JP2007319064A - 修飾化アミノ酸を部位特異的に導入したタンパク質を発現させる方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】光照射により脱離可能なブロモクマリンを有する保護基を付加した修飾化アミノ酸を含むアミノアシルtRNA。
【選択図】なし
Description
[1] 光照射により脱離可能なブロモクマリンを有する保護基を付加した修飾化アミノ酸を含むアミノアシル化tRNA。
[2] 修飾化アミノ酸の修飾が翻訳後修飾により生じるものである、[1]のアミノアシル化tRNA。
[3] 修飾化アミノ酸がリン酸化アミノ酸またはメチル化アミノ酸である、[1]のアミノアシル化tRNA。
[4] 修飾化アミノ酸がリン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化スレオニンおよびメチル化リジンからなる群から選択される、[1]〜[3]のいずれかのアミノアシル化tRNA。
[5] [1]〜[4]のいずれかの保護基付加修飾化アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを用いて、該アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することを含む保護基付加修飾化タンパク質を合成する方法。
[6] 保護基付加修飾化アミノ酸のタンパク質への導入が、4塩基コドン法、終止コドン法および人工コドン法よりなる群から選択される方法により行われる、[5]の保護基付加修飾化タンパク質を合成する方法。
[7] [5]または[6]の方法により合成された保護基付加修飾化タンパク質。
[8] [1]〜[4]のいずれかの保護基付加修飾化アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを用いて、該アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入し、その後光照射により保護基を脱離させることを含む、修飾化タンパク質を合成する方法。
[9] 保護基付加修飾化アミノ酸のタンパク質への導入が、4塩基コドン法、終止コドン法および人工コドン法よりなる群から選択される方法により行われる、[8]の修飾化タンパク質を合成する方法。
[10] [8]または[9]の方法により合成された修飾化タンパク質。
リン酸化チロシン(pTyr、シグマ社製)のDMSO溶液(91.2μmol)に、Bmc-diazo 42μmolを加え、室温で46時間反応させた。HPLCにより反応の進行を確認した後、メタノール2mL、水2mLを加えた。撹拌し、15000rpmで5分間遠心し、上清を回収し、遠心濃縮機により溶媒を除去した。逆相HPLC(カラム:ウォーターズ社製XterraC18 4.6mm×20mm、溶離液:0.38%ギ酸とメタノールのリニアグラジエント(0〜100%/10min)、流速:1.5mL/min、検出:260nmの吸光度)により目的物を含むフラクションを回収し、遠心濃縮機により溶媒を除去しBmc-pTyrを得た。
5×Ligation Buffer(275mM Hepes-Na pH7.5, 75mM MgCl2, 16.5mM DTT, 5mM ATP) 4μL、200μM tRNA(-CA)(配列番号1)2.5μL、Bmc-pTyr-pdCpAのDMSO溶液 2μL、0.1% BSA 0.4μL、T4 RNA Ligase (25 units/μL) 1.2μL、水 9.9μLを混合し、4℃で2時間反応させた。3M AcOK pH4.5を10μL、水70μLを加え、等量のフェノール/クロロホルム=1/1(0.3M AcOK pH4.5で飽和させたもの)を加え撹拌し、遠心した。上層を回収し、等量のクロロホルムを加え、撹拌、遠心した。上層を回収し、エタノール300μLを加え、軽く混合し、-20℃で1時間置いた。15000rpm 30min 4℃で遠心した後、上清を除き、-20℃で保存してある70%エタノール200μLを加え、15000rpm 4℃で5秒遠心した。上清を除き、減圧乾燥した。1mM 酢酸カリウムpH4.5 2μLに溶解させた。
反応液(10μL)に、55 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 210 mM グルタミン酸カリウム, 6.9 mM 酢酸アンモニウム, 1.7 mM ジチオスレイトール, 1.2 mM ATP, 0.28 mM GTP, 26 mMホスホエノールピルビン酸, 1 mMスペルミジン, 1.9 % ポリエチレングリコール-8000, 35 μg/mL 葉酸, 12 mM 酢酸マグネシウム, 0.1 mM 20種類のアミノ酸、ストレプトアビジンmRNA(N末端領域にCGGGが挿入されたもの(配列番号2))8μg/μLを1μL、大腸菌抽出液(Promega社製)を2μL、Bmc-pTyr-tRNA溶液を1μL混合した。37℃で1時間翻訳反応を行なった。翻訳反応液1μLに、水9μLと2×サンプルバッファー10μLを加え、95℃5分間加熱した。このうちの5μLを15%SDS-PAGEに流し、終了後、抗T7tag抗体(Novagen社製)を用いたウエスタンブロット分析を行なった(図6)。Bmc-pTyr-tRNAを加えて翻訳反応を行なった場合、ウエスタンブロット分析において野生型ストレプトアビジンと同じ位置にバンドが見られることから、Bmc-pTyrがストレプトアビジンへ導入されたことが確認された。
Bmc-pTyrを導入したストレプトアビジンを含む翻訳反応液1μLにUVクロスリンカー(UVP社製)を用いて光照射(365nm、3分間)した後、水9μLと2×サンプルバッファー10μLを加え、95℃5分間加熱した。このうちの5μLを15%SDS-PAGEに流し、終了後、抗リン酸化チロシン抗体を用いたウエスタンブロット分析を行なった(図7)。光照射を行なった場合は明確なバンドが確認された。一方、光照射を行わなかった場合はバンドが見られなかった。これは光照射により導入されたBmc-pTyrのBmc基が脱離してpTyr残基が生成したために、抗リン酸化抗体と結合できるようになったためであると言える。
Claims (10)
- 光照射により脱離可能なブロモクマリンを有する保護基を付加した修飾化アミノ酸を含むアミノアシル化tRNA。
- 修飾化アミノ酸の修飾が翻訳後修飾により生じるものである、請求項1記載のアミノアシル化tRNA。
- 修飾化アミノ酸がリン酸化アミノ酸またはメチル化アミノ酸である、請求項1記載のアミノアシル化tRNA。
- 修飾化アミノ酸がリン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化スレオニンおよびメチル化リジンからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアミノアシル化tRNA。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の保護基付加修飾化アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを用いて、該アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入することを含む保護基付加修飾化タンパク質を合成する方法。
- 保護基付加修飾化アミノ酸のタンパク質への導入が、4塩基コドン法、終止コドン法および人工コドン法よりなる群から選択される方法により行われる、請求項5記載の保護基付加修飾化タンパク質を合成する方法。
- 請求項5または6に記載の方法により合成された保護基付加修飾化タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の保護基付加修飾化アミノ酸でアミノアシル化されたtRNAを用いて、該アミノ酸をタンパク質の特定部位へ導入し、その後光照射により保護基を脱離させることを含む、修飾化タンパク質を合成する方法。
- 保護基付加修飾化アミノ酸のタンパク質への導入が、4塩基コドン法、終止コドン法および人工コドン法よりなる群から選択される方法により行われる、請求項8記載の修飾化タンパク質を合成する方法。
- 請求項8または9に記載の方法により合成された修飾化タンパク質。
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Cited By (7)
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---|---|---|---|---|
WO2015019999A1 (ja) * | 2013-08-05 | 2015-02-12 | 国立大学法人東京大学 | 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法 |
WO2018143145A1 (ja) * | 2017-01-31 | 2018-08-09 | 中外製薬株式会社 | 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法 |
US10815489B2 (en) | 2015-03-13 | 2020-10-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified aminoacyl-tRNA synthetase and use thereof |
US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11732002B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Deprotection method and resin removal method in solid-phase reaction for peptide compound or amide compound, and method for producing peptide compound |
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Cited By (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11891457B2 (en) | 2011-12-28 | 2024-02-06 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Peptide-compound cyclization method |
JPWO2015019999A1 (ja) * | 2013-08-05 | 2017-03-02 | 国立大学法人 東京大学 | 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法 |
EP3031915A4 (en) * | 2013-08-05 | 2017-04-19 | The University of Tokyo | Production method for charged non-protein amino acid-containing peptide |
WO2015019999A1 (ja) * | 2013-08-05 | 2015-02-12 | 国立大学法人東京大学 | 荷電性非タンパク質性アミノ酸含有ペプチドの製造方法 |
US10745692B2 (en) | 2013-08-05 | 2020-08-18 | The University Of Tokyo | Production method for charged non-protein amino acid-containing peptide |
US10815489B2 (en) | 2015-03-13 | 2020-10-27 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Modified aminoacyl-tRNA synthetase and use thereof |
WO2018143145A1 (ja) * | 2017-01-31 | 2018-08-09 | 中外製薬株式会社 | 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法 |
JP7187323B2 (ja) | 2017-01-31 | 2022-12-12 | 中外製薬株式会社 | 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法 |
JPWO2018143145A1 (ja) * | 2017-01-31 | 2019-11-21 | 中外製薬株式会社 | 無細胞翻訳系におけるペプチドの合成方法 |
US11542299B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-01-03 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11787836B2 (en) | 2017-06-09 | 2023-10-17 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for synthesizing peptide containing N-substituted amino acid |
US11492369B2 (en) | 2017-12-15 | 2022-11-08 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for producing peptide, and method for processing bases |
US11732002B2 (en) | 2018-11-30 | 2023-08-22 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Deprotection method and resin removal method in solid-phase reaction for peptide compound or amide compound, and method for producing peptide compound |
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