino And an amino group having two arbitrary substituents, and these two arbitrary substituents may form a ring.
  • substituted amidino examples include three substituents R, R ′, and R ′′ on the N atom that are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, hetero Groups independently selected from aryl and aralkyl, for example, alkyl (aralkyl) (aryl) amidino and the like can be mentioned.
  • substituted guanidino examples include R, R ′, R ′′, and R ′ ′′ where alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl , A heteroaryl group and an aralkyl group independently selected from each other, or a group in which these form a ring.
  • aminocarbonylamino examples are those where R, R ′, and R ′′ are selected from among hydrogen, alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl Examples thereof include a group independently selected from each other, or a group that forms a ring.
  • substituent derived from the B atom examples include boryl (—BR (R ′)) and dioxyboryl (—B (OR) (OR ′)). These two substituents R and R ′ are each independently selected from alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl and the like, or they may form a ring .
  • At least one atom that constitutes a peptide or peptide moiety is an atom (isotope) that has the same atomic number (number of protons) and a different mass number (sum of protons and neutrons). Also good.
  • isotopes contained in the "amino acid" constituting the peptide site include a chlorine atom, respectively, 2 H , 3 H, 13 C, 14 C, 15 N, 17 O, 18 O, 31 P, 32 P, 35 S, 18 F, 36 Cl, and the like.
  • non-natural amino acids amino acid analogs
  • amino acid analogs amino acid analogs
  • Many of these unnatural amino acids can be purchased with protected or unprotected side chains and protected or unprotected amine sites. Those that cannot be purchased can be synthesized by known methods.
  • N-Me amino acids can be used as non-natural amino acids.
  • N-alkyl amino acids can also be used as non-natural amino acids.
  • D-type amino acids can also be used as non-natural amino acids.
  • ⁇ , ⁇ -dialkyl amino acids can also be used as non-natural amino acids.
  • amino acids can also be used as non-natural amino acids.
  • peptide having a circular portion of the present invention a complex of the peptide and a nucleic acid (peptide-nucleic acid complex), or a library of peptide-nucleic acid complexes is produced using, for example, a method including the steps described below. Is possible.
  • the acyclic peptide or peptide moiety has the following general formula (I) or general formula (II) having the first reaction site: And 2) a first reaction point, a second reaction point, and an amino acid residue having a second reaction point in one of the side chains on the C-terminal side; And reacting with a reaction site of the method to form an amide bond.
  • an initiation suppression (iSP) method is used for translational synthesis of an acyclic peptide or peptide site.
  • methionine is generally translated as an N-terminal amino acid as a translation initiation amino acid.
  • starting tRNA for initiating translation.
  • the starting tRNA binds to methionine (formylmethionine in prokaryotes) and is transported to the ribosome to initiate translation, and the N-terminal amino acid is methionine (in prokaryotes). Formylmethionine).
  • Translation synthesis of a peptide having a desired amino acid at the N-terminus is referred to as an initiation suppression method. It is known that amino acid analogs introduced with N-terminal amino acids have higher tolerance of amino acids than when they are extended, and use amino acids and amino acid analogs that are significantly different in structure from natural amino acids (non-patent literature: J Am Chem Soc). 2009 Apr 15; 131 (14): 5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.).
  • a peptide comprising an amino acid residue represented by the above general formula (I) having a first reaction point at the N-terminus and an amino acid residue having a second reaction point at one of the side chains at the C-terminus It can be obtained by the iSP method by translating the nucleic acid encoding it.
  • the amino acid constituting the peptide or peptide site is preferably a drug-like amino acid.
  • the resulting peptide or peptide site may be chemically modified so that it becomes a drug-like amino acid after translation synthesis so that it becomes drug-like.
  • aminoacylation of amino acid residues having a thiol group in the vicinity of the amino group and in which both the thiol group and the amino group are protected is aminoacylated. It is also possible to translate the N-terminus as a desired amino acid by translating using the translation initiation tRNA. That is, the present invention includes the amino acid residue represented by the general formula (I) having the first reaction point at the N-terminus, and the amino acid residue having the second reaction point in one of the side chains as the C-terminal side. A method for producing a non-cyclic peptide included in the above is also provided.
  • the iSP method can be used. That is, by adding an aminoacylated tRNA to a translation system from which methionine, formyl donor, or methionyl transferase has been removed, and translating the translation initiation codon (for example, AUG) by encoding the triangular unit, the N-terminus is converted into a triangular unit.
  • a peptide site or peptide site library before cyclization can be constructed.
  • cyste means L-cysteine, and the thiol group and amino group mean those having no protecting group.
  • the “cysteine analog” means an amino acid other than a natural amino acid having a thiol in the side chain and having no protecting group on the thiol group or amino group (R1 in the formula (I)) , R2, and SP-1 are hydrogen atoms).
  • the configuration of the cysteine analog is arbitrary, and the side chain structure is not particularly limited as long as it has a thiol group. Specific examples of such a side chain include optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, cycloalkyl, and the like.
  • the number of substituents is not limited to one and may be two or more.
  • mRNA or mRNA library using aminoacyl tRNA in which a desired cysteine or cysteine analog is aminoacylated to a plurality of types of translation initiation tRNAs having different anticodons, and using a codon corresponding to the anticodon of the aminoacyl tRNA as a start codon By translating, a peptide site before cyclization or a library of peptide sites in which the N-terminal residue is not limited to one type can be prepared. Specifically, for example, Mayer C, et al.
  • Anticodon sequence mutants of Escherichia coli initiator tRNA effects of overproduction of aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA formyltransferase, and initiation factor 2 on, activity in initiation.42 4787-99 (mutation of an initiation tRNA having an anticodon other than CAU by the start of translation from an amino acid other than f-Met by E. coli and expression of a protein containing the same codon in the middle) Peptide sites or peptide site libraries can be generated.
  • reaction point for example, amino group
  • the basic functional group that is not desired to react with the amino acid residue constituting the peptide site
  • a method of activating the reaction point of the triangular unit is used.
  • an amino acid having a reaction auxiliary group for example, a thiol group
  • cysteine corresponds to such an amino acid because it has a thiol at the ⁇ -position of the amino group.
  • cysteine is used as the N-terminus, as shown in Scheme C, the thiol group and amino group of cysteine are both protected during the translation introduction process, but are deprotected simultaneously with or prior to the cyclization reaction.
  • a reaction point of a triangular unit for example, an amino group
  • a reaction point of an intersection unit for example, an activated carboxyl group
  • the thiol group contained in the triangular unit of the obtained cyclic peptide is TCEP (tris (2-carboxylethyl) phosphine) and VA-044 (2,2′-azobis-2- (2-imidazolin-2-yl) propane.
  • TCEP tris (2-carboxylethyl) phosphine
  • VA-044 2,2′-azobis-2- (2-imidazolin-2-yl) propane.
  • a suitable reagent such as dihydrochloride
  • desulfurization can be performed under mild reaction conditions in which RNA does not react.
  • the pH is preferably 6.0 or more and 9.2 or less, more preferably 7.0 or more and 8.5 or less.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it can usually carry out a chemical reaction, but it is preferably 4 ° C to 80 ° C, more preferably 10 ° C to 50 ° C.
  • TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine
  • the amount used is not particularly limited, but is preferably 1 mM or more, and more preferably 10 mM or more and 100 mM or less in order to increase the reactivity.
  • the pH is preferably 3.0 or more and 9.2 or less, and preferably 5.0 or more and 8. More preferably, it is 5 or less.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as it can usually carry out a chemical reaction, but it is preferably 4 ° C. to 80 ° C., more preferably 30 ° C. to 60 ° C.
  • the usage-amount of TCEP is not specifically limited, In order to improve reactivity, 10 mM or more is preferable, It is more preferable that it is 50 mM or more and 2 M or less, It is further more preferable that it is 100 mM or more and 500 mM or less.
  • the amount of VA-044 used is not particularly limited, but is preferably 10 mM or more, more preferably 50 mM or more and 2 M or less, and even more preferably 100 mM or more and 500 mM or less in order to increase the reactivity.
  • the reaction may be performed alone in a reaction translation solution such as PUREsystem, or an organic solvent such as DMF or NMP may be added thereto. Moreover, after purifying a translation liquid by column purification etc., you may carry out by changing a solvent.
  • N-terminal amino acid residue before cyclization that can be used as a triangular unit is represented by the following general formula (I) or general formula (II): Can be expressed as
  • R1 is a protecting group of a thiol group capable of translational synthesis, and is deprotected in a translation synthesis solution, and before cyclization. If it becomes a hydrogen atom, it will not specifically limit.
  • a protecting group include an S—R23 group, a sulfonate (—SO 3 ⁇ ), and a thiosulfonate (—S 2 O 3 ⁇ ).
  • the counter cation is not particularly limited, and examples thereof include Na + and K + .
  • R23 is alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, or aralkyl, and these groups may be substituted. Specific examples of R23 include methyl, ethyl, isopropyl, tert-butyl, phenyl, p-trifluoromethylphenyl, p-fluorophenyl, benzyl, phenethyl and the like. Since a protecting group such as the S—R23 group is slowly deprotected in the translation synthesis solution, it can be deprotected without the need to positively define deprotection conditions. By employing these protecting groups, deprotection and amide cyclization can be carried out in one step. For the deprotection, a deprotecting agent can be added under various reaction conditions described in this specification, if necessary.
  • R2 and R3 are defined similarly to the definition of the side chain of a drug-like amino acid.
  • R 2 and R 3 are preferably each independently a hydrogen atom, or optionally substituted alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, or cycloalkyl.
  • R2 and R3 may form a ring together with the atoms to which they are attached, or R2 or R3 may form a ring together with R4 and the atoms to which they are attached.
  • the three-dimensional arrangement included in the structure allows arbitrary arrangement.
  • R2 and R4 and the atoms to which they are bonded to form a ring are examples of constituent atoms.
  • R2, N to which R2 is bonded, R4, and C to which R4 is bonded are examples of constituent atoms.
  • Examples of the structure include a 5- to 7-membered ring formed as a part.
  • R3, R4, and C to which R3 and R4 are bonded are used as a part of the constituent atoms.
  • Examples of the structure that forms a member ring include the following.
  • R2 and R3 are a hydrogen atom, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy and / or C1-C4 alkyl optionally substituted with halogen, or two sites selected from R2, R3 and R4. C5-C6 membered ring formed.
  • the three-dimensional arrangement included in the structure allows arbitrary arrangement.
  • R4 is a unit connecting an S (sulfur) atom and an amino acid moiety, and is selected from the group consisting of alkylene, arylene, heteroarylene, alkylenearylene, alkyleneheteroarylene, arylenealkylene, and heteroarylenealkylene, and these groups May be substituted.
  • N-3 to N-8 which are representative structures of R4, are shown below.
  • Substitution of S atom and amino acid site such as optionally substituted methylene (N-3), optionally substituted ethylene (N-4), optionally substituted propylene (N-5), etc. It may be linked with 1 to 5 carbon atoms which may be substituted.
  • optionally substituted methylene, ethylene, and propylene include a group in which R13 is methyl and R14 is a hydrogen atom, and a dialkylated group in which R13 and R14 are both methyl.
  • R13, R14, R15, R16, R17, and R18 are defined in the same manner as R2 or R3, and are selected from, for example, a hydrogen atom, an alkyl that may be substituted with a halogen atom, or an alkoxy that may be substituted with a halogen atom. It is preferred that A ring structure may be formed between them. More preferably, R13 to R18 are a hydrogen atom, linear or branched C1-C4 alkyl, C1-C5 alkoxy optionally substituted with one or more fluorine atoms, one or more fluorine atoms.
  • R13 to R18 are a hydrogen atom or methyl.
  • N-6 carbon atom of the aromatic ring
  • N-7, N-8 aralkyl structure
  • benzene is used as the aromatic ring, but aromatic rings other than benzene (that is, various aromatic rings including aromatic heterocycles) may be used.
  • the ring may be substituted with a substituent such as halogen, alkoxy or trifluoromethyl.
  • R11 and R12 are also selected from the same partial structure as R4. For example, it can be selected from N-3, N-4, N-5, N-6, N-7, and N-8 type structures, each having a substituent of R13 ′ to R18 ′. R11 and R12 may be a single bond.
  • N-9, N-10, and N-11 Preferred structural formulas of formula (I) are shown in N-9, N-10, and N-11.
  • R12 in formula (I) is a single bond.
  • the R12 site of formula (I) is one carbon atom (corresponding to N-3 type).
  • R12 in formula (I) is 2 carbon atoms (corresponding to N-4 type).
  • R1 to R4 in the formula are the same as the definitions of R1 to R4, R13 ′ to R16 ′ are the same as the definitions of R13 to R16, and SP-1 in the formula is SP- The definition of 1 is the same.
  • N-18, N-19, and N-20 Preferred structural formulas of formula (II) are shown in N-18, N-19, and N-20.
  • the R11 site of formula (II) is 1 carbon atom (corresponding to N-3 type).
  • R11 in the formula (II) is 2 carbon atoms (corresponding to the N-4 type).
  • N-20 R11 in formula (II) is 3 carbon atoms (corresponding to the N-5 type).
  • R1 and R4 in the formula are the same as the definitions of R1 and R4, R13 ′ to R18 ′ are the same as the definitions of R13 to R18, and SP-1 in the formula is SP- The definition of 1 is the same.
  • N-12, N-13, N-14, N-15, N-16 and N-17 are shown in N-12, N-13, N-14, N-15, N-16 and N-17.
  • R4 of N-9 is one carbon atom (N-3).
  • N-13 R4 of N-10 is one carbon atom (N-3).
  • N-14 R4 of N-11 is one carbon atom (N-3).
  • N-15 R4 of N-9 is 2 carbon atoms (N-4).
  • N-16 R4 of N-10 is 2 carbon atoms (N-4).
  • N-17 R4 of N-11 is 2 carbon atoms (N-4).
  • R1 to R3 and R13 to R16 in the formula are the same as the definitions of R1 to R3 and R13 to R16, respectively, and R13 ′ to R16 ′ in the formula are the same as the definitions of R13 to R16, respectively.
  • SP-1 in the formula is the same as the definition of SP-1 described later,
  • R2 is taken together with R13, R14, R15 or R16 and the atom to which they are attached to form a ring, provided that R2 is taken together with the N atom to which it is attached and SP-1 to form an azide group (—N 3 )
  • N 3 azide group
  • N-21 to N-26 More preferred structural formulas of the formula (II) are shown in N-21 to N-26.
  • R4 of N-18 is 2 carbon atoms (N-4).
  • N-22 R4 of N-19 is 2 carbon atoms (N-4).
  • N-23 R4 of N-20 is 2 carbon atoms (N-4).
  • N-24 R4 of N-18 is 3 carbon atoms (N-5).
  • N-25 R4 of N-19 is 3 carbon atoms (N-5).
  • N-26 R4 of N-20 is 3 carbon atoms (N-5).
  • R1 and R13 to R18 in the formula are the same as the definitions of R1 and R13 to R18, respectively, and R13 ′ to R18 ′ in the formula are the same as the definitions of R13 to R18, respectively.
  • SP-1 has the same definition as SP-1 described later.
  • a protective group for an amino group in a triangular unit before cyclization (for example, an amino acid residue represented by the general formula (I)) SP-1 ") preferably satisfies all of the following three conditions. (1) improving the stability of aminoacyl-tRNA under translation reaction conditions; (2) Do not reduce translation efficiency, (3) Only the desired functional group is selectively deprotected without reacting with mRNA during the deprotection reaction.
  • Protecting groups that satisfy these three conditions include protecting groups that are deprotected under reducing conditions. Specifically, for example, tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP), dithiothreitol (DTT), VA-044 (2,2′-azobis-2- (2-imidazolin-2-yl) propanedihydrochloride A protecting group which can be deprotected in the presence of a salt).
  • SP-1 has the following formula: Can be expressed as In this case, P1 is selected from a single bond, arylene, heteroarylene and the like, and these groups may be further substituted with a substituent such as halogen or alkoxy. In addition, the methylene group located at the ⁇ -position of the carbonyl group in the formula may also be substituted.
  • preferred examples of SP-1 include 4-azidobenzyloxycarbonyl (p-Acbz), 2-azidobenzyloxycarbonyl (o-Acbz), azidomethoxycarbonyl (Azoc) and the like.
  • SP-1 has the following formula: Can be expressed as In this case, P2 is selected from alkyl, aryl, heteroaryl and the like, and these groups may be further substituted. In addition, the methylene group at the ⁇ -position and / or ⁇ -position of the carbonyl group in the formula may also be substituted.
  • P2 is selected from alkyl, aryl, heteroaryl and the like, and these groups may be further substituted.
  • the methylene group at the ⁇ -position and / or ⁇ -position of the carbonyl group in the formula may also be substituted.
  • phenyldisulfanylethyloxycarbonyl Phdec
  • 2-pyridyldisulfanylethyloxycarbonyl Pydec
  • 2- (t-butyldisulfanyl) ethyloxycarbonyl group Tbeoc
  • N-terminal amino acid residue is represented by the general formula (I)
  • SP-1 is combined with the nitrogen atom to which it is bonded and R2 together with an azide (—N 3 ).
  • Azide can be used as an amine equivalent.
  • R1 is -S-R23 and R23 is C1-C20 alkyl, optionally substituted phenyl, or optionally substituted benzyl
  • R2 is C1-C6 alkyl optionally substituted with a substituent that contributes to drug likeness
  • SP-1 is p-Acbz, o-Acbz, or Azoc.
  • R1 is -S-R23 and R23 is C1-C20 alkyl, optionally substituted phenyl, or optionally substituted benzyl
  • SP-1 is p-Acbz, o-Acbz, or Azoc.
  • R1 is -S-R23;
  • R23 is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, or sec-butyl;
  • R2 is methyl, ethyl, n-propyl, or n-butyl;
  • SP-1 is p-Acbz or o-Acbz.
  • R1 is -S-R23;
  • R23 is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, t-butyl, or sec-butyl;
  • SP-1 is p-Acbz, o-Acbz, or Azoc.
  • an amino acid residue having a second reactive site in one of the side chains is represented by the general formula (III): Can be expressed as
  • substituents that is, R2 ′′, R3 ′′, R26
  • the active ester site (—COR25), which is the second reaction point, can be selected from groups that become drug-like amino acids.
  • the active ester means an ester or thioester that can react with the amino group site of the triangular unit via a thiol that is a reaction auxiliary group, and is not particularly limited as long as it has such a property. .
  • R25 is a hydroxyl group or forms an active ester with CO to which it is attached.
  • R25 those generally used in this technical field can be used. Specifically, halogen, N-hydroxysuccinimide (—OSu), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (—OAt) can be used. ), 1-hydroxybenzotriazole (—OBt), pentafluorophenol (—OPfp), and the like.
  • R25 is a hydroxyl group
  • 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride (DMT-MM) or 1-ethyl- Amidation can be carried out using a condensing agent such as 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (WSC).
  • R25 is a thioester such as methylthioester, arylthioester, aralkylthioester (—C ( ⁇ O) SR: R, preferably methyl, ethyl, isopropyl, t-butyl, benzyl, CH 2 -benzyl, together with CO to which it is bonded.
  • Phenyl may be included).
  • These active esters can be used for substituents commonly used in the technical field (for example, electron withdrawing groups such as halogen, nitro, trifluoromethyl, nitrile, etc.
  • electron-donating groups such as alkoxy such as methoxy, alkyl such as methyl
  • bulky substituents represented by t-butyl and isopropyl and hydrophilicity, which are often used for the purpose of lowering the reaction selectivity. Even if a sulfo group, a di-substituted amino group such as dimethylamino, or a highly fat-soluble group such as long-chain alkyl considering lipophilicity is added, the same reactivity is exhibited. Can be used.
  • an amino acid residue containing a carboxylic acid is translated by PUREsystem and then converted into an active ester in the reaction system.
  • a technique for generating an activated ester by a reaction a technique for translating amino acid residues having an active ester in advance using PUREsystem, and the like can be used.
  • amino acid residues having a thioester having a relatively low reactivity among active esters are suitable for translation after isolation as an active ester in advance.
  • an amino acid residue having a more reactive 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (OAt) ester or the like preferably generates an activated ester after translation.
  • the S—R1 group possessed by the amino acid residue of the triangular unit (for example, the residue represented by the general formula (I)) is deprotected during the cyclization reaction, and the resulting SH group is converted into a reaction auxiliary group. Therefore, the active ester of the crossing unit and the amino group of the triangular unit can be selectively and efficiently reacted to form an amide bond and cyclize. That is, since the SH group has high nucleophilicity, the SH group of the triangular unit and the active ester of the crossing unit first react quickly, and then transfer to a thermodynamically more stable amide bond by intramolecular transfer reaction. To do. As a result, it is possible to selectively amidate the triangular unit and the crossing unit (Chemical ligation method).
  • R2 ′′ and R3 ′′ in formula (III) are defined in the same manner as R2 and R3 defined in formula (I).
  • R2 ′′ and R3 ′′ are each independently a hydrogen atom, alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl, heteroaryl, aralkyl, or cycloalkyl, and these groups may be substituted.
  • R2 ′′ and R3 ′′ may form a ring together with the atoms to which they are attached, or R2 ′′ or R3 ′′ together with R26 and the atoms to which they are attached to form a ring. May be.
  • the three-dimensional arrangement included in the structure allows arbitrary arrangement.
  • R2 ′′, N to which R2 ′′ is bonded, R3 ′′, and C to which R3 ′′ are bonded are configured.
  • Examples include the following structures in which a 4- to 7-membered ring is formed as part of the atom.
  • R2 ′′ forms a ring together with R26 and the atoms to which they are bonded
  • R2 ′′, N to which R2 ′′ is bonded, R26, and C to which R26 is bonded are configured.
  • Examples include the following structures in which a 4- to 7-membered ring is formed as part of the atom.
  • R3 ′′ forms a ring together with R26 and the atoms to which they are bonded
  • R3 ′′, R26, and C to which R3 ′′ and R26 are bonded are part of the constituent atoms.
  • Examples include the following structures in which a 3- to 7-membered ring is formed.
  • R2 ′′ and R3 ′′ are more preferably selected from a hydrogen atom, C1-C4 alkyl, C1-C4 alkoxy and / or C1-C4 alkyl optionally substituted with halogen, or the like, or R2 ′′, R3 ′′, R26 A C5-C6 membered ring formed at two sites.
  • the three-dimensional arrangement included in the structure allows arbitrary arrangement.
  • R26 is defined in the same manner as R4 in formula (I). Specifically, R26 is selected from the group consisting of alkylene, arylene, heteroarylene, alkylenearylene, alkyleneheteroarylene, arylenealkylene, and heteroarylenealkylene, and these groups may be substituted.
  • R26 The typical structure of R26 is shown below.
  • the second reaction point (for example, active ester) and the amino acid site may be substituted with methylene (N-3 ′), optionally substituted ethylene (N-4 ′), optionally substituted It can be linked by 1 to 6 carbon atoms which may be substituted, such as propylene (N-5 ′).
  • R13 ′′, R14 ′′, R15 ′′, R16 ′′, R17 ′′, R18 ′′ are the same as the definition of the side chain of the drug-like amino acid defined above, but are substituted with, for example, a hydrogen atom or a halogen atom. It is selected from alkyl which may be substituted, alkoxy which may be substituted with a halogen atom and the like. A cyclized structure may be formed between them.
  • R13 ′′ to R18 ′′ are a hydrogen atom, linear or branched C1-C4 alkyl, C1-C5 alkoxy optionally substituted with one or more fluorine atoms, one or more A fluorine atom, or a C1-C4 alkyl optionally substituted with one or more fluorine atoms, or a C1-C4 alkyl, or two sites selected from R13 "-R18" And a C3-C7 membered ring composed of the atoms to which they are bonded.
  • R13 ′′ to R18 ′′ are a hydrogen atom or methyl.
  • R26 is more preferably 1 carbon atom methylene (N-3 ′), 4 carbon atoms, 5 carbon atoms, or 6 carbon atoms. More preferably, R26 is 1 carbon atom (N-3 ′).
  • the second reaction point for example, active ester site
  • the amino acid site from the carbon atom of the aromatic ring (N-6 ′).
  • the active ester moiety and the amino acid moiety can be linked with an aralkyl structure (N-7 ′, N-8 ′).
  • connection position is limited to ortho, but is not limited to ortho, meta, para, and the like are also possible.
  • benzene is used as the aromatic ring, but aromatic rings other than benzene (that is, various aromatic rings including aromatic heterocyclic rings) may be used.
  • the aromatic ring may be substituted with a substituent such as halogen or alkoxy.
  • R27 represents a hydrogen atom, an optionally substituted alkyl, an optionally substituted alkenyl, an optionally substituted alkynyl, an optionally substituted aryl, an optionally substituted heteroaryl, an optionally substituted cycloalkyl, a substituted Selected from aralkyl optionally substituted with alkyl.
  • the substituent that the group listed as R27 may have is not particularly limited as long as the formula (III-2) having the substituent can be translationally synthesized.
  • substituents are often used for the purpose of increasing reactivity, such as electron withdrawing groups such as halogen, nitro, trifluoromethyl, and nitrile, and for the purpose of lowering the reaction and increasing the reaction selectivity.
  • Electron-donating groups such as alkoxy such as methoxy, alkyl such as methyl, bulky substituents typified by t-butyl and isopropyl, sulfo group considering hydrophilicity, and dimethylamino Examples include di-substituted amino groups and highly lipophilic groups such as long-chain alkyls that are lipophilic.
  • Such substituents preferably include optionally substituted alkyl, optionally substituted cycloalkyl, optionally substituted aralkyl, and more preferably, alkyl and / or aryl may be substituted.
  • alkyl and / or aryl may be substituted.
  • a good aralkyl is mentioned.
  • R3 ′′ in the formula (III-2) is defined in the same manner as the side chain of a drug-like amino acid.
  • a C1-C4 alkyl which may be substituted with a hydrogen atom, C1-C4 alkyl, halogen, etc.
  • a hydrogen atom is particularly preferable.
  • the configuration of R3 ′′ is acceptable for both L-type and D-type amino acids when R3 ′′ is assumed to be a hydrogen atom, but corresponding to L-type amino acids. Is preferred.
  • R28 and R29 are each defined similarly to the definition of the side chain of a drug-like amino acid, for example, a hydrogen atom, an optionally substituted C1-C6 alkyl, an optionally substituted C2-C6 alkenyl, a substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted aryl, optionally substituted heteroaryl, aralkyl optionally substituted with optionally substituted C1-C6 alkyl, and optionally substituted cycloalkyl Selected.
  • a drug-like amino acid for example, a hydrogen atom, an optionally substituted C1-C6 alkyl, an optionally substituted C2-C6 alkenyl, a substituted C2-C6 alkynyl, optionally substituted aryl, optionally substituted heteroaryl, aralkyl optionally substituted with optionally substituted C1-C6 alkyl, and optionally substituted cycloalkyl Selected.
  • R3 ′′ is selected from a hydrogen atom, C1-C4 alkyl optionally substituted with halogen, etc., and particularly preferably a hydrogen atom.
  • the configuration of the R3 ′′ group is that when R3 ′′ is a hydrogen atom.
  • N-12 and N-15 amino acid residues are used as a triangular unit, and a formula (III-3) is used as a crossing unit.
  • Amino acid residues are preferably used.
  • an N-alkylated amino acid for example, proline or N-methylalanine
  • Examples of a method for producing a complex of a drug-like peptide and nucleic acid having a desired activity include a production method including the following steps (Patent Document 1): (i) A non-cyclic peptide site having a total number of amino acids of 9 to 13 is synthesized by translation, and the non-cyclic peptide site and a nucleic acid sequence encoding the non-cyclic peptide site are linked via a linker.
  • a circular peptide site-nucleic acid complex (ii) cyclizing the acyclic peptide site of the complex translated and synthesized in step (i) with an amide bond to form a cyclic compound in which the total number of amino acid residues in the cyclic part is 5 to 12 (iii) A step of contacting the peptide site-nucleic acid complex library having a circular portion obtained in step (ii) with an in vivo molecule and selecting a complex having binding activity to the in vivo molecule.
  • aminoacyl-tRNA used in the peptide or peptide site-nucleic acid complex synthesis step can be prepared by the following method.
  • RNA polymerase suitable for the promoter such as T7 RNA polymerase or T3, SP6 RNA polymerase.
  • I can do it. It is also possible to extract and purify tRNA from the cells, and extract the target generated tRNA using a probe having a sequence complementary to the sequence of tRNA. At this time, cells transformed with the expression vector of the target tRNA can also be used as a source. RNA of the target sequence can also be synthesized by chemical synthesis.
  • an aminoacyl-tRNA can be obtained by binding the tRNA obtained by removing the CA from the 3′-terminal CCA sequence thus obtained and an aminoacylated pdCpA or pCpA separately prepared with RNA ligase (pdCpA method).
  • pdCpA method RNA ligase
  • PCpA method RNA ligase
  • a tRNA for an amino acid represented by formula (I) can be produced using pdCpA or pCpA linked to an amino acid represented by formula (I).
  • the tRNA is useful in the production of the peptide of the present invention, a peptide site / mRNA conjugate, and a peptide site / mRNA conjugate library.
  • the present invention relates to pdCpA or pCpA bound to an amino acid represented by formula (I).
  • the present invention also relates to a tRNA aminoacylated with an amino acid represented by the formula (I).
  • aminoacylation by flexizyme which is a ribozyme prepared by preparing full-length tRNA and carrying active esters of various amino acid analogs on tRNA, is also possible.
  • acylated tRNA can be obtained by using the method described later.
  • translation synthesis is performed by, for example, protein factors (methionyl tRNA transformylase, EF-G, RF1, RF2, RF3, RRF, IF1, IF2, IF3, EF-Tu, EF- Ts, ARS (Choose what you need from AlaRS, ArgRS, AsnRS, AspRS, CysRS, GlnRS, GluRS, GlyRS, HisRS, IleRS, LeuRS, LysRS, MetRS, PheRS, ProRS, SerRS, ThrRS, TrpRS, TyrRS, ValRS) ), Ribosome, amino acid, creatine kinase, myokinase, inorganic pyrophosphatase, nucleoside diphosphate kinase, E.
  • protein factors methionyl tRNA transformylase, EF-G, RF1, RF2, RF3, RRF, IF1, IF2, IF3, EF-Tu, EF- Ts
  • coli -derived tRNA creatine phosphate, potassium glutamate, HEPES-KOH pH7.6, magnesium acetate, spermidine, dithiothreitol, It can be performed by adding mRNA to a known cell-free translation system such as PUREsystem in which GTP, ATP, CTP, UTP and the like are mixed.
  • PUREsystem a known cell-free translation system
  • T7-RNA-polymerase is added, transcription and translation from a template DNA containing a T7 promoter can be performed in a coupled manner.
  • a peptide containing an amino acid analog group can be translated and synthesized by adding a desired acylated tRNA group or an amino acid analog group allowed by ARS (eg, F-Tyr) to the system (Kawakami T, et al . Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat 2009-Chem Biol.
  • ARS eg, F-Tyr
  • Cell-free translation system is a combination of ribosomes extracted from cells, protein factor groups involved in translation, energy sources such as tRNA, amino acids, ATP, etc., and a regeneration system that can translate mRNA into protein. If it is, it will not be limited.
  • the cell-free translation system of the present invention can contain an initiation factor, elongation factor, dissociation factor, aminoacyl tRNA synthetase and the like. These factors can be obtained by purifying from various cell extracts. Examples of the cell for purifying the factor include prokaryotic cells and eukaryotic cells. Prokaryotic cells can include E. coli cells, hyperthermophilic cells, or Bacillus subtilis cells.
  • Known eukaryotic cells are those made from yeast cells, wheat germ, rabbit reticulocytes, plant cells, insect cells, or animal cells.
  • the PURE system is a reconstituted cell-free translation system in which protein factors, energy regeneration enzymes, and ribosomes necessary for translation of Escherichia coli are extracted and purified and mixed with tRNA, amino acids, ATP, GTP, and the like. Not only is the content of impurities small, but because it is a reconstitution system, it is possible to easily produce a system that does not contain protein factors and amino acids to be excluded. ((I) Nat Biotechnol. 2001; 19: 751-5.
  • An mRNA display library can be prepared, for example, as follows. First, a DNA library in which a desired sequence is arranged downstream of a promoter such as T7 promoter is chemically synthesized, and this is used as a template to form double-stranded DNA by primer extension reaction. Using this as a template, it is transcribed into mRNA using RNA polymerase such as T7 RNA polymerase. A linker (spacer) to which the antibiotic puromycin, which is an analog of aminoacyl tRNA, is connected to the 3 ′ end of this RNA is bound.
  • RNA polymerase such as T7 RNA polymerase
  • a display library comprising a complex of mRNA and its product in which mRNA and its product are associated can be constructed.
  • the linker may further comprise a spacer well known to those skilled in the art.
  • molecules that bind to the target can be concentrated (panning).
  • PCR amplification and analysis of the base sequence can reveal the sequence of the bound peptide.
  • the construction of a display library of a complex of a cyclized peptide site and a nucleic acid, and the acquisition of a cyclized peptide site or a cyclized branched peptide that binds to a target from the constructed display library are specifically described.
  • it can be carried out by the method shown in the following manner.
  • the method for producing a peptide-nucleic acid complex having a circular portion and an amide-cyclized peptide library thereof includes the following one or more steps.
  • Step of providing pdCpA or pCpA in which N-9 is aminoacylated B) Providing an initiation tRNA lacking the 3′-terminal CA C) linking the pdCpA or pCpA of step A) and the start tRNA of step B) to provide an N-9 starting aminoacyl tRNA; D) Providing pdCpA or pCpA obtained by aminoacylating Formula (III) -2 or Formula (III) -2-OH
  • Step of providing pdCpA or pCpA in which N-12 or N-15 is aminoacylated B) Providing an initiation tRNA lacking the 3′-terminal CA C) linking the pdCpA or pCpA of step A) and the starting tRNA of step B) to provide an N-12 or N-15 starting aminoacyl tRNA; D) Providing pdCpA or pCpA obtained by aminoacylating formula (III) -3 or (III) -3-OH
  • a method for producing such a peptide-mRNA conjugate having a cyclic portion of the present invention and an amide cyclized peptide library thereof a method comprising one or more of the following steps is even more preferable.
  • this invention relates to the compound represented with the following general formula (IA) and general formula (IIA).
  • this invention relates to the compound represented with the following general formula (IB) and general formula (IIB).
  • R1 to R4, R12, and SP-1 are the same as R1 to R4, R12, and SP-1 in the general formula (I), and R30 is H or Represents a hydroxyl group.
  • R30 is particularly preferably OH.
  • R1, R4, R11, and SP-1 are the same as R1, R4, R11, and SP-1 in the general formula (II), and R30 is H or a hydroxyl group is represented.
  • R30 is particularly preferably OH.
  • the present invention relates to a conjugate of the above general formula (IA) or general formula (IIA) and aminoacyl tRNA.
  • the compound represented by the above general formula (IA), (IB), (IIA), and (IIB), the general formula (IA) or the conjugate of the general formula (IIA) and aminoacyl tRNA is cysteine or a cysteine analog. It is useful in efficient translation of peptides containing multiple amino acid analogs located at the N-terminus. Moreover, it is useful in the manufacturing method of the complex of the peptide and nucleic acid which has a cyclic part containing a several amino acid analog, and a library containing the same.
  • the present invention has an amino acid residue represented by the following general formula (I) or the following general formula (II) having the first reaction point at the N-terminus, and a second chain in one of its side chains.
  • the present invention relates to a complex of an acyclic peptide and a nucleic acid having an amino acid residue having a reactive site at least 4 residues from the N-terminus to the C-terminus.
  • the complex has an amino acid residue represented by the above general formula (I) or general formula (II) having a first reaction point at the N-terminus, and a second reaction in one of its side chains.
  • R1 to R4, R11, R12, and SP-1 are as defined in this specification.
  • a nucleic acid encoding a non-cyclic peptide constituting the complex is used, a complex of a peptide and a nucleic acid containing two or more amino acid analogs and having a cyclic part, or a library thereof can be efficiently produced. it can.
  • the LCMS analysis conditions are as follows.
  • Example 1 Synthesis of pCpA-amino acid for use in a cell-free translation system 1-1.
  • peptides with cysteine or a cysteine analogue synthesis N-terminus of pCpA- amino acids for translating introduce a cysteine or a cysteine analogue at the N-terminus by Initiation suppression method, or cysteine analogues
  • the aminoacylated pCpA was synthesized. That is, aminoacylated pCpA (nk-05, 09, 14, 19, 22) was synthesized according to the following scheme.
  • Buffer A was prepared as follows. Acetic acid is added to an aqueous solution of N, N, N-trimethylhexadecane-1-aminium chloride (6,40 g, 20 mmol) and imidazole (6.81 g, 100 mmol), pH 8, 20 mM N, N, N-trimethylhexadecane- Buffer solution A (1 L) of 1-aminium and 100 mM imidazole was obtained.
  • reaction solution was purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.1% aqueous formic acid / 0.1% formic acid acetonitrile), and (R) -3- (tert-butyldisulfanyl) -2- (methylamino) propane.
  • the acid compound nk10, H-MeCys (StBu) -OH
  • reaction solution was purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.1% aqueous formic acid / 0.1% formic acid acetonitrile) to obtain (S) -3- (tert-butyldisulfanyl) -2- (methylamino) propane.
  • the acid compound nk15, HD-MeCys (StBu) -OH
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure, diethyl ether was added to the concentrated residue, the mixture was filtered, the solid on the filter paper was washed with diethyl ether, and the crude product (2S) -2- (methylamino) -3- (1, 3-Thiazol-4-yl) propanoic acid was obtained.
  • N-methylglycine (1.5 g, 16.8 mmol) and N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (7.35 ml, 42.1 mmol) were added to dichloromethane (33.7 ml). Thereafter, the mixture was cooled to 0 ° C., 2,4-dioxopyrrolidin-1-yl penta-4-enoate (1.95 ml, 17.7 mmol) was added, and the reaction solution was stirred at 25 ° C. for 3 days.
  • N-ethyl-isopropylpropan-2-amine (DIPEA) (2.94 ml, 16.8 mmol) and 2-bromoacetonitrile (2.35 ml, 33.7 mmol) were added to the reaction mixture at 25 degrees. For 4 hours.
  • the reaction solution was diluted with dichloromethane, saturated aqueous ammonium chloride solution was added, and the organic layer was washed with saturated brine. Thereafter, the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • dihydrogen phosphate ((2R, 3R, 4R, 5R) -5- (4-amino-2-oxopyrimidin-1 (2H) -yl) -3-(((((( 2R, 3S, 4R, 5R) -5- (6-Amino-9H-purin-9-yl) -3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (hydroxy) phosphoryl) oxy) -4-(( Tetrahydrofuran-2-yl) oxy) tetrahydrofuran-2-yl) methyl (compound pc01) (400 mg, 0.55 mmol) was dissolved and synthesized by the method described in the literature (WO2013 / 100132A).
  • Example 2 Synthesis of aminoacyl-tRNA for translation initiation having cysteine or cysteine analog 2-1.
  • SEQ ID NO: D-1 (SEQ ID NO: 1): tRNAfMetCAT (-CA) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 2: tRNAfMetCAU (-CA) RNA sequence: GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
  • cysteine or cysteine analogs were synthesized by adding tRNAfMet aminoacylated to a cell-free translation system.
  • PURE system a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli, was used.
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to mass-analyze peptides synthesized by cell-free translation system, MALDI-TOF MS was used. Specifically, 1 ⁇ M template mRNA (R-4) and Thr, Arg, Lys, Ala, Tyr, Trp, Ser, Leu, Pro, and Gly (each final concentration of 250 ⁇ M) are added to the above-described cell-free translation system.
  • a 20 ⁇ M aminoacyl tRNAfMet (Acbz-Cys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AAtR-1), Acbz-D-Cys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AATR-2)), Acbz-MeCys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AAtR-3).
  • WO2013 / 100132A1 it is reported that the Acbz protecting group is removed during the MALDI measurement or the measurement pretreatment operation.
  • MS indicating a peptide in which the first character was skipped as a by-product (Table 2, peptide SEQ ID NO: Pep-2) was observed.
  • a preparation in which 250 ⁇ M Met was added instead of the aminoacyl tRNA for translation initiation and a preparation in which no aminoacyl tRNA for translation initiation was added were prepared, and left at 37 ° C. for 1 hour.
  • the translation reaction was analyzed by MALDI-TOF MS.
  • MALDI-TOF MS As a matrix in MALDI-TOF MS, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) was used.
  • MS indicating a peptide (Table 2, peptide SEQ ID NO: Pep-1) whose N-terminus was started from formylmethionine (hereinafter formylmethionine is abbreviated as fMet) was observed.
  • MS indicating a peptide (Table 2, Peptide SEQ ID NO: Pep-2) whose first character is skipped by initiation read-through (patent document (WO2013 / 100132A1)) was observed.
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUUAAGCUUCUCG
  • the gel after electrophoresis is dried using Clear Dry Quick Dry Starter KIT (TEFCO, 03-278), exposed to an imaging plate (GE Healthcare, 28-9564-75) for 24 hours, and bioanalyzer system ( (Typhoon FLA 7000, GE Healthcare) and detected by ImageQuantTL (GE Healthcare).
  • the peptide (peptide sequence number Pep-10, 11, 12, 15) which is the target product even when translated into Acbz-Cys (StBu), Acbz-D-Cys (StBu), and Acbz-MeCys (StBu) at the N-terminus. ) Bands were observed as main products (in FIG.
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUGACGACGACUAAGCUUCG
  • tRNAfMet amino-acylated with N-methylcysteine having a protecting group is added to a cell-free translation system for translation synthesis. went.
  • PURE system which is a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli, was used.
  • a cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mg / ml E.
  • a cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mg / ml E.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to mass-analyze peptides synthesized by cell-free translation system, MALDI-TOF MS was used. Specifically, 1 ⁇ M template mRNA (R-4) and Thr, Arg, Lys, Ala, Tyr, Trp, Ser, Leu, Pro, and Gly (each final concentration of 250 ⁇ M) are added to the above-described cell-free translation system.
  • tRNAfMet (Acbz-MeCys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AAtR-3), Acbz-D-MeCys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound) was further prepared by aminoacylation of 2 or 25 ⁇ MN-methylcysteine analog. AAtR-4) and o-Acbz-MeCys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AAtR-5)) were added to the translation solution mixture and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • Tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) (final concentration 20 mM) was added to the obtained translation reaction product, and then allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the translation products were analyzed by MALDI-TOF MS using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) as the matrix.
  • the gel after electrophoresis is dried using Clear Dry Quick Dry Starter KIT (TEFCO, 03-278), exposed to an imaging plate (GE Healthcare, 28-9564-75) for 24 hours, and bioanalyzer system ( (Typhoon FLA 7000, GE Healthcare) and detected by ImageQuantTL (GE Healthcare).
  • TEZ Clear Dry Quick Dry Starter KIT
  • GE Healthcare 28-9564-75
  • bioanalyzer system (Typhoon FLA 7000, GE Healthcare) and detected by ImageQuantTL (GE Healthcare).
  • the translation efficiency of the target peptide is the highest when the aminoacyl-tRNA concentration is 25 ⁇ M, and by-products Was found to have the lowest translation efficiency (Fig. 3-1).
  • the production ratio of the target peptide (peptide SEQ ID NO: Pep-12) and by-product (peptide SEQ ID NO: Pep-9) is 96:33 (control experiment) It shows the relative translation efficiency when the translation efficiency of the peptide initiated with formylmethionine (peptide SEQ ID NO: Pep-8) is taken as 100).
  • the production ratio of the target peptide (peptide SEQ ID NO: Pep-13) and by-product (peptide SEQ ID NO: Pep-9) was 56:22.
  • SEQ ID NO: D-2 (SEQ ID NO: 6) tRNAGluCTG (-CA) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
  • SEQ ID NO: D-3 (SEQ ID NO: 7) tRNAGluAAG (-CA) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
  • SEQ ID NO: R-2 (SEQ ID NO: 8) tRNAGluCUG (-CA) RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
  • SEQ ID NO: R-3 (SEQ ID NO: 9) tRNAGluAAG (-CA) RNA sequence: GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
  • a translation solution containing the product was subjected to MS analysis, and the MS intensity of the target product, which is the same peptide compound, was compared to compare translation efficiency. In order to confirm the purity of the product, the MS intensity of the cleaved peptide contained in the product was compared.
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
  • the translation synthesis and translation system for peptides having a cysteine at the N-terminal using the initiation read-through method was PURE system, a reconstructed cell-free protein synthesis system derived from E. coli.
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • strength of the target object and the cleaved peptide which were translationally synthesized is shown in FIG.
  • the total value of the MS intensities of the respective cleaved peptides is represented.
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • Tables 14 to 18 show the template mRNA sequence numbers used for the translation synthesis, the MS theoretical values of the translation synthesized products and cleaved peptides, and the measured values of MALDI-TOF MS. Moreover, the MS intensity
  • the initiation suppression method shows a stronger MS intensity of the target product, and the cleavage.
  • the MS intensity of the peptide was observed weaker. That is, it was proved that the initiation suppression method is a method for efficiently translating and synthesizing a peptide containing a plurality of amino acid analogs having a cysteine at the N-terminus.
  • the cleaved peptide was cleaved before and after the introduction of translation of the amino acid analog, and it was shown that the initiation suppression method can translate and synthesize a peptide containing a plurality of amino acid analogs with high purity.
  • Example 5 Synthesis of an amide-cyclized peptide by native chemical ligation after translational synthesis of a peptide having NMe cysteine having a protecting group at the N-terminus, deprotecting the protecting group 5-1.
  • Translation synthesis of peptides with NMe cysteine with a protecting group at the N-terminus and an active ester in the side chain of the amino acid at the C-terminal side, and native chemical ligation and desulfurization after deprotecting the protecting group of the translated peptide Synthesis of Amide Cyclized Peptide Using the Initiation Suppression Method As shown in the following reaction formula, a peptide having Acbz-MeCys (StBu) at the N-terminus was translated and synthesized, and then tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) was synthesized.
  • StBu Acbz-MeCys
  • the amide cyclized peptide was synthesized by deprotection of Acbz, native chemical ligation, and desulfurization reaction. Specifically, in native chemical ligation using MeCys as a substrate, an equilibrium exists between the thiolactone form produced from thioester exchange and the NCL amide form produced from the subsequent SN exchange, and two mixtures are obtained. . The mixture was subjected to a desulfurization reaction, and the NCL amide compound was desulfurized to bias the equilibrium and proceed the reaction to obtain the desired cyclic peptide. Therefore, the reaction conditions were set so that the peptide obtained from translational synthesis was continuously converted to synthesize the desired amide cyclized peptide. The obtained reaction mixture was subjected to mass spectrometry by MALDI, and it was confirmed that each reaction proceeded and the target amide cyclized peptide was obtained.
  • the template mRNA sequence used for translational synthesis is shown in Table 19 below.
  • PURE system a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, cell-free translation solution (1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • RNasein Ribonuclease inhibitor Promega, N21111
  • 1 mM GTP 1 mM ATP
  • 20 mM creatine phosphate 20 mM creatine phosphate
  • 50 mM HEPES-KOH pH 7.6 100 mM potassium acetate, 6 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol
  • 150 mM TCEP cyclization reaction reagent solution is pH 7.0 TCEP solution (500 mM, 12 ⁇ L), pH 8.3 Tris solution (2 M, 3 ⁇ L), pH 8.0 EDTA solution (500 mM, product number 14362-24, 5 ⁇ L, nacalai) ) And an aqueous potassium hydroxide solution (200 mM, 20 ⁇ L). Further, pH 7.0 TCEP solution (500 mM, 7 ⁇ L) and glutathione (GSH) solution (250 mM, 1 ⁇ L) were added to the cyclization reaction solution (7 ⁇ L), and the mixture was allowed to stand at 42 ° C.
  • pH 7.0 TCEP solution 500 mM, 7 ⁇ L
  • GSH glutathione
  • RNA stability evaluation under post-translational modification conditions RNA is stable under each reaction condition in which the peptide obtained from translational synthesis can be continuously converted to synthesize the desired amide cyclized peptide. An experiment was conducted to confirm this. 6-1. Preparation of mRNA-puromycin linker ligation product for evaluation of stability under post-translational modification conditions A DNA library (SEQ ID NO: D-16) prepared by the method described in the literature (Patent Document WO2013 / 100132) was used as a template.
  • T7 RiboMAX TM Express Large Scale RNA Production System (Promega Corporation, P1320) mRNA (SEQ ID NO: R-16) were prepared by in vitro transcription using was purified using RNeasy MinElute kit (Qiagen Inc.). 6 ⁇ M mRNA (SEQ ID NO: R-16) was added to 9 ⁇ M puromycin linker (Sigma) (SEQ ID NO: C-1), 1X T4 RNA ligase reaction buffer (New england bio lab.), 1 mM ATP, 10% DMSO. The ligation reaction was carried out at 37 ° C.
  • NNN GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC
  • RNA SEQ ID NO: R-16 (SEQ ID NO: 29) GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC (PPP) 9 UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAA
  • PPP GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC
  • UUU, UUG, CUA, AUU, GUU, CCG, ACU, GCU, UAC, CAU, CAG, GAA, UGG, CGG, AGU, AGG, GGU appear randomly Means that.
  • (PP) 9 is schematically that are meant (AUU) 9 not mean only 17 9 diversity by selecting, for example, from 17 different results that it is bound any PPP is 9 times It is shown as an example.
  • mRNA-puromycin linker ligation product (SEQ ID NO: R-17) (SEQ ID NO: 31) GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC (PPP) 9 UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAACCCGTCCCCGCCGCCCT [Spacer18] [Spacer18] [Spacer18] [Spacer18] [Spacer18] CC [Puromycin]
  • a buffer solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM acetic acid containing 1 ⁇ M mRNA-puromycin linker ligation product (SEQ ID NO: R-17).
  • Magnesium, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.1 mM 10-HCO-H4folate (60 ⁇ L) was mixed with 150 mM TCEP cyclization reagent solution (15 ⁇ L) and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour.
  • the 150 mM TCEP cyclization reagent solution has pH 7.0 TCEP solution (500 mM, 12 ⁇ L), pH 8.3 Tris solution (2 M, 3 ⁇ L), pH 8.0 EDTA solution (500 mM, product number 14362-24, 5 ⁇ L, nacalai), An aqueous solution of potassium hydroxide (200 mM, 20 ⁇ L) was mixed to prepare an Acbz deprotected cyclization solution.
  • pH 7.0 TCEP solution 500 mM, 75 ⁇ L
  • glutathione (GSH) solution 250 mM, 10.7 ⁇ L
  • VA-044 2,2 ′ -Azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride (VA-044) solution (1M, 42.9 ⁇ L) and aqueous potassium hydroxide solution (1M, 10.7 ⁇ L) were mixed at 42 ° C. It was left for 3 hours. Thereafter, purification was performed using RNeasy MinElute kit (Qiagen) to obtain a solution of mRNA-puromycin linker ligation product, and then analysis by electrophoresis was performed. (FIG. 7, lane 1).
  • mRNA-puromycin linker ligation product was purified using the RNeasy MinElute kit (Qiagen) in the same manner as described above, prepared as a solution not subjected to desulfurization reaction conditions, and used for migration comparison (FIG. 7, lane 2). ). Further, as a standard solution, a 0.5 ⁇ M mRNA-puromycin linker ligation product (SEQ ID NO: R-17) solution not subjected to the reaction conditions was used for migration comparison (FIG. 7, lane 3). As a marker, TrackIt 10 bp ladder (Life Technologies, product number 10488-019) was used (FIG. 7, lane 4).
  • RNA does not decompose and exists stably in a series of reaction conditions of deprotection reaction of Acbz group, amide cyclization reaction by native chemical ligation, and subsequent desulfurization reaction.
  • tert-butyl 2-bromoacetate (0.006 ml, 0.040 mmol) was added and stirred at room temperature for 16.5 hours, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure to obtain a concentrated residue.
  • the obtained concentrated residue was dissolved in DCM (1 ml), the mixture was cooled in an ice bath, and TFA (1 ml) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 60 minutes, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure. Under a nitrogen atmosphere, DMF (0.40 mL) was added to a mixture of the obtained concentrated residue and (4-nitrophenyl) 4-azidobenzyl carbonate (62.9 mg, 0.20 mmol) at room temperature.
  • N-((((4-azidobenzyl) oxy) carbonyl) -N- (2- (tert-butyldisulfanyl) ethyl) glycine compound nk32
  • DIPEA N-diisopropylethylamine
  • the obtained concentrated residue was dissolved in DCM (1 ml), the mixture was cooled in an ice bath, and TFA (1 ml) was added. The reaction mixture was stirred at room temperature for 15 minutes, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure. Under a nitrogen atmosphere, DMF (0.4 mL) was added to a mixture of the obtained concentrated residue and carbonic acid (4-nitrophenyl) 4-azidobenzyl (62.9 mg, 0.20 mmol) at room temperature. After the mixture was cooled in an ice bath, triethylamine (139 ⁇ L, 1.00 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 35 ° C.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure and purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.1% formic acid aqueous solution / 0.1% formic acid acetonitrile solution) to obtain (2S, 4R) -1-((((9H-fluorene-9 -Yl) methoxy) carbonyl) -4- (methyldisulfanyl) pyrrolidine-2-carboxylic acid (compound nk43) (77.8 mg, 95%) was obtained.
  • LCMS (ESI) m / z 416 (M + H) + Retention time: 0.87 minutes (analysis condition SQDFA05)
  • the obtained concentrated residue was dissolved in acetonitrile (1.6 mL), and N, N-diisopropylethylamine (0.14 mL, 0.80 mmol) was added. After cooling the mixture to ⁇ 20 degrees, chloromethyl chloroformate (51.6 mg, 0.400 mmol) was added. The reaction mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes, water (7.2 ⁇ L, 0.40 mmol) was added, and the reaction mixture was stirred at room temperature for 10 minutes, and then the reaction solution was concentrated under reduced pressure. The resulting concentrated residue was dissolved in acetonitrile (1.6 mL) and tetrabutylammonium azide (569 mg, 2.00 mmol) was added.
  • Example 8 Synthesis of aminoacyl-tRNA for translation initiation having a protecting group at the amino group 8-1.
  • Aminoacyl-tRNA synthesis for introducing an amino acid analog at the N-terminus 50 ⁇ M Transcription tRNAfMetCAU (-CA) (SEQ ID NO: R-1) (20 ⁇ l) and 10 ⁇ ligation buffer (500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2) ( 4 ⁇ l), 10 mM ATP (4 ⁇ l), and Nuclease free water (5.6 ⁇ l) were added, heated at 95 ° C. for 2 minutes, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes to refold tRNA.
  • -CA Transcription tRNAfMetCAU
  • Example 9 9-1 Translation synthesis of peptides having amino acids with amino groups and thiol groups at the N-terminus using the initiation suppression method In the same way as in 3-2 above, the amino suppression and thiol groups are protected using the initiation suppression method, respectively.
  • Translation synthesis was performed by adding tRNAfMet in which the amino acid having a group was aminoacylated to a cell-free translation system.
  • PURE system a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli, was used.
  • cell-free translation solution 1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mg / ml E.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to mass-analyze peptides synthesized by cell-free translation system, MALDI-TOF MS was used. Specifically, 1 ⁇ M template mRNA (R-4) and Thr, Arg, Lys, Ala, Tyr, Trp, Ser, Leu, Pro, and Gly (each final concentration of 250 ⁇ M) are added to the above-described cell-free translation system.
  • tRNAfMet (Acbz- (tBuSSEt) Gly-tRNAfMetCAU (compound AAtR-10), Acbz- (tBuSSEt) ⁇ Ala-tRNAfMetCAU) in which amino acids each having a protecting group at the amino group and thiol group are aminoacylated.
  • the translation products were analyzed by MALDI-TOF MS using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) as the matrix.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • -tRNAfMetCAU (compound AAtR-10), Acbz- (tBuSSEt) ⁇ Ala-tRNAfMetCAU (compound AAtR-11), Acbz- ⁇ hCys (StBu) -tRNAfMetCAU (compound AATR-12), Acbz-Pro (SSMe) -tRNAfMtCAU (tAAfMtCAU) -13), Azoc- (tBuSSEt) GABA-tRNAfMetCAU (compound AATR-14) (final concentration 25 ⁇ M) was added to the translation solution mixture and allowed to stand for 1 hour at 37 ° C. Also, as a control experiment, for starting translation.
  • the gel after electrophoresis is dried using Clear Dry Quick Dry Starter KIT (TEFCO, 03-278), exposed to an imaging plate (GE Healthcare, 28-9564-75) for 24 hours, and bioanalyzer system ( (Typhoon FLA 7000, GE Healthcare) and detected by ImageQuantTL (GE Healthcare).
  • TEZ- (tBuSSEt) Gly the production ratio of the target peptide (peptide SEQ ID NO: Pep-66) and by-product (peptide SEQ ID NO: Pep-9) was 96:10 (formylmethionine as a control experiment).
  • the initiation suppression method is used to have an Acbz-Cys (StBu) at the N-terminus and a Cys-Pro-HOGly sequence and a side chain amino group as shown in the following reaction formula
  • a peptide having a lysine with a translation was synthesized.
  • a cyclic peptide was synthesized by a cyclization reaction by native chemical ligation, and then a branched peptide was synthesized by a subsequent second reaction.
  • PURE system a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, cell-free translation solution (1% (v / v) RNasein Ribonuclease inhibitor (Promega, N2111), 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.5 mg / ml E.
  • RNasein Ribonuclease inhibitor Promega, N21111
  • 1 mM GTP 1 mM ATP
  • 20 mM creatine phosphate 20 mM creatine phosphate
  • 50 mM HEPES-KOH pH 7.6 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol
  • coli MRE600 RNase negative -derived tRNA (Roche), 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml nucleoside diphosphate kinase, 0.6 ⁇ M methionyl tRNA transformylase, 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 2.7 ⁇ M IF1,0 4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M IF3, 40 ⁇ M EF-Tu, 44 ⁇ M EF-Ts, 1.2 ⁇ M ribosome, 0.73 ⁇ M AlaRS, 0.03 ⁇ M ArgRS, 0.38 ⁇ M AsnRS, 0.13 ⁇ M AspRS, 0.02 ⁇ M CysRS, 0.
  • the TCEP solution (1M) was prepared by mixing TCEP hydrochloride (73.2 mg, 0.256 mmol) and an aqueous potassium hydroxide solution (8M, 128 ⁇ L) using Nuclease free water.
  • the generation of branched peptides was confirmed by MALDI-TOF MS (FIG. 10-2, lower figure).
  • the MS intensity ratio of the target branched peptide (Pep-73), by-product (Pep-74) and cyclic peptide (Pep-71) was 85: 9: 6.
  • Example 11 Construction of Display Library Cyclized by Amide Cyclization Using Initiation Suppression Method and Panning of Target-Binding Peptide Using the initiation suppression method, a cyclic peptide display library was prepared and panned to perform GTPase. Experiments were conducted to obtain binding peptides for KRas (KRAS).
  • reaction solution was purified by reverse phase silica gel column chromatography (0.05% trifluoroacetic acid aqueous solution / 0.05% trifluoroacetic acid acetonitrile) to give the title compound (compound nk58, Pen-MePhe (4-Cl) -pCpA). (119 mg, 46%, 2 steps) was obtained.
  • LCMS (ESI) m / z 928 (M ⁇ H) ⁇ Retention time: 0.52 minutes (analysis condition SQDFA05)
  • a DNA library was constructed by the method described in a randomized double-stranded DNA library patent document (WO2013 / 100132A1) encoding a peptide library .
  • a TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG, AGT, AGG, and GGT codons that appear repeatedly 9 times were prepared.
  • Translation solution used for panning has the following composition. 1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.5 mg / ml E.
  • E. coli tRNA Ala1B 3 ⁇ M purified E. coli tRNA His QUG (Nucleic Acids Res. 2010 Apr; 38 (6): e89. Purification)
  • 250 ⁇ M glycine 250 ⁇ M isoleucine, 250 ⁇ M proline, 250 ⁇ M threonine, 250 ⁇ M tryptophan, 250 ⁇ M lysine, 5 mM N-methylvaline, 5 mM N-methylserine, 5 mM N-methylalanine, 5 mM N-methylphenylalanine, 250 ⁇ M 3-fluorotyrosine, 5 mM N-methylhistidine
  • Elongator aminoacylated tRNA mixture shown in Table 23. Furthermore, it prepared by adding any one of Initiator aminoacylated tRNA (Table 24).
  • the present invention is useful in providing a peptide having a drug-like cyclic portion containing a plurality of amino acid analogs, a complex of the peptide and a nucleic acid, and a display library of the complex.
  • a display library constructed using the present invention it is possible to synthesize peptides with higher efficiency than a display library obtained by a conventional technique.
  • a display library constructed using the present invention is expected to contain more diverse compounds than a display library obtained by a conventional method. Therefore, by using the method of the present invention, the probability of acquiring more various drug-like hit compounds is further increased.

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Abstract

チオール基をアミノ基近傍に有し、そのチオール基とアミノ基に特定の保護基を導入したアミノ酸残基をＮ末端に有するペプチドを、イニシエーション・サプレッション法により翻訳すると、アミノ酸翻訳反応の開始確率が向上するうえ、切断ペプチドの生成が抑制され、翻訳効率と純度が向上することが明らかとなった。また、当該ペプチドにおいて、アミド結合による環化反応を効率的に進行させることが可能であることが明らかとなった。これらの知見に基づき、非天然アミノ酸を多複数含むペプチドであってアミド結合による環化部位を有するペプチドと核酸の複合体の新たな製造方法が見出された。

Description

チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸をＮ末端に持つ非環状ペプチド－核酸複合体、そのライブラリー、およびそれから誘導される環状ペプチド－核酸複合体ライブラリーの製造方法
　本発明は、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸がＮ末端に配置された、アミノ酸類縁体を複数含むペプチド、当該ペプチドと核酸複合体の効率的な翻訳手法の構築に関する。また本発明は、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法に関する。
　従来の低分子化合物からではヒット化合物の取得が困難な分子を標的とする創薬を可能とする技術として、近年、分子量５００～２０００の中分子化合物を用いた創薬が注目されている。中分子化合物のひとつであるペプチドは一般に代謝安定性や膜透過性が低いとされてきた。
　しかし、シクロスポリンＡに代表される環状ペプチドや、Ｎ－メチルアミノ酸、Ｄ－アミノ酸等のアミノ酸類縁体を含むペプチドにおいて、代謝安定性や膜透過性が向上することが明らかとなってきている（非特許文献１～３）。さらに、中分子ペプチドのドラッグライクネス（druglikeness、代謝安定性と膜透過性が優れた性質）を満たすために必要な条件（例えば、総アミノ酸数の範囲、Ｎ－置換アミノ酸数、ペプチドの脂溶性）が明らかとなってきている（特許文献１）。
　そこで、膜透過性と代謝安定性の要件を満たす中分子環状ペプチドからなるライブラリーを構築し、ディスプレイライブラリー技術により、その中から薬効を有するペプチド（ヒット化合物）を選択し、その構造最適化を行えれば、中分子創薬を効率化できると考えられる。
　近年、多様なペプチドを有するライブラリーとしてｍＲＮＡディスプレイ法によるライブラリーの研究が進んでいる。この技術によれば１０１２の種類の多様な化合物を含むライブラリーを短期間で創出することが可能である。また最近、再構成無細胞翻訳系を利用したアミノ酸類縁体を含むペプチド調製法が報告され、アミノ酸類縁体を含む環状ペプチドのディスプレイ用ライブラリーが作製された例も報告されている（特許文献２、非特許文献４、５）。
　しかし、従来の方法により作製される、チオエーテル結合により環化されたペプチドは、一般的に酸化代謝を受けやすいことを考慮すると（非特許文献６）、代謝安定性において改善の余地が残されている。
　その一方、特許文献１にて報告されているアミド結合により環化されたペプチドライブラリーは、先述のチオエーテル環化部位を有するペプチドライブラリーと比べて膜透過性と代謝安定性に優れる。
　アミド環化部位を有するペプチドライブラリーを構築する方法の１つとして、Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持ち、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳してネイティブケミカルライゲーションを用いて環化させる方法がある（特許文献１）。
　その環化ペプチド前駆体であるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を持つペプチドを翻訳合成するには以下の３つの方法が報告されている（特許文献１）。
　第１に、ホルミルメチオニンで開始されたペプチドのＮ末端アミノ酸もしくはＮ末端側ペプチドを、システインの直前で酵素によって切断し、システインをＮ末端に有するペプチドを合成する方法である。酵素の例としては、ペプチドデホルミラーゼ（ＰＤＦ）とメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）を利用した方法が報告されている（非特許文献７）。
　第２に、再構築無細胞翻訳系を用い、予め系内からメチオニンを除き、かつＮ末端から２残基目にシステインあるいはシステイン類縁体を配置し、開始コドンであるメチオニンを読み飛ばして翻訳合成を行う方法（イニシエーションリードスルー（initiation read-through；ｉＲＴ）法と定義する)である。
　第３に、メチオニンもしくは翻訳開始メチオニンｔＲＮＡを含まない再構築無細胞翻訳系に、予め開始用のｔＲＮＡとして、アミノ基またはチオール基が保護されていてもよいシステインあるいはシステイン類縁体をアミノアシル化して調製したアミノアシルｔＲＮＡを加えて翻訳合成を行う方法（イニシエーションサプレッション（Initiation suppression）法（ｉＳＰ）法と定義する)である。
　特許文献１には、システインおよびシステイン類縁体が無保護である場合、そのアミノアシルｔＲＮＡを調製するのが困難であること、アミノ基の保護基としてペンテノイル（pentenoyl）基または６－ニトロベラトリルオキシカルボニル（NVOC）基を有するアミノアシルｔＲＮＡを用いたことが報告されている。
　一方、アミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成する方法として、予め人工的にアミノ酸類縁体をアミノアシル化したｔＲＮＡを調製し翻訳に使う方法と、天然型アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase、ARS）を利用して翻訳系中にてアミノ酸類縁体からアミノアシルｔＲＮＡを調製して翻訳導入する方法が知られている（非特許文献５，８，９）。これらは、翻訳導入部位に直接関与するアミノ酸類縁体のアミノアシルｔＲＮＡを利用した方法である。
　しかし、これらの方法を用いてアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成しても、翻訳効率が高くない、あるいは生成物の純度が低下する課題が残されている。例えば、アミノ酸類縁体の導入点前後で切れたペプチド(これらを「切断ペプチド」と定義する)が生成する現象が知られている（非特許文献１０）。
ＷＯ２０１３／１００１３２ ＷＯ２００８／１１７８３３
J. Chatterjee, et al., Acc. Chem. Res. 2008, 41, 1331. J. E. Bock, et al., ACS Chem. Biol. 2013, 8, 488. K. Jpsephson, et al., Drug Discovery Today 2014, 19, 388-399. H. Suga et al., Chem. Bio. 2008, 15, 32. J. W. Szostak et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 10469-10477 薬物代謝学　医療薬学・医薬品開発の基礎として　第3版　加藤隆一、鎌滝哲也、横井毅　編 Meinnel, T., et al. Biochimie (1993) 75, 1061-1075 M. C. T. Hartman et al., PLoS one, 2007, 10, e972. T. Kawakami, ACS Chem Biol., 8, 1205-1214, 2013 J. W. Szostak et al., J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 6131-6136
　本発明は、上述の課題を鑑みてなされたものであり、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基がＮ末端に配置された、アミノ酸類縁体を複数含むペプチドの効率的な翻訳手法を提供することを目的とする。また本発明は、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部であってアミド結合による環化部位を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、翻訳の伸長反応に直接関与しないと想定されてきた翻訳の開始方法が、翻訳の下流におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度ならびに、不純物である切断ペプチドの生成に影響を与えることを明らかにした。この事実は、通常の評価法（すなわち、Ｎ末端以外は天然型アミノ酸から構成されるペプチドでの評価）で検出することはできず、複数のアミノ酸類縁体が含まれるペプチドでの評価によって初めて可能となった。
　即ち本発明者らは、ペプチドやペプチドと核酸の複合体に様々な官能基が共存する中、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基であって、チオール基とアミノ基の両方が選択的かつ定量的に脱保護可能な特定の保護基で保護されたアミノ酸残基をＮ末端に有するペプチドを、ｉＳＰ法により翻訳したところ、当該翻訳反応の開始確率が向上するうえ、切断ペプチドの生成が抑制され、翻訳効率と純度が向上することを明らかにした。さらに本発明者らは、ｉＳＰ法を用いて得られたペプチドおよび当該ペプチドと核酸の複合体のペプチド部位を効率的に環化できる、環化部位を有するペプチドおよび当該ペプチドと核酸の複合体の新たな製造方法を見出し、本発明に至った。
　すなわち、本発明は以下を含む。
〔１〕
　２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、
　第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
（式中、
　Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
　Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
　Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
　Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
　ＳＰ－１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000019
（式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000020
（式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成されるペプチド、または当該ペプチドと当該核酸との複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程を含む、方法。
〔２〕
　Ｒ１が、Ｓ－Ｒ２３（ここで、Ｒ２３はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい）、スルホネート（－ＳＯ３ －）、およびチオスルホネート（－Ｓ２Ｏ３ －）からなる群より選択される、〔１〕記載の方法。
〔３〕
　Ｒ２３が、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ－トリフルオロメチルフェニル、ｐ－フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、〔２〕に記載の方法。
〔４〕
　Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル、またはＣ１－Ｃ４アルコキシである、〔１〕～〔３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔５〕
　Ｒ４が、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000021
（式中、Ｒ１３～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕～〔４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔６〕
　Ｒ１３～Ｒ１８が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
　Ｒ１１およびＲ１２がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000022
（ここでＲ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕～〔６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔８〕
　Ｒ１３'～Ｒ１８'が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000023
（式中、
　Ｒ１～Ｒ４およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１～Ｒ４およびＳＰ－１と同意義を表し、
　Ｒ１３'～Ｒ１６'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'～Ｒ１６'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000024
（式中、
　Ｒ１、Ｒ４およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１、Ｒ４およびＳＰ－１と同意義を表し、
　Ｒ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'～Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕～〔８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１０〕
　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000025
（式中、
　Ｒ１～Ｒ３およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１～Ｒ３およびＳＰ－１と同意義を表し；
　Ｒ１３～Ｒ１６は、それぞれ〔５〕に記載のＲ１３～１６と同意義を表し；
　Ｒ１３'～Ｒ１６'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'～Ｒ１６'と同意義を表し；あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない）のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000026
（式中、
　Ｒ１およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕に記載のＲ１およびＳＰ－１と同意義を表し；
　Ｒ１３～Ｒ１８は、それぞれ〔５〕に記載のＲ１３～Ｒ１８と同意義を表し；
　Ｒ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ〔７〕に記載のＲ１３'～Ｒ１８'と同意義を表す。）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕～〔９〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１１〕
　ＳＰ－１が、４－アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ－Ａｃｂｚ）、２－アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ－Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２－ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、もしくは２－（ｔ－ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル（Ｔｂｅｏｃ）であるか、またはＳＰ－１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成する、〔１〕～〔１０〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１２〕
　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000027
（式中、
　Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２"またはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し；
　Ｒ２５は水酸基であるか、またはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成し；
　Ｒ２６は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよい）
で表される、〔１〕～〔１１〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１３〕
　Ｒ２６が、以下：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000028
（式中、Ｒ１３"～Ｒ１８"は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、〔１〕～〔１２〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１４〕
　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000029
（式中、
　Ｒ２"は、〔１２〕に記載のＲ２"と同意義を表し；
　Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル基であり；
　Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、〔１〕～〔１３〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１５〕
　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000030
（式中、
　Ｒ２"は、〔１２〕に記載のＲ２"と同意義を表し；
　Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル基であり；
　Ｒ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいＣ１－Ｃ６アルキル基、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルケニル基、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいアラルキル基、または置換されてもよいシクロアルキル基であり；
　Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
で表される、〔１〕～〔１４〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１６〕
　環状部に存在する－ＳＨ基を脱硫する工程をさらに含む、〔１〕～〔１５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１７〕
　環状部を有するペプチドと核酸との複合体が、ペプチドと核酸との間にリンカーを有する、〔１〕～〔１６〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１８〕
　ペプチドが、メチオニン、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）、メチオニン用翻訳開始ｔＲＮＡ、フォルミルドナー、メチオニルｔＲＮＡトランスフェラーゼの少なくとも１つを含まない無細胞翻訳系において翻訳して合成される、〔１〕～〔１７〕のいずれか一項に記載の方法。
〔１９〕
下記一般式（ＩＡ）または下記一般式（ＩＩＡ）で表される化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000031
（式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）。
〔２０〕
　下記一般式（ＩＢ）または下記一般式（ＩＩＢ）で表される化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000033
（式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表し、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す）。
〔２１〕
　〔１９〕記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。
〔２２〕
　第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表される、アミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000034
（式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）。
〔２３〕
　非環状ペプチドが、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000035
（式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって得られる、〔２２〕記載のペプチド又は複合体。
〔２４〕
　〔２２〕もしくは〔２３〕記載のペプチド又は複合体を用いて、２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを製造する方法。
〔２５〕
　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000036
（式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１、Ｒ２、およびＳＰ－１と同意義を表す）。
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または
　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000037
（式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり、
　Ｒ２３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕～〔１８〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２６〕
　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000038
（式中、Ｒ１、およびＳＰ－１は、それぞれ〔１〕のＲ１、およびＳＰ－１と同意義を表し、Ｒ２は水素原子、またはアルキル基であり、アルキル基は置換されていてもよい）
のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
（式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり、
　Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、またはｓｅｃ－ブチルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである）
のいずれかで表されるアミノ酸残基である、〔１〕～〔１８〕および〔２５〕のいずれか一項に記載の方法。
〔２７〕
　２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、以下の（ａ）および（ｂ）に記載の工程を含む方法：
（ａ）第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000040
（式中、
　Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
　Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
　Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
　Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
　ＳＰ－１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000041
（式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000042
（式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体を、当該ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程、および
（ｂ）工程（ａ）で得られる非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体から一般式（Ｉ）中のＲ１およびＳＰ－１を除去し、第一の反応点と第二の反応点とを反応させてアミド結合を形成させる工程を含む、方法。
　本発明により、アミノ酸類縁体を複数含むペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体を、切断ペプチドの生成を抑制して高い収率と純度で翻訳合成し、かつ効率的に環化することが可能となる。
　その結果、アミノ酸類縁体を複数含むドラックライクな環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体、および当該複合体のディスプレイライブラリーが提供される。本発明を用いて構築したディスプレイライブラリーは、従来の手法よりもアミノ酸類縁体を多数含むペプチドを高い効率で翻訳合成できるので、より多彩なドラックライクなヒット化合物を取得する確率がさらに高まる。
　また、本発明を用いればＬ－システインのみならず、Ｄ－システインや、ＬまたはＤ－Ｎメチルシステインを含む、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基を、Ｎ末端に翻訳導入することが可能となる。そのため、より多様性の高いドラッグライクなディスプレイライブラリーを提供することが可能となる。
　さらに本発明によるｍＲＮＡディスプレイライブラリーから得られたヒット化合物は、既に優れた膜透過性と代謝安定性を有しているので、医薬品としての最適化を効率良く実施することが可能である。
図１は、Ｎ末端にｐ－Ａｃｂｚ保護されたシステイン類縁体を持つ翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。 図２－１は、ｐ－Ａｃｂｚ保護されたＮ－メチルシステインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。 図２－２は、ｐ－Ａｃｂｚ保護されたＮ－メチル－Ｄ－システインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。 図２－３は、ｏ－Ａｃｂｚまたはｐ－Ａｃｂｚ保護されたＮ－メチルシステインの翻訳合成ペプチドのMALDI TOF MSによる確認を示す図である。 図３－１は、Ａｃｂｚ保護されたＮ－メチルシステインの翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。 図３－２は、ｏ－Ａｃｂｚまたはｐ－Ａｃｂｚ保護されたＮ－メチルシステインの翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。 図４は、Initiation suppression法とinitiation read-through法のそれぞれの翻訳の開始方法を用いて同じペプチドを翻訳合成した際のMALDI-TOF MS分析の結果を示す図である。Initiation read-through法とInitiation suppression法を比較すると、 Initiation suppression法は目的物のＭＳ強度がより強く観測された。また切断ペプチドのＭＳ強度はより弱く観測され、それぞれのＭＳ強度は目的物と比較して１／２０以下であった。 図５は、それぞれの翻訳開始方法によってアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成した際に得られた目的物と副生成物である切断ペプチドのＭＳ強度を示す図である。切断ペプチドＭＳ強度を示すグラフは、複数の切断ペプチドが観測された場合、それらのＭＳ強度の合計値を表している。Initiation read-through法とInitiation suppression法を比較すると、 Initiation suppression法は目的物のＭＳ強度がより強く観測され、切断ペプチドのＭＳ強度はより弱く観測された。 図６－１は、Ｎ－末端に保護基を有するＮ－メチルシステインとＣ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳合成した後に、Ｎ－メチルシステインの保護基を脱保護し、ネイティブケミカルライゲーションによる環化反応によって得られた化合物と、その後の脱硫反応によって得られたアミド環化ペプチドのマススペクトルを示した図である。 図６－２は、図６－１の続きを示す図である。 図６－３は、図６－２の続きを示す図である。 図６－４は、図６－３の続きを示す図である。 図６－５は、図６－４の続きを示す図である。 図６－６は、図６－５の続きを示す図である。 図７は、Ａｃｂｚ脱保護反応、ネイティブケミカルライゲーションによる環化反応、脱硫反応条件下におけるＲＮＡの安定性を電気泳動により評価した結果を示す図である。 アミノ基がp-Acbz保護されたアミノ酸類縁体をN末端に翻訳導入したペプチドの電気泳動による確認を示す図である。 アミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を有するアミノ酸類縁体をN末端に翻訳導入したペプチドの電気泳動による確認を示す図である。 N-末端にAcbz-Cys(StBu)を有しCys-Pro-HOGlyとC末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドを翻訳合成した後にAcbz基、StBuをそれぞれ脱保護しネイティブケミカルライゲーションによる環化反応によって得られた環化ペプチドPep-71のマススペクトルを示した図である。 翻訳ペプチドからネイティブケミカルライゲーションによって合成した環状ペプチドPep-71を分枝反応条件に付した分枝ペプチドのマススペクトルを示した図である。上図は分枝反応条件改良する前、下図は改良した分岐反応条件に付したマススペクトルをそれぞれ示す。
＜置換基等の定義＞
　本明細書において、「アルキル」とは脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１～２０個の範囲である。アルキルとしては、たとえば、「Ｃ１－Ｃ６アルキル」が挙げられ具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、１－メチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、２，２－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル等が挙げられる。
　本明細書において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。アルケニルとしては、直鎖状または分枝鎖状のものが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。好ましくはＣ２－Ｃ１０アルケニル、さらに好ましくはＣ２－Ｃ６アルケニルが挙げられる。
　このようなアルケニルとして、具体的には、たとえば、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキニル」は、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。好ましくはＣ２－Ｃ１０アルキニル、さらに好ましくはＣ２－Ｃ６アルキニルが挙げられる。
　アルキニルとしては具体的には、たとえば、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２'－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。好ましくはＣ３－Ｃ１０シクロアルキルが挙げられる。シクロアルキルとしては具体的には、たとえば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリール」とは１価の芳香族炭化水素環を意味し、好ましくはＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられる。アリールとしては具体的には、たとえば、フェニル、ナフチル（たとえば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に好ましくは１～５個のヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（たとえば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は好ましくは５～１０である（５員－１０員ヘテロアリール）。
　ヘテロアリールとしては具体的には、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味し、好ましくは、「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」が挙げられる。たとえば、ベンジルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキレン」は、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、アルキレンとしては好ましくはＣ１－Ｃ２アルキレン、Ｃ１－Ｃ３アルキレン、Ｃ１－Ｃ４アルキレン、Ｃ１－Ｃ５アルキレン、Ｃ１－Ｃ６アルキレンが挙げられる。アルキレンとして具体的には、たとえば、メチレン、１，２－エチレン、１，１－エチレン、１，３－プロピレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレンなどが挙げられる。
　本明細書において「アリーレン」は、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。アリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは６～１０である（Ｃ６－１０アリーレン）。アリーレンとして具体的には、たとえば、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリーレン」は、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。ヘテロアリーレンは、単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、好ましくは５～１０である（５員～１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとして具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイルおよびチオフェンジイルなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキレンアリーレン」とは、前記アルキレンと前記アリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンアリーレンとして具体的には、－Ｃ１－Ｃ６アルキレン－Ｃ６－Ｃ１０アリーレンなどが挙げられる。
　本明細書において「アリーレンアルキレン」とは、前記アリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアリーレンが結合した基を意味する。アリーレンアルキレンとして具体的には、－Ｃ６－Ｃ１０アリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
　本明細書において「アルキレンヘテロアリーレン」とは、前記アルキレンと前記ヘテロアリーレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にアルキレンが結合した基を意味する。アルキレンヘテロアリーレンとして具体的には、－Ｃ１－Ｃ６アルキレン－５員－１０員ヘテロアリーレンなどが挙げられる。
　本明細書において「ヘテロアリーレンアルキレン」とは、前記ヘテロアリーレンと前記アルキレンとが任意の位置で結合した２価の基であって、基本骨格側にヘテロアリーレンが結合した基を意味する。ヘテロアリーレンアルキレンとして具体的には、－５員－１０員ヘテロアリーレン－Ｃ１－Ｃ６アルキレンなどが挙げられる。
　本明細書において、「活性エステル」とは、アミノ基と反応してアミド結合を生成するカルボニルを含む基であって、該カルボニルに、たとえばＯＢｔ、ＯＡｔ、ＯＳｕ、ＯＰｆｐ、ＳＲ１などが結合した基であり、アミンとの反応を促進しうる基である。
　「反応補助基」とは、望みの位置で選択的に反応を起こさせるために、結合させる官能基の近傍に導入されて、該官能基を結合反応に対して活性化する基であり、たとえば、カルボニルとアミンを反応させるため、カルボニルとアミン側のいずれか、あるいは両方に反応補助基を導入させることができる。このような反応補助基は、結合反応とともに、あるいは結合反応後に脱離させることもできる。
＜ペプチド、ペプチドと核酸の複合体＞
・環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体
　本発明において、環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の環状部は、翻訳合成された後のペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体をアミド化反応に供することにより形成される。本発明において、ペプチドと核酸の複合体のペプチドの部分を、「ペプチド部位」と記載する場合がある。また、本発明において、「核酸」にはＤＮＡとｍＲＮＡが含まれる。
　また、翻訳合成後、アミド化反応により環状部が形成されたペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体のペプチド部位をさらに化学修飾して得られるペプチド、ペプチドと核酸の複合体も、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体に含まれる。
　スキームＡに例示されるとおり、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体は直鎖部を有していてもよい。ペプチド、ペプチド部位のアミド結合の数（アミノ酸の数・長さ）は特に限定されないが、直鎖部を有する場合、環状部と直鎖部を併せて３０残基以内が好ましい。直鎖部の数は特に限定されないが、１または２以上の直鎖部を有していてもよい。最終的に得られる環状ペプチドが高い膜透過性を獲得するためには、環状部と直鎖部を併せた総アミノ酸数は１３残基以下であることが好ましい。高い代謝安定性を獲得するためには、総アミノ酸数が９以上であることが好ましい。膜透過性と代謝安定性の両立（ドラッグライクネス）を考慮すると環状部を構成するアミノ酸の数は５～１２であることが好ましく、５～１１であることがより好ましく、７～１１であることがさらに好ましく、９～１１であることが特に好ましい。直鎖部のアミノ酸の数（ユニットの数）は０～８であることが好ましく、０～３であることがより好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000043
　スキームＡは、本発明のペプチドと核酸の複合体のうち、（環化前後の）ペプチド部位を説明したスキームである。白丸（○）ユニット（交差ユニット）、黒丸（●）ユニット（環状部主鎖ユニット）、四角（■）ユニット（直鎖部主鎖ユニット）、三角（▲）ユニット（環化Ｎ末端ユニット）はそれぞれペプチド部位を構成するアミノ酸を意味する。それぞれのユニットは同一のアミノ酸であっても、異なるアミノ酸であってもよい。
　ここで、ユニットとは、翻訳合成後環化前のアミノ酸、環化後のアミノ酸、環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸のいずれかを意味する。環化後の化学修飾が完了した時点でのアミノ酸には、１つのｔＲＮＡによって翻訳されたアミノ酸が、翻訳後の化学修飾により、化学変換や骨格変換されたアミノ酸が含まれる。
　環状部とは、スキームＡにおいては、１つの三角ユニットと８つの黒丸ユニットおよび１つの白丸ユニットからなる部位であり、直鎖部とは６つの四角ユニットからなる部位である。スキームＡの曲線部分が翻訳後に環化される部位（翻訳後環化部）であり、この部分はアミド結合にて結合される。
　本発明のペプチドまたはペプチド部位は、スキームＡに記載の三角ユニットや交差ユニットに反応性官能基を要求するため、三角ユニットや交差ユニットには必ずしもドラッグライクなアミノ酸が選択されない。また、本発明においては、環状部は、２以上のアミノ酸類縁体残基を含むことが好ましい。
　また、本発明のペプチド、ペプチドと核酸の複合体は、スキームＡに沿って、三角ユニットと交差ユニットとを環化した後、例えば、分子内環化反応をさらに行うことにより、２つの直鎖部（直鎖部１および直鎖部２）を有する環状ペプチドを得ることができる（ＷＯ２０１３／１００１３２参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000044
　本明細書において「翻訳合成」とは、ペプチドまたはペプチド部位をコードする核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）から、該ペプチドまたはペプチド部位を翻訳して合成すること意味する。翻訳とは、リボゾームの作用によってｍＲＮＡを鋳型にアミド結合反応を繰り返すことによって直鎖ペプチドを得る工程である。
　本明細書において「翻訳後修飾」とは、翻訳後にリボゾームの作用以外で自動的にあるいは試薬を添加させて生じさせる化学反応を意味し、例えば環化反応、脱硫反応、脱保護反応を挙げることができる。
　本発明において、環化前のペプチドまたはペプチド部位における三角ユニット（環化前Ｎ末端ユニット）には、チオール基をアミノ基近傍に有するアミノ酸残基であって、チオール基とアミノ基の両方が保護基によって保護されたものを利用することができる。このようなアミノ酸残基として、具体的には、一般式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000045
または一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000046
で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
　本発明において、環化前のペプチドまたはペプチド部位における交差ユニットには、三角ユニットのアミノ酸が有する官能基（第一の反応点）と、アミド結合によって環化できる官能基（第二の反応点）を側鎖に有するアミノ酸が用いられる。交差ユニットでは、主鎖のアミノ基、カルボキシル基が翻訳合成での他のアミノ酸残基との共有結合形成に使用され、かつ第三の官能基が翻訳後環化に必要であるため、合計３つ以上の官能基を有する必要がある。この中で、翻訳後の環化反応には、交差ユニットの側鎖部位の官能基が用いられる。
　交差ユニットは、環化可能な位置であれば、環化前ペプチド部位中の任意の位置に組み込むことが可能であるが、環化、もしくは環化後の翻訳後修飾が施された後の環状部のアミノ酸数が５～１２となるような位置に組み込むことが好ましく、５～１１となる位置に組み込むことがより好ましい。すなわち本発明においては、交差ユニットは、三角ユニットから少なくとも４アミノ酸残基（例えば、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基）Ｃ末端側の位置に組み込むことが好ましい。
　このような交差ユニットとして具体的には、下記一般式（ＩＩＩ）または（ＩＩＩ－ＯＨ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000047
で表されるアミノ酸残基が挙げられる。
　黒丸ユニット、四角ユニットはアミノ酸より選択され、好ましくはドラッグライクなアミノ酸から選択される。
　本発明において「ドラッグライクなアミノ酸」とは、ドラッグライクなペプチド部位を構成するアミノ酸をいい、「アミノ酸」と同一の骨格、すなわち、α、βおよびγ－アミノ酸と同一の骨格を有するものをいう。具体的には、ドラッグライクなアミノ酸は、Ｌ型アミノ酸およびＤ型アミノ酸、α、α―ジアルキルアミノ酸などから選択される。好ましくは、主鎖アミノ基（ＮＨ２基）の水素原子２つのうちの１つがメチルで置換されたものが挙げられ、当該メチルの水素原子のうち１つあるいは２つがさらにアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどで置換されてもよいものが挙げられる。また、主鎖メチレン（－ＣＨ２－）の水素原子のうち、１つあるいは２つがアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどで置換されたもの、あるいは「ドラッグライクネスに寄与する置換基」が直接置換したものも含む。
　「ドラッグライクなアミノ酸」の上記の置換基は、「ドラッグライクネスに寄与する置換基」でさらに置換されていてもよい。ここで、「ドラッグライクネスに寄与する置換基」には、例えば、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、アミド（－ＮＲ－ＣＯ－Ｒ'もしくは－ＣＯ－ＮＲＲ'）、スルホニル（－ＳＯ２－Ｒ）、スルフィニル（－ＳＯ－Ｒ）、ハロゲン、オキシアミノ（－ＮＲ－ＯＲ'）、アミノオキシ（－Ｏ－ＮＲＲ'）、オキシカルボニル（－ＣＯ－ＯＲ）、チオカルボニル（－ＣＯ－ＳＲ）、チオール（－ＳＨ）、チオ（－ＳＲ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨＲ）あるいは３級アミノ（－ＮＲＲ'）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、ボリル（－ＢＲＲ'）、ジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））、アジド（－Ｎ３）、カルボキシカルボニル（－ＣＯ－ＣＯ２Ｈ）、ホスホリルカルボニル（－ＣＯ－ＰＯ（Ｒ）（Ｒ'））、カルボニルオキシアミノ（－ＮＨ－Ｏ－ＣＯ－Ｒ）などの中から選択される１つ以上の置換基が挙げられる。
　また「ドラッグライクなアミノ酸」には、ペプチドの側鎖部分（例えばＤ－チロシンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたＤ型のアミノ酸、β―アラニンにてヒット化合物が取得された場合には、そこから化学修飾させたβ―アミノ酸）、あるいはＮメチルアミノ酸の化学変換によるＮ末端置換部分の構造を最適化した、化学的に合成し得る全てのアミノ酸も含まれる。
　本発明において「ドラッグライクネス」あるいは「ドラッグライク」とは、ペプチド部位が、少なくとも経口剤、あるいは、細胞内蛋白、核酸、膜蛋白の細胞内領域又は膜蛋白の膜貫通ドメインを標的とした場合に、医薬品として利用できる程度の膜透過性と代謝安定性を有することを意味する。
　本発明のペプチドまたはペプチド部位は、直鎖部がなくてもよいが、直鎖部を有することで、環状部を有するペプチドまたはペプチド部位の機能を強化することが可能である。例えば、あるレセプターとリガンドの結合を阻害するために前記ペプチドまたはペプチド部位を利用する場合、当該ペプチドまたはペプチド部位が直鎖部を有することで、直鎖部がない場合と比較して、当該ペプチドまたはペプチド部位の、レセプターあるいはリガンドに対する結合活性を高めることができる。そして、当該結合活性の増強により、レセプターとリガンドの結合阻害効果を高めることが可能である（ＷＯ２０１３／１００１３２参照）。
　本発明において、ペプチドまたはペプチド部位を構成する「アミノ酸」は、「天然アミノ酸」でも「アミノ酸類縁体」でもよい。「アミノ酸」、「天然アミノ酸」、「アミノ酸類縁体」はそれぞれ、「アミノ酸残基」、「天然アミノ酸残基」、「アミノ酸類縁体残基」ということがある。
　「天然アミノ酸」とは、α－アミノカルボン酸（α－アミノ酸）であり、タンパク質に含まれる２０種類のアミノ酸を指す。具体的にはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｐｒｏを指す。
　「アミノ酸類縁体」は、非天然型アミノ酸（例えば、非天然型のα－アミノ酸、βアミノ酸、γ－アミノ酸）を含む。α－アミノ酸の場合、Ｄ型アミノ酸でもよく、α，α－ジアルキルアミノ酸でもよい。βやγ－アミノ酸の場合も、α－アミノ酸と同様に、任意の立体配置が許容される。アミノ酸類縁体の側鎖（主鎖メチレン）は特に制限されないが、水素原子の他にも例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを有し得る。それぞれには１つ以上の置換基を有していてもよく、それら置換基は例えば、ハロゲン原子、Ｎ原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、Ｐ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本明細書において「ハロゲンを置換基に有していてもよいＣ１－Ｃ６アルキル」とは、１つ以上のハロゲン原子で置換された「Ｃ１－Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタプルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチル等が挙げられる。また、例えば「置換基を有していてもよいＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」とは、「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」のアリールおよび／またはアルキルの少なくとも一つの水素原子が、置換基により置換された基を意味する。さらに、これら「置換基を２つ以上有している場合」は、例えば、Ｓ原子を含む官能基を有し、さらにその官能基がアミノやハロゲンなどの官能基を有していることも含む。
　アミノ酸類縁体の主鎖アミノ基は、非置換（ＮＨ２基）でもよく、置換（即ち、ＮＨＲ基：Ｒは置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示し、またプロリンのようにＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。該置換基は、側鎖の置換基と同様であり、例えば、ハロゲン、オキシ、ヒドロキシなどが挙げられる。）されていてもよい。さらに、これらの置換基の定義の中における「アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキル」は、前記の当該官能基の定義を準用する。例えば、本明細書において「アルコキシ」とは、水酸基の水素原子が前記アルキルで置換された基を意味し、例えば好ましい例として「Ｃ１－Ｃ６アルコキシ」が挙げられる。
　また、「アミノ酸類縁体」には、「アミノ酸」のアミノ基が水酸基に置き換わった、ヒドロキシカルボン酸も含まれる。当該ヒドロキシカルボン酸は、他のアミノ酸類縁体と同様に、様々な置換基を有していてもよい。ヒドロキシカルボン酸の立体配置はアミノ酸のＬ型、Ｄ型のいずれに対応するものでもよい。その側鎖は特に制限されないが、例えば置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどの中から選択される。
　ハロゲン由来の置換基としては、フルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）、ヨウド（－Ｉ）などが挙げられる。
　Ｏ原子由来の置換基としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ基（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）が挙げられる。
　オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
　カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
　オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）
　カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
　チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
　カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
　アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。これらに加えて、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
　カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
　オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
　スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。これらに加えて、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
　アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。これらに加えて、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子がアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルでさらに置換された化合物が挙げられる。
　スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子はアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より独立して選択される置換基で置換されていてもよく、またこれらの２つの置換基は環を形成しても良い。
　Ｓ原子由来の置換基として、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）が挙げられる。
　チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどの中から選択される。
　スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
　スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
　Ｎ原子由来の置換基として、アジド（－Ｎ３、「アジド基」ともいう）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）が挙げられる。
　２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
　３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ'））の例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなど、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択される、任意の２つの置換基を有するアミノ基が挙げられ、これらの任意の２つの置換基は環を形成しても良い。
　置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｎ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。
　置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ'''）－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ，Ｒ'、Ｒ"、およびＲ'''が、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらが環を形成した基などが挙げられる。
　アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ'Ｒ"）の例としては、Ｒ、Ｒ'、およびＲ"が、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルの中からそれぞれ独立して選択された基、あるいはこれらは環を形成した基などが挙げられる。
　Ｂ原子由来の置換基として、ボリル（－ＢＲ（Ｒ'））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ'））などが挙げられる。これらの２つの置換基ＲおよびＲ'は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルなどの中からそれぞれ独立して選択されるか、あるいはこれらは環を形成してもよい。
　ペプチドまたはペプチド部位を構成する「アミノ酸」を構成する少なくとも１つの原子は、原子番号（陽子数）が同じで，質量数（陽子と中性子の数の和）が異なる原子（同位体）であってもよい。当該ペプチド部位を構成する「アミノ酸」に含まれる同位体の例としては、水素原子、炭素原子、窒素原子、酸素原子、リン原子、硫黄原子、フッ素原子、塩素原子などがあり、それぞれ、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌ等が含まれる。
　本発明において、Ｎ末端以外に利用できる非天然型アミノ酸（アミノ酸類縁体）を以下に例示するが、それらに限定されない。これらの非天然型アミノ酸の多くは側鎖が保護あるいは無保護、アミン部位が保護あるいは無保護の状態で購入することができる。購入できないものは、既知の方法によって合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000048
　非天然型アミノ酸として、以下のＮ－Ｍｅアミノ酸を用いることができる。
　Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４―クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸、
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000049
　非天然型アミノ酸として、以下のＮ－アルキルアミノ酸も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000050
　非天然型アミノ酸として、以下のＤ型アミノ酸も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000051
　非天然型アミノ酸として、以下のα，α－ジアルキルアミノ酸も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000052
　非天然型アミノ酸として以下のアミノ酸も用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000053
＜環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の製造方法＞
　本発明の環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体（ペプチド－核酸複合体）、またはペプチド－核酸複合体のライブラリーは、例えば以下に記載の工程を含む方法を利用して製造することが可能である。
１）アミノ酸残基により構成される非環状のペプチドまたはペプチド部位を、該ペプチドまたはペプチド部位をコードする核酸から翻訳して合成する工程であって、
　該非環状のペプチドまたはペプチド部位は、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000054
で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含む、工程；および
２）第一の反応点と、第二の反応点とを反応させ、アミド結合を形成させる工程
を含む、前記方法。
　本発明において、非環状のペプチドまたはペプチド部位の翻訳合成には、イニシエーションサプレッション（Initiation Suppression：iSP）法を利用する。通常の翻訳では、一般的に翻訳開始アミノ酸としてメチオニンがＮ末端アミノ酸として翻訳される。翻訳の開始には専用の「開始ｔＲＮＡ」があり、開始ｔＲＮＡがメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）と結合しリボソームに運ばれることによって、翻訳が開始され、Ｎ末端のアミノ酸がメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）となる。これに対し、翻訳系内からメチオニンがアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを除去し（または生成されないにし）、予め調製した所望のアミノ酸がアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを代わりに翻訳系内に加えることによって、Ｎ末端に所望のアミノ酸を持つペプチドを翻訳合成することをイニシエーションサプレッション法という。アミノ酸類縁体のＮ末端導入ではアミノ酸の許容度が伸長時よりも高く、天然型アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸、アミノ酸類縁体を利用することが知られている（非特許文献：J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1.Translation initiation with initiator tRNA charged with exotic peptides.Goto Y, Suga H.）。
　第一の反応点を有する上記一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含むペプチドは、それをコードする核酸を翻訳することによってｉＳＰ法により取得することができる。
　ペプチドまたはペプチド部位を構成するアミノ酸は、ドラッグライクなアミノ酸であることが好ましい。得られるペプチドまたはペプチド部位がドラッグライクなものとなるように、翻訳合成後にドラッグライクなアミノ酸となるように化学修飾してもよい。
＜翻訳可能なアミノ酸のＮ末端への導入＞
　本発明では、チオール基をアミノ基近傍に有し、チオール基とアミノ基がどちらとも保護されているアミノ酸残基（三角ユニット、例えば、保護基によって保護されたシステインやシステイン類縁体）をアミノアシル化した翻訳開始ｔＲＮＡを用いて翻訳させることによってＮ末端を所望のアミノ酸として翻訳させることもできる。すなわち本発明は、第一の反応点を有する一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に含み、側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＣ末端側に含む非環状ペプチドの製造方法をも提供する。
　本発明においては、ｉＳＰ法を使用することができる。すなわち、アミノアシル化したｔＲＮＡをメチオニン、フォルミルドナーもしくはメチオニルトランスフェラーゼを抜いた翻訳系に添加し、翻訳開始コドン（例えばＡＵＧ）に三角ユニットをコードさせて翻訳させることによって、Ｎ末端を三角ユニットとする環化前のペプチド部位又はペプチド部位ライブラリーを構築することができる。
　本発明における「システイン」とはＬ－システインを意味し、そのチオール基、アミノ基は保護基を有していないものを意味する。また「システイン類縁体」とは側鎖にチオールを有する、天然アミノ酸以外のアミノ酸であって、そのチオール基、アミノ基には保護基を有していないものを意味する（式（I）のＲ１、Ｒ２、ＳＰ－１が水素原子であるものに対応）。システイン類縁体の立体配置は任意であり、チオール基を有していれば側鎖の構造は特に限定されない。このような側鎖として、具体的には、例えば置換されていてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどが挙げられる。置換基の数は１つに限定されず、２つ以上有していてもよい。
　アンチコドンがＣＡＵでない翻訳開始ｔＲＮＡと当該翻訳開始ｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンの様々な組み合わせを、翻訳開始ｔＲＮＡ及び開始コドンの組み合わせとして利用すると、Ｎ末端に多様性をもたせることが可能である。つまり、アンチコドンの異なる複数種類の翻訳開始ｔＲＮＡに所望のシステインまたはシステイン類縁体をそれぞれアミノアシル化したアミノアシルｔＲＮＡを使用して、当該アミノアシルｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを開始コドンとしたｍＲＮＡ又はｍＲＮＡライブラリーを翻訳させることによって、Ｎ末端残基が一種類に限定されない環化前のペプチド部位又はペプチド部位のライブラリーを作製することができる。具体的には例えば、Mayer C,et al. Anticodon sequence mutants of Escherichia coli initiator tRNA: effects of overproduction of aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA formyltransferase, and initiation factor 2 on activity in initiation.Biochemistry. 2003, 42, 4787-99.（ＣＡＵ以外のアンチコドンを持つ開始ｔＲＮＡの変異大腸菌によるｆ－Ｍｅｔ以外のアミノ酸からの翻訳開始と同コドンを途中に含む蛋白の発現。）に記載の方法を用いて環化前のペプチド部位又はペプチド部位ライブラリーを作製することができる。
　以下に本発明のペプチドまたはペプチド部位おいて環状部を形成させる工程について説明する。交差ユニットの反応点とアミド結合を形成する三角ユニットの反応させたい基（反応点、例えばアミノ基）と、ペプチド部位を構成するアミノ酸残基の反応させたくない塩基性官能基との反応選択性を獲得するために、三角ユニットの反応点をより活性化させる手法が用いられる。このような手法として、具体的には反応点の近傍に反応補助基（例えば、チオール基）を有するアミノ酸をＮ末端に用いる。例えばシステインは、アミノ基のβ位にチオールを有することから、このようなアミノ酸に該当する。Ｎ末端としてシステインを用いる場合、スキームＣに示されるとおり、システインのチオール基とアミノ基は、翻訳導入の過程では、どちらとも保護されているが、環化反応と同時にまたはそれに先立って脱保護反応により遊離のチオール基とアミノ基を生成させる。反応補助基を介した三角ユニットの反応点（例えば、アミノ基）と、交差ユニットの反応点（例えば、活性化されたカルボキシル基）との反応により、望みの位置でのアミド環化されたペプチドを得ることができる。得られた環状ペプチドの三角ユニットに含まれるチオール基は、ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシルエチル）ホスフィン）とＶＡ－０４４（２，２'－アゾビス－２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン二塩酸塩）などの適当な試薬を用いて、ＲＮＡが反応しない温和な反応条件で脱硫することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000055
　環化反応の好ましい反応条件として、ｐＨは、好ましくは６．０以上９．２以下であり、より好ましくは７．０以上８．５以下である。反応温度は通常化学反応が実施できる範囲であれば特に限定されないが、好ましくは４℃～８０℃であり、より好ましくは１０℃～５０℃である。副反応である空気による酸化反応（Ｓ－Ｓ形成反応）を抑制する目的で、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（＝ＴＣＥＰ）のような還元剤を添加することも可能である。ＴＣＥＰを用いる場合、その使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１ｍＭ以上が好ましく、１０ｍＭ以上１００ｍＭ以下であることがより好ましい。
　脱硫反応の好ましい反応条件として、ＲＮＡを安定に存在させること、および加水分解を抑制させることを考慮すると、ｐＨは、３．０以上９．２以下であることが好ましく、５．０以上８．５以下であることがより好ましい。反応温度は通常化学反応が実施できる範囲であれば特に限定されないが、４℃～８０℃であることが好ましく、３０℃～６０℃であることがより好ましい。ＴＣＥＰの使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上２Ｍ以下であることがより好ましく、１００ｍＭ以上５００ｍＭ以下であることがさらに好ましい。またＶＡ－０４４の使用量は特に限定されないが、反応性を高めるために１０ｍＭ以上が好ましく、５０ｍＭ以上２Ｍ以下がより好ましく、１００ｍＭ以上５００ｍＭ以下がさらに好ましい。反応は、PUREsystemなどの反応翻訳液中単独で実施してもよく、これにＤＭＦやＮＭＰなどの有機溶媒を添加してもよい。また、翻訳液をカラム精製などで精製した後に溶媒を変更して実施してもよい。
　三角ユニットとして用いることができる環化前のＮ末端アミノ酸残基は、以下の一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000056
として表すことができる。
　前記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基において、Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり、翻訳合成液中で脱保護され、環化前に水素原子となるものであれば、特に限定されない。このような保護基として、具体的にはＳ－Ｒ２３基、スルホネート（－ＳＯ３ －）、チオスルホネート（－Ｓ２Ｏ３ －）が挙げられる。Ｒ１が、スルホネートやチオスルホネートである場合、対カチオンは特に限定されないが、Ｎａ＋やＫ＋などが挙げられる。Ｒ２３は、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい。Ｒ２３として、具体的には、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ－トリフルオロメチルフェニル、ｐ－フルオロフェニル、ベンジル、フェネチルなどが挙げられる。Ｓ－Ｒ２３基のような保護基は翻訳合成液中でゆっくりと脱保護されるため、積極的に脱保護条件を別途定める必要なく脱保護することができる。これらの保護基の採用によって、脱保護とアミド環化を１工程で実施することができる。脱保護には必要に応じて本明細書記載の様々な反応条件にて脱保護剤を添加することができる。
　Ｒ２、Ｒ３はドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義される。たとえば、Ｒ２、Ｒ３は、好ましくは、それぞれ独立して水素原子であるか、または置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、もしくはシクロアルキルである。あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、またはＲ２もしくはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
　「Ｒ２とＲ３が結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２と、Ｒ２が結合するＮと、Ｒ３と、Ｒ３が結合するＣとを構成原子の一部として４～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000057
　「Ｒ２は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２と、Ｒ２が結合するＮと、Ｒ４と、Ｒ４が結合するＣとを構成原子の一部として５～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000058
　「Ｒ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ３と、Ｒ４と、Ｒ３およびＲ４が結合するＣとを構成原子の一部として３～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000059
　Ｒ２、Ｒ３としてさらに好ましくは、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ及び／またはハロゲンなどで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル、またはＲ２、Ｒ３、Ｒ４から選択された２つの部位で形成されるＣ５－Ｃ６員環である。なお、その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
　Ｒ４は、Ｓ（硫黄）原子とアミノ酸部位を連結するユニットであり、例えばアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、およびヘテロアリーレンアルキレンからなる群より選択され、これらの基は置換されていてもよい。
　Ｒ４の代表的構造であるＮ－３～Ｎ－８を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000060
　Ｓ原子とアミノ酸部位とを、置換されていてもよいメチレン（Ｎ－３）、置換されていてもよいエチレン（Ｎ－４）、置換されていてもよいプロピレン（Ｎ－５）などの、置換されていてもよい１～５の炭素原子で連結させることができる。置換されていてもよいメチレン、エチレン、プロピレンの例としては、たとえば、Ｒ１３がメチルでＲ１４が水素原子である基や、Ｒ１３もＲ１４もメチルのように、ジアルキル化された基などが挙げられる。
　Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８も、Ｒ２又はＲ３と同様に定義され、例えば、水素原子、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルキル、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルコキシから選択されることが好ましい。これらの間で環構造を形成してもよい。より好ましくは、Ｒ１３～Ｒ１８は、水素原子、直鎖状もしくは分岐状のＣ１－Ｃ４アルキル、１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１－Ｃ５アルコキシ、１またはそれ以上のフッ素原子、または１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１－Ｃ５アルコキシで置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲ１３～Ｒ１８から選択された２つの部位とそれらが結合する原子で構成されるＣ３－Ｃ７員環を形成する。特に好ましくは、Ｒ１３～Ｒ１８は、水素原子またはメチルである。
　Ｓ原子とアミノ酸部位とを芳香環の炭素原子と直接連結させることもできる（Ｎ－６）。Ｓ原子とアミノ酸部位とをアラルキル構造で連結させることもできる（Ｎ－７、Ｎ－８）。Ｎ－７では、２つの結合部位のうち、どちらがアミノ酸部位側であっても、Ｓ原子側であってもよい。
　なお、Ｎ－６～Ｎ－８では、芳香環としてベンゼンが用いられているが、ベンゼン以外の芳香環（すなわち、芳香族複素環を含む様々な芳香環）を用いてもよく、また該芳香環はハロゲンやアルコキシやトリフルオロメチルなどの置換基により置換されていてもよい。
　Ｒ１１およびＲ１２もＲ４と同様の部分構造から選択される。例えばＮ－３、Ｎ－４、Ｎ－５、Ｎ－６、Ｎ－７、Ｎ－８型の構造から選択することができ、それぞれＲ１３'からＲ１８'の置換基を有する。また、Ｒ１１およびＲ１２は単結合でもよい。
　式（Ｉ）の好ましい構造式を、Ｎ－９、Ｎ－１０、Ｎ－１１に示す。Ｎ－９では、式（Ｉ）のＲ１２が単結合である。Ｎ－１０では、式（Ｉ）のＲ１２部位が１炭素原子（Ｎ－３型に対応）である。Ｎ－１１では、式（Ｉ）のＲ１２が２炭素原子（Ｎ－４型に対応）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000061
　式中のＲ１～Ｒ４は、それぞれ前記Ｒ１～Ｒ４の定義と同一であり、Ｒ１３'～Ｒ１６'はそれぞれ前記Ｒ１３～Ｒ１６の定義と同様であり、式中のＳＰ－１は、後述のＳＰ－１の定義と同一である。
　式（ＩＩ）の好ましい構造式を、Ｎ－１８、Ｎ－１９、Ｎ－２０に示す。Ｎ－１８では、式（ＩＩ）のＲ１１部位が１炭素原子（Ｎ－３型に対応）である。Ｎ－１９では、式（ＩＩ）のＲ１１が２炭素原子（Ｎ－４型に対応）である。Ｎ－２０では、式（ＩＩ）のＲ１１が３炭素原子（Ｎ－５型に対応）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000062
　式中のＲ１、Ｒ４は、それぞれ前記Ｒ１、Ｒ４の定義と同一であり、Ｒ１３'～Ｒ１８'はそれぞれ前記Ｒ１３～Ｒ１８の定義と同様であり、式中のＳＰ－１は、後述のＳＰ－１の定義と同一である。
　さらに、式（Ｉ）のより好ましい構造式を、Ｎ－１２、Ｎ－１３、Ｎ－１４、Ｎ－１５、Ｎ－１６、Ｎ－１７に示す。Ｎ－１２では、Ｎ－９のＲ４が１炭素原子（Ｎ－３）である。Ｎ－１３では、Ｎ―１０のＲ４が１炭素原子（Ｎ－３）である。Ｎ－１４では、Ｎ－１１のＲ４が１炭素原子（Ｎ－３）である。Ｎ－１５では、Ｎ－９のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。Ｎ－１６では、Ｎ－１０のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。Ｎ－１７では、Ｎ－１１のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000063
　式中のＲ１～Ｒ３、およびＲ１３～Ｒ１６は、それぞれ前記Ｒ１～Ｒ３、およびＲ１３～Ｒ１６の定義と同一であり、式中のＲ１３'～Ｒ１６'は、それぞれ前記Ｒ１３～Ｒ１６の定義と同様であり、式中のＳＰ－１は、後述のＳＰ－１の定義と同一であり、
あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない
　さらに、式（ＩＩ）のより好ましい構造式を、Ｎ－２１～Ｎ－２６に示す。Ｎ－２１では、Ｎ－１８のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。Ｎ－２２では、Ｎ－１９のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。Ｎ－２３では、Ｎ－２０のＲ４が２炭素原子（Ｎ－４）である。Ｎ－２４では、Ｎ－１８のＲ４が３炭素原子（Ｎ－５）である。Ｎ－２５では、Ｎ－１９のＲ４が３炭素原子（Ｎ－５）である。Ｎ－２６では、Ｎ－２０のＲ４が３炭素原子（Ｎ－５）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000064
　式中のＲ１、およびＲ１３～Ｒ１８は、それぞれ前記Ｒ１、およびＲ１３～Ｒ１８の定義と同一であり、式中のＲ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ前記Ｒ１３～Ｒ１８の定義と同様であり、式中のＳＰ－１は、後述のＳＰ－１の定義と同一である。
　環化前のペプチド部位の翻訳合成にｉＳＰ法を利用する本発明においては、環化前の三角ユニット（例えば、一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基）中のアミノ基の保護基"ＳＰ－１"）は、以下の３つ条件の全てを満たすことが好ましい。
（１）翻訳反応条件下でのアミノアシルｔＲＮＡの安定性を向上させること、
（２）翻訳効率を低下させないこと、
（３）脱保護反応時にｍＲＮＡには反応せずに望みの官能基のみが選択的に脱保護されること。
　このような３条件を満たす保護基として、還元的条件で脱保護される保護基が挙げられる。具体的には、例えばトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ＶＡ－０４４（２，２'－アゾビス－２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン二塩酸塩）の存在下で脱保護可能な保護基である。
　ある態様において、ＳＰ－１は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000065
で表すことができる。
　この場合、Ｐ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンなどから選択され、これらの基は、ハロゲンやアルコキシなどの置換基によりさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位に位置するメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、ＳＰ－１の好ましい例として、４－アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ－Ａｃｂｚ）、２－アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ－Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）などが挙げられる。
　別の態様において、ＳＰ－１は、以下の式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000066
で表すことができる。この場合、Ｐ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールなどから選択され、これらの基はさらに置換されていてもよい。また、式中のカルボニル基のβ位および／またはγ位のメチレン基もまた置換されていてもよい。この態様における、ＳＰ－１の好ましい例として、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２－ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、２－（ｔ－ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル基（Ｔｂｅｏｃ）などが挙げられる。
　さらに別の態様において、Ｎ末端のアミノ酸残基が、一般式（Ｉ）で表される場合、ＳＰ－１は、自身が結合した窒素原子およびＲ２と一緒になってアジド（－Ｎ３）を形成することができる。アジドは、アミン等価体として用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000067
　ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、Ａｚｏｃ、Ｐｈｄｅｃ、Ｐｙｄｅｃ、Ｔｂｅｏｃの具体的な構造を以下に示す。これらのうち、好ましくは、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、Ａｚｏｃである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000068
　さらに好ましい、式（Ｉ）の構造式と置換基を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000069
式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり
　Ｒ２３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
　Ｒ２は、ドラッグライクネスに寄与する置換基で置換されていてもよいＣ１－Ｃ６アルキルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
　さらに好ましい、式（ＩＩ）の構造式と置換基を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000070
式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり
　Ｒ２３は、Ｃ１－Ｃ２０アルキル、置換されていてもよいフェニル、または置換されていてもよいベンジルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
　よりさらに好ましい、式（Ｉ）の構造式と置換基を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000071
式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり、
　Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、またはｓｅｃ－ブチルであり、
　Ｒ２は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、またはｎ－ブチルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、またはｏ－Ａｃｂｚである。
　よりさらに好ましい、式（ＩＩ）の構造式と置換基を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000072
式中、
　Ｒ１は、－Ｓ－Ｒ２３であり、
　Ｒ２３は、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、またはｓｅｃ－ブチルであり、
　ＳＰ－１は、ｐ－Ａｃｂｚ、ｏ－Ａｃｂｚ、またはＡｚｏｃである。
　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基を一般式（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000073
で表すことができる。式中、第二の反応点である活性エステル部位（－ＣＯＲ２５）以外の置換基（即ち、Ｒ２"、Ｒ３"、Ｒ２６）は、ドラッグライクなアミノ酸となるような基から選択することができる。本発明では活性エステルとは、三角ユニットのアミノ基部位と反応補助基であるチオールを介して反応することが可能なエステルまたはチオエステルを意味し、そのような性質を有するものであれば特に制限されない。
　具体的には、Ｒ２５は、水酸基であるか、あるいはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成する。このようなＲ２５として、本技術分野において一般に使用されているものを用いることができ、具体的には、ハロゲン、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（－ＯＳｕ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（－ＯＡｔ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（－ＯＢｔ）、ペンタフルオロフェノール（－ＯＰｆｐ）などが挙げられる。また、Ｒ２５が水酸基の場合は、例えば、４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）や１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＷＳＣ）といった縮合剤を用いてアミド化を行うことができる。Ｒ２５はそれが結合するＣＯと共に、メチルチオエステルやアリールチオエステル、アラルキルチオエステルなどのチオエステル（－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ：Ｒとして好ましくは、メチル、エチル、イソプロピル、ｔ－ブチル、ベンジル、ＣＨ２－ベンジル、フェニルが挙げられる）を形成してもよい。これらの活性エステルは、本技術分野において一般に利用されている置換基（たとえば、反応性を高める目的で使用されることが多いハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリルなどの電子吸引基や、反応をより低めて反応選択性を高める目的で使用されることが多いメトキシなどのアルコキシ、メチルなどのアルキルのような電子供与基、ｔ－ブチルやイソプロピルに代表される嵩高い置換基、親水性を考慮した、スルホ基や、ジメチルアミノのようなジ置換アミノ基、親油性を考慮した長鎖アルキルなどの高脂溶性基など）がさらに付与されたものであっても、同様の反応性を示すものであれば利用することができる。
　このような活性エステルを側鎖の一つに有するアミノ酸残基のペプチド部位への導入には、例えば、カルボン酸を含むアミノ酸残基をPUREsystemなどにて翻訳させた後に反応系中で活性エステル化反応により活性化エステルを発生させる手法や、予め活性エステルを有するアミノ酸残基をPUREsystemにて翻訳させる手法などを用いることができる。一般的には、活性エステルの中でも比較的反応性が低いチオエステルなどを有するアミノ酸残基は予め活性エステルとして単離した後に翻訳させるのに適している。一方、より反応性の高い１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＯＡｔ）エステルなどを有するアミノ酸残基は翻訳後に活性化エステルを発生させることが好ましい。
　本発明において、三角ユニットのアミノ酸残基（例えば、一般式（Ｉ）で表される残基）が有するＳ－Ｒ１基は、環化反応時に脱保護され、その結果生じるＳＨ基が反応補助基として作用することから、交差ユニットの活性エステルと三角ユニットのアミノ基とを選択的かつ効率的に反応させて、アミド結合を形成し、環化することができる。すなわち、ＳＨ基が高い求核性を有するために、最初に三角ユニットのＳＨ基と交差ユニットの活性エステルとが素早く反応し、次いで分子内転移反応によって、熱力学的により安定なアミド結合に移行する。その結果、三角ユニットと交差ユニットとを選択的にアミド化することが可能となる（Chemical ligation法）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000074
　式（ＩＩＩ）のＲ２"およびＲ３"は、式（Ｉ）で定義したＲ２およびＲ３と同様に定義される。具体的には、Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよい。あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよく、またはＲ２"もしくはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成してもよい。その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
　「Ｒ２"とＲ３"が結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２"と、Ｒ２"が結合するＮと、Ｒ３"と、Ｒ３"が結合するＣとを構成原子の一部として４～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000075
　「Ｒ２"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ２"と、Ｒ２"が結合するＮと、Ｒ２６と、Ｒ２６が結合するＣとを構成原子の一部として４～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000076
　「Ｒ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成する」場合の例として、Ｒ３"と、Ｒ２６と、Ｒ３"およびＲ２６が結合するＣとを構成原子の一部として３～７員環を形成した、以下の構造が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000077
　Ｒ２"、Ｒ３"としてさらに好ましくは、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、Ｃ１－Ｃ４アルコキシ及び／またはハロゲンなどで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル、またはＲ２"、Ｒ３"、Ｒ２６から選択された２つの部位で形成されるＣ５－Ｃ６員環である。なお、その構造に含まれる立体配置は任意の配置を許容する。
　Ｒ２６は式（Ｉ）のＲ４の定義と同様に定義される。具体的には、Ｒ２６は例えばアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、およびヘテロアリーレンアルキレンからなる群より選択され、これらの基は置換されていてもよい。
　以下にＲ２６の代表的構造を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000078
　第二の反応点（例えば、活性エステル）とアミノ酸部位とを置換されていてもよいメチレン（Ｎ－３'）、置換されていてもよいエチレン（Ｎ－４'）、置換されていてもよいプロピレン（Ｎ－５'）などの、置換されていてもよい１～６の炭素原子で連結させることができる。
　Ｒ１３"、Ｒ１４"、Ｒ１５"、Ｒ１６"、Ｒ１７"、Ｒ１８"は、上述で定義したドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様であるが、例えば、水素原子、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルキル、ハロゲン原子などで置換されてもよいアルコキシから選択される。これらの間で環化構造となっていてもよい。より好ましくは、Ｒ１３"～Ｒ１８"は、水素原子、直鎖状もしくは分岐状のＣ１－Ｃ４アルキル、１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１－Ｃ５アルコキシ、１またはそれ以上のフッ素原子、または１またはそれ以上のフッ素原子で置換されていてもよいＣ１－Ｃ５アルコキシで置換されていてもよいＣ１－Ｃ４アルキルであるか、またはＲ１３"～Ｒ１８" から選択された２つの部位とそれらが結合する原子で構成されるＣ３－Ｃ７員環を形成する。特に好ましくは、Ｒ１３"～Ｒ１８"は、水素原子またはメチルである。
　Ｒ２６は、より好ましくは、１炭素原子のメチレン（Ｎ－３'）、４炭素原子、５炭素原子、または６炭素原子である。さらに好ましくは、Ｒ２６は、１炭素原子（Ｎ－３'）である。
　また第二の反応点（例えば、活性エステル部位）とアミノ酸部位とを芳香環の炭素原子から直接連結させることもできる（Ｎ－６'）。また活性エステル部位とアミノ酸部位とをアラルキル構造で連結させることもできる（Ｎ－７'、Ｎ－８'）。
　なお、Ｎ－６'～Ｎ－８'では、連結位置をオルトに限定したが、オルトに限定されずメタ、パラなども可能である。またＮ－６'～Ｎ－８'では、芳香環としてベンゼンが用いられているが、ベンゼン以外の芳香環（すなわち、芳香族複素環を含む様々な芳香環）を用いてもよく、また該芳香環はハロゲンやアルコキシなどの置換基により置換されていてもよい。
　式（ＩＩＩ）の中で、好ましい構造を式（ＩＩＩ－２）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000079
　Ｒ２７は水素原子、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいアルケニル、置換されてもよいアルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアルキルで置換されていてもよいアラルキルの中から選択される。
　Ｒ２７として列記された基が有し得る置換基は、その置換基を有する式（ＩＩＩ－２）が翻訳合成され得るものであれば、特に限定されない。このような置換基としては、反応性を高める目的で使用されることが多いハロゲン、ニトロ、トリフルオロメチル、ニトリルなどの電子吸引基や、反応をより低めて反応選択性を高める目的で使用されることが多いメトキシなどのアルコキシ、メチルなどのアルキルのような電子供与基、ｔ－ブチルやイソプロピルに代表される、嵩高い置換基、親水性を考慮した、スルホ基や、ジメチルアミノのようなジ置換アミノ基、親油性を考慮した長鎖アルキルなどの高脂溶性基などが挙げられる。このような置換基として、好ましくは、置換されてもよいアルキル、置換されてもよいシクロアルキル、置換されてもよいアラルキルが挙げられ、さらに好ましくは、アルキルおよび／またはアリールが置換されていてもよいアラルキルが挙げられる。
　式（ＩＩＩ－２）のＲ３"はドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えば、水素原子、Ｃ１－Ｃ４アルキル、ハロゲンなどで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキルが好ましく、水素原子が特に好ましい。なお、Ｒ３"の立体配置はＲ３"が水素原子と仮定した場合のＬ型、Ｄ型アミノ酸に対応するものの両方が許容されるが、Ｌ型アミノ酸に対応するものが好ましい。
　式（ＩＩＩ）の中で、さらに好ましい構造を式（ＩＩＩ－３）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000080
　Ｒ２８およびＲ２９はそれぞれ、ドラッグライクなアミノ酸の側鎖の定義と同様に定義されるが、例えば水素原子、置換されてもよいＣ１－Ｃ６アルキル、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルケニル、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルキニル、置換されてもよいアリール、置換されてもよいヘテロアリール、置換されてもよいＣ１－Ｃ６アルキルで置換されていてもよいアラルキル、置換されてもよいシクロアルキルの中から選択される。
　Ｒ２８およびＲ２９として好ましくは、モノメチル（Ｒ２８＝Ｍｅ、Ｒ２９＝Ｈ）やジメチル（Ｒ２８＝Ｒ２９＝Ｍｅ）、モノトリフルオロメチル（Ｒ２８＝ＣＦ３、Ｒ２９＝Ｈ）などが挙げられる。
　Ｒ３"は水素原子、ハロゲンなどで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキルなどから選択されるが、特に水素原子が好ましい。なお、Ｒ３"基の立体配置はＲ３"が水素原子と仮定した場合のＬ型、Ｄ型アミノ酸に対応するもの両方が許容されるが、Ｌ型アミノ酸に対応するものが好ましい。
　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基として、ＩＩＩ、ＩＩＩ－２、ＩＩＩ－３に加えて、ＩＩＩ－ＯＨ、ＩＩＩ－２－ＯＨ、ＩＩＩ－３－ＯＨを利用することもできる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000081
（式ＩＩＩ－ＯＨ中の、Ｒ３"、Ｒ２５、Ｒ２６、式ＩＩＩ－２－ＯＨ中のＲ３"、Ｒ２６、Ｒ２７、式ＩＩＩ－３－ＯＨ中のＲ３"、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９は、それぞれ式ＩＩＩ中の、Ｒ３"、Ｒ２５、Ｒ２６、式ＩＩＩ－２中のＲ３"、Ｒ２６、Ｒ２７、式ＩＩＩ－３中のＲ３"、Ｒ２７、Ｒ２８、Ｒ２９と同意義である。）
　本発明において、環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体の製造方法には、三角ユニットとして、Ｎ－１２、Ｎ－１５のアミノ酸残基を用い、交差ユニットとして、式（ＩＩＩ－３）のアミノ酸残基を用いることが好ましい。また、副反応を避けるべく、交差ユニットの隣のアミノ酸残基には、Ｎ－アルキル化されたアミノ酸（例えばプロリンや、Ｎ－メチルアラニンなど）を用いることが好ましい。
　所望の活性を有するドラッグライクなペプチドと核酸の複合体を製造する方法としては、例えば以下の工程を含む製造方法を挙げることができる（特許文献１）：
(i)アミノ酸の総数が９～１３残基である非環状ペプチド部位を翻訳合成して、当該非環状ペプチド部位とそれをコードする核酸配列がリンカーを介して結合している複合体からなる非環状ペプチド部位－核酸複合体を形成する工程
(ii)工程(i)で翻訳合成された複合体の非環状ペプチド部位をアミド結合によって環化し、環状部のアミノ酸残基数の合計が５～１２となる環状化合物を形成する工程
(iii)工程(ii)で得られた環状部を有するペプチド部位-核酸複合体ライブラリーと生体内分子とを接触させ、当該生体内分子に対して結合活性を有する複合体を選択する工程。
　ペプチドまたはペプチド部位－核酸複合体の合成工程において用いられるアミノアシルｔＲＮＡは、具体的には、以下のような方法を用いて作製することができる。
　所望のｔＲＮＡ配列をコードし、上流にＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターを配置した鋳型ＤＮＡを用意し、T7 RNA polymeraseやT3, SP6 RNA polymeraseなどプロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを利用して転写によってＲＮＡを合成することが出来る。細胞からｔＲＮＡを抽出精製し、ｔＲＮＡの配列の相補配列のプローブを用いて目的の生成ｔＲＮＡを抽出することも出来る。この際目的のｔＲＮＡの発現ベクターで形質転換した細胞をソースにすることも出来る。化学合成によって目的の配列のＲＮＡを合成することも出来る。例えば、このようにして得られた３'末端のＣＣＡ配列からＣＡを除いたｔＲＮＡと別途調製したアミノアシル化したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡとをＲＮＡリガーゼで結合させることでアミノアシルｔＲＮＡを得ることが出来る（ｐｄＣｐＡ法、ｐＣｐＡ法）。例えば、式（Ｉ）で表されるアミノ酸のためのｔＲＮＡは、式（Ｉ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡを使用して製造することができる。当該ｔＲＮＡは、本発明のペプチド、ペプチド部位とｍＲＮＡの結合体、ペプチド部位とｍＲＮＡの結合体のライブラリーの製造において有用である。したがって本発明は、式（Ｉ）で表されるアミノ酸と結合したｐｄＣｐＡまたはｐＣｐＡに関する。また本発明は、式（Ｉ）で表されるアミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡに関する。
　あるいは、全長ｔＲＮＡを用意し、種々のアミノ酸類縁体の活性エステルをｔＲＮＡに担持させるリボザイムであるフレキシザイムによるアミノアシル化も可能である。この他にも後述の方法を用いることによってアシル化ｔＲＮＡを得ることが出来る。
　また本発明において翻訳合成は、例えば、大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類（メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ、 EF-G、RF1、RF2、RF3、RRF、IF1、IF2、IF3、EF-Tu、EF-Ts、ARS（AlaRS、ArgRS、AsnRS、AspRS、CysRS、GlnRS、GluRS、GlyRS、HisRS、IleRS、LeuRS、LysRS、MetRS、PheRS、ProRS、SerRS、ThrRS、TrpRS、TyrRS、ValRSから必要なものを選ぶ））、リボソーム、アミノ酸、クレアチンキナーゼ、ミオキナーゼ、無機ピロフォスファターゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼ、E. coli 由来tRNA、クレアチンリン酸、グルタミン酸カリウム、HEPES-KOH pH7.6、酢酸マグネシウム、スペルミジン、ジチオスレイトール、GTP、ATP、CTP、UTPなどを混合したPUREsystem等の公知の無細胞翻訳系にmRNAを加えることによって行うことが出来る。また、T7 RNA polymeraseを加えておけば、T7プロモーターを含む鋳型DNAからの転写、翻訳を共役して行なうこともできる。このとき所望のアシル化tRNA群やARSが許容するアミノ酸類縁体群（例えばF-Tyr）を系に添加することによってアミノ酸類縁体群を含むペプチドを翻訳合成することが出来る（Kawakami T, et al. Ribosomal synthesis of polypeptoids and peptoid-peptide hybrids. J Am Chem Soc. 2008, 130, 16861-3., Kawakami T, et al. Diverse backbone-cyclized peptides via codon reprogramming. Nat Chem Biol. 2009, 5, 888-90.）。あるいは、リボソームやEF-Tuなどの変異体を利用することによってアミノ酸類縁体の翻訳導入の効率を高めることも出来る(Dedkova LM, et al. Construction of modified ribosomes for incorporation of D-amino acids into proteins. Biochemistry. 2006, 45, 15541-51., Doi Y,et al. Elongation factor Tu mutants expand amino acid tolerance of protein biosynthesis system. J Am Chem Soc. 2007, 129, 14458-62., Park HS,et al. Expanding the genetic code of Escherichia coli with phosphoserine. Science. 2011, 333, 1151-4.)。
　無細胞翻訳系は、細胞より抽出したリボソームの他、翻訳に関与する蛋白因子群、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰなどのエネルギー源、その再生系を組み合わせたものでｍＲＮＡを蛋白に翻訳することが出来るものであれば限定されない。本発明の無細胞翻訳系には、これら以外にも、開始因子、伸長因子、解離因子、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などを含むことができる。これらの因子は、種々の細胞の抽出液から精製することによって得ることができる。因子を精製するための細胞は、例えば原核細胞、または真核細胞を挙げることができる。原核細胞としては、大腸菌細胞、高度好熱菌細胞、または枯草菌細胞を挙げることができる。真核細胞としては、酵母細胞、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞を材料にしたものが知られている。
　一方、PURE systemは大腸菌の翻訳に必要な蛋白因子類、エネルギー再生系酵素、リボソームのそれぞれを抽出、精製し、ｔＲＮＡ、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰなどと混合した再構成無細胞翻訳系である。不純物の含有量が少ないだけでなく、再構成系であるため排除したい蛋白因子、アミノ酸を含まない系を容易に作製することができる。（(i)Nat Biotechnol. 2001;19:751-5. Cell-free translation reconstituted with purified components. Shimizu Y, Inoue A, Tomari Y, Suzuki T, Yokogawa T, Nishikawa K, Ueda T.(ii)Methods Mol Biol. 2010;607:11-21.PURE technology.Shimizu Y, Ueda T.）。
　ｍＲＮＡディスプレイライブラリーは、例えば以下のように作製することができる。まずＴ７プロモーターなどのプロモーターの下流に所望の配列を配置したＤＮＡのライブラリーを化学合成し、これを鋳型にプライマー伸長反応にて二本鎖ＤＮＡにする。これを鋳型にT7 RNApolymeraseなどのRNAポリメラーゼを用いてｍＲＮＡに転写する。このＲＮＡの３'末端にアミノアシルｔＲＮＡのアナログである抗生物質ピューロマイシンなどがつながったリンカー（スペーサー）を結合させる。これを上記のPUREsystemなど公知の無細胞翻訳系に加え、保温することによってｍＲＮＡが翻訳され、ｍＲＮＡとこれにコードされるペプチドがピューロマイシンなどを含むリンカーを介して連結される。このようにしてｍＲＮＡとその産物が対応付けられたｍＲＮＡとその産物の複合体からなるディスプレイライブラリーを構築することが出来る。リンカーはさらに、当業者に周知のスペーサーを含むことができる。
　さらに、所望の固定した標的に当該ライブラリーを接触させ、標的に結合しない分子を洗い流すことで標的に結合する分子を濃縮することが出来る（パニング）。このように選択された分子についている遺伝子情報を含むタグであるｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲ増幅し、塩基配列を解析することで、結合したペプチドの配列を明らかにすることが出来る。
　本発明では、環化ペプチド部位と核酸の複合体のディスプレイライブラリーの構築、さらには構築されたディスプレイライブラリーから、標的に結合する環化ペプチド部位もしくは環化分枝ペプチドの取得は、具体的には、例えば以下の様態に示す方法によって行なうことができる。
　より具体的には、本発明の環状部を有するペプチドと核酸複合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法は、以下の１又は複数の工程を含む。
A)　式（Ｉ）をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)　3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)　工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、式（Ｉ）の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)　式（ＩＩＩ）をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)　3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)　工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)　工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H)　プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとして有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)　工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)　工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)　工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)　環状部を形成し、その後脱硫させる工程
　本発明においては、工程J)の後、mRNAライブラリーの3'領域にアニールするプライマーにてcDNAを合成する工程を含むことができる。さらに本発明の方法は、以下の工程を含むことができる。
M)　パニングにて、標的物質に結合したmRNAライブラリーを濃縮する工程
N)　逆転写酵素にてcDNAを合成する工程
O)　塩基配列を解析する工程
　このような本発明の環状部を有するペプチド－ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として、以下の１又は複数の工程を含む方法が好ましい。
A)　N-9をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)　3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)　工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、N-9の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)　式（ＩＩＩ）－２または式（ＩＩＩ）－２―ＯＨをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)　3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)　工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）－２または式（ＩＩＩ）－２―ＯＨのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)　工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ－メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)　工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)　工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)　工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)　環状部を形成し、その後脱硫させる工程
　このような本発明の環状部を有するペプチド－ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として、以下の１又は複数の工程を含む方法がより好ましい。
A)　Ｎ－１２またはＮ－１５をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)　3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)　工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、Ｎ－１２またはＮ－１５の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)　式（ＩＩＩ）－３または（ＩＩＩ）－３－ＯＨをアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)　3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)　工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）－３または（ＩＩＩ）－３－ＯＨのアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)　工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ－メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)　工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)　工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)　工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)　環状部を形成し、その後脱硫させる工程
　このような本発明の環状部を有するペプチド－ｍＲＮＡ結合体およびそのアミド環化ペプチドライブラリーの製造方法として以下の１又は複数の工程を含む方法がさらにより好ましい。
A)　Ｎ－１２－１、Ｎ－１２－２、Ｎ－１３－１またはＮ－１４－１をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
B)　3'末端のCAを欠損する開始tRNAを提供する工程
C)　工程A)のpdCpA又はpCpAと工程B)の開始tRNAを連結させ、Ｎ－１２－１、Ｎ－１２－２、Ｎ－１３－１またはＮ－１４－１の開始アミノアシルtRNAを提供する工程、
D)　式（ＩＩＩ）－３をアミノアシル化したpdCpA又はpCpAを提供する工程
E)　3'末端のCAを欠損するtRNAを提供する工程
F)　工程 D)のpdCpA又はpCpAと工程E)のtRNAを連結させ、式（ＩＩＩ）－３のアミノアシルtRNAを提供する工程、
G)　工程C)の開始アミノアシルtRNAと工程F)のアミノアシルtRNAを含み、メチオニン、メチオニルtRNA合成酵素(MetRS)、メチオニン用翻訳開始tRNA、フォルミルドナー、メチオニルtRNAトランスフェラーゼのいずれかを含まない無細胞翻訳系を提供する工程、
H）プロモーターの下流に、工程C)の開始アミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドンを１番目のコドンとしてATGを有し、さらにその下流に工程F)のアミノアシルtRNAのアンチコドンに対応するコドン、その３'側にプロリンもしくは他のARSの基質となるＮ－メチルアミノ酸のコドンを含むペプチド配列をコードする鋳型DNAライブラリーを提供する工程
I)　工程H)の鋳型DNAライブラリーからmRNAライブラリーを提供する工程
J)　工程I)のmRNAライブラリーの3'末端にリンカーを結合させる工程
K)　工程G)の無細胞翻訳系に工程J)のリンカーを結合したmRNAライブラリーを加え、翻訳することで、環化前（非環状）ペプチド部位-mRNA複合体ディスプレイライブラリーを提供する工程
L)　環状部を形成し、その後脱硫させる工程
アスパルチミド形成抑制法
　アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する場合、Ｃ末端側アミノ酸残基直後のアミド結合とチオエステルが反応してアスパルチミドを形成する。そこで、アスパラギン酸型のチオエステルを翻訳にて導入する際に直後のアミノ酸残基をＮ－アルキル基を有するアミノ酸（例えばプロリン）にすることによって望みのチオエステルを含む全長ペプチドを翻訳合成することができる。
　また本発明は、以下の一般式（ＩＡ）および一般式（ＩＩＡ）で表される化合物に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000082
　また本発明は、以下の一般式（ＩＢ）および一般式（ＩＩＢ）で表される化合物に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000083
　上記一般式（ＩＡ）および（ＩＢ）中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、一般式（Ｉ）のＲ１～Ｒ４、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義であり、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す。Ｒ３０として特に好ましくはＯＨである。
　また、上記一般式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）中、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ１１、およびＳＰ－１は、一般式（ＩＩ）のＲ１、Ｒ４、Ｒ１１、およびＳＰ－１と同意義であり、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す。Ｒ３０として特に好ましくはＯＨである。
　さらに本発明は、上記一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体に関する。
　上記一般式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、および（ＩＩＢ）で表される化合物、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体は、システインまたはシステイン類縁体がＮ末端に配置されたアミノ酸類縁体を複数含むペプチドの効率的な翻訳において有用である。また、複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチドと核酸の複合体およびそれを含むライブラリーの製造方法において有用である。
　上記一般式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、および（ＩＩＢ）で表される化合物、一般式（ＩＡ）または一般式（ＩＩＡ）とアミノアシルｔＲＮＡの結合体は、当業者に周知の方法によって取得することができる。
　さらに本発明は、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドと核酸との複合体に関する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000084
　当該複合体は、第一の反応点を有する上記一般式（Ｉ）または一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって取得することができる。なお、上記式（Ｉ）中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、本明細書に記載の定義に従う。
　当該複合体を構成する非環状ペプチドをコードする核酸を用いれば、２以上のアミノ酸類縁体を含み、かつ環状部を有するペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを効率的に製造することができる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＤＣＭ　　　　　ジクロロメタン
ＤＩＰＥＡ　　　Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ　　　　　ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ　　　　ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ　　　　　ジチオスレイロール
ＦＡ　　　　　　ギ酸
ＴＦＡ　　　　　トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ　　　　　テトラヒドロフラン
ＴＣＥＰ　　　　トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン
ＮＭＰ　　　　　N-メチル‐２‐ピロリドン
ＤＢＵ　　　　　１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
Ａｃｂｚ　　　　４－アジドベンジルオキシカルボニル基
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000085
ｏ－Ａｃｂｚ　　２－アジドベンジルオキシカルボニル基
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000086
Ｐｅｎ　　　　　４－ペンテノイル基
ＣＨ２ＣＮ　　　 シアノメチル基
　また、ＬＣＭＳの分析条件は、下記のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000087
実施例１　無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
１－１．Initiation suppression法によりＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳導入するためのｐＣｐＡ－アミノ酸の合成
　Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドをInitiation suppression法により翻訳合成するために、システインまたはシステイン類縁体のアミノアシル化ｐＣｐＡを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ－０５、０９、１４、１９、２２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000088
(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000089
　窒素雰囲気下、Ｓ－ｔｅｒｔ－ブチルメルカプト－Ｌ－システイン（化合物ｎｋ０１、Ｈ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ））（１２６ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）と文献記載（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｍ．　２００８，　１９，　７１４．）の方法で合成した炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（２０７ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．６ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（２５１μＬ、１．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｒ）－２－（（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（２２０．１ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３８３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000090
　窒素雰囲気下、（Ｒ）－２－（（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０２、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１．１５ｇ、３．００ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．５７６ｍＬ、３．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（６．０ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．６２７ｍＬ、９．００ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．２１ｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４２２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０４)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000091
　緩衝液Ａ（６０ｍｌ）に、文献記載（Helv. Chim. Acta, 90, 297-310）の方法で合成したリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（１２０．４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ０３、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（２１２ｍｇ、０．５００ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（２．５ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．８３ｍＬ、合計３回投与)，、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０４）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（５６６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０８７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　なお、緩衝液Ａは以下のように調整した。
　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物（６，４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ　Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ０５、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000092
　前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０４)とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（２７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０５、Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）（１７．８ｍｇ、２１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０１９　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸(化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000093
　窒素雰囲気下、Ｓ－ｔｅｒｔ－ブチルメルカプト－Ｄ－システイン（Ｈ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（４００ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ）と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（６６１ｍｇ、２．１０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（１．９１ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（７９９μＬ、５．７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（６５８．２ｍｇ、９０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３８３　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000094
　窒素雰囲気下、（Ｓ）－２－（（（（４－アジドベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジスルファニル）プロパン酸（化合物ｎｋ０６、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（０．６５８ｇ、１．７１ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３２９ｍＬ、１．８８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．４２ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．３５８ｍＬ、５．１３ｍｍｏｌ）を加えて室温で５時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７１５ｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４２２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０８)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000095
　緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ０７、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１０６ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で７０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０８）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０８７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ０９、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000096
　前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ０８)とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（２４２．５ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ０９、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）（２４．７ｍｇ、２９％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０１９　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000097
　（Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（３．００ｇ、６．７３ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１３．４ｍｌ）溶液に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（１．１２ｍｌ、７．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１．４６ｇ、９７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２２４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000098
　窒素雰囲気下、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（７００ｍｇ、３．１３ｍｍｏｌ）と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（１．０３４ｇ、３．２９ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（３．１３ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（１．３１ｍＬ、９．４０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で４日間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１．１５ｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000099
　窒素雰囲気下、(R)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１１、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１．１４ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４９ｍＬ、２．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５．７２ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．５９８ｍＬ、８．５８ｍｍｏｌ）を加えて室温で７時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィ（酢酸エチル：ヘキサン＝１：９→１：１）で精製し、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ、９３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１３)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000100
　緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１２、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１０９ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．２６ｍｌ）溶液を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１３）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（９０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１０１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ１４、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000101
　前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ１３)とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（９０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で１５０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１４、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）（２６．７ｍｇ、３１％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(S)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000102
　（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－３－（ｔｅｒｔ－ブチルジスルファニル）プロパン酸（Ｆｍｏｃ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（０．５ｇ、１．１２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（２．２４ｍｌ）溶液に１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（ＤＢＵ）（０．１８６ｍｌ、１．２３４ｍｍｏｌ）を加え、室温で９０分攪拌した。反応溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(Ｓ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（０．２２ｇ、８８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２２４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(S)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000103
　窒素雰囲気下、(Ｓ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１５、Ｈ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（２００ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（２９５ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．９０ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（３７４μＬ、２．６９ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で２時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(Ｓ)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（３５０ｍｇ、９８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000104
　窒素雰囲気下、(Ｓ)-2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ１６、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（３５０ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１５ｍＬ、０．８６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．７５ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．１８ｍＬ、２．６３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１７ｇ）を得た。得られた粗生成物2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）をアセトニトリル（４．４ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１８)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000105
　緩衝液Ａ（５６．４ｍＬ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（８５．０ｍｇ、０．１１８ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ１７、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．７７ｍｌ、０．３５３ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．５９ｍＬ、合計３回投与)、室温で１２０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１８）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（１０５．２ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１１０１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（ｎｋ１９、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000106
　前工程にて得られた2-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ１８)とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（１００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（５ｍＬ）を加えて室温で８０分撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ１９、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）（３９．８ｍｇ、４３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸(化合物ｎｋ２０、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000107
　窒素雰囲気下、(R)-3-(tert-ブチルジスルファニル)-2-(メチルアミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ１０、Ｈ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１１２ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）と炭酸（４－ニトロフェニル）２－アジドベンジル（１６５ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．５ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（０．２１ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で４時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ２０、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１９７ｍｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000108
　窒素雰囲気下、(R)-2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸（化合物ｎｋ２０、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（１９６ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０８４ｍＬ、０．４８ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（９８４μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．１０３ｍＬ、１．４８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）をアセトニトリル（２．４６ｍｌ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (2R)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２２、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000109
　緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６０．２ｍｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-((((2-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(tert-ブチルジスルファニル)プロパン酸 (R)-シアノメチル（化合物ｎｋ２１、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＣＨ２ＣＮ）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．２５ｍｌ、０．２５ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から５分後、３０分後にそれぞれ０．４２ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２２、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｐＣｐＡ）（２６．３ｍｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
１－２．翻訳伸長用のｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＨ)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000110
　(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)(メチル)アミノ)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸（Ｆｍｏｃ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＨ）（４．２０ｇ、１０．２８ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（１００ｍＬ）を加え室温で２時間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、濃縮残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過し、ジエチルエーテルでろ紙上の固体を洗浄し、粗生成物(2S)-2-(メチルアミノ)-3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸を得た。
　得られた(2S)-2-(メチルアミノ)-3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸を１，４－ジオキサン （４０ ｍｌ）／水（４０ｍｌ）に溶解させた後に、ペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル（３．２００　ｇ，　１６．２３　ｍｍｏｌ）と、炭酸水素ナトリウム（１．８０ｇ、２１．４３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を３０度で１２時間撹拌した。反応が完結した後、反応液に水を加えて酢酸エチルで洗浄し、水層の液性がｐＨ２になるまで１Ｍ硫酸水素ナトリウム水溶液を加えた。得られた混合物を酢酸エチルで抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸(化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＨ)（０．６０ｇ、２２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２６９　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．３２分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ１）
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル（化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000111
　窒素雰囲気下、(2S)-2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)- 3-(1,3-チアゾール-4-イル)プロパン酸（化合物ｎｋ２３、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＨ）（１．５０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（６８０ｍｇ、５．２６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（８０ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１．２５ｇ、１０．４２ｍｍｏｌ）を加えて室温で終夜攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＣＨ２ＣＮ)（０．２３ｇ、２７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３０８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．６１分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ１）
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２５)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000112
　緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）を溶解させ、2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (S)-シアノメチル(化合物ｎｋ２４、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ＯＣＨ２ＣＮ)（３１１ｍｇ、１．０１３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で４時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２５）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（３００ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９７１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５９分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ２６、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000113
　前工程にて得られた2-(N-メチルペンタ-4-エンアミド)-3-(チアゾール-4-イル)プロパン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ２５)とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物を（３００ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（６ｍＬ）を加えて室温で７時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２６、Ｐｅｎ－ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ｐＣｐＡ）（４６ｍｇ、１７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９０３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000114
　Ｎ－メチルグリシン（１．５ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）とＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（７．３５ｍｌ、４２．１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン （３３．７ ｍｌ）に加えた。その後混合物を０℃に冷却した後に、ペンタ-4-エン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イル (１．９５ｍｌ、 １７．７ｍｍｏｌ)を加え、反応液を２５度で３日間撹拌した。反応が完結した後、反応混合物にＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（２．９４ｍｌ、１６．８ｍｍｏｌ）と２－ブロモアセトニトリル（２．３５ｍｌ、３３．７ｍｍｏｌ）を加えて２５度で４時間攪拌した。反応液にジクロロメタンで希釈したのちに、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、有機層を飽和食塩水で洗浄した。その後、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し、２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．１ｇ、３１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２１１　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７２分（分析条件ＳＭＤｍｅｔｈｏｄ３）
(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-メチル-N-(ペンタ-4-エノイル)グリシナート（化合物ｎｋ２８、Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000115
　緩衝液Ａ（１００ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（２５０ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を溶解させ、２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）酢酸シアノメチル（化合物ｎｋ２７、Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２９０ｍｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（１．５ｍｌ）を加え、室温で４時間撹拌した。さらに８０％酢酸水溶液（１５ｍｌ）を反応液に加えて、室温で４時間撹拌した。
　反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ２８、Ｐｅｎ－ＭｅＧｌｙ－ｐＣｐＡ）（３７．６ｍｇ、１３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８０６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６０分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ２）
１－３．交差ユニット用のｐＣｐＡ-アミノ酸の合成
4-(メチルチオ)-4-オキソ-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸 (2S)-(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ３０、Ｐｅｎ－ＡｓｐＳＭｅ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000116
　緩衝液Ａ（２００ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、文献記載（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）の方法で合成した4-(メチルチオ)-4-オキソ-2-(ペンタ-4-エンアミド)ブタン酸 (S)-シアノメチル（６３０ｍｇ、２．２２ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液（４．０ｍｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。さらにトリフルオロ酢酸（４．６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）を反応液に加えて、反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３０、Ｐｅｎ－ＡｓｐＳＭｅ－ｐＣｐＡ）（２０ｍｇ、４．２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８８０.４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例２　システインまたはシステイン類縁体を有する翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡの合成
２－１．転写によるｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）の合成
　鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ－１）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro の転写により３'端のCAを欠くtRNAfMetCAU(-CA)（配列番号Ｒ－１）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
配列番号Ｄ－1（配列番号：１）:
tRNAfMetCAT(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGGCGGGGTGGAGCAGCCTGGTAGCTCGTCGGGCTCATAACCCGAAGATCGTCGGTTCAAATCCGGCCCCCGCAAC
配列番号Ｒ－１（配列番号：２）:
tRNAfMetCAU(-CA)　RNA配列：
GGCGGGGUGGAGCAGCCUGGUAGCUCGUCGGGCUCAUAACCCGAAGAUCGUCGGUUCAAAUCCGGCCCCCGCAAC
２－２．　システインまたはシステイン類縁体アミノアシル化ｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ合成
　５０μＭ　転写tRNAfMetCAU(-CA)　（配列番号Ｒ－１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ－０５、０９、１４、１９、２２）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１、２、３、４、５）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１、２、３、４、５）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１
Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000117
化合物ＡＡｔＲ－２
Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000118
化合物ＡＡｔＲ－３
Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000119
化合物ＡＡｔＲ－４
Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000120
化合物ＡＡｔＲ－５
o-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000121
実施例３　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基のついたシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
　以下の実験で示すとおり、アミノ基にＡｃｂｚ基、チオール基にＳｔＢｕをそれぞれ保護されたシステインまたはシステイン類縁体をＮ末端に翻訳導入することが可能であることが示された。すなわち、L-システインのみならず、D-システインや、LまたはD-Nメチルシステインを含むシステイン類縁体を、N末端に翻訳導入することが可能であることが示された。ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１において、アミノ基の保護基であるＡｃｂｚ基はＲＮＡが安定に存在できる反応条件下にて選択的に脱保護できることが示されており、アミド環化を有するペプチドライブラリーを効率的に合成するために必要な条件が満たされた。
３－１．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
　Initiation suppression法を用いてN末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されているかを確かめるために、システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙの各アミノ酸をそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらに２０μＭ　翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
＜質量分析による検出＞
　無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、２０μＭ　翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）。
　ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１において、Ａｃｂｚ保護基はＭＡＬＤＩ測定中または測定前処理の操作中において外れてしまうことが報告されている。そのため、Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、をそれぞれ用いた翻訳実験では、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）による還元的条件によって脱保護を行った後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳによる質量分析を実施した。具体的には、得られた翻訳反応物に、ｐＨ　７．０トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）溶液（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで翻訳産物を分析した。
　その結果Ｎ末端にシステインまたはシステイン類縁体が導入されたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－３，４，５）を示すＭＳがそれぞれ観測された。また副生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－２）を示すＭＳが観測された。
　また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものをそれぞれ調製し、３７℃で１時間静置した。翻訳反応物を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにおけるマトリックスはα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いた。翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを用いた場合は、Ｎ末端がホルミルメチオニン（以下ホルミルメチオニンをｆＭｅｔと略称する）から開始されたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１）を示すＭＳが観測された。また翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものでは，ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ（特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１））により、1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－２）を示すＭＳが観測された。
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号Ｒ－４（配列番号：４）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUUAAGCUUCG
ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGly
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000122
＜電気泳動による検出＞
　N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４Ｄ）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、２０μＭ　システインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-1）、Acbz-D-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-２）、Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものをそれぞれ調製し、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
　Ｎ末端にＡｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ－Ｄ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）それぞれ翻訳導入した場合においても目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１０、１１、１２、１５）のバンドが主生成物としてそれぞれ観測された（図1において、対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）。また不純物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）を示すバンドが観測された。
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号Ｒ－４Ｄ（配列番号：５）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGACUCGUACUAAGGCUUACUGGAGUCUUCCGGGUGACGACGACUAAGCUUCG
ペプチド配列
[Xaa]ThrArgThrLysAlaTyrTrpSerLeuProGlyAspAspAsp
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000123
３－２．　副生成物の生成を低減させた翻訳合成条件下における、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にＮ－メチルシステインを有するペプチドの翻訳合成
　上記の通り、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法によるＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を翻訳合成する際に、２番目コドンにコードされるアミノ酸から開始して全長にわたって翻訳されたペプチドが副生成物として確認された。次に副生成物の生成を低減させて目的とするペプチドの翻訳効率を向上させるために、翻訳条件の最適化を行った。具体的には翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの濃度条件（１，２，５，１０，２５μＭ）の検討を行い、目的とするペプチドと副生成物の生成比が最も良い翻訳条件を設定するに至った。
　Initiation suppression法を用いてN末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されているかを確かめるために、保護基を有するＮ－メチルシステインがアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙをそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらにＮ－メチルシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
＜質量分析による検出＞
　無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、さらに２または２５μＭＮ－メチルシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）、o-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-５））を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより翻訳産物を分析した。
　その結果Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）をそれぞれ２５μＭ使用した場合、主生成物としてＮ末端にＮＭｅシステインまたはＮＭｅ－Ｄ－システインが導入されたペプチド（表４　ペプチド配列番号Ｐｅｐ－５、６）を示すＭＳがそれぞれ観測された（図２－１，２－２）。またAcbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-３）、Acbz-D-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-４）をそれぞれ２μＭ使用した場合、主生成物として1文字目が読み飛ばされたペプチド（表２、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－２）を示すＭＳが観測された（図２－１，２－２）。Ｎ末端にＮＭｅシステインまたはＮＭｅ－Ｄ－システインが導入されたペプチド（表４　ペプチド配列番号Ｐｅｐ－５、６）を示すＭＳは観測されたものの、そのＭＳ強度比は1文字目が読み飛ばされたペプチド（表1、ペプチド配列番号Ｐｅｐ－２）の1/10以下であった。
　またo-Acbz-MeCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-５））を２５μＭ用いた場合、主生成物としてＮ末端にＮＭｅシステインが導入されたペプチド（表４　ペプチド配列番号Ｐｅｐ－５）を示すＭＳが観測された（図２－３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000124
＜電気泳動による検出＞
　N末端にシステインまたはシステイン類縁体が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４Ｄ）と各アミノ酸、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにシステインまたはシステイン類縁体がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（１，２，５，１０，２５μＭの５条件を実施）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものを調製し、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
　Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）、Ａｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）それぞれの翻訳合成において、どちらの場合においてもアミノアシルｔＲＮＡの濃度が２５μＭのときに目的とするペプチドの翻訳効率が最も高く、さらに副生成物の翻訳効率が最も低いことが示された（図３－１）。具体的にはＡｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１２）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は９６：３３（対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）であった。またＡｃｂｚ－Ｄ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１３）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は５６：２２であった。さらに、ｏ－Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１４）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は１０９：１６であった（図３－２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000125
実施例４　翻訳の開始方法によって翻訳の伸長反応におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度を評価するための翻訳合成
　以下の方法に従って、アミノ酸類縁体のアミノアシルｔＲＮＡの合成を行った。
４－１－１．転写によるｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）の合成
　鋳型ＤＮＡ（配列番号Ｄ－２）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro の転写により３'端のCAを欠くtRNAGluCUG(-CA)（配列番号Ｒ－２）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
配列番号Ｄ－２（配列番号：６）
tRNAGluCTG(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTCTGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
配列番号Ｄ－３（配列番号：７）
tRNAGluAAG(-CA) DNA配列：
GGCGTAATACGACTCACTATAGTCCCCTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTAAGACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAGGGGACGC
配列番号Ｒ－２（配列番号：８）
tRNAGluCUG(-CA)　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUCUGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
配列番号Ｒ－３（配列番号：９）
tRNAGluAAG(-CA)　RNA配列：
GUCCCCUUCGUCUAGAGGCCCAGGACACCGCCCUAAGACGGCGGUAACAGGGGUUCGAAUCCCCUAGGGGACGC
４－１－２．　ｔＲＮＡ（ＣＡ欠損）とｐＣｐＡ-アミノ酸との反応による、アミノアシルｔＲＮＡの合成
　５０μＭ　転写tRNAGluCUG(-CA)　（配列番号Ｒ－２）またはtRNAGluAAG(-CA)　（配列番号Ｒ－３）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ－０２６、２８、３０）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液４０μＬに、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（４μＬ）６２．５ｍＭ　ヨウ素（水：ＴＨＦ＝１：１溶液）４４μＬを加え、室温で１時間、脱保護を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－７、８、９）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－７、８、９）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－７（配列番号：１０）
MeAla(4-Thz)-tRNAGluCUG
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000126
化合物ＡＡｔＲ－８
MeGly-tRNAGluCUG（配列番号：１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000127
化合物ＡＡｔＲ－９（配列番号：１１）
AspSMe-tRNAGluAAG
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000128
　次に翻訳の開始方法によって、翻訳の伸長反応におけるアミノ酸類縁体の翻訳効率と生成物の純度がどのように影響されるかを確認するための実験を実施した。具体的には、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法の翻訳の開始方法をそれぞれ用いて、アミノ酸類縁体を複数含む同じペプチド化合物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１７）を翻訳合成を実施した。生成物を含む翻訳液のＭＳ分析を行い、同じペプチド化合物である目的物のＭＳ強度を比較し翻訳効率の比較を行った。また生成物の純度を確認するために生成物に含まれる切断ペプチドのＭＳ強度を比較した。
４－２―１．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてN末端にＣｙｓを翻訳導入したペプチドを翻訳合成した後に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて翻訳合成から得られたペプチドの純度を確認した。
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－５－２ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）を５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ－７）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで翻訳産物を分析した。その結果、Ｎ末端にＣｙｓが導入された目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１７）のＭＳが観測されたものの、２種類の切断ペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１９、２１）のＭＳも観測された(図４)。またそれぞれのペプチドのＭＳ強度比は、目的物（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ－１７）：切断ペプチド（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ－１９）：切断ペプチド（ペプチド配列番号 Ｐｅｐ－２１）＝１：１：１であった。
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号Ｒ－５－２（配列番号：１７）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGCAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000129
４－２―２．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
　Initiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を翻訳導入したペプチドを翻訳合成した後に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護を行った。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて、翻訳合成によって得られるペプチドの純度を確認した。
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－５－１ (配列番号１２)）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）を５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ－１）と２０μＭ　ＭｅＡｌａ（４－Ｔｈｚ）－ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ－７）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで翻訳産物を分析した。
　その結果、Ｎ末端にＣｙｓが導入された目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１７）のＭＳがメインピークとして観測され、ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法と比べて２８倍のＭＳ強度であった(図４)
　また４種類の切断ペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１８、１９、２０、２１）のＭＳは観測されたものの、目的物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－１７）のＭＳ強度と比べてそれぞれ１／２０以下のＭＳ強度であった。
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号Ｒ－５－１（配列番号：１２）
ＲＮＡ配列：
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUCCGAGUCAGAUUGUUUACACUGGUCGUCCGUAAGCUUCG
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000130
　以上の結果からＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いれば、Ｎ末端にシステインを持ちアミノ酸類縁体を複数含むペプチドをより効率良くならびに高い純度で翻訳合成することができることが示された。
４－３―１．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法それぞれの翻訳の開始方法を用いてＮ末端にシステインまたはシステイン類縁体を有するペプチドの翻訳合成
　以上の観測された現象が他のペプチドを翻訳合成する際にも観測されるかを確認するために実施した実験を次に記す。対照実験としてAcbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ－１）の代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを加えて、Ｎ末端がｆＭｅｔで開始されたペプチドの翻訳合成を実施した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列を以下の表８に記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000131
４－３―１－１．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－６－２ (配列番号１８)、Ｒ－７－２ (配列番号１９)、Ｒ－８－２ (配列番号２０)、Ｒ－９－２ (配列番号２１)、Ｒ－５－２ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、Ｎ－メチルアラニン（ＭｅＡｌａ）をそれぞれ５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　ＭｅＧｌｙ－ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ－８）（配列番号：１０）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ理論値、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの実測値を示す表９～１３に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ強度を図５に記した。図５における切断ペプチドのＭＳ強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのＭＳ強度の合計値を表している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000132
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000133
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000134
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000135
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000136
４－３―１－２．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有するペプチドの翻訳合成
　Initiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を翻訳導入したペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護を行った。得られた反応混合物をＭＡＬＤＩによる質量分析を実施し、翻訳合成によって得られるペプチドの純度を確認した。
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－６－１ (配列番号１８)、Ｒ－７－１ (配列番号１９)、Ｒ－８－１ (配列番号２０)、Ｒ－９－１ (配列番号２１)、Ｒ－５－１ (配列番号１７)）と、各アミノ酸Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、Ｎ－メチルアラニン（ＭｅＡｌａ）をそれぞれ５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　ＭｅＧｌｙ－ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ－８）（配列番号：１０）、２０μＭ　Acbz-Cys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物ＡＡｔＲ－１）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物を、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで翻訳産物を分析した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列番号と翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ理論値、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの実測値を示す表１４～１８に記した。また、翻訳合成された目的物と切断ペプチドのＭＳ強度を図５に記した。図５における切断ペプチドのＭＳ強度を示すグラフにおいて、複数の切断ペプチドが観測された場合はそれぞれの切断ペプチドのＭＳ強度の合計値を表している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000137
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000138
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000139
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000140
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000141
　図５に示したように、今回翻訳評価したアミノ酸類縁体を複数含むペプチドすべてにおいてＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ法とＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を比較すると、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は目的物のMS強度がより強く観測され、切断ペプチドのMS強度はより弱く観測された。すなわち、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は効率よくＮ末端にシステインを持つアミノ酸類縁体を複数含むペプチドを翻訳合成する手法であることが証明された。また、切断ペプチドはアミノ酸類縁体の翻訳導入前後で切断されたものが観測されており、Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法は複数のアミノ酸類縁体を含むペプチドを高い純度で翻訳合成できることが示された。
実施例５　Ｎ末端に保護基を持つＮＭｅシステインを有するペプチドを翻訳合成し、保護基を脱保護した後にネイティブケミカルライゲーションによりアミド環化ペプチドの合成
５―１．　Ｎ末端に保護基を持つＮＭｅシステインを有し、Ｃ末端側のアミノ酸の側鎖に活性エステルを持つペプチドの翻訳合成と、翻訳合成したペプチドの保護基を脱保護した後にネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成
　以下の反応式に示すようにInitiation suppression法を用いてN末端にＡｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）を持つペプチドを翻訳合成し、その後にトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）によってＡｃｂｚを脱保護とネイティブケミカルライゲーションと脱硫反応によるアミド環化ペプチドの合成を実施した。具体的には、ＭｅＣｙｓを基質とするネイティブケミカルライゲーションはチオエステル交換から生成するチオラクトン体と、その後のＳ－Ｎ交換から生成するＮＣＬアミド体との間で平衡が存在し、２つの混合物が得られる。その混合物を脱硫反応に付し、ＮＣＬアミド体を脱硫させることによって平衡を偏らせて反応を進行させ目的の環状ペプチドが得られた。よって翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し、目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできる反応条件の設定に至った。
　得られた反応混合物をＭＡＬＤＩによる質量分析を実施し、それぞれの反応が進行し目的のアミド環化ペプチドが得られたことを確認した。翻訳合成に使用した鋳型ｍＲＮＡ配列を以下の表１９に記した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000142
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000143
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，６ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－１０、Ｒ－１１、Ｒ－１２、Ｒ－１３，Ｒ－１４，Ｒ－１５）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　ＡｓｐＳＭｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＡＡＧ（化合物ＡＡｔＲ－９）、２０μＭ　Ａｃｂｚ－ＭｅＣｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ（化合物ＡＡｔＲ－３）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　次に翻訳反応液（８μＬ）に、１５０ｍＭ　ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液（２μＬ）を混合し、３７℃で１時間静置した。Ａｃｂｚの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより確認した（図６）。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの分析には反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。また、１５０ｍＭ　ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液は、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１２μＬ）、ｐＨ８．３　Ｔｒｉｓ溶液（２Ｍ，３μＬ）、ｐＨ８．０　ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社　製品番号14362-24、５μＬ）、水酸化カリウム水溶液（２００ｍＭ、２０μＬ）を混合し調製した。
　さらに、環化反応液（７μＬ）に、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，７μＬ）、グルタチオン（ＧＳＨ）溶液（２５０ｍＭ，１μＬ）を加え、４２℃で１分間静置し、続いて2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩（ＶＡ－０４４）溶液（１Ｍ、４μＬ）、水酸化カリウム水溶液（１Ｍ、１μＬ）を混合し４２℃で２時間静置した。
　脱硫反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより確認した（図６）。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの分析には、反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１０　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＳｅｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－４３とＰｅｐ－４４の混合物）
Ｐｅｐ－４３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000144
Ｐｅｐ－４４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000145
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝1477.5　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．1476.7
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１０　から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ－４３とＰｅｐ－４４）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＳｅｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－４５）
Ｐｅｐ－４５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000146
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４４５．５　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１４４４．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１１　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＩｌｅ［ＭｅＰｈｅ］ＳｅｒＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－４６とＰｅｐ－４７）
Ｐｅｐ－４６
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000147
Ｐｅｐ－４７
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000148
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４２１．５　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１４２０．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１１　から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ－４６とＰｅｐ－４７）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＧｌｎＩｌｅ［ＭｅＰｈｅ］ＳｅｒＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－４８）
Ｐｅｐ－４８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000149
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１３８９．６　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１３８８．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１２　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］ＴｈｒＴｈｒＰｒｏ［ＭｅＰｈｅ］ＧｌｙＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＩｌｅＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－４９とＰｅｐ－５０）
Ｐｅｐ－４９
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000150
Ｐｅｐ－５０
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000151
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１６１１．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１６１０．８
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１２　から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ－４９と化合物Ｐｅｐ－５０）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］ＴｈｒＴｈｒＰｒｏ［ＭｅＰｈｅ］ＧｌｙＧｌｎＳｅｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＩｌｅＶａｌＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５１）
Ｐｅｐ－５１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000152
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５７９．５　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１５７８．８
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１３　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＴｈｒＧｌｎＡｌａＴｈｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＧｌｙＩｌｅＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５２とＰｅｐ－５３）
Ｐｅｐ－５２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000153
Ｐｅｐ－５３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000154
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４９８．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１４９７．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１３　から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ－５２とＰｅｐ－５３）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］［ＭｅＰｈｅ］ＶａｌＴｈｒＧｌｎＡｌａＴｈｒ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＧｌｙＩｌｅＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５４）
Ｐｅｐ－５４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000155
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１４６６．５　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１４６５．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１４　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＩｌｅＶａｌ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＴｈｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５５とＰｅｐ－５６）
Ｐｅｐ－５５
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000156
Ｐｅｐ－５６
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000157
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５４０．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１５３９．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１４　から由来する化合物（Ｐｅｐ－５５とＰｅｐ－５６）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＳｅｒＧｌｎＩｌｅＶａｌ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＴｈｒＡｓｐ＊ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000158
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５０８．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１５０７．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１５　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物の混合物
［ＭｅＣｙｓ＊］［ＭｅＰｈｅ］［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］Ｔｒｐ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＧｌｎ［ＭｅＰｈｅ］ＬｙｓＴｒｐＡsp＊ＰｒｏＡｒｇ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）]（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－５８とＰｅｐ－５９）
Ｐｅｐ－５８
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000159
Ｐｅｐ－５９
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000160
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝２０５６．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．２０５５．９
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１５　から由来する化合物の混合物（Ｐｅｐ－５８とＰｅｐ－５９）を脱硫反応に付して得られた化合物
［ＭｅＡｌａ＊］［ＭｅＰｈｅ］［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］Ｔｒｐ［ＭｅＰｈｅ］ＰｒｏＧｌｎ［ＭｅＰｈｅ］ＬｙｓＴｒｐＡsp＊ＰｒｏＡｒｇ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）]（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－６０）
Ｐｅｐ－６０
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000161
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝２０２４．７　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．２０２４．０
実施例６　翻訳後修飾条件下におけるＲＮＡの安定性評価
　翻訳合成から得られたペプチドから連続的に変換し目的とするアミド環化ペプチドを合成することのできるそれぞれの反応条件下において、ＲＮＡが安定であることを確認する実験を行った。
６－１．　翻訳後修飾条件下における安定性を評価するためのｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の調製
　文献記載（特許文献　ＷＯ２０１３／１００１３２）の方法により調製したＤＮＡライブラリー(配列番号　Ｄ－１６)を鋳型に、T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System(Promega社、P1320)を用いたin vitro転写によりｍＲＮＡ（配列番号R-16)を調製し、RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製した。
　6μＭ　ｍＲＮＡ（配列番号R-16)を、9μＭのピューロマイシンリンカー (Sigma社)(配列番号Ｃ－１)、 1X T4 RNAライゲースリアクションバッファー(New england bio lab.社)、１ｍＭ　ＡＴＰ、１０％ ＤＭＳＯ、０．６２５ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４　ＲＮＡライゲース(New england bio lab.社)の条件で、37℃で30分間ライゲーション反応させた後、RNeasy MinElute kit (Qiagen社)により精製しｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を得た。
ＤＮＡ　配列番号Ｄ－１６（配列番号：２８）
GTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGTGC(NNN)9TAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGATAGGGCGGCGGGGACAAA
　配列中に（NNN）と示した箇所は、TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, GAA, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTがランダムに出現することを意味する。また、（NNN）9は任意のNNN が９回結合していることを意味しており（ATT）９のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。
ＲＮＡ　配列番号Ｒ－１６（配列番号：２９）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAA
　配列中に（PPP）と示した箇所は、UUU, UUG, CUA, AUU, GUU, CCG, ACU, GCU, UAC, CAU, CAG, GAA, UGG, CGG, AGU, AGG, GGUがランダムに出現することを意味する。また、（PPP）9は任意のPPP が９回結合していることを意味しており（AUU）９のみを意味するのでなく、例えば17種類から選択すると179の多様性が生じることを模式的に示したものである。
ピューロマイシンリンカー 配列番号Ｃ－１（配列番号：３０）
[P]CCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin] ([P]:5'リン酸化)
　詳細な部分構造は以下の通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000162
ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)（配列番号：３１）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGUGC(PPP)9UAGCCGACCGGCACCGGCACCGGCGAUAGGGCGGCGGGGACAAACCCGTCCCCGCCGCCCT[Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18][Spacer18]CC[Puromycin]
６－２．　Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応とその後の脱硫反応条件でのＲＮＡの安定性を確認した例
　前述したＡｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応、その後の脱硫反応という一連の反応条件においてRNAが安定に存在するかを確認した。すなわち、ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を一連の反応条件に付した後、ゲル電気泳動による解析を行った。
　具体的には、１μＭ　ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)を含む緩衝液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．１ｍM　10-HCO-H4folate）（６０μL）に、１５０ｍＭ　ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液（１５μＬ）を混合し、３７℃で１時間静置した。１５０ｍＭ　ＴＣＥＰ環化反応試薬溶液は、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１２μＬ）、ｐＨ８．３　Ｔｒｉｓ溶液（２Ｍ，３μＬ）、ｐＨ８．０　ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社　製品番号14362-24、５μＬ）、水酸化カリウム水溶液（２００ｍＭ、２０μＬ）を混合しＡｃｂｚ脱保護環化溶液を調製した。
　さらに、混合溶液（７５μＬ）に、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，７５μＬ）、グルタチオン（ＧＳＨ）溶液（２５０ｍＭ，１０．７μＬ）を加え、４２℃で１分間静置し、続いて2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]二塩酸塩（ＶＡ－０４４）溶液（１Ｍ、４２．９μＬ）、水酸化カリウム水溶液（１Ｍ、１０．７μＬ）を混合し４２℃で３時間静置した。
　その後RNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いて精製し、ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物の溶液を得た後、電気泳動による解析を行った。（図７、レーン１）。
　一方、上述のＡｃｂｚ脱保護環化溶液（７５μＬ）に水１３９．３μLを加え、４２℃で３時間静置した。上記と同様にRNeasy MinElute kit (Qiagen社)を用いてｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物を精製し、脱硫反応条件に付していない溶液として調製し泳動比較に用いることにした（図７，レーン２）。
　さらに標準溶液として、反応条件に付していない０．５μＭ　ｍＲＮＡ－ピューロマイシンリンカーライゲーション産物(配列番号R-17)溶液を泳動比較に用いることにした（図７，レーン３）。またマーカーとしてTrackIt 10 bp ladder (Life Technologies社, 製品番号10488-019)を用いた（図７，レーン４）。
　それぞれの上記反応サンプル１０μＬの溶液に対して１０μＬのNovex(登録商標) TBE－Ureaサンプルバッファー（２ｘ）（Invitrogen社）を加え、そのうち４μＬを使って１０％TBE－ウレアゲルにて電気泳動を行い、SYBR gold nucleic acid stain　(Invitrogen社)により染色を行った。その結果、いずれの反応サンプル(図７、レーン１，２)においても、標準溶液（図７，レーン３）と比較して分解物に由来するようなバンドパターンの変化は観測されなかった。 これらの事から、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによるアミド環化反応、その後の脱硫反応という一連の反応条件においてRNAは分解せず安定に存在する事が示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000163
実施例７　無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ－アミノ酸の合成
用語の定義
Ａｚｏｃ　　　　アジドメトキシカルボニル基
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000164
ＨＯＧｌｙ　　　グリコール酸
ＤＭＴ　　　　　ジ（p-メトキシフェニル）フェニルメチル基
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000165
７－１．Initiation suppression法によりＮ末端にアミノ酸類縁体を翻訳導入するためのｐＣｐＡ－アミノ酸の合成
2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000166
　文献記載（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）の方法で合成した(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)カルバミン酸 tert-ブチル（５３ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４－ジオキサン溶液（１．０ｍｌ）を加えて室温で９０分撹拌した。反応液を減圧濃縮して2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１６６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．３６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000167
　前工程にて得られた2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１４０ｍｌ、０．８０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、２－ブロモ酢酸 tert-ブチル（０．０２９ｍｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５分撹拌後、室温で９０分撹拌した。さらに２－ブロモ酢酸 tert-ブチル（０．００６ｍｌ、０．０４０ｍｍｏｌ）を添加し室温で１６．５時間撹拌した後に、反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。得られた濃縮残渣をＤＣＭ（１ｍｌ）に溶かし、混合物を氷浴で冷却後にＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で６０分撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。
　窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（６２．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．４０ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（８４μＬ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）（５３．９ｍｇ、６８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート(化合物ｎｋ３３)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000168
　窒素雰囲気下、N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシン（化合物ｎｋ３２）（５３．９ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０４７ｍＬ、０．２７１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５４１μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．０１４ｍＬ、０．２０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間３０分攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）を得た。得られた粗生成物シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）をアセトニトリル（０．６７５ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　(2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート(化合物ｎｋ３４)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000169
　緩衝液Ａ（１６．４ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（２４．６ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル N-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-N-(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)グリシナート（化合物ｎｋ３３）の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．３３９ｍｌ、０．０６８ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．１１３ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（０．８２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３４）（１６．２ｍｇ、４６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000170
　2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（４０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２７９ｍｌ、１．６０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．０ｍｌ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、3-ブロモプロパン酸 tert-ブチル（０．１０ｍｌ、０．６０ｍｍｏｌ）を添加し、５分撹拌した。反応混合物を室温で１８時間撹拌した後に、反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。得られた濃縮残渣をＤＣＭ（１ｍｌ）に溶かし、混合物を氷浴で冷却後にＴＦＡ（１ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で１５分撹拌した後、反応液を減圧濃縮した。
　窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（６２．９ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．４ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（１３９μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５℃で１日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）（４７．５ｍｇ、５８％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000171
　窒素雰囲気下、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸（化合物ｎｋ３５）（４７．５ｍｇ、０．１１５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０４０ｍＬ、０．２３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４６１μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．０１２ｍＬ、０．１７３ｍｍｏｌ）を加えて室温で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)を得た。得られた粗生成物3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)をアセトニトリル（０．５７５ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４５２　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
　3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ３７)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000172
　緩衝液Ａ（２７．７ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（４１．５ｍｇ、０．０５８ｍｍｏｌ）を溶解させ、3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)プロパン酸シアノメチル (化合物ｎｋ３６)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．５７６ｍｌ、０．１１５ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．１９２ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（１．３９ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ３７）（２８．１ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０４７．５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル(化合物ｎｋ３８)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000173
　N-(tert-ブトキシカルボニル)-S-(tert-ブチルチオ)-L-システイン（Ｂｏｃ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ）（３０９ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１７５ｍＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えて、混合物を－１５度に冷却し、クロロギ酸エチル（０．１０５ｍＬ、１．１０ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合液を－１５度で６時間攪拌し、さらに室温で１２時間撹拌した。反応液を氷浴で冷却後、酢酸（０．１１４ｍＬ、２．００ｍｍｏｌ）を加え、混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和食塩水で洗浄を行った。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製し(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル（化合物ｎｋ３８）（５５．１ｍｇ、１７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３３４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000174
　(R)-(1-(tert-ブチルジスルファニル)-4-ジアゾ-3-オキソブタン-2-イル)カルバミン酸 tert-ブチル（化合物ｎｋ３８）（８５ｍｇ、０．２５５ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．７ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．１１１ｍＬ、０．６３７ｍｍｏｌ）を加えて、混合液を氷浴で冷却後、トリフルオロ酢酸銀(I)（１１．３ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を遮光下、０度で２時間攪拌し、さらに室温で３日間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)（３０ｍｇ、３６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３２２　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000175
　(R)-3-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (化合物ｎｋ３９)（３０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）に４Ｎ塩酸／１，４－ジオキサン溶液（１．０ｍｌ）を加えて室温で６０分撹拌し、反応液を減圧濃縮した。
　窒素雰囲気下、得られた濃縮残渣と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（２９．２ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（０．９３ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（３２μＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）（１８．８ｍｇ、５１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000176
　窒素雰囲気下、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸（化合物ｎｋ４０）（１８．８ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０１２ｍＬ、０．０７１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（２３６μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．００５ｍＬ、０．０７１ｍｍｏｌ）を加えて室温で６時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)を得た。得られた粗生成物(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)をアセトニトリル（０．２３６ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４３６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(3R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル (化合物ｎｋ４２)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000177
　緩衝液Ａ（４０ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（３４．０ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を溶解させ、(R)-3-((((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)アミノ)-4-(tert-ブチルジスルファニル)ブタン酸シアノメチル(化合物ｎｋ４１)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．２３６ｍｌ、０．０４７ｍｍｏｌ）を加えて、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４２）（１０．３ｍｇ、２１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０３３．６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000178
　(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(トリチルチオ)ピロリジン-2-カルボン酸（１２０ｍｇ、０．１９６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶かし、ＴＦＡ（０．１００ｍＬ、１．３０ｍｍｏｌ）とトリエチルシラン（０．０６０ｍＬ、０．３８ｍｍｏｌ）を加えて、反応混合液を室温で１時間攪拌した。さらに反応液にメタンチオスルホン酸 Ｓ-メチル（０．０９２ｍＬ、０．９８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．２４０ｍＬ、１．３７ｍｍｏｌ）を加えて反応混合液を室温で１時間攪拌した。
　反応液を減圧濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)（７７．８ｍｇ、９５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４１６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000179
　(2S,4R)-1-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４３)（１００ｍｇ、０．２４１ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（０．９６ｍｌ）溶液に4-(3-フェニルプロピル)ピペリジン（０．１０２ｍｌ、０．４８１ｍｍｏｌ）を加え、室温で６０分攪拌した。反応溶液を減圧濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル）にて精製し、(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)（３９．５ｍｇ、８５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１９４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000180
　窒素雰囲気下、(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-2-カルボン酸(化合物ｎｋ４４)（３９．５ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）と炭酸（４－ニトロフェニル）４－アジドベンジル（６４．２ｍｇ、０．２０４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（０．４１ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、トリエチルアミン（７１．２μＬ、０．５１１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３０℃で４時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)（７４．８ｍｇ、９９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３６７　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000181
　窒素雰囲気下、(2S,4R)-1-(((4-アジドベンジル)オキシ)カルボニル)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-2-カルボン酸 (化合物ｎｋ４５)（７４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０５２ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４００μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．０２０ｍＬ、０．３０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１７時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)を得た。得られた粗生成物(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)をアセトニトリル（１．０ｍｌ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　４０８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
(2S,4R)-4-(メチルジスルファニル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 1-(4-アジドベンジル) 2-((2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル) (化合物ｎｋ４７)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000182
　緩衝液Ａ（４８ｍｌ）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（７２．２ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ）を溶解させ、(2S,4R)-4-((R)-メチルスルフィノチオイル)ピロリジン-1,2-ジカルボン酸 2-(シアノメチル) 1-(4-アジドベンジル) (化合物ｎｋ４６)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（１．００Ｌ、０．２０ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．３３ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．４ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌しさらに室温で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４７）（２３．５ｍｇ、２３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１００１　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000183
　2-(tert-ブチルジスルファニル)エタン-1-アミン 塩酸塩（化合物ｎｋ３１）（８１ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．２７９ｍＬ、１．６０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶解した。混合物を氷浴で冷却後、4-ブロモ酪酸メチル（０．０７５ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５分撹拌後、６０度で２５時間撹拌した後に反応液を減圧濃縮して濃縮残渣を得た。
　得られた濃縮残渣をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶かし、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．１４ｍＬ、０．８０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を－２０度に冷却後にクロロぎ酸クロロメチル（５１．６ｍｇ、０．４００ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を０度で３０分撹拌した後、水（７．２μＬ、０．４０ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を室温で１０分撹拌した後に反応液を減圧濃縮した。得られた濃縮残渣をアセトニトリル（１．６ｍＬ）に溶かし、テトラブチルアンモニウムアジド（５６９ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３日撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）（８９．７ｍｇ、６２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３６５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000184
　4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸メチル（化合物ｎｋ５０）（８４ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）をメタノール（０．８０ｍＬ）に溶かした後、０．６Ｍ水酸化リチウム溶液（メタノール：水＝１：１、０．７６８ｍＬ）を加えて反応液を室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷浴で冷却後、１Ｍ塩酸（０．５ｍＬ）を添加した後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)（７５．６ｍｇ、９４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３４９　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000185
　窒素雰囲気下、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸 (化合物ｎｋ５１)（７５．６ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（０．０９４ｍＬ、０．５４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５３９μｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（０．０２９ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)を得た。得られた粗生成物4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)をアセトニトリル（１．０８ｍＬ）に溶解させ、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３９０　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸
 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル(化合物ｎｋ５３)の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000186
　緩衝液Ａ（４５ｍL）に、リン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（６７ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）を溶解させ、4-(((アジドメトキシ)カルボニル)(2-(tert-ブチルジスルファニル)エチル)アミノ)ブタン酸シアノメチル (化合物ｎｋ５２)の０．２Ｍアセトニトリル溶液（０．９２ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を３回に分割投与し(反応開始時、反応開始から１０分後、３０分後にそれぞれ０．３１ｍＬ、合計３回投与)、室温で９０分撹拌した。反応液を０度に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を０度で１０分撹拌しさらに室温で１０分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ５３）（３１．０ｍｇ、３４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９８５．５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
実施例８　アミノ基に保護基を有する翻訳開始用のアミノアシルｔＲＮＡの合成
８－１．　アミノ酸類縁体をＮ末端に導入するためのアミノアシルｔＲＮＡ合成
　５０μＭ　転写tRNAfMetCAU(-CA)　（配列番号Ｒ－１）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのアミノアシル化ｐＣｐＡ（ｎｋ－３４、３７、４２、４７、５３）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１０、１１、１２、１３、１４）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１０、１１、１２、１３）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１０
Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000187
化合物ＡＡｔＲ－１１
Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000188
化合物ＡＡｔＲ－１２
Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000189
化合物ＡＡｔＲ－１３
Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000190
化合物ＡＡｔＲ－１４
Azoc-(tBuSSEt)GABA-tRNAfMetCAU（配列番号：３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000191
実施例９
９－１．　Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸を有するペプチドの翻訳合成
　上記３－２と同様に、Initiation suppression法を用いて、アミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを無細胞翻訳系に加えて翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡと、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙをそれぞれ２５０μＭずつ加え、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔを翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
＜質量分析による検出＞
　無細胞翻訳系にて翻訳合成されたペプチドを質量分析するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いて実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４）と各アミノ酸としてＴｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１０）、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１１）、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１２）、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１３）、Azoc-(tBuSSEt)GABA -tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１４））（最終濃度２５μＭ）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応物に、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン（ＴＣＥＰ）（最終濃度２０ｍＭ）を加えた後、３７℃で１時間静置した。マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより翻訳産物を分析した。
　その結果Ｎ末端にチオール基を有するアミノ酸が導入されたペプチド（表２１　ペプチド配列番号Ｐｅｐ－６１、Ｐｅｐ－６２、Ｐｅｐ－６３，Ｐｅｐ－６４，Ｐｅｐ－６５）を示すＭＳが観測された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000192
＜電気泳動による検出＞
　N末端にアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸が翻訳導入されたペプチドを検出するために、ラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を用いてペプチドの翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－４Ｄ）と各アミノ酸、Ｔｈｒ，Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ａｌａ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｓｅｒ，Ｌｅｕ，Ｐｒｏ，Ｇｌｙ（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、さらにアミノ基とチオール基にそれぞれ保護基を持つアミノ酸がアミノアシル化されたｔＲＮＡｆＭｅｔ（Acbz-(tBuSSEt)Gly-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１０）、Acbz-(tBuSSEt)βAla-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１１）、Acbz-βhCys(StBu)-tRNAfMetCAU （化合物AAtR-１２）、Acbz-Pro(SSMe)-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１３）、Azoc-(tBuSSEt)GABA-tRNAfMetCAU（化合物AAtR-１４）（最終濃度２５μＭ）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。また対照実験として翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡの代わりに２５０μＭ　Ｍｅｔを加えたものと、翻訳開始用アミノアシルｔＲＮＡを加えないものを調製し、３７℃で１時間静置した。
　得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に２４時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
　その結果Ａｃｂｚ－（ｔＢｕＳＳＥｔ）Ｇｌｙの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－６６）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は９６：１０（対照実験であるホルミルメチオニンで開始されたペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－８）の翻訳効率を１００としたときの相対的な翻訳効率を示す）であった（図８）。また、Ａｃｂｚ－（ｔＢｕＳＳＥｔ）βＡｌａの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－６７）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は９２：１２であり、Ａｃｂｚ－βｈＣｙｓ（ＳｔＢｕ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－６８）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は１０４：１１であった。
　また、Ａｃｂｚ－Ｐｒｏ（ＳＳＭｅ）の場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－６９）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は９３：９、Ａｚｏｃ－（ｔＢｕＳＳＥｔ）ＧＡＢＡの場合、目的物であるペプチド（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－７０）と副生成物（ペプチド配列番号Ｐｅｐ－９）の生成比は１０８：１０であった(図９）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000193
実施例１０　翻訳産物からの分枝ペプチドの生成
１０－１．　翻訳産物から分枝ペプチドの生成を可能とするアシルｐＣｐＡの合成
2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ－ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000194
　窒素雰囲気下、文献記載（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．　２００７，　１２９，　６１８０．）の方法で合成した2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸シアノメチル（１１５ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）とリン酸二水素 ((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-3-(((((2R,3S,4R,5R)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-3,4-ジヒドロキシテトラヒドロフラン-2-イル)メトキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-2-イル)メチル（化合物ｐｃ０１）（１６７ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．５ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（１９３μＬ、１．３８ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３５℃で３時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ－ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ）（６１．２ｍｇ、４１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０８１．６　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
2-ヒドロキシ酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3S,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-4-ヒドロキシ-2-((ホスホノオキシ)メチル)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４９、ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000195
　前工程にて得られた（2-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)酢酸 (2R,3S,4R,5R)-2-((((((2R,3R,4R,5R)-5-(4-アミノ-2-オキソピリミジン-1(2H)-イル)-2-((ホスホノオキシ)メチル)-4-((テトラヒドロフラン-2-イル)オキシ)テトラヒドロフラン-3-イル)オキシ)(ヒドロキシ)ホスホリル)オキシ)メチル)-5-(6-アミノ-9H-プリン-9-イル)-4-ヒドロキシテトラヒドロフラン-3-イル（化合物ｎｋ４８、ＤＭＴ－ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ）（１５．８ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）に８０％酢酸水溶液（３１６μＬ）を加えて室温で９０分撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ４９、ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ）（８．４ｍｇ、８１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　７０９　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１３分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
１０－２．　ＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡを用いたアシルｔＲＮＡ合成
　５０μＭ　転写tRNAGluCUG(-CA)　（配列番号Ｒ－２）(２０μｌ)に、10X ligation buffer （500 mM HEPES-KOH pH 7.5, 200 mM MgCl2）(４μｌ)、１０ｍＭ　ＡＴＰ　（４μｌ）、Nuclease free water　（５．６μｌ）を加え、９５℃で２分間加熱した後、室温で５分間放置し、ｔＲＮＡのリフォールディングを行った。１０ｕｎｉｔ／μｌ　Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ（New england bio lab.社）（２．４μＬ）および、５ｍＭのＨＯＧｌｙ－ｐＣｐＡ（ｎｋ－４９）のＤＭＳＯ溶液　（４μＬ）を加え、１６℃で４５分間ライゲーション反応を行った。アシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１５）は、フェノール・クロロホルム抽出した後、エタノール沈殿により回収した。アシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１５）は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１５
HOGly-tRNAGluCUG（配列番号：１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000196
　翻訳ペプチドから分枝ペプチドを合成するために、以下の反応式に示すようにＩｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にＡｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）を有しＣｙｓ－Ｐｒｏ－ＨＯＧｌｙ配列をおよび側鎖アミノ基を有するリジンを持つペプチドを翻訳合成した。さらにＡｃｂｚ脱保護後にネイティブケミカルライゲーションによる環化反応により環状ペプチドを合成した後に、続く2回目の反応により分枝ペプチドを合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000197
１０－３．Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてＮ末端にシステインを有し、システニルプロリルエステル配列及び側鎖アミノ基を持つペプチドを翻訳合成した後にネイティブケミカルライゲーションによる環状ペプチドの合成
鋳型ｍＲＮＡ　配列番号Ｒ－１８　（配列番号：３７）
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAGUUUUUGCCCGCAGAUUAAAUACGUUGGUCUUCCGCGUUAAGCUUCG
　翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ　ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、無細胞翻訳液（１％(ｖ/ｖ)RNasein Ribonuclease inhibitor(Promega社，Ｎ２１１１），１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ、０．２４μＭ　ＲＦ２、０．１７μＭ　ＲＦ３、０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．３８μＭ　ＡｓｎＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０２μＭ　ＣｙｓＲＳ，０．０６μＭ　ＧｌｎＲＳ，０．２３μＭ　ＧｌｕＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．０２μＭ　ＨｉｓＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ　ＬｅｕＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，０．０４μＭ　ＳｅｒＲＳ，０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０３μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，０．０２μＭ　ＶａｌＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－１８）と、各アミノ酸Ａｌａ，Ａｒｇ，Ｃｙｓ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｉｌｅ，Ｌｙｓ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，Ｖａｌ，３-フルオローＬ－チロシン（Ｔｙｒ（３－Ｆ））をそれぞれ２５０μＭずつ加え、Ｎ－メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）５ｍＭ加え、さらに２０μＭ　ＡｓｐＳＭｅ－ｔＲＮＡＧｌｕＡＡＧ（化合物ＡＡｔＲ－９）、２０μＭ　ＨＯＧｌｙ－ｔＲＮＡＧｌｕＣＵＧ（化合物ＡＡｔＲ－１５）、２０μＭ　Ａｃｂｚ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ｔＲＮＡｆＭｅｔＣＡＵ（化合物ＡＡｔＲ－１）を翻訳液混合物に加えて、３７℃で１時間静置した。
　次に翻訳反応液（７．８μＬ）に、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，１．２μＬ）、Ｎ－メチルー２-ピロリドン（ＮＭＰ）(１０μＬ)　、ｐＨ８．０　ＥＤＴＡ溶液（５００ｍＭ、nacalai社　製品番号14362-24、０．５μＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ（０．５μＬ）を
をそれぞれ混合し、３７℃で３０分間静置した。Ａｃｂｚの脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応が進行していることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより確認した（図１０－１）。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの分析には反応液を１μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１８　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物
［Ｃｙｓ＊］Ｓｅｒ［ＭｅＰｈｅ］ＣｙｓＰｒｏＨＯＧｌｙＩｌｅＬｙｓ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ＊]ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－７１）
Ｐｅｐ－７１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000198
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１５５６．４　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１５５５．７
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１８　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応において生成した副生成物
ＨＯＧｌｙＩｌｅＬｙｓ［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ（ＳＭｅ）]ＰｒｏＡｒｇ（Ｐｅｐ－７２）
Ｐｅｐ－７２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000199
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１０５３．３　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１０５２．５
１０－４．翻訳ペプチドから合成した環状ペプチドＰｅｐ－７１を用いた分子内分枝ペプチド生成反応
　前述のＰｅｐ－７１を含む環化反応液（１０μＬ）に、Ｎ－メチルー２-ピロリドン（ＮＭＰ）(２０μＬ)、ｐＨ　７．０ＴＣＥＰ溶液（５００ｍＭ，５μＬ）、ｐＨ９．２　ビシン溶液（２Ｍ、９μＬ）、水酸化カリウム水溶液（５Ｍ、６μＬ）、４－（トリフルオロメチル）ベンゼンチオール（６．８μＬ、５０μＬ）をそれぞれ混合し、３０℃で２４時間静置した。
　分枝ペプチドが生成していることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより確認した（図１０－２、上図）。その結果目的物である分枝ペプチド（Ｐｅｐ－７３）と副生成物（Ｐｅｐ－７４）と環状ペプチド（Ｐｅｐ－７１）のＭＳ強度比は２０：６：７４であった。
　ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの分析には、反応液を２μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。
鋳型ｍＲＮＡ配列番号　Ｒ－１８　から翻訳合成された後、Ａｃｂｚ基の脱保護反応とネイティブケミカルライゲーションによる環化反応から得られた化合物（Ｐｅｐ－７３）
Ｐｅｐ－７３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000200
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１３５６．３　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１３５５．６
分子内分枝ペプチド合成反応において生成した副生成物
ＨＯＧｌｙＩｌｅ[Ｌｙｓ＊]［Ｔｙｒ（３－Ｆ）］ＶａｌＧｌｙ[Ａｓｐ＊]ＰｒｏＡｒｇ（２つの＊部位にて環化）（Ｐｅｐ－７４）
Ｐｅｐ－７４
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000201
ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ
ｍ／ｚ＝１００５．３　（Ｍ＋Ｈ）＋　　Ｃａｌｃ．１００４．５
　以上の結果から分枝ペプチド（Ｐｅｐ－７３）は生成しているものの、中間体である環状ペプチド（Ｐｅｐ－７１）が主なピークであり改善の余地が残されていた。分枝ペプチドをより効率よく合成するために、さらなる分枝化反応の改良を実施した。
１０－５．分枝化反応が良好に進行する条件下における、翻訳ペプチドから合成した環状ペプチドＰｅｐ－７１を用いた分子内分枝ペプチド生成反応
　前述のＰｅｐ－７１を含む環化反応液（１０μＬ）に、Ｎ－メチル－２-ピロリドン（ＮＭＰ）(２０μＬ)、ＴＣＥＰ溶液（１Ｍ，５μＬ）、ｐＨ９．２　ビシン溶液（２Ｍ、８μＬ）、水酸化カリウム水溶液（５Ｍ、７μＬ）、４－（トリフルオロメチル）ベンゼンチオール（６．８μＬ、５０μＬ）をそれぞれ混合し、４５℃で１４時間静置した。
　ＴＣＥＰ溶液（１Ｍ）は、ＴＣＥＰ塩酸塩（７３．２ｍｇ、０．２５６ｍｍｏｌ）、水酸化カリウム水溶液（８Ｍ、１２８μＬ）を混合しＮｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒを用いて調製した。
　分枝ペプチドが生成していることを、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳにより確認した（図１０－２、下図）。その結果目的物である分枝ペプチド（Ｐｅｐ－７３）と副生成物（Ｐｅｐ－７４）と環状ペプチド（Ｐｅｐ－７１）のＭＳ強度比は８５：９：６であった。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳの分析には、反応液を２μＬサンプリングしSPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を用いて実施した。
　以上の結果から、分枝化反応の条件を改良することによって翻訳産物から一連の反応を経て目的とする分枝ペプチドを良好な収率で進行することが示された。
　一方、文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ）からこれらの一連の反応条件はＲＮＡが十分安定な範囲であるため、ペプチド－ＲＮＡ複合体においてもＲＮＡを分解させることなく良好な収率で分枝反応を進行させることが可能である。
実施例１１　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いてアミド環化にて環化されたディスプレイライブラリの構築と標的結合ペプチドのパニング実施
　ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を利用して環状ペプチドのディスプレイライブラリを作製しパニングを実施してＧＴＰａｓｅ　ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）に対する結合ペプチドを取得するための実験を行った。
１１－１．　ディスプレイライブラリ構築のためのｐＣｐＡ―アミノ酸の合成
３－（４－クロロフェニル）－２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（Ｓ）－シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
下記のスキームにしたがって合成を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000202
　（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）－３－（４－クロロフェニル）プロパン酸（Ｂｏｃ－Ｐｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＨ）（４．００ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）（１２０ｍＬ）に溶解した後、０℃にて水素化ナトリウム（１．６０ｇ、４０．０ｍｍｏｌ、６０％オイルディスパージョン）、ヨウ化メチル（９．４８ｇ、６６．８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液をオイルバスを用い、３０℃にて２日間撹拌した後、反応を氷水（５０ｍＬ）で停止させた。混合溶液を酢酸エチルで３回洗浄した後、水層を硫酸水素ナトリウムを用いてｐＨ３－４に調整し、酢酸エチルで３回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）－３－（４－クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｎｋ５４、Ｂｏｃ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＨ）（２．２０ｇ、５３％）を得た。
　窒素雰囲気下、前工程にて得られた（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）－３－（４－クロロフェニル）プロパン酸（化合物ｎｋ５４、Ｂｏｃ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＨ）（１．５０ｇ、４．７８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（８０ｍＬ）溶液にＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．２４ｇ、９．５９ｍｍｏｌ）および２－ブロモアセトニトリル（２．２８ｇ、１９．０ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）－３－（４－クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５５、Ｂｏｃ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．４５ｇ、８６％）を得た。
　前工程にて得られた（Ｓ）－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）（メチル）アミノ）－３－（４－クロロフェニル）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５５、Ｂｏｃ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．３０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、塩酸ガスを吹き付け２０℃にて１時間撹拌した。反応液を濃縮し、混合物として（Ｓ）－３－（４－クロロフェニル）－２－（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルを（１．０６ｇ）得た。
　前工程にて得られた（Ｓ）－３－（４－クロロフェニル）－２－（メチルアミノ）プロパン酸シアノメチルの混合物（０．９６ｇ）をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解し、０℃にてトリエチルアミン（８４０ｍｇ、８．３０ｍｍｏｌ）を加えた後、塩化ペンタ－４－エノイル（４７２ｍｇ、３．９８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）を滴下しながら加えた。反応液を２０℃で２時間撹拌した後、濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、３－（４－クロロフェニル）－２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（Ｓ）－シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（０．９１８ｇ、８３％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３３５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：２．２１分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ５）
３－（４－クロロフェニル）－２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ５７）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000203
　緩衝液Ａ（１１５ｍｌ）に、リン酸二水素　（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（６．２５ｍＬ）、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ５６、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（３７１ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．１ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製、表題化合物（化合物ｎｋ５７）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（２７７ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　１０００　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５８分（分析条件ＳＱＤFＡ０５）
３－（４－クロロフェニル）－２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ５８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000204
　前工程にて得られた３－（４－クロロフェニル）－２－（Ｎ－メチルペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ５７）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物を（２７７ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（４．０ｍＬ）を加えて室温で４時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ５８、Ｐｅｎ－ＭｅＰｈｅ（４－Ｃｌ）－ｐＣｐＡ）（１１９ｍｇ、４６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９２８　（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）－４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000205
　（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－４－（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）（５．００ｇ、１２．４ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８０．０ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で３時間撹拌した。次いで、反応液にジエチルエーテル（５０ｍＬ）を加え、混合物をろ過し、得られた固体をジエチルエーテルおよびヘキサンで洗浄することで、粗生成物である（Ｓ）－２－アミノ－４－（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ―Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）（２．８８ｇ）を得た。
　水（４０ｍＬ）と１，４－ジオキサン（４０ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）－２－アミノ－４－（メチルスルホニル）ブタン酸（Ｈ―Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）（２．８８ｇ）とペンタ－４－エン酸　２，５－ジオキソピロリジン－１－イル　（３．７６ｇ、１９．１ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（２．６８ｇ、３１．９ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で４時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで４回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）－４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）（２．４ｇ、７４％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　２６４　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：１．００分（分析条件ＳＭＤ　ｍｅｔｈｏｄ４）
４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（Ｓ）－シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000206
　窒素雰囲気下、（Ｓ）－４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸（化合物ｎｋ５９、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＨ）（１．８０ｇ、６．８４ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３．００ｇ、２３．２ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３０ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（３．２８ｇ、２７．４ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（Ｓ）－シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．５ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３０３　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６１）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000207
　緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素　（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３００ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）の水溶液（３．６ｍＬ）、４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（Ｓ）－シアノメチル（化合物ｎｋ６０、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ＯＣＨ２ＣＮ）（５０２ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．６ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６１）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（１３６ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９６８．５　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６２、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000208
　前工程にて得られた４－（メチルスルホニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）ブタン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６１）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（７０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（１．０ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６２、Ｐｅｎ－Ｍｅｔ（Ｏ２）－ｐＣｐＡ）（１２．７ｍｇ、７％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　８９８　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．２９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000209
　（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（３－クロロフェニル）プロパン酸（ＦｍｏｃーＰｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（５．００ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）に２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（７６ｍＬ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を濃縮後、得られた残渣にジエチルエーテルを加え、混合物をろ過することで、粗生成物である（Ｓ）－２－アミノ－３－（３－クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ―Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（２．２２ｇ）を得た。
　水（２８ｍＬ）と１，４－ジオキサン（２８ｍＬ）の混合溶媒に、得られた粗生成物である（Ｓ）－２－アミノ－３－（３－クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ―Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（２．２２ｇ）とペンタ－４－エン酸　２，５－ジオキソピロリジン－１－イル　（２．６２ｇ、１３．３ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（１．８６ｇ、２２．１ｍｍｏｌ）を加えた後、反応液を２５℃で１６時間撹拌した。反応液を酢酸エチルで２回洗浄した後、水層を１Ｍの塩酸水溶液でｐＨ２になるまで調整し、ジクロロメタンで３回抽出した。得られた有機層をまとめて、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過、減圧濃縮を行った。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（１．５ｇ、４５％、２工程）を得た。
　窒素雰囲気下、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸（Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（１．５０ｇ、５．３２ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（１．３７ｇ、１０．６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２４ｍｌ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（２．５５ｇ、２１．３ｍｍｏｌ）を加えて２５℃で１６時間攪拌した。反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル）にて精製し、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（０．７６７ｇ、４５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　３２１　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６４）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000210
　緩衝液Ａ（１２０ｍｌ）に、リン酸二水素　（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（２００ｍｇ、０．２７７ｍｍｏｌ）の水溶液（３．０ｍＬ）、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸シアノメチル（化合物ｎｋ６３、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＣＨ２ＣＮ）（３５５ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（３．０ｍｌ）溶液を加え、室温で２時間撹拌した。反応液を凍結乾燥し、得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）にて精製し、表題化合物（化合物ｎｋ６４）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物（７５ｍｇ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９８６　（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７７分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５）
３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６５、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ｐＣｐＡ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000211
　前工程にて得られた３－（３－クロロフェニル）－２－（ペンタ－４－エンアミド）プロパン酸　（２Ｓ）－（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－２－（（ホスホノオキシ）メチル）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ｎｋ６４）とＮ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム　塩化物の混合物を（４０ｍｇ）に８０％酢酸水溶液（０．８０ｍＬ）を加えて室温で６時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液／メタノール）で精製した後、再び逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）で精製することで、表題化合物（化合物ｎｋ６５、Ｐｅｎ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ｐＣｐＡ）（７．５ｍｇ、６％、２工程）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）　ｍ／ｚ　＝　９１４　（Ｍ―Ｈ）―
保持時間：０．４７分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５）
１１－２．アシル化ｔＲＮＡの合成
 特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に記載の手法でパニングに使用するアシル化ｔＲＮＡを調製した。使用したtRNA(CA欠損)の塩基配列を表２３に示した。表２４に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物を調製した。以降、翻訳で使用する際には、表２４示す最終濃度となるよう翻訳液を調製した。Ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡの調製は、ライゲーション反応後、脱保護を実施せずにフェノール抽出以降の作業を行った。表２５に示す三種類を個別に調整し、翻訳で使用する際にもいずれか一つを表に示す最終濃度で翻訳液に添加した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000212
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000213
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000214
１１－３．ペプチドライブラリをコードするランダム化された２本鎖ＤＮＡライブラリ
　特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に記載の手法で、DNAライブラリを構築した。　TTT, TTG, CTA, ATT, GTT, CCG, ACT, GCT, TAC, CAT, CAG, TGG, CGG, AGT, AGG, GGTのいずれかのコドンが9回繰り返しで出現するもの用意した。
１１－４．ビオチン化標的タンパク質の調製
　パニングに使用する標的タンパク質として、大腸菌で発現・精製したＧＴＰａｓｅ　ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）を用いた。非特許文献BMC biotechnology, 2008,8,41、および非特許文献Protein Science,1999,8,921-929の方法を用いてビオチン化タンパクを調製した。
１１－５．パニングに使用する翻訳液
　パニングに使用した翻訳液は以下の組成で構成される。１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，１０ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，２．７３μＭ　ＡｌａＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ　ＩｌｅＲＳ，０．５μＭ　変異体ＰｈｅＲＳ０５（特許文献WO2016/148044），０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ，１μＭ　変異体ＳｅｒＲＳ３７（特許文献WO2016/148044），０．０９μＭ　ＴｈｒＲＳ，０．０１μＭ　ＴｒｐＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ，１μＭ　変異体ＶａｌＲＳ１３（特許文献WO2016/148044），０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．３３μＭ　ＨｉｓＲＳ，３μＭ　in vitro転写大腸菌ｔＲＮＡ　Ａｌａ１Ｂ，３μＭ　精製大腸菌ｔＲＮＡ　Ｈｉｓ　ＱＵＧ（非特許文献Nucleic Acids Res. 2010 Apr;38(6):e89.の手法に習い精製。），２５０μＭグリシン、２５０μＭイソロイシン、２５０μＭプロリン、２５０μＭスレオニン、２５０μＭトリプトファン、２５０μＭリジン、５ｍＭ　Ｎ－メチルバリン、５ｍＭ　Ｎ－メチルセリン、５ｍＭ　Ｎ－メチルアラニン、５ｍＭ　Ｎ－メチルフェニルアラニン、２５０μＭ　３－フルオロチロシン、５ｍＭ　Ｎ－メチルヒスチジン、表２３に示すＥｌｏｎｇａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ混合物。さらにＩｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（表２４）のなかのいずれか一つを加えて調製した。
１１－６．パニングの実施
　前述の二本鎖ＤＮＡライブラリと翻訳液を使用し、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に倣ってパニングを実施した。
１１－７．濃縮配列の解析と標的への結合確認
　パニング後のＤＮＡプールの塩基配列解析を行い、出現頻度の高かった配列について、特許文献（ＷＯ２０１３／１００１３２Ａ１）に倣ってペプチドの固相合成を実施した。標的タンパク質に対する結合能をＢｉａｃｏｒｅで確認した。その結果複数の配列で標的に結合することが示された。
これらの標的に結合する配列は複数のアミノ酸類縁体を含む環状部を有するペプチドであった。以上の結果よりｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ法を用いて、ＧＴＰａｓｅ　ＫＲａｓ（ＫＲＡＳ）に対して結合するアミノ酸類縁体を複数含む環状ペプチドを取得できたことが示された。
　本発明は、アミノ酸類縁体を複数含むドラックライクな環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸の複合体、および当該複合体のディスプレイライブラリーの提供において有用である。本発明を用いて構築されたディスプレイライブラリーを用いれば、従来の手法により得られるディスプレイライブラリーと比較して、高い効率でペプチドを合成することができる。また、本発明を用いて構築されたディスプレイライブラリーは、、従来の手法により得られるディスプレイライブラリーと比較して、より多彩な化合物を含むことが期待される。したがって、本発明の方法を利用することにより、より多彩なドラックライクなヒット化合物を取得する確率がさらに高まる。

Claims (24)

  1. 　２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又は当該複合体を含むライブラリーの製造方法であって、
    　第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
    （式中、
    　Ｒ１は、翻訳合成が可能なチオール基の保護基であり；
    　Ｒ２、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基、またはシクロアルキル基であり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２とＲ３は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２またはＲ３は、Ｒ４およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されず；
    　Ｒ４は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく； 
    　Ｒ１１、およびＲ１２は、それぞれ独立して、単結合、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アルキレンアリーレン、アルキレンヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよく；
    　ＳＰ－１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成するか、
    以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
    （式中のＰ１は、単結合、アリーレン、またはヘテロアリーレンである）で表されるか、または以下の式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
    （式中のＰ２は、アルキル、アリール、またはヘテロアリールである）で表される、アミノ基の保護基である）
    で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成されるペプチド、または当該ペプチドと当該核酸との複合体において、第一の反応点と第二の反応点とを反応させて、アミド結合を形成させる工程を含む、方法。
  2. 　Ｒ１が、Ｓ－Ｒ２３（ここで、Ｒ２３はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、またはアラルキルであり、これらの基は置換されていてもよい）、スルホネート（－ＳＯ３ －）、およびチオスルホネート（－Ｓ２Ｏ３ －）からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
  3. 　Ｒ２３が、メチル、エチル、イソプロピル、ｔｅｒｔ―ブチル、フェニル、ｐ－トリフルオロメチルフェニル、ｐ－フルオロフェニル、ベンジル、またはフェネチルであり、これらの基は置換されていてもよい、請求項２に記載の方法。
  4. 　Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲンで置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル、またはＣ１－Ｃ４アルコキシである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　Ｒ４が、以下：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
    （式中、Ｒ１３～Ｒ１８は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　Ｒ１３～Ｒ１８が、それぞれ独立して、水素原子またはメチルである、請求項５に記載の方法。
  7. 　Ｒ１１およびＲ１２がそれぞれ独立して、単結合であるか、または以下：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
    （ここでＲ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　Ｒ１３'～Ｒ１８'が、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基である、請求項７に記載の方法。
  9. 　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
    （式中、
    　Ｒ１～Ｒ４およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１～Ｒ４およびＳＰ－１と同意義を表し、
    　Ｒ１３'～Ｒ１６'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'～Ｒ１６'と同意義を表す。）
    のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
    　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
    （式中、
    　Ｒ１、Ｒ４およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１、Ｒ４およびＳＰ－１と同意義を表し、
    　Ｒ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'～Ｒ１８'と同意義を表す。）
    のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 　一般式（Ｉ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
    （式中、
    　Ｒ１～Ｒ３およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１～Ｒ３およびＳＰ－１と同意義を表し；
    　Ｒ１３～Ｒ１６は、それぞれ請求項５に記載のＲ１３～１６と同意義を表し；
    　Ｒ１３'～Ｒ１６'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'～Ｒ１６'と同意義を表し；あるいはＲ２は、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５またはＲ１６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し、但しＲ２が、これが結合するＮ原子およびＳＰ－１と一緒になってアジド基（－Ｎ３）を形成する場合、上記の定義はＲ２に対して適用されない）
    のいずれかで表されるアミノ酸残基であるか、または、
    　一般式（ＩＩ）で表されるアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
    （式中、
    　Ｒ１およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１に記載のＲ１およびＳＰ－１と同意義を表し；
    　Ｒ１３～Ｒ１８は、それぞれ請求項５に記載のＲ１３～Ｒ１８と同意義を表し；
    　Ｒ１３'～Ｒ１８'は、それぞれ請求項７に記載のＲ１３'～Ｒ１８'と同意義を表す。）
    のいずれかで表されるアミノ酸残基である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 　ＳＰ－１が、４－アジドベンジルオキシカルボニル（ｐ－Ａｃｂｚ）、２－アジドベンジルオキシカルボニル（ｏ－Ａｃｂｚ）、アジドメトキシカルボニル（Ａｚｏｃ）、フェニルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｈｄｅｃ）、２－ピリジルジスルファニルエチルオキシカルボニル（Ｐｙｄｅｃ）、もしくは２－（ｔ－ブチルジスルファニル）エチルオキシカルボニル（Ｔｂｅｏｃ）であるか、またはＳＰ－１は、これが結合するＮ原子およびＲ２と一緒になってアジド基を形成する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000010
    （式中、
    　Ｒ２"、Ｒ３"は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、またはシクロアルキルであり、これらの基は置換されていてもよく、あるいはＲ２"とＲ３"は、それらが結合する原子と一緒になって環を形成し；あるいはＲ２"またはＲ３"は、Ｒ２６およびそれらが結合する原子と一緒になって環を形成し；
    　Ｒ２５は水酸基であるか、またはそれが結合するＣＯと共に活性エステルを形成し；
    　Ｒ２６は、アルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アリーレンアルキレン、またはヘテロアリーレンアルキレンであり、これらの基は置換されていてもよい）
    で表される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 　Ｒ２６が、以下： 
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000011
    （式中、Ｒ１３"～Ｒ１８"は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいアルキル、または置換されてもよいアルコキシである）からなる群より選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
    （式中、
    　Ｒ２"は、請求項１２に記載のＲ２"と同意義を表し；
    　Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル基であり；
    　Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
    で表される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 　側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基が、以下の一般式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000013
    （式中、
    　Ｒ２"は、請求項１２に記載のＲ２"と同意義を表し；
    　Ｒ３"は、水素原子、または置換されてもよいＣ１－Ｃ４アルキル基であり；
    　Ｒ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、置換されてもよいＣ１－Ｃ６アルキル基、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルケニル基、置換されてもよいＣ２－Ｃ６アルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいアラルキル基、または置換されてもよいシクロアルキル基であり；
    　Ｒ２７は、水素原子、置換されてもよいアルキル基、置換されてもよいアルケニル基、置換されてもよいアルキニル基、置換されてもよいアリール基、置換されてもよいヘテロアリール基、置換されてもよいシクロアルキル基、置換されてもよいアラルキル基の中から選択される）
    で表される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 　環状部に存在する－ＳＨ基を脱硫する工程をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 　環状部を有するペプチドと核酸との複合体が、ペプチドと核酸との間にリンカーを有する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 　ペプチドが、メチオニン、メチオニルｔＲＮＡ合成酵素（ＭｅｔＲＳ）、メチオニン用翻訳開始ｔＲＮＡ、フォルミルドナー、メチオニルｔＲＮＡトランスフェラーゼの少なくとも１つを含まない無細胞翻訳系において翻訳して合成される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 下記一般式（ＩＡ）または下記一般式（ＩＩＡ）で表される化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000014
    （式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）。
  20. 　下記一般式（ＩＢ）または下記一般式（ＩＩＢ）で表される化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000015
    （式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表し、Ｒ３０はＨまたは水酸基を表す）。
  21. 　請求項１９記載の化合物とｔＲＮＡが結合してなるアミノアシルｔＲＮＡ。
  22. 　第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）で表される、アミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチド、または当該ペプチドと核酸との複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000016
    （式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）。
  23. 　非環状ペプチドが、第一の反応点を有する下記一般式（Ｉ）または下記一般式（ＩＩ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-I000017
    （式中、Ｒ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１は、それぞれ請求項１のＲ１～Ｒ４、Ｒ１１、Ｒ１２、およびＳＰ－１と同意義を表す）で表されるアミノ酸残基をＮ末端に有し、かつその側鎖の１つに第二の反応点を有するアミノ酸残基をＮ末端から少なくとも４残基Ｃ末端側に有する非環状ペプチドをコードする核酸から翻訳して合成する工程を含む方法によって得られる、請求項２２記載のペプチド又は複合体。
  24. 　請求項２２もしくは２３記載のペプチド又は複合体を用いて、２以上のアミノ酸類縁体残基を含みかつ環状部を有するペプチド、当該ペプチドと核酸との複合体又はそのライブラリーを製造する方法。
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