JP2023182649A - コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ - Google Patents

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Abstract

【課題】ＮＮＡおよびＮＮＧのコドンの読み分けを可能とする新たな手段を提供する。【解決手段】本開示は、アンチコドンの１文字目がライシジンまたはアグマチジンに置換された変異ｔＲＮＡ、および当該変異ｔＲＮＡを含む翻訳系に関する。特定の態様において、本開示は、ＮＮＡのコドンを選択的に翻訳することが可能な変異ｔＲＮＡを提供する。別の態様において、本開示は、一つのコドンボックスから２種類または３種類のアミノ酸を翻訳することが可能な翻訳系を提供する。別の態様において、本開示は、ライシジン二リン酸、アグマチジン二リン酸およびこれらの誘導体の新規な合成方法を提供する。【選択図】なし

Description

本開示は、ｔＲＮＡおよび翻訳系、ならびにその使用方法に関する。
ディスプレイライブラリーは、標的タンパク質に結合する分子を進化工学的に効率よく取得できる、大変有用な技術である。ディスプレイライブラリーを用いて、任意の標的分子に対し高結合能を示す分子を取得したり、あるいは複数のエピトープに対してそれぞれ結合する分子を多種類取得したりするためには、高い多様性をもつライブラリーからのパニングが必要である。多様性の高いライブラリーを構築するためには、その構成単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）の数を増やす、あるいは種類を増やすことが考えられるが、膜透過性の観点から分子量に制限がある場合、ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋの数にも制限がかかる。よって、ライブラリーの多様性を高めるためにｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋの種類を増やすという手段は重要な意味を持つ。
ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（非特許文献１）のような再構成された無細胞翻訳系は、アミノ酸、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ； ＡＲＳ）等の構成成分の濃度調整が可能であるため、天然のコドン－アミノ酸の対応付けを変更できる。このような翻訳系を用いることにより、任意のｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋを２０種類以上導入したディスプレイライブラリーを構築することも可能となっているが、３塩基コドンを用いた大腸菌の翻訳系においては、ウォブル（ｗｏｂｂｌｅ）則の存在により、原理上は３２種類が導入できるｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋの上限であると考えられる。より具体的に説明すると、コドンの３文字目とアンチコドンの１文字目の対合には、“遊び”が存在し、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対以外にも、ｗｏｂｂｌｅ塩基対と呼ばれるＧ・Ｕ間の対合が可能となっている。そのため、アンチコドンＧＮＮはＮＮＵおよびＮＮＣのコドンを、アンチコドンＵＮＮはＮＮＡおよびＮＮＧのコドンを解読（ｄｅｃｏｄｅ）してしまうため、これらのコドンを読み分けることができず、１つのコドンボックスに導入できるアミノ酸の種類は最大２アミノ酸に制限されてしまう（非特許文献２）。
一方、自然界では、ＡＵＡおよびＡＵＧのコドンの読み分けを可能にする手段が存在する。大腸菌のｔＲＮＡ Ｉｌｅ２の３４位（アンチコドン１文字目）に導入されているライシジン（Ｌｙｓｉｄｉｎｅ）修飾がその一例であり、この修飾によりｔＲＮＡ Ｉｌｅ２はＡＵＡコドンのみを解読し、ＡＵＧコドンは解読しないことが分かっている（非特許文献３）。この修飾は、イソロイシンｔＲＮＡ－ライシジン合成酵素（ｔＲＮＡＩｌｅ－ｌｙｓｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉｌＳ）によって導入されるが（非特許文献４）、その基質となるｔＲＮＡはｔＲＮＡ Ｉｌｅ２に限定されるため、それ以外のｔＲＮＡにライシジンを導入することは容易ではない（非特許文献５）。
Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１ Ａｕｇ；１９（８）：７５１－７５５． Ｉｗａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ．，２０１６ Ａｐｒ；８（４）：３１７－３２５． Ｇｒｏｓｊｅａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．，２００４ Ａｐｒ；２９（４）：１６５－１６８． Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２０１０ Ｊａｎ ２１；５８４（２）：２７２－２７７． Ｌａｊｏｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２０１６ Ｆｅｂ ２７；４２８（５ Ｐｔ Ｂ）：１００４－１０２１．
上述の通り、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２では３４位（アンチコドン１文字目）にライシジンが導入されることによって、ＡＵＡおよびＡＵＧのコドンが読み分けられているが、天然において、それ以外のｔＲＮＡにライシジン修飾が行われている例は見出されていない。また、何らかの人工的な手段によって、ＮＮＡおよびＮＮＧのコドンが読み分けられた例も報告されていない。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、ＮＮＡおよびＮＮＧのコドンの読み分けを可能とする新たな手段を提供することを本開示の目的の一つとする。
今回本発明者らは、化学合成したｔＲＮＡ断片とライシジン（別名２－リシルシチジン）を酵素反応により連結させることで、３４位にライシジンが導入され、なおかつ３５位および３６位（アンチコドン２文字目および３文字目）に様々な配列を有するｔＲＮＡを調製した。それらのｔＲＮＡを含む翻訳系を再構成して、アミノ酸の翻訳を行ったところ、いずれの翻訳系においてもＮＮＡおよびＮＮＧコドンの読み分けが可能であることが見出された。また、これらの検討過程において、ＵＮＮのアンチコドンを有するｔＲＮＡは、ＮＮＡやＮＮＧのコドンだけでなくＮＮＵのコドンも解読してしまうことが見出されたが、ライシジン導入ｔＲＮＡの使用により、このＮＮＵコドンのミスリードも大幅に低減された。
本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１〕ｔＲＮＡを改変することにより作製されている変異ｔＲＮＡであって、当該改変が、Ｎ１Ｎ２Ｎ３で表されるアンチコドンの改変後の１文字目のヌクレオシドＮ１がライシジン（ｋ２Ｃ）、ライシジン誘導体、アグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）、またはアグマチジン誘導体のいずれかである改変を含み、Ｎ２およびＮ３はそれぞれ、該アンチコドンの２文字目および３文字目の任意のヌクレオシドである、変異ｔＲＮＡ。
〔２〕改変前のＮ１がシチジン（Ｃ）であって、かつ当該シチジン（Ｃ）からライシジン（ｋ２Ｃ）への改変が、配列番号：５１のアミノ酸配列を有するライシジン合成酵素（ｔＲＮＡＩｌｅ－ｌｙｓｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉｌＳ）では触媒され得ない、〔１〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３〕改変前のＮ１がシチジン（Ｃ）であって、かつ当該シチジン（Ｃ）からアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）への改変が、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するアグマチジン合成酵素（ｔＲＮＡＩｌｅ－ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉａＳ）では触媒され得ない、〔１〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔４〕Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドン（ここで、Ｍ１およびＭ２はそれぞれコドンの１文字目および２文字目のヌクレオシドを表し、Ｍ１およびＭ２はそれぞれアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれかから選択され、３文字目のヌクレオシドはアデノシンである）に相補的なアンチコドンを有する、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔５〕アンチコドンがｋ２ＣＮ２Ｎ３またはａｇｍ２ＣＮ２Ｎ３（ここで、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドはライシジン（ｋ２Ｃ）またはアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）であり、２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）、３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）はそれぞれＭ２、Ｍ１に相補的である）で表される、〔４〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔６〕Ｎ２およびＮ３がそれぞれアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれかから選択される、〔５〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔７〕ｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡまたは伸長ｔＲＮＡである、〔１〕から〔６〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔８〕ｔＲＮＡが原核または真核生物由来のｔＲＮＡである、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔９〕天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＡであるコドンとＧであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１０〕天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＵであるコドンとＡであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１１〕天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＵであるコドン、Ｃであるコドン、Ａであるコドン、およびＧであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１２〕天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＡであるコドンとＧであるコドンが互いに異なるアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１３〕天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＡであるコドンおよび／またはＧであるコドンが終止コドンであるコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１４〕Ｍ１がウリジン（Ｕ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１５〕Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１６〕Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１７〕Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がグアノシン（Ｇ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１８〕Ｍ１がアデノシン（Ａ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔１９〕Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２０〕Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２１〕Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がグアノシン（Ｇ）である、〔４〕から〔８〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２２〕Ｎ２がグアノシン（Ｇ）であり、Ｎ３がアデノシン（Ａ）である、〔１４〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２３〕Ｎ２がアデノシン（Ａ）であり、Ｎ３がグアノシン（Ｇ）である、〔１５〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２４〕Ｎ２がグアノシン（Ｇ）であり、Ｎ３がグアノシン（Ｇ）である、〔１６〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２５〕Ｎ２がシチジン（Ｃ）であり、Ｎ３がグアノシン（Ｇ）である、〔１７〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２６〕Ｎ２がアデノシン（Ａ）であり、Ｎ３がウリジン（Ｕ）である、〔１８〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２７〕Ｎ２がアデノシン（Ａ）であり、Ｎ３がシチジン（Ｃ）である、〔１９〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２８〕Ｎ２がグアノシン（Ｇ）であり、Ｎ３がシチジン（Ｃ）である、〔２０〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔２９〕Ｎ２がシチジン（Ｃ）であり、Ｎ３がシチジン（Ｃ）である、〔２１〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３０〕３’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、〔１〕から〔２９〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３１〕アミノ酸が、天然アミノ酸または非天然アミノ酸である、〔３０〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３２〕天然アミノ酸が、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）からなる群より選択される、〔３１〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３３〕天然アミノ酸が、グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、プロリン（Ｐｒｏ）からなる群より選択される、〔３２〕に記載の変異ｔＲＮＡ。
〔３４〕複数の異なる種類のｔＲＮＡを含む翻訳系であって、〔１〕から〔３３〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
〔３５〕変異ｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつＭ１Ｍ２Ａで表されるコドンが、前記変異ｔＲＮＡとは異なるｔＲＮＡと比較して、前記変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る、〔３４〕に記載の翻訳系。
〔３６〕（ａ）〔１〕から〔３３〕のいずれかに記載の変異ｔＲＮＡ、および（ｂ）Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡを含む、〔３４〕または〔３５〕に記載の翻訳系。
〔３７〕〔３６〕（ｂ）に記載のｔＲＮＡのアンチコドンがＣＮ２Ｎ３、ａｃ４ＣＮ２Ｎ３、またはＣｍＮ２Ｎ３（ここで、ａｃ４ＣはＮ４－アセチルシチジン、Ｃｍは２’－Ｏ－メチルシチジンを表す）である、〔３６〕に記載の翻訳系。
〔３８〕〔３６〕（ｂ）に記載のｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつＭ１Ｍ２Ｇで表されるコドンが、〔３６〕（ｂ）に記載のｔＲＮＡとは異なるｔＲＮＡと比較して、〔３６〕（ｂ）に記載のｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る、〔３６〕または〔３７〕に記載の翻訳系。
〔３９〕〔３６〕（ａ）および〔３６〕（ｂ）に記載のｔＲＮＡに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体が互いに異なる、〔３６〕から〔３８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４０〕Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇのコドンから、２種類のアミノ酸が翻訳可能である、〔３９〕に記載の翻訳系。
〔４１〕Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇのコドンが、互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、〔３９〕に記載の翻訳系。
〔４２〕さらに、（ｃ）Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡを含む、〔３４〕から〔４１〕に記載の翻訳系。
〔４３〕〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡのアンチコドンがＡＮ２Ｎ３、ＧＮ２Ｎ３、ＱＮ２Ｎ３、およびＧｌｕＱＮ２Ｎ３（ここでＱはキューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）、ＧｌｕＱはグルタミルキューオシン（ｇｌｕｔａｍｙｌ－ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）を表す）からなる群より選択される、〔４２〕に記載の翻訳系。
〔４４〕〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンとは異なるコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンを選択的に翻訳することが可能であり、かつＭ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンが、〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡとは異なるｔＲＮＡと比較して、〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る、〔４２〕または〔４３〕に記載の翻訳系。
〔４５〕〔３６〕（ａ）、〔３６〕（ｂ）、および〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体がいずれも互いに異なる、〔４２〕から〔４４〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４６〕Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、Ｍ１Ｍ２Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇによって構成されるコドンボックスから、３種類のアミノ酸が翻訳可能である、〔４５〕に記載の翻訳系。
〔４７〕Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、Ｍ１Ｍ２Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇによって構成されるコドンボックスにおいて、
（ｉ）Ｍ１Ｍ２Ａ、Ｍ１Ｍ２ＧおよびＭ１Ｍ２Ｕが互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、または
（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２Ａ、Ｍ１Ｍ２ＧおよびＭ１Ｍ２Ｃが互いに異なるアミノ酸またはアミノ酸類縁体をコードし得る、
〔４５〕に記載の翻訳系。
〔４８〕〔３６〕（ａ）、〔３６〕（ｂ）、および〔４２〕（ｃ）に記載のｔＲＮＡのうち、少なくとも一つに非天然アミノ酸が結合している、〔４５〕から〔４７〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔４９〕２０種類より多くのアミノ酸を翻訳可能である、〔３４〕から〔４８〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔５０〕無細胞翻訳系である、〔３４〕から〔４９〕のいずれかに記載の翻訳系。
〔５１〕再構成型の無細胞翻訳系である、〔５０〕に記載の翻訳系。
〔５２〕大腸菌由来のリボソームを含む、〔５０〕または〔５１〕に記載の翻訳系。
〔５３〕〔３４〕から〔５２〕のいずれかに記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔５４〕ペプチドが環状部を有するペプチドである、〔５３〕に記載の方法。
〔５５〕〔５３〕または〔５４〕に記載の方法により製造されたペプチド。
〔５６〕〔３４〕から〔５２〕のいずれかに記載の翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む、ペプチドライブラリーの製造方法。
〔５７〕〔５６〕に記載の方法により製造されたペプチドライブラリー。
〔５８〕〔５７〕に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む、当該標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法。
〔５９〕ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、前記ペプチドをコードする核酸は以下の（Ａ）または（Ｂ）のいずれかに記載の３種類のコドンを含み：
（Ａ）Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇ；
（Ｂ）Ｍ１Ｍ２Ｃ、Ｍ１Ｍ２Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇ、
前記ペプチド上において、前記３種類のコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも異なる、前記核酸－ペプチド複合体。
〔６０〕〔５９〕に記載の核酸－ペプチド複合体を含むライブラリー。
〔６１〕以下の化合物またはその塩。
Figure 2023182649000001
〔６２〕〔６１〕に記載の化合物とｔＲＮＡを構成する核酸断片とを酵素反応によって連結する工程を含む、ライシジンをｔＲＮＡナンバリング則の３４位に有する変異ｔＲＮＡの製造方法。
〔６３〕〔６１〕に記載の化合物、ｔＲＮＡを構成する１または複数の核酸断片、およびアミノ酸またはアミノ酸類縁体とを酵素反応によって連結する工程を含む、ライシジンをｔＲＮＡナンバリング則の３４位に有する変異ｔＲＮＡであって、３’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異ｔＲＮＡの製造方法。
〔６４〕以下の化合物またはその塩。
Figure 2023182649000002
〔６５〕〔６４〕に記載の化合物とｔＲＮＡを構成する核酸断片とを酵素反応によって連結する工程を含む、アグマチジンをｔＲＮＡナンバリング則の３４位に有する変異ｔＲＮＡの製造方法。
〔６６〕〔６４〕に記載の化合物、ｔＲＮＡを構成する１または複数の核酸断片、およびアミノ酸またはアミノ酸類縁体とを酵素反応によって連結する工程を含む、アグマチジンをｔＲＮＡナンバリング則の３４位に有する変異ｔＲＮＡであって、３’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異ｔＲＮＡの製造方法。
〔６７〕アミノ酸がメチオニン（Ｍｅｔ）およびイソロシン（Ｉｌｅ）以外のアミノ酸である、〔６３〕または〔６６〕に記載の方法。
〔６８〕〔６２〕または〔６５〕に記載の方法により製造される、変異ｔＲＮＡ。
〔６９〕〔６３〕、〔６６〕、または〔６７〕に記載の方法により製造される、３’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異ｔＲＮＡ。
〔７０〕〔６８〕および／または〔６９〕に記載の変異ｔＲＮＡを含む、翻訳系。
〔７１〕〔７０〕に記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
〔７２〕以下の工程を含む、下記式Ａ：
Figure 2023182649000003
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｌは、ヒドロキシおよびＣ１－Ｃ３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよく、
Ｍは、単結合、
Figure 2023182649000004
であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。）
で表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法：
下記式Ｂ１：
Figure 2023182649000005
（式中、ＰＧ１１は、アミノ基の保護基である。）
で表される化合物を分子内で環化して、下記式Ｃ１：
Figure 2023182649000006
（式中、ＰＧ１１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｃ１で表される化合物に、下記式Ｄ１：
Figure 2023182649000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、およびＭは上記と同じである。）
で表されるアミンまたはその塩を導入して、下記式Ｅ１：
Figure 2023182649000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ１１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｅ１で表される化合物にＰＧ１２および／またはＰＧ１３を導入して、下記式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂ：
Figure 2023182649000009
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ１２は、アミノ基の保護基であり、
ＰＧ１３は、カルボキシル基またはイミノ基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ１１は上記と同じであり、
但し、Ｍが単結合である場合、ＰＧ１３は存在しない。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｆ１ＡまたはＦ１Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ１４およびＰＧ１５を導入して、下記式Ｇ１ＡまたはＧ１Ｂ：
Figure 2023182649000010
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ１４は、水酸基の保護基であり、
ＰＧ１５は、水酸基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ１１、ＰＧ１２、およびＰＧ１３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｇ１ＡまたはＧ１Ｂで表される化合物にＰＧ１６を導入して、下記式Ｈ１ＡまたはＨ１Ｂ
Figure 2023182649000011
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ１６は、水酸基および／またはアミノ基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、ＰＧ１４、およびＰＧ１５は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｈ１ＡまたはＨ１Ｂで表される化合物からＰＧ１４およびＰＧ１５を除去して、下記式Ｉ１Ａまたは式Ｉ１Ｂ：
Figure 2023182649000012
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、およびＰＧ１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｉ１ＡまたはＩ１Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、下記式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂ：
Figure 2023182649000013
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ１７は、水酸基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、およびＰＧ１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｊ１Ａで表される化合物からＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、およびＰＧ１７を除去して、あるいは式Ｊ１Ｂで表される化合物からＰＧ１１、ＰＧ１３、およびＰＧ１７を除去して、下記式Ｋ１：
Figure 2023182649000014
（式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ１６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、および
式Ｋ１で表される化合物からＰＧ１６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程。
〔７３〕式Ａで表される化合物が、ライシジン二リン酸：
Figure 2023182649000015
またはアグマチジン二リン酸：
Figure 2023182649000016
である、〔７２〕記載の方法。
〔７４〕ＰＧ１１が、ｐ－ブロモベンゾイル、置換されていてもよいベンゾイル、ピリジンカルボニル、またはアセチルである、〔７２〕記載の方法。
〔７５〕ＰＧ１２が、Ｆｍｏｃである、〔７２〕記載の方法。
〔７６〕ＰＧ１３が、Ｍが
Figure 2023182649000017
の場合にはメチル、エチル、または置換されていてもよいベンジルであり、Ｍが
Figure 2023182649000018
の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚまたは置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルである、〔７２〕記載の方法。
〔７７〕ＰＧ１４およびＰＧ１５は一緒になって、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する、〔７２〕記載の方法。
〔７８〕ＰＧ１６が、ＴＯＭである、〔７２〕記載の方法。
〔７９〕ＰＧ１７が、シアノエチルである、〔７２〕記載の方法。
〔８０〕分子内環化がアゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンの存在下で行われる、〔７２〕記載の方法。
〔８１〕式Ｄ１で表されるアミンまたはその塩の導入が塩化リチウムおよびＤＢＵの存在下で行われる、〔７２〕記載の方法。
〔８２〕ＰＧ１２がＦｍｏｃであり、ＰＧ１２の導入に用いられる試薬が、炭酸（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルおよび炭酸ナトリウムである、〔７２〕記載の方法。
〔８３〕ＰＧ１３がメチルであり、ＰＧ１３の導入に用いられる試薬が、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、メタノール、およびＮ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジンである、〔７２〕記載の方法。
〔８４〕アセトニドの除去に用いられる試薬が、ＴＦＡである、〔７２〕記載の方法。
〔８５〕ＰＧ１４およびＰＧ１５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成し、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルの導入に用いられる試薬が、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルである、〔７２〕記載の方法。
〔８６〕ＰＧ１６がＴＯＭであり、ＰＧ１６の導入に用いられる試薬が、ＤＩＰＥＡ、および塩化（トリイソプロピルシロキシ）メチルである、〔７２〕記載の方法。
〔８７〕ＰＧ１４およびＰＧ１５の除去に用いられる試薬が、フッ化水素ピリジンコンプレックスである、〔７２〕記載の方法。
〔８８〕亜リン酸エステル化に用いられる試薬が、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミジットである、〔７２〕記載の方法。
〔８９〕酸化に用いられる試薬が、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドである、〔７２〕記載の方法。
〔９０〕ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、およびＰＧ１７の除去に用いられる試薬が、ビス－（トリメチルシリル）アセトアミドおよびＤＢＵである、〔７２〕記載の方法。
〔９１〕ＰＧ１６の除去に用いられる試薬が、フッ化アンモニウムである、〔７２〕記載の方法。
〔９２〕Ｒ１がＨである、〔７２〕記載の方法。
〔９３〕Ｒ２がＨである、〔７２〕記載の方法。
〔９４〕Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンが、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルキレンまたはＣ４－Ｃ５直鎖アルケニレンである、〔７２〕記載の方法。
〔９５〕Ｌが－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５、－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－Ｓ－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）２－、または－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）である、〔７２〕記載の方法。
〔９６〕以下の工程を含む、下記式Ａ：
Figure 2023182649000019
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｌは、ヒドロキシおよびＣ１－Ｃ３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよく、
Ｍは、単結合、
Figure 2023182649000020
であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない）
で表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法：
下記式Ｂ２：
Figure 2023182649000021
（式中、ＰＧ２１は、アミノ基の保護基である。）
で表される化合物を分子内で環化して、下記式Ｃ２：
Figure 2023182649000022
（式中、ＰＧ２１は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｃ２で表される化合物に、下記式Ｄ２ＡまたはＤ２Ｂ：
Figure 2023182649000023
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ２２は、アミノ基の保護基であり、
ＰＧ２３は、カルボキシル基またはイミノ基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、およびＭは上記と同じであり、
但し、Ｍが単結合である場合、ＰＧ２３は存在しない。）
で表されるアミンまたはその塩を導入して、下記式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂ：
Figure 2023182649000024
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、およびＰＧ２３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ２４およびＰＧ２５を導入して、下記式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂ：
Figure 2023182649000025
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ２４は、水酸基の保護基であり、
ＰＧ２５は、水酸基の保護基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｍ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、およびＰＧ２３は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物にＰＧ２６を導入して、下記式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂ
Figure 2023182649000026
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ２６は、水酸基の保護基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｌ、Ｍ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、ＰＧ２４、およびＰＧ２５は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物からＰＧ２４およびＰＧ２５を除去して、下記式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂ：
Figure 2023182649000027
で表される化合物を得る工程、
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、およびＰＧ２６は上記と同じである。）
式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、下記式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂ：
Figure 2023182649000028
（式中、
Ｒ２は、Ｃ１－Ｃ３アルキルであり、
ＰＧ２７は、水酸基の保護基であり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、およびＰＧ２６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、
式Ｉ２Ａで表される化合物からＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、およびＰＧ２７を除去して、あるいは式Ｉ２Ｂで表される化合物からＰＧ２１、ＰＧ２３、およびＰＧ２７を除去して、下記式Ｊ２：
Figure 2023182649000029
（式中、
Ｒ２は、ＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
Ｒ１、Ｌ、Ｍ、およびＰＧ２６は上記と同じである。）
で表される化合物を得る工程、および
式Ｊ２で表される化合物からＰＧ２６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程。
〔９７〕式Ａで表される化合物が、ライシジン二リン酸：
Figure 2023182649000030
またはアグマチジン二リン酸：
Figure 2023182649000031
である、〔９６〕記載の方法。
〔９８〕ＰＧ２１が、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔９９〕ＰＧ２２が、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔１００〕ＰＧ２３が、Ｍが
Figure 2023182649000032
の場合には置換されていてもよいベンジルであり、Ｍが
Figure 2023182649000033
の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚ、または置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０１〕ＰＧ２４およびＰＧ２５は一緒になって、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する、〔９６〕記載の方法。
〔１０２〕ＰＧ２６が、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、またはメトキシメチルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０３〕ＰＧ２７が、ベンジルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０４〕分子内環化がアゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンの存在下で行われる、〔９６〕記載の方法。
〔１０５〕式Ｄ２で表されるアミンまたはその塩の導入が塩化リチウムおよびＤＢＵの存在下で行われる、〔９６〕記載の方法。
〔１０６〕アセトニドの除去に用いられる試薬が、ＴＦＡである、〔９６〕記載の方法。
〔１０７〕ＰＧ２４およびＰＧ２５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成し、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルの導入に用いられる試薬が、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルである、〔９６〕記載の方法。
〔１０８〕ＰＧ２６がテトラヒドロピラニルであり、ＰＧ２６の導入に用いられる試薬が、ＴＦＡ、および３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピランである、〔９６〕記載の方法。
〔１０９〕ＰＧ２４およびＰＧ２５の除去に用いられる試薬が、テトラブチルアンモニウムフルオリドである、〔９６〕記載の方法。
〔１１０〕亜リン酸エステル化に用いられる試薬が、ジベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトである、〔９６〕記載の方法。
〔１１１〕酸化に用いられる試薬が、デス－マーチンペルヨージナンである、〔９６〕記載の方法。
〔１１２〕ＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、およびＰＧ２７が、接触水素化によって除去される、〔９６〕記載の方法。
〔１１３〕ＰＧ２６の除去に用いられる試薬が、塩酸である、〔９６〕記載の方法。
〔１１４〕Ｒ１がＨである、〔９６〕記載の方法。
〔１１５〕Ｒ２がＨである、〔９６〕記載の方法。
〔１１６〕Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンが、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルキレンまたはＣ４－Ｃ５直鎖アルケニレンである、〔９６〕記載の方法。
〔１１７〕Ｌが－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５、－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－Ｓ－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）２－、または－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）である、〔９６〕記載の方法。
図１は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡ（ＵＲ－１）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＵＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図２は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａ－ＣＡ（ＬＲ－１）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＧｐの配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図３は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ（ＬＲ－２）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＡＧｐの配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＡＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＡＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図４は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｃ－ＣＡ（ＬＲ－３）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＡＣＡＣＧｐ（配列番号：１９７）の配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＡＣＡＣＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＡＣＡＣＧｐ（配列番号：１９８）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図５は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｃ－ＣＡ（ＬＲ－４）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＣＣＡＣＧｐ（配列番号：１９９）の配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＣＣＡＣＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＣＣＡＣＧｐ（配列番号：２００）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図６は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ａｓｐ）Ｌａｇ－ＣＡ（ＬＲ－５）のマスクロマトグラムを示す図である。上段はｐＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵＬＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ（配列番号：１３４）の配列を有する核酸（目的物）、中段はｐＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ（配列番号：２０１）の配列を有する核酸（ｐＬｐがライゲーションされなかった場合の副生成物）、下段はｐＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵＵＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ（配列番号：１５４）の配列を有する核酸（ｐＬｐの代わりにｐＵｐがライゲーションされた場合の副生成物）の結果をそれぞれ示す。 図７は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）Ｌａｇ－ＣＡ（ＬＲ－６）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＡＵＵＬＡＧｐの配列を有する断片、中段はＡＵＵＡＧｐの配列を有する断片、下段はＡＵＵＵＡＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図８は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｇ－ＣＡ（ＬＲ－７）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＣＧｐの配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＣＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＣＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図９は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｕ－ＣＡ（ＬＲ－８）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵＬＡＵＡＣＧｐ（配列番号：２０２）の配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＡＵＡＣＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＡＵＡＣＧｐ（配列番号：２０３）の配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図１０は、実施例１０に記載されるように、ライゲーション反応を利用して調製されたｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）（Ａｇｍ）ａｇ－ＣＡ（ＡＲ－１）をＲＮａｓｅで断片化したもののマスクロマトグラムを示す図である。上段はＣＣＣＵ（Ａｇｍ）ＡＧｐの配列を有する断片、中段はＣＣＣＵＡＧｐの配列を有する断片、下段はＣＣＣＵＵＡＧｐの配列を有する断片の結果をそれぞれ示す。 図１１は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＵＣＵ、ＵＣＡ、ＵＣＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１２を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：ａｇａ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－２（アンチコドン：ｕｇａ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：ｃｇａ、アミノ酸：ｎＢｕＧ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１（ＵＣＵのコドンを含む） ｍＲ－２（ＵＣＡのコドンを含む） ｍＲ－３（ＵＣＧのコドンを含む）（図中）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：ａｇａ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－３（アンチコドン：ｕｇａ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：ｃｇａ、アミノ酸：ｎＢｕＧ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１（ＵＣＵのコドンを含む） ｍＲ－２（ＵＣＡのコドンを含む） ｍＲ－３（ＵＣＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１（アンチコドン：ａｇａ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－４（アンチコドン：Ｌｇａ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－５（アンチコドン：ｃｇａ、アミノ酸：ｎＢｕＧ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１（ＵＣＵのコドンを含む） ｍＲ－２（ＵＣＡのコドンを含む） ｍＲ－３（ＵＣＧのコドンを含む） 図１２は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１３を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－７（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－８（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図１３は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＵＵ、ＧＵＡ、ＧＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１４を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１０（アンチコドン：ａａｃ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－１１（アンチコドン：ｕａｃ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－１３（アンチコドン：ｃａｃ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－７（ＧＵＵのコドンを含む） ｍＲ－８（ＧＵＡのコドンを含む） ｍＲ－９（ＧＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１０（アンチコドン：ａａｃ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－１２（アンチコドン：Ｌａｃ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－１３（アンチコドン：ｃａｃ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－７（ＧＵＵのコドンを含む） ｍＲ－８（ＧＵＡのコドンを含む） ｍＲ－９（ＧＵＧのコドンを含む） 図１４は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＧＧＵ、ＧＧＡ、ＧＧＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１５を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１４（アンチコドン：ｇｃｃ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－１５（アンチコドン：ｕｃｃ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－１７（アンチコドン：ｃｃｃ、アミノ酸：ＭｅＨｐｈ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１０（ＧＧＵのコドンを含む） ｍＲ－１１（ＧＧＡのコドンを含む） ｍＲ－１２（ＧＧＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１４（アンチコドン：ｇｃｃ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－１６（アンチコドン：Ｌｃｃ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－１７（アンチコドン：ｃｃｃ、アミノ酸：ＭｅＨｐｈ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１０（ＧＧＵのコドンを含む） ｍＲ－１１（ＧＧＡのコドンを含む） ｍＲ－１２（ＧＧＧのコドンを含む） 図１５は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１６を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１９（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２０（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－２２（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－１９（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２１（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－２２（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図１６は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１７を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－２３（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２４（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－２６（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－２３（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２５（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－２６（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図１７は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１８を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２７（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：ＭｅＨｐｈ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２８（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：ＭｅＨｐｈ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図１８は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表１９を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－２９（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：Ｆ３Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－３０（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：Ｆ３Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図１９は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２０を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－３１（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：ＳｉＰｅｎ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－３２（アンチコドン：Ｌａｇ、アミノ酸：ＳｉＰｅｎ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む） 図２０は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＧＵ、ＣＧＡ、ＣＧＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２１を参照）。ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－３３（アンチコドン：ｇｃｇ、アミノ酸：ｄＡ） 化合物ＡＡｔＲ－３４（アンチコドン：Ｌｃｇ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－３５（アンチコドン：ｃｃｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１３（ＣＧＵのコドンを含む） ｍＲ－１４（ＣＧＡのコドンを含む） ｍＲ－１５（ＣＧＧのコドンを含む） 図２１は、実施例１２～１３に記載されるように、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＡＵＵ、ＡＵＡ、ＡＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２２を参照）。ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－３６（アンチコドン：ａａｕ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－３７（アンチコドン：Ｌａｕ、アミノ酸：Ｐｉｃ２） 化合物ＡＡｔＲ－３８（アンチコドン：ｃａｕ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－１６（ＡＵＵのコドンを含む） ｍＲ－１７（ＡＵＡのコドンを含む） ｍＲ－１８（ＡＵＧのコドンを含む） 図２２は、実施例１２～１３に記載されるように、Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価の結果を示す図である。評価したコドンはＣＵＵ、ＣＵＡ、ＣＵＧである。以下に記載のｔＲＮＡおよびｍＲＮＡのそれぞれの組合せで翻訳を行った場合に得られるペプチドの翻訳量をグラフの縦軸に示す（具体的な測定値は表２３を参照）。（図左）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－３９（アンチコドン：ｕａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）（図右）ｔＲＮＡ：化合物ＡＡｔＲ－６（アンチコドン：ａａｇ、アミノ酸：ｎＢｕＧ） 化合物ＡＡｔＲ－４０（アンチコドン：（Ａｇｍ）ａｇ、アミノ酸：ＳＰｈ２Ｃｌ） 化合物ＡＡｔＲ－９（アンチコドン：ｃａｇ、アミノ酸：ｄＡ）ｍＲＮＡ：ｍＲ－４（ＣＵＵのコドンを含む） ｍＲ－５（ＣＵＡのコドンを含む） ｍＲ－６（ＣＵＧのコドンを含む）
Ｉ．定義
本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、該当する場合はいつでも、単数形で使用された用語は複数形をも含み、その逆もまた同様である。本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明することのみを目的としており、限定を意図したものではないことが、理解されるべきである。下記の定義のいずれかが、参照により本明細書に組み入れられた任意の文書と矛盾する場合には、下記の定義が優先するものとする。
「コドン」とは、生体内の遺伝情報がタンパク質に翻訳される際の、各アミノ酸に対応する３つのヌクレオシドの組合せ（トリプレット）のことである。ＤＮＡの場合は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）の４種類の塩基が用いられ、ｍＲＮＡの場合は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）の４種類の塩基が用いられる。各コドンとアミノ酸の対応関係を示した表は遺伝暗号表あるいはコドン表と呼ばれ、終止コドンを除く６１種類のコドンに、２０種類のアミノ酸が割り当てられている（表１）。表１に記載の遺伝暗号表は、真核生物および原核生物（真正細菌および古細菌）におけるほとんどすべての生物で共通して使用されていることから、標準遺伝暗号表あるいは普遍遺伝暗号表とも呼ばれる。本開示においては、天然に存在する生物で使用されている遺伝暗号表を天然の遺伝暗号表と称し、人工的にリプログラミングされた（コドンとアミノ酸の対応関係が改変された）遺伝暗号表とは区別する。遺伝暗号表においては、通常、１文字目と２文字目が共通で３文字目のみが異なる４つのコドンが一つのボックスにまとめられており、これらをコドンボックスと呼ぶ。
Figure 2023182649000034
本開示において、ｍＲＮＡにおけるコドンは「Ｍ１Ｍ２Ｍ３」で表されることがある。ここで、Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３はそれぞれコドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドを表す。
「アンチコドン」とは、ｍＲＮＡ上のコドンに対応する、ｔＲＮＡ上の３つの連続したヌクレオシドのことである。ｍＲＮＡと同様に、アンチコドンには、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）の４種類の塩基が用いられる。さらに、それらを修飾して得られる修飾塩基が用いられることもある。コドンがアンチコドンによって特異的に認識されることによって、ｍＲＮＡ上の遺伝情報が読み取られ、タンパク質に翻訳される。ｍＲＮＡ上の５’から３’方向のコドン配列とｔＲＮＡ上の５’から３’方向のアンチコドン配列は相補的に結合するため、コドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドと、アンチコドンの３文字目、２文字目、および１文字目のヌクレオシドとの間でそれぞれ相補的な塩基対が形成される。
本開示において、ｔＲＮＡにおけるアンチコドンは「Ｎ１Ｎ２Ｎ３」で表されることがある。ここで、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３はそれぞれアンチコドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドを表す。後述のｔＲＮＡナンバリング則に従うと、Ｎ１、Ｎ２、およびＮ３はそれぞれｔＲＮＡの３４位、３５位、および３６位に番号付けされる。
本開示においては、熱力学的に安定な塩基対を形成し得るような核酸の組合せを互いに「相補的」であるという。アデノシンとウリジン（Ａ－Ｕ）、グアノシンとシチジン（Ｇ－Ｃ）といったワトソン－クリック型塩基対に加えて、グアノシンとウリジン（Ｇ－Ｕ）、イノシンとウリジン（Ｉ－Ｕ）、イノシンとアデノシン（Ｉ－Ａ）、イノシンとシチジン（Ｉ－Ｃ）などの非ワトソン－クリック型塩基対を形成する核酸の組合せも、本開示における「相補的」な核酸の組合せに含まれる。特に、コドンの１文字目とアンチコドンの３文字目、コドンの２文字目とアンチコドンの２文字目の間にはワトソン－クリック型塩基対の形成のみが許容されるのに対し、コドンの３文字目とアンチコドンの１文字目の間には空間的なゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）が存在するため、上記のような非ワトソン－クリック型塩基対の形成も許容されると考えられている（ゆらぎ仮説）。
「伝令ＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ；ｍＲＮＡ）」とは、タンパク質に翻訳され得る遺伝情報を持ったＲＮＡのことである。遺伝情報はコドンとしてｍＲＮＡ上にコードされており、それらが全２０種類のアミノ酸にそれぞれ対応している。タンパク質の翻訳は開始コドンから始まり、終止コドンで終了する。真核生物における開始コドンは原則としてＡＵＧであるが、原核生物（真正細菌および古細菌）ではＡＵＧの他にＧＵＧやＵＵＧなども開始コドンとして使用されることがある。ＡＵＧはメチオニン（Ｍｅｔ）をコードするコドンであり、真核生物および古細菌ではそのままメチオニンから翻訳が開始される。一方、真正細菌では、開始コドンのＡＵＧのみＮ－ホルミルメチオニン（ｆＭｅｔ）に対応しているため、ホルミルメチオニンから翻訳が開始される。終止コドンには、ＵＡＡ（オーカー）・ＵＡＧ（アンバー）・ＵＧＡ（オパール）の３種がある。終止コドンが翻訳終結因子（ｒｅｌｅａｓｅ ｆａｃｔｏｒ；ＲＦ）と呼ばれるタンパク質によって認識されると、それまでに合成されたペプチド鎖がｔＲＮＡから解離し、翻訳工程は終了する。
「転移ＲＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒ ＲＮＡ；ｔＲＮＡ）」とは、ｍＲＮＡを鋳型にしたペプチド合成を仲介する１００塩基以下の短いＲＮＡのことである。二次構造上は、３つのステムループ（Ｄアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム）と１つのステム（アクセプターステム）からなる、クローバー葉状の構造を有している。ｔＲＮＡによっては、さらに１つの可変ループが含まれることがある。アンチコドンアームには、アンチコドンと呼ばれる３つの連続したヌクレオシドからなる領域が存在し、アンチコドンがｍＲＮＡ上のコドンと塩基対を形成することによってコドンが認識される。一方、ｔＲＮＡの３’末端には、シチジン－シチジン－アデノシンからなる核酸配列（ＣＣＡ配列）が存在し、その末端のアデノシン残基にアミノ酸が付加される（具体的には、アデノシン残基のリボースの２位または３位のヒドロキシル基と、アミノ酸のカルボキシル基がエステル結合する）。アミノ酸が付加したｔＲＮＡはアミノアシルｔＲＮＡと呼ばれる。本開示においては、アミノアシルｔＲＮＡもｔＲＮＡの定義に含まれる。また、後述のように、ｔＲＮＡのＣＣＡ配列から末端の２残基（ＣおよびＡ）を除去し、それをアミノアシルｔＲＮＡの合成に用いる方法が知られている。そのような３’末端のＣＡ配列が除去されたｔＲＮＡも、本開示におけるｔＲＮＡの定義に含まれる。生体内において、ｔＲＮＡへのアミノ酸の付加は、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａｍｉｎｏａｃｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ａａＲＳまたはＡＲＳ）という酵素によって行われる。通常、アミノ酸ごとに１種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が存在していて、なおかつそれぞれのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素が複数のｔＲＮＡの中から特定のｔＲＮＡのみを基質として特異的に認識することから、ｔＲＮＡとアミノ酸との対応関係は厳密に制御されている。
ｔＲＮＡにおける各ヌクレオシドは、ｔＲＮＡナンバリング則に従って番号付けがなされている（Ｓｐｒｉｎｚｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（１９９８）２６：１４８－１５３）。例えば、アンチコドンは３４位～３６位に、ＣＣＡ配列は７４～７６位にそれぞれ番号付けされている。
「開始ｔＲＮＡ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ ｔＲＮＡ）」とは、ｍＲＮＡの翻訳の開始時に使用される特定のｔＲＮＡのことである。開始アミノ酸を結合した開始ｔＲＮＡが、翻訳開始因子（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＩＦ）に触媒されてリボソームに導入され、ｍＲＮＡ上の開始コドンに結合することで、翻訳が始まる。開始コドンとして、一般的にはメチオニンのコドンであるＡＵＧが用いられるため、開始ｔＲＮＡはＡＵＧに対応するアンチコドンを有しており、また、開始アミノ酸としてメチオニン（原核生物ではホルミルメチオニン）を結合している。開始ｔＲＮＡの例として、ｔＲＮＡ ｆＭｅｔ（配列番号：１０、１１）を挙げることができる。
「伸長ｔＲＮＡ（ｅｌｏｎｇａｔｏｒ ｔＲＮＡ）」とは、翻訳工程におけるペプチド鎖の伸長反応において使用されるｔＲＮＡのことである。ペプチド合成においては、アミノ酸を結合した伸長ｔＲＮＡが、ＧＴＰ化された翻訳伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ；ＥＦ）ＥＦ－Ｔｕ／ｅＥＦ－１によりリボソームに順次運ばれることによって、ペプチド鎖の伸長反応が進行する。伸長ｔＲＮＡの例として、各種アミノ酸に対応したｔＲＮＡ（配列番号：１～９、１２～５０）を挙げることができる。
「ライシジン（ｌｙｓｉｄｉｎｅ）」は修飾ヌクレオシドの一種で、２－リジルシチジン（２－ｌｙｓｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｋ２ＣあるいはＬ）とも表記される。ライシジンは、真正細菌におけるイソロイシンに対応したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２は、ＣＡＵのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ライシジン合成酵素（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ｌｙｓｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉｌＳ）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（Ｃ）がライシジン（ｋ２Ｃ）に改変（変換）される。その結果、ｋ２ＣＡＵのアンチコドンをもったｔＲＮＡ Ｉｌｅ２が完成する（Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８８）２６３：９２６１－９２６７、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（２０１０）５８４：２７２－２７７）。ｋ２ＣＡＵのアンチコドンは、イソロイシンのコドンＡＵＡのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがｋ２ＣＡＵに改変されることによって初めて、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素によりｔＲＮＡ Ｉｌｅ２が基質として認識され、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。大腸菌のＴｉｌＳのアミノ酸配列を配列番号：５１に示す。
「アグマチジン（ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ）」は修飾ヌクレオシドの一種で、２－アグマチニルシチジン（２－ａｇｍａｔｉｎｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ａｇｍ２ＣあるいはＡｇｍ）とも表記される。アグマチジンは、古細菌におけるイソロイシンに対応したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２）において、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドとして用いられている。ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２は、ＣＡＵのアンチコドンをもった前駆体の状態で合成された後、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－アグマチジン合成酵素（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉａＳ）と呼ばれる酵素の作用により、アンチコドンの１文字目のシチジン（Ｃ）がアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）に改変（変換）される。その結果、ａｇｍ２ＣＡＵのアンチコドンをもったｔＲＮＡ Ｉｌｅ２が完成する（Ｉｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１０）６（４）：２７７－２８２）。ａｇｍ２ＣＡＵのアンチコドンは、イソロイシンのコドンＡＵＡのみを特異的に認識することが知られている。また、アンチコドンがａｇｍ２ＣＡＵに改変されることによって初めて、イソロイシルｔＲＮＡ合成酵素によりｔＲＮＡ Ｉｌｅ２が基質として認識され、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２のアミノアシル化（イソロイシンの付加）が起きると考えられている。古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓのＴｉａＳのアミノ酸配列を配列番号：５２に示す。
＜置換基等の定義＞
本開示において「アルキル」とは、脂肪族炭化水素から任意の水素原子を１個除いて誘導される１価の基であり、骨格中にヘテロ原子または不飽和の炭素－炭素結合を含有せず、水素および炭素原子を含有するヒドロカルビルまたは炭化水素基構造の部分集合を有する。炭素鎖の長さｎは１～２０個の範囲であり、アルキルとしては、例えばＣ２－Ｃ１０アルキル、Ｃ１－Ｃ６アルキル、Ｃ１－Ｃ３アルキルなどが挙げられ、具体的には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、ｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、１－メチルプロピル、１，１－ジメチルプロピル、２，２－ジメチルプロピル、１，２－ジメチルプロピル、１，１，２－トリメチルプロピル、１，２，２－トリメチルプロピル、１，１，２，２－テトラメチルプロピル、１－メチルブチル、２－メチルブチル、３－メチルブチル、１，１－ジメチルブチル、１，２－ジメチルブチル、１，３－ジメチルブチル、２，２－ジメチルブチル、２，３－ジメチルブチル、３，３－ジメチルブチル、１－エチルブチル、２－エチルブチル、イソペンチル、ネオペンチルなどが挙げられる。
本開示において「シクロアルキル」とは、飽和または部分的に飽和した環状の１価の脂肪族炭化水素基を意味し、単環、ビシクロ環、スピロ環を含む。シクロアルキルとしては、例えばＣ３－Ｃ１０シクロアルキルが挙げられ、具体的には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、ビシクロ［２．２．１］ヘプチルなどが挙げられる。
本開示において「アルケニル」とは、少なくとも１個の二重結合（２個の隣接ＳＰ２炭素原子）を有する１価の基である。二重結合および置換分（存在する場合）の配置によって、二重結合の幾何学的形態は、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖状または分枝鎖状のアルケニルが挙げられ、内部オレフィンを含む直鎖などを含む。アルケニルとしては、例えばＣ２－Ｃ１０アルケニル、Ｃ２－Ｃ６アルケニルなどが挙げられ、具体的には、ビニル、アリル、１－プロペニル、２－プロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル（シス、トランスを含む）、３－ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが挙げられる。
本開示において「アルキニル」とは、少なくとも１個の三重結合（２個の隣接ＳＰ炭素原子）を有する、１価の基である。直鎖状または分枝鎖状のアルキニルが挙げられ、内部アルキレンを含む。アルキニルとしては、例えばＣ２－Ｃ１０アルキニル、Ｃ２－Ｃ６アルキニルなどが挙げられ、具体的には、エチニル、１－プロピニル、プロパルギル、３－ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、３－フェニル－２－プロピニル、３－（２’－フルオロフェニル）－２－プロピニル、２－ヒドロキシ－２－プロピニル、３－（３－フルオロフェニル）－２－プロピニル、３－メチル－（５－フェニル）－４－ペンチニルなどが挙げられる。
本開示において「アリール」とは、１価の芳香族炭化水素環を意味する。アリールとしては、例えばＣ６－Ｃ１０アリールが挙げられ、具体的には、フェニル、ナフチル（例えば、１－ナフチル、２－ナフチル）などが挙げられる。
本開示において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中にヘテロ原子を含有する芳香族性の環の１価の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、または２個の縮合環（例えば、ベンゼンまたは単環へテロアリールと縮合した２環式ヘテロアリール）であってもよい。環を構成する原子の数は例えば５－１０個である（５員－１０員ヘテロアリール）。環を構成する原子中に含まれるヘテロ原子の数は例えば１－５個である。ヘテロアリールとしては、具体的には、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられる。
本開示において「アリールアルキル（アラルキル）」とは、アリールとアルキルを共に含む基であり、例えば、前記アルキルの少なくとも一つの水素原子がアリールで置換された基を意味する。アラルキルとしては、例えばＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」が挙げられ、具体的には、ベンジルなどが挙げられる。
本開示において「アルキレン」とは、前記「アルキル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。直鎖アルキレンとしては、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレン、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５－、－（ＣＨ２）６－などが挙げられる。分岐アルキレンとしては、Ｃ２－Ｃ６分岐アルキレン、Ｃ４－Ｃ５分岐アルキレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ２－、－Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２－、－ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）－などが挙げられる。
本開示において「アルケニレン」は、前記「アルケニル」からさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される二価の基を意味し、直鎖状のものでも分枝鎖状のものでもよい。二重結合および置換基（存在する場合）の配置によって、エントゲーゲン（Ｅ）またはツザンメン（Ｚ）、シスまたはトランス配置をとることができる。直鎖アルケニレンとしては、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルケニレン、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルケニレンなどが挙げられ、具体的には、－ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－などが挙げられる。
本開示において「アリーレン」とは、前記アリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば６－１０個である（Ｃ６－Ｃ１０アリーレン）。アリーレンとしては、具体的には、フェニレン、ナフチレンなどが挙げられる。
本開示において「ヘテロアリーレン」とは、前記ヘテロアリールからさらに任意の水素原子を１個除いて誘導される２価の基を意味する。環は単環でも縮合環でもよい。環を構成する原子の数は特に限定されないが、例えば５－１０個である（５員～１０員ヘテロアリーレン）。ヘテロアリーレンとしては、具体的には、ピロールジイル、イミダゾールジイル、ピラゾールジイル、ピリジンジイル、ピリダジンジイル、ピリミジンジイル、ピラジンジイル、トリアゾールジイル、トリアジンジイル、イソオキサゾールジイル、オキサゾールジイル、オキサジアゾールジイル、イソチアゾールジイル、チアゾールジイル、チアジアゾールジイル、フランジイル、チオフェンジイルなどが挙げられる。
本開示における「翻訳系」とは、ペプチドを翻訳するための方法およびペプチドを翻訳するためのキットの両方を含む概念として定義される。翻訳系には、通常、リボソーム、翻訳因子、ｔＲＮＡ、アミノ酸、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、及びＡＴＰやＧＴＰなどのペプチドの翻訳反応に必要な因子が構成成分として含まれる。翻訳系の主な種類としては、生細胞を利用した翻訳系や、細胞抽出液を利用した翻訳系（無細胞翻訳系）がある。生細胞を利用した翻訳系としては、例えば、アフリカツメガエル卵母細胞や哺乳動物細胞などの生細胞に、所望のアミノアシルｔＲＮＡおよびｍＲＮＡをマイクロインジェクション法やリポフェクション法により導入してペプチド翻訳を行う系が知られている（Ｎｏｗａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）２６８：４３９－４４２）。無細胞翻訳系の例としては、大腸菌（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）１０１：６７４－６９０）、酵母（Ｇａｓｉｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９７９）２５４：３９６５－３９６９）、小麦胚芽（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）９６：３８－５０）、ウサギ網状赤血球（Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９８３）９６：５０－７４）、ＨｅＬａ細胞（Ｂａｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９６）２７５：３５－５７）、あるいは昆虫細胞（Ｓｗｅｒｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｐ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂ（１９８９）９３：８０３－８０６）などからの抽出液を利用した翻訳系が知られている。このような翻訳系は、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって適宜調製することができる。無細胞翻訳系には、ペプチド翻訳に必要な因子をそれぞれ単離・精製して、それらを再構成して構築された翻訳系（再構成型の無細胞翻訳系）も含まれる（Ｓｈｉｍｉｚｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１）１９：７５１－７５５）。再構成型の無細胞翻訳系には、通常、リボソーム、アミノ酸、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ａａＲＳ）、翻訳開始因子（例えば、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦ３）、翻訳伸長因子（例えばＥＦ－Ｔｕ、ＥＦ－Ｔｓ、ＥＦ－Ｇ）、翻訳終結因子（例えばＲＦ１、ＲＦ２、ＲＦ３）、リボソーム再生因子（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ；ＲＲＦ）、エネルギー源としてのＮＴＰ類、エネルギー再生系、および翻訳に必要なその他の因子などが含まれ得る。ＤＮＡからの転写反応を併せて行う場合は、さらにＲＮＡポリメラーゼなどが含まれ得る。無細胞翻訳系に含まれる種々の因子は、当業者に周知の方法によって単離・精製することが可能であり、それらを用いて再構成型の無細胞翻訳系を適宜構築することができる。あるいは、ジーンフロンティア社のＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）や、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社のＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓ（登録商標）などの市販されている再構成型の無細胞翻訳系を利用することもできる。再構成型の無細胞翻訳系の場合、翻訳系の構成成分のうち必要な成分だけを再構成して、所望の翻訳系を構築することができる。
アミノ酸・ｔＲＮＡ・アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の特異的な組合せにより、アミノアシルｔＲＮＡが合成され、それがペプチドの翻訳に用いられる。上記の組合せの代わりに、アミノアシルｔＲＮＡをそのまま翻訳系の構成成分として用いることもできる。特に、非天然アミノ酸など、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素でアミノアシル化することが困難なアミノ酸が翻訳に用いられる場合は、あらかじめ非天然アミノ酸でアミノアシル化されたｔＲＮＡを構成成分として用いることが望ましい。
翻訳系にｍＲＮＡを加えることによって、その翻訳が開始される。ｍＲＮＡには、通常、目的のペプチドをコードする配列が含まれており、さらに、翻訳反応の効率を上昇させるための配列（例えば、原核生物におけるシャイン・ダルガーノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ；ＳＤ）配列、真核生物におけるコザック（Ｋｏｚａｃ）配列など）が含まれていてもよい。あらかじめ転写されたｍＲＮＡを系に直接加えてもよいし、ｍＲＮＡの代わりに、プロモーターを含む鋳型ＤＮＡとそれに適したＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７プロモーターとＴ７ ＲＮＡポリメラーゼなど）を系に加えることによって、ｍＲＮＡが鋳型ＤＮＡから転写されるようにしてもよい。
ＩＩ．組成物および方法
＜変異ｔＲＮＡ＞
一局面において、本開示は、改変されたｔＲＮＡを提供する。具体的には、本発明は、ｔＲＮＡを改変することにより作製されている変異ｔＲＮＡを提供する。改変されるｔＲＮＡは、任意の生物（例えば大腸菌など）に由来する天然ｔＲＮＡであってもよいし、または天然ｔＲＮＡとは異なる配列を人工的に合成した非天然ｔＲＮＡであってもよい。あるいは、天然ｔＲＮＡと同じ配列を人工的に合成したｔＲＮＡであってもよい。本開示においてｔＲＮＡに導入される改変はいずれも人工的な改変であって、当該改変により作製される変異ｔＲＮＡはいずれも天然には存在しない核酸配列を有していることを特徴とする。
いくつかの態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変とは、ｔＲＮＡを構成する１つ以上のヌクレオシドに対して、以下の群から選択される少なくとも１種類以上の改変を導入することを意味する：（ｉ）付加（既存のｔＲＮＡに任意の新たなヌクレオシドを付け足すこと）、（ｉｉ）欠失（既存のｔＲＮＡから任意のヌクレオシドを削除すること）、（ｉｉｉ）置換（既存のｔＲＮＡにおける任意のヌクレオシドを別の任意のヌクレオシドに置き換えること）、（ｉｖ）挿入（既存のｔＲＮＡにおける任意の２つのヌクレオシドの間に新たな任意のヌクレオシドを追加すること）、（ｖ）修飾（既存のｔＲＮＡにおける任意のヌクレオシドの構造の一部（例えば塩基部分や糖部分）を別の構造に変化させること）。改変はｔＲＮＡのどの構造（例えばＤアーム、アンチコドンアーム、Ｔアーム、アクセプターステム、可変ループなど）に対して行われてもよい。特定の態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変は、アンチコドンアームに含まれるアンチコドンに対して行われる。さらなる態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変は、アンチコドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドのうちの少なくとも１つに対して行われる。ｔＲＮＡにおけるヌクレオシドのナンバリング則に従うと、アンチコドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドは、それぞれｔＲＮＡの３４位、３５位、および３６位に該当する。本明細書においては、アンチコドンの１文字目、２文字目、および３文字目のヌクレオシドをそれぞれＮ１、Ｎ２、およびＮ３と表現することがある。特定の態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変は、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドに対して行われる改変を含む。本開示のｔＲＮＡにおいて改変されるヌクレオシドの数は１以上の任意の数であることができる。いくつかの態様において、本開示のｔＲＮＡにおいて改変されるヌクレオシドの数は、２０以下、１５以下、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、あるいは１である。別の態様において、改変後のｔＲＮＡの核酸配列は、改変前の核酸配列と比べて、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、あるいは９９％以上同一である。
特定の態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変とは、ｔＲＮＡを構成する１つ以上のヌクレオシドを置換することを意味する。ヌクレオシドの種類に関して、置換された後のヌクレオシドは、天然ｔＲＮＡ中に存在するいずれかのヌクレオシドであってもよいし、天然ｔＲＮＡ中には存在しない任意のヌクレオシド（人工的に合成されたヌクレオシド）であってもよい。天然ｔＲＮＡ中には、４つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンの他に、それらを修飾して得られる改変体（修飾ヌクレオシド）も含まれている。いくつかの態様において、天然ｔＲＮＡ中に存在するヌクレオシドは、以下のヌクレオシドの中から選択され得る：アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ；Ａ）、シチジン（ｃｙｔｉｄｉｎｅ；Ｃ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ；Ｇ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ；Ｕ）、１－メチルアデノシン（１－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｍ１Ａ）、２－メチルアデノシン（２－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｉｓｉｎｅ；ｍ２Ａ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（Ｎ６－ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（２－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－Ｎ６－ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｍｓ２ｉ６Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（Ｎ６－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｍ６Ａ）、Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（Ｎ６－ｔｈｒｅｏｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｔ６Ａ）、Ｎ６－メチル－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（Ｎ６－ｍｅｔｈｙｌ－Ｎ６－ｔｈｒｅｏｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｍ６ｔ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（２－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ－Ｎ６－ｔｈｒｅｏｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｍｓ２ｔ６Ａ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ；Ａｍ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ；Ｉ）、１－メチルイノシン（１－ｍｅｔｈｙｌｉｎｏｓｉｎｅ；ｍ１Ｉ）、２’－Ｏ－リボシルアデノシン（リン酸塩）（２’－Ｏ－ｒｉｂｏｓｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；Ａｒ（ｐ））、Ｎ６－（ｃｉｓ－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン（Ｎ６－（ｃｉｓ－ｈｙｄｒｏｘｙｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌ）ａｄｅｎｏｓｉｎｅ；ｉｏ６Ａ）、２－チオシチジン（２－ｔｈｉｏｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｓ２Ｃ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；Ｃｍ）、Ｎ４－アセチルシチジン（Ｎ４－ａｃｅｔｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ａｃ４Ｃ）、５－メチルシチジン（５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｍ５Ｃ）、３－メチルシチジン（３－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｍ３Ｃ）、ライシジン（ｌｙｓｉｄｉｎｅ；ｋ２Ｃ）、５－ホルミルシチジン（５－ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｆ５Ｃ）、２’－Ｏ－メチル－５－ホルミルシチジン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ；ｆ５Ｃｍ）、アグマチジン（ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ；ａｇｍ２Ｃ）、２’－Ｏ－リボシルグアノシン（リン酸塩）（２’－Ｏ－ｒｉｂｏｓｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；Ｇｒ（ｐ））、１－メチルグアノシン（１－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（Ｎ２－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；ｍ２Ｇ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；Ｇｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（Ｎ２，Ｎ２－ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；ｍ２２Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン（Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；ｍ２２Ｇｍ）、７－メチルグアノシン（７－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ；ｍ７Ｇ）、アーキオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ；Ｇ＊）、キューオシン（ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ；Ｑ）、マンノシルキューオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｕｏｓｉｎｅ；ｍａｎＱ）、ガラクトシルキューオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｕｏｓｉｎｅ；ｇａｌＱ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ；ｙＷ）、ペルオキシワイブトシン（ｐｅｒｏｘｙｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ；ｏ２ｙＷ）、５－メチルアミノメチルウリジン（５－ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｍｎｍ５Ｕ）、２－チオウリジン（２－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｓ２Ｕ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；Ｕｍ）、４－チオウリジン（４－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｓ４Ｕ）、５－カルバモイルメチルウリジン（５－ｃａｒｂａｍｏｙｌｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｎｃｍ５Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（５－ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｍｃｍ５Ｕ）、５－メチルアミノメチル－２－チオウリジン（５－ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（５－ｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、ウリジン５－オキシ酢酸（ｕｒｉｄｉｎｅ ５－ｏｘｙａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ｃｍｏ５Ｕ）、５－メトキシウリジン（５－ｍｅｔｈｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ；ｍｏ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン（５－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｃｍｎｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（５－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウリジン（３－（３－ａｍｉｎｏ－３－ｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｕｒｉｄｉｎｅ；ａｃｐ３Ｕ）、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル（５－（ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｕｒｉｄｉｎｅｍｅｔｈｙｌ ｅｓｔｅｒ；ｍｃｈｍ５Ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（５－ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ－２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（５－ｃａｒｂａｍｏｙｌｍｅｔｈｙｌ－２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｎｃｍ５Ｕｍ）、ジヒドロウリジン（ｄｉｈｙｄｒｏｕｒｉｄｉｎｅ；Ｄ）、シュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ；Ψ）、１－メチルシュードウリジン（１－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｍ１Ψ）、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン（２’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ；Ψｍ）、５－メチルウリジン（５－ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｍ５Ｕ）、５－メチル－２－チオウリジン（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｔｈｉｏｕｒｉｄｉｎｅ；ｍ５ｓ２Ｕ）、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（５，２’－Ｏ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ；ｍ５Ｕｍ）。特定の態様において、本開示のｔＲＮＡを構成する１つ以上のヌクレオシドが、ライシジンまたはアグマチジンに置換される。上述の天然ｔＲＮＡ中に存在するヌクレオシドの構造の一部（例えば塩基部分）を修飾して得られたヌクレオシド誘導体も置換に用いることができる。特定の態様において、本開示のｔＲＮＡを構成する１つ以上のヌクレオシドが、ライシジン誘導体またはアグマチジン誘導体に置換される。
本開示において改変されるｔＲＮＡは、任意の核酸配列を有するｔＲＮＡの中から適宜選択することができる。いくつかの態様において、ｔＲＮＡはｔＲＮＡ Ａｌａ、ｔＲＮＡ Ａｒｇ、ｔＲＮＡ Ａｓｎ、ｔＲＮＡ Ａｓｐ、ｔＲＮＡ Ｃｙｓ、ｔＲＮＡ Ｇｌｎ、ｔＲＮＡ Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ Ｇｌｙ、ｔＲＮＡ Ｈｉｓ、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ、ｔＲＮＡ Ｌｅｕ、ｔＲＮＡ Ｌｙｓ、ｔＲＮＡ Ｍｅｔ、ｔＲＮＡ Ｐｈｅ、ｔＲＮＡ Ｐｒｏ、ｔＲＮＡ Ｓｅｒ、ｔＲＮＡ Ｔｈｒ、ｔＲＮＡ Ｔｒｐ、ｔＲＮＡ Ｔｙｒ、ｔＲＮＡ Ｖａｌのいずれかである。上記の２０種類のｔＲＮＡ以外もに、ｔＲＮＡ ｆＭｅｔやｔＲＮＡ Ｓｅｃ（セレノシステイン）、ｔＲＮＡ Ｐｙｌ（ピロリシン）、ｔＲＮＡ ＡｓｎＥ２なども用い得る。特定の態様において、ｔＲＮＡはｔＲＮＡ Ｇｌｕ、ｔＲＮＡ Ａｓｐ、ｔＲＮＡ ＡｓｎＥ２のいずれかである。いくつかのｔＲＮＡについて、例示的な核酸配列を配列番号：１～５０に示す。ｔＲＮＡの本体部分（核酸で構成された主要な構造部分）を指してｔＲＮＡ ｂｏｄｙとの用語が用いられることもある。
なお、本開示において、ｔＲＮＡは以下のように表記されることがある。
・「ｔＲＮＡ Ｘｘｘ」あるいは「ｔＲＮＡ（Ｘｘｘ）」・・・アミノ酸Ｘｘｘに対応したｔＲＮＡ（全長）を示す（例えばｔＲＮＡ ＧｌｕやｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）など）。
・「ｔＲＮＡ（Ｘｘｘ）ｎｎｎ」・・・アミノ酸Ｘｘｘに対応したｔＲＮＡであって、アンチコドン配列がｎｎｎであるｔＲＮＡ（全長）を示す（例えばｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａやｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａなど）。
・「ｔＲＮＡ（Ｘｘｘ）ｎｎｎ－ＣＡ」・・・アミノ酸Ｘｘｘに対応したｔＲＮＡであって、アンチコドン配列がｎｎｎであるｔＲＮＡ（３’末端のＣＡ配列が除去されたもの）を示す（例えばｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡやｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａ－ＣＡなど）。
特定の態様において、本開示におけるｔＲＮＡの改変は、アンチコドンの１文字目のヌクレオシド（Ｎ１）をライシジン、ライシジン誘導体、アグマチジン、またはアグマチジン誘導体のいずれかに置換する改変を含む。ここで、ライシジン誘導体とは、ライシジンの構造の一部（例えば塩基部分）に修飾を加えて作製されている分子であって、アンチコドンの一部として用いられた場合に、ライシジンと同等のコドン識別能（相補的塩基対の形成能）を有している分子を意味する。また、アグマチジン誘導体とは、アグマチジンの構造の一部（例えば塩基部分）に修飾を加えて作製されている分子であって、アンチコドンの一部として用いられた場合に、アグマチジンと同等のコドン識別能（相補的塩基対の形成能）を有している分子を意味する。
天然ｔＲＮＡにおけるライシジンは、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ライシジン合成酵素（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ｌｙｓｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉｌＳ）と呼ばれる酵素の作用により合成される。ＴｉｌＳは、イソロイシンに対応したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２）を基質として特異的に認識し、そのアンチコドンの１文字目（Ｎ１）におけるシチジン（Ｃ）をライシジン（ｋ２Ｃ）に改変（変換）する活性を有している。本開示のｔＲＮＡにおけるライシジンは、ＴｉｌＳを介して合成されたものであってもよいし、ＴｉｌＳを介さずに合成されたものであってもよい。
前者の場合（ライシジンがＴｉｌＳを介して合成されたものである場合）、本開示のｔＲＮＡは、ＴｉｌＳによって基質として認識され得る。すなわち、当該ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンはＴｉｌＳによってライシジンに改変され得る。あるｔＲＮＡのＮ１におけるシチジンがＴｉｌＳによってライシジンに改変され得るか否かは、例えば遺伝子組み換え手法によりＴｉｌＳを調製し、または生物学的材料からＴｉｌＳを抽出し、それをＮ１がシチジンであるｔＲＮＡと適切な条件下で反応させた後、反応産物中におけるライシジンを検出することで確認することができる（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（２０１０）５８４：２７２－２７７などを参照のこと）。あるいは、ＴｉｌＳを内在的に発現する細胞に、またはＴｉｌＳを遺伝子組み換え手法により発現させた細胞に、Ｎ１がシチジンであるｔＲＮＡを導入して、細胞内のＴｉｌＳと適切な条件下で反応させた後、当該ｔＲＮＡに含まれるライシジンを検出することでも確認することができる。本開示の一態様において、ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンからライシジンへの改変がＴｉｌＳによって触媒され得る。
一方、後者の場合（ライシジンがＴｉｌＳを介さずに合成されたものである場合）、本開示のｔＲＮＡは、ＴｉｌＳによって基質として認識され得ない。すなわち、当該ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであったとしても、当該シチジンはＴｉｌＳによってライシジンに改変され得ない。その場合、ライシジンおよびそれを含むｔＲＮＡは、ＴｉｌＳを用いない方法（例えば、化学的な合成法）によって合成することができる。後述の実施例には、そのような合成法の一例が示されている。本開示の一態様において、ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンからライシジンへの改変がＴｉｌＳでは触媒され得ない。シチジンからライシジンへの改変がＴｉｌＳでは触媒され得ない状態とは、例えば、１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ（ｐＨ８．０），１０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ２，２ｍＭ ＤＴＴ，２ｍＭ ＡＴＰ，１００μＭ Ｌｙｓｉｎｅ中で１０μｇ／ｍＬ ＴｉｌＳと１μＭのｔＲＮＡを３７℃で２時間反応させたときに、天然の基質であるｔＲＮＡ Ｉｌｅ２のシチジンをライシジンに改変する活性を１とした場合、ＴｉｌＳが対象ｔＲＮＡのシチジンをライシジンに改変する活性がそれより１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、あるいは４００倍以上低下している状態として表現することができる。ＴｉｌＳによる触媒活性が低下している場合、結果的にＮ１がシチジンのままの未改変ｔＲＮＡを多く含むような低純度の目的物しか得られないため、ＴｉｌＳを用いた方法でライシジンを合成するよりも、ＴｉｌＳを用いない方法（例えば、化学的な合成法）でライシジンを合成する方が有利であると考えられる。特定の態様において、ＴｉｌＳは大腸菌由来のＴｉｌＳである。さらなる態様において、ＴｉｌＳは配列番号：５１のアミノ酸配列を有する大腸菌由来の野生型のＴｉｌＳである。
また、ＴｉｌＳは、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２における一部のヌクレオシドが他のヌクレオシドに改変された後のｔＲＮＡに対しても、ある程度のライシジン合成能を維持していることが報告されている（Ｉｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ（２００５）１９：２３５－２４６）。
天然ｔＲＮＡにおけるアグマチジンは、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－アグマチジン合成酵素（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ－ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉａＳ）と呼ばれる酵素の作用により合成される。ＴｉａＳは、イソロイシンに対応したｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２）を基質として特異的に認識し、そのアンチコドンの１文字目（Ｎ１）におけるシチジン（Ｃ）をアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）に改変（変換）する活性を有している。本開示のｔＲＮＡにおけるアグマチジンは、ＴｉａＳを介して合成されたものであってもよいし、ＴｉａＳを介さずに合成されたものであってもよい。
前者の場合（アグマチジンがＴｉａＳを介して合成されたものである場合）、本開示のｔＲＮＡは、ＴｉａＳによって基質として認識され得る。すなわち、当該ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンはＴｉａＳによってアグマチジンに改変され得る。あるｔＲＮＡのＮ１におけるシチジンがＴｉａＳによってアグマチジンに改変され得るか否かは、例えば遺伝子組み換え手法によりＴｉａＳを調製し、または生物学的材料からＴｉａＳを抽出し、それをＮ１がシチジンであるｔＲＮＡと適切な条件下で反応させた後、反応産物中におけるアグマチジンを検出することで確認することができる（例えば、Ｉｋｅｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１０）６（４）：２７７－２８２などを参照のこと）。あるいは、ＴｉａＳを内在的に発現する細胞に、またはＴｉａＳを遺伝子組み換え手法により発現させた細胞に、Ｎ１がシチジンであるｔＲＮＡを導入して、細胞内のＴｉａＳと適切な条件下で反応させた後、当該ｔＲＮＡに含まれるアグマチジンを検出することでも確認することができる。本開示の一態様において、ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンからアグマチジンへの改変がＴｉａＳによって触媒され得る。
一方、後者の場合（アグマチジンがＴｉａＳを介さずに合成されたものである場合）、本開示のｔＲＮＡは、ＴｉａＳによって基質として認識され得ない。すなわち、当該ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであったとしても、当該シチジンはＴｉａＳによってアグマチジンに改変され得ない。その場合、アグマチジンおよびそれを含むｔＲＮＡは、ＴｉａＳを用いない方法（例えば、化学的な合成法）によって合成することができる。本開示の一態様において、ｔＲＮＡにおける改変前のＮ１がシチジンであった場合、当該シチジンからアグマチジンへの改変がＴｉａＳでは触媒され得ない。シチジンからアグマチジンへの改変がＴｉａＳでは触媒され得ない状態とは、例えば、ＴｉａＳが天然の基質であるｔＲＮＡ Ｉｌｅ２のシチジンをアグマチジンに改変する活性を１とした場合、ＴｉａＳが対象ｔＲＮＡのシチジンをアグマチジンに改変する活性がそれより１０倍以上、２０倍以上、４０倍以上、１００倍以上、２００倍以上、あるいは４００倍以上低下している状態として表現することができる。ＴｉａＳによる触媒活性が低下している場合、結果的にＮ１がシチジンのままの未改変ｔＲＮＡを多く含むような低純度の目的物しか得られないため、ＴｉａＳを用いた方法でアグマチジンを合成するよりも、ＴｉａＳを用いない方法（例えば、化学的な合成法）でアグマチジンを合成する方が有利であると考えられる。特定の態様において、ＴｉａＳは古細菌由来のＴｉａＳである。さらなる態様において、ＴｉａＳは配列番号：５２のアミノ酸配列を有する古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来の野生型のＴｉａＳである。
また、ＴｉａＳは、ｔＲＮＡ Ｉｌｅ２における一部のヌクレオシドが他のヌクレオシドに改変された後のｔＲＮＡに対しても、ある程度のアグマチジン合成能を維持していることが報告されている（Ｏｓａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ（２０１１）１８：１２７５－１２８０）。
いくつかの態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、開始ｔＲＮＡまたは伸長ｔＲＮＡである。開始ｔＲＮＡまたは伸長ｔＲＮＡを改変することによって変異ｔＲＮＡを作製してもよいし、改変により作製された変異ｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡまたは伸長ｔＲＮＡとしての機能を有していてもよい。あるｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡとしての機能を有しているか否かは、当該ｔＲＮＡを翻訳系で用いた場合に、（ｉ）ＩＦ２を介してリボソームに導入され、なおかつ（ｉｉ）当該ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸を開始アミノ酸として用いて、ペプチド翻訳を開始させることができるか否かによって判断することができる。また、あるｔＲＮＡが伸長ｔＲＮＡとしての機能を有しているか否かは、当該ｔＲＮＡを翻訳系で用いた場合に、（ｉ）ＥＦ－Ｔｕを介してリボソームに導入され、なおかつ（ｉｉ）当該ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸をペプチド鎖に取り込ませて、ペプチド鎖を伸長させることができるか否かによって判断することができる。
いくつかの態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、原核生物由来のｔＲＮＡまたは真核生物由来のｔＲＮＡである。原核生物由来のｔＲＮＡまたは真核生物由来のｔＲＮＡを改変することによって変異ｔＲＮＡを作製してもよいし、改変により作製された変異ｔＲＮＡが、原核生物由来のｔＲＮＡまたは真核生物由来のｔＲＮＡと最も高い核酸配列同一性を有していてもよい。真核生物はさらに動物、植物、菌類および原生生物に分類される。本開示の変異ｔＲＮＡは、例えばヒト由来のｔＲＮＡであってもよい。原核生物は、さらに真正細菌と古細菌に分類される。真正細菌としては、例えば大腸菌、枯草菌、乳酸菌、またはＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅなどを挙げることができる。古細菌としては、例えば高度好塩菌、好熱菌、またはメタン菌（例えばＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ，Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）などを挙げることができる。本開示の変異ｔＲＮＡは、例えば大腸菌やＤｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｆｎｉｅｎｓｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｍａｚｅｉ由来のｔＲＮＡであってもよい。
いくつかの態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンを翻訳することができる。ここで、コドンの１文字目のヌクレオシド（Ｍ１）および２文字目のヌクレオシド（Ｍ２）は、それぞれ独立にアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれかから選択され、なおかつ３文字目のヌクレオシドはアデノシンである。別の態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、Ｍ１Ｍ２Ａで表される特定のコドンに相補的なアンチコドンを有する。特定の態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、ｋ２ＣＮ２Ｎ３またはａｇｍ２ＣＮ２Ｎ３で表されるアンチコドンを有する。ここで、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドはライシジン（ｋ２Ｃ）またはアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）であり、なおかつ２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）および３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）はそれぞれ上述のＭ２およびＭ１に相補的なヌクレオシドである。ライシジンおよびアグマチジンは、いずれもアデノシンに相補的に結合するヌクレオシドとして知られている。さらなる態様において、Ｎ２およびＮ３は、それぞれ独立にアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれかから選択され得る。具体的には、Ｍ２（またはＭ１）がアデノシンのとき、Ｎ２（またはＮ３）はウリジンである。Ｍ２（またはＭ１）がグアノシンのとき、Ｎ２（またはＮ３）はシチジンである。Ｍ２（またはＭ１）がシチジンのとき、Ｎ２（またはＮ３）はグアノシンである。Ｍ２（またはＭ１）がウリジンのとき、Ｎ２（またはＮ３）はアデノシンである。
本開示の文脈において、「あるｔＲＮＡが特定のコドンを翻訳可能である」との態様は、「あるｔＲＮＡが特定のコドンに相補的なアンチコドンを有している」との態様を本質的に内包するものであり、当該ｔＲＮＡ上のアンチコドンの配列について言及する限りにおいて、これらの表現は置き換えが可能である。
本開示の変異ｔＲＮＡが翻訳可能なコドンの１文字目のヌクレオシド（Ｍ１）および２文字目のヌクレオシド（Ｍ２）は、遺伝暗号表における特定のコドンボックスを構成するコドンの１文字目のヌクレオシド（Ｍ１）および２文字目のヌクレオシド（Ｍ２）からそれぞれ選択することができる。特定の態様において、遺伝暗号表は標準遺伝暗号表である。別の態様において、遺伝暗号表は天然の遺伝暗号表である。
一態様において、Ｍ１およびＭ２は、３文字目がＡであるコドンとＧであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがＵＵＮで表されるコドンボックスにおいては、３文字目がＡであるコドン（ＵＵＡ）とＧであるコドン（ＵＵＧ）がともに同じアミノ酸（Ｌｅｕ）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
一態様において、Ｍ１およびＭ２は、３文字目がＵであるコドンとＡであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがＡＵＮで表されるコドンボックスにおいては、３文字目がＵであるコドン（ＡＵＵ）とＡであるコドン（ＡＵＡ）がともに同じアミノ酸（Ｉｌｅ）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
一態様において、Ｍ１およびＭ２は、３文字目がＵであるコドン、Ｃであるコドン、Ａであるコドン、およびＧであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがＵＣＮで表されるコドンボックスにおいては、３文字目がＵであるコドン（ＵＣＵ）、Ｃであるコドン（ＵＣＣ）、Ａであるコドン（ＵＣＡ）、およびＧであるコドン（ＵＣＧ）がいずれも同じアミノ酸（Ｓｅｒ）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
一態様において、Ｍ１およびＭ２は、３文字目がＡであるコドンとＧであるコドンが互いに異なるアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがＡＵＮで表されるコドンボックスにおいては、３文字目がＡであるコドン（ＡＵＡ）とＧであるコドン（ＡＵＧ）が互いに異なるアミノ酸（ＩｌｅとＭｅｔ）をコードしているので、同コドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
一態様において、Ｍ１およびＭ２は、３文字目がＡであるコドンおよび／またはＧであるコドンが終止コドンであるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。一例として、コドンがＵＧＮで表されるコドンボックスにおいては、３文字目がＡであるコドン（ＵＧＡ）が終止コドン（オパール）であるので、同コドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＵＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＵＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＵＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＵＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＣＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＣＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＣＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＣＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＡＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＡＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＡＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＡＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＧＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＧＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＧＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
さらなる態様において、Ｍ１およびＭ２は、コドンがＧＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンのＭ１およびＭ２からそれぞれ選択され得る。具体的には、当該コドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）をそれぞれＭ１およびＭ２として選択することができる。
本開示の変異ｔＲＮＡにおけるアンチコドンの３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）および２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）は、Ｍ１およびＭ２とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＵＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＡを、Ｎ２としてＡをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＵＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＡを、Ｎ２としてＧをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＵＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＡを、Ｎ２としてＵをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＵＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｕ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＡを、Ｎ２としてＣをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＣＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＧを、Ｎ２としてＡをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＣＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＧを、Ｎ２としてＧをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＣＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＧを、Ｎ２としてＵをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＣＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｃ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＧを、Ｎ２としてＣをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＡＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＵを、Ｎ２としてＡをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＡＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＵを、Ｎ２としてＧをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＡＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＵを、Ｎ２としてＵをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＡＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ａ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＵを、Ｎ２としてＣをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＧＵＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｕ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＣを、Ｎ２としてＡをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＧＣＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｃ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＣを、Ｎ２としてＧをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＧＡＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ａ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＣを、Ｎ２としてＵをそれぞれ選択することができる。
一態様において、Ｎ３およびＮ２は、コドンがＧＧＮで表されるコドンボックスを構成するコドンにおける１文字目のヌクレオシド（Ｇ）および２文字目のヌクレオシド（Ｇ）とそれぞれ相補的なヌクレオシドとして選択され得る。具体的には、Ｎ３としてＣを、Ｎ２としてＣをそれぞれ選択することができる。
いくつかの態様において、本開示の変異ｔＲＮＡにはアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している。アミノ酸またはアミノ酸類縁体は、通常、ｔＲＮＡの３’末端に、より具体的には、３’末端のＣＣＡ配列のアデノシン残基に結合している。変異ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体の具体的な種類は、以下の記載のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の中からそれぞれ適宜選択することができる、
本開示におけるアミノ酸には、α－アミノ酸、β－アミノ酸、γ－アミノ酸などが含まれる。立体構造としては、Ｌ型アミノ酸、Ｄ型アミノ酸のいずれも含まれる。また、本開示におけるアミノ酸は、天然アミノ酸および非天然アミノ酸を含む。特定の態様において、天然アミノ酸は、以下の２０種類のα－アミノ酸：グリシン（Ｇｌｙ）、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびプロリン（Ｐｒｏ）からなる。あるいは、上述の２０種類のアミノ酸から、任意の１種類以上のアミノ酸を除いたものを、本開示における天然アミノ酸としてもよい。一態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンを除く１９種類のアミノ酸からなる。一態様において、天然アミノ酸は、メチオニンを除く１９種類のアミノ酸からなる。さらなる態様において、天然アミノ酸は、イソロイシンおよびメチオニンを除く１８種類のアミノ酸からなる。天然アミノ酸は通常、Ｌ型アミノ酸である。
本開示において、非天然アミノ酸とは、上記の２０種類のα－アミノ酸からなる天然アミノ酸を除く全てのアミノ酸を表す。非天然アミノ酸の例として、β－アミノ酸、γ－アミノ酸、Ｄ型アミノ酸、天然アミノ酸とは側鎖が異なるα－アミノ酸、α，α－二置換アミノ酸、主鎖のアミノ基が置換基を有するアミノ酸（Ｎ置換アミノ酸）などを挙げることができる。非天然アミノ酸の側鎖は、特に限定されないが、水素原子の他に、例えばアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルなどを有していてもよい。また、α，α－二置換アミノ酸の場合、２つの側鎖が環を形成していてもよい。さらに、これらの側鎖は、１つ以上の置換基を有していてもよい。特定の態様において、置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。例えば、本開示において「ハロゲンを置換基に有するＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アルキルにおける少なくとも一つの水素原子がハロゲン原子で置換された「Ｃ１－Ｃ６アルキル」を意味し、具体的には、例えば、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、フルオロメチル、ペンタフルオロエチル、テトラフルオロエチル、トリフルオロエチル、ジフルオロエチル、フルオロエチル、トリクロロメチル、ジクロロメチル、クロロメチル、ペンタクロロエチル、テトラクロロエチル、トリクロロエチル、ジクロロエチル、クロロエチルなどを含む。また、例えば「置換基を有するＣ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」とは、アリールおよび／またはアルキルにおける少なくとも一つの水素原子が置換基により置換された「Ｃ５－Ｃ１０アリールＣ１－Ｃ６アルキル」を意味する。さらに、「置換基を２つ以上有している」とは、ある官能基（例えばＳ原子を含む官能基）を置換基として有し、さらにその官能基が別の置換基（例えばアミノやハロゲンなどの置換基）を有していることも含む。非天然アミノ酸の具体的な例としては、ＷＯ２０１３／１００１３２やＷＯ２０１８／１４３１４５なども参照することができる。
非天然アミノ酸の主鎖のアミノ基は、非置換のアミノ基（ＮＨ２基）でもよく、置換されたアミノ基（ＮＨＲ基）であってもよい。ここで、Ｒは、置換基を有していてもよいアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、シクロアルキルを示す。また、プロリンのように主鎖のアミノ基のＮ原子に結合した炭素鎖とα位の炭素原子とが環を形成していてもよい。置換基は、ハロゲン原子、Ｏ原子、Ｓ原子、Ｎ原子、Ｂ原子、Ｓｉ原子、またはＰ原子を含む任意の官能基の中から選択することができる。アミノ基のアルキル置換の例としては、Ｎ－メチル化、Ｎ－エチル化、Ｎ－プロピル化、Ｎ－ブチル化などが、アラルキル置換の例としては、Ｎ－ベンジル化などが挙げられる。Ｎ－メチルアミノ酸の具体的な例としては、Ｎ－メチルアラニン、Ｎ－メチルグリシン、Ｎ－メチルフェニルアラニン、Ｎ－メチルチロシン、Ｎ－メチル－３－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－クロロフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－メトキシフェニルアラニン、Ｎ－メチル－４－チアゾールアラニン、Ｎ－メチルヒスチジン、Ｎ－メチルセリン、Ｎ－メチルアスパラギン酸などを挙げることができる。
ハロゲン原子を含む置換基の例としては、フルオロ（－Ｆ）、クロロ（－Ｃｌ）、ブロモ（－Ｂｒ）、ヨード（－Ｉ）などが挙げられる。
Ｏ原子を含む置換基の例としては、ヒドロキシル（－ＯＨ）、オキシ（－ＯＲ）、カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、カルボキシル（－ＣＯ２Ｈ）、オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）、カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）、カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）、オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）、スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）、アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）、スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）、チオカルボキシル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＳＨ）、カルボキシルカルボニル（－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＯ２Ｈ）などが挙げられる。
オキシ（－ＯＲ）の例としては、アルコキシ、シクロアルコキシ、アルケニルオキシ、アルキニルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、アラルキルオキシなどが挙げられる。
カルボニル（－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、ホルミル（－Ｃ＝Ｏ－Ｈ）、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、アラルキルカルボニルなどが挙げられる。
オキシカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルキルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、アルケニルオキシカルボニル、アルキニルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシカルボニル、アラルキルオキシカルボニルなどが挙げられる。
カルボニルオキシ（－Ｏ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルオキシ、シクロアルキルカルボニルオキシ、アルケニルカルボニルオキシ、アルキニルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、ヘテロアリールカルボニルオキシ、アラルキルカルボニルオキシなどが挙げられる。
チオカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＳＲ）の例としては、アルキルチオカルボニル、シクロアルキルチオカルボニル、アルケニルチオカルボニル、アルキニルチオカルボニル、アリールチオカルボニル、ヘテロアリールチオカルボニル、アラルキルチオカルボニルなどが挙げられる。
カルボニルチオ（－Ｓ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルチオ、シクロアルキルカルボニルチオ、アルケニルカルボニルチオ、アルキニルカルボニルチオ、アリールカルボニルチオ、ヘテロアリールカルボニルチオ、アラルキルカルボニルチオなどが挙げられる。
アミノカルボニル（－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノカルボニル、シクロアルキルアミノカルボニル、アルケニルアミノカルボニル、アルキニルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、ヘテロアリールアミノカルボニル、アラルキルアミノカルボニルなどが挙げられる。さらに、－Ｃ＝Ｏ－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
カルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルカルボニルアミノ、シクロアルキルカルボニルアミノ、アルケニルカルボニルアミノ、アルキニルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
オキシカルボニルアミノ（－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ）の例としては、アルコキシカルボニルアミノ、シクロアルコキシカルボニルアミノ、アルケニルオキシカルボニルアミノ、アルキニルオキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシカルボニルアミノ、アラルキルオキシカルボニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－Ｃ＝Ｏ－ＯＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
スルホニルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニルアミノ、シクロアルキルスルホニルアミノ、アルケニルスルホニルアミノ、アルキニルスルホニルアミノ、アリールスルホニルアミノ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、アラルキルスルホニルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－Ｒ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
アミノスルホニル（－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルアミノスルホニル、シクロアルキルアミノスルホニル、アルケニルアミノスルホニル、アルキニルアミノスルホニル、アリールアミノスルホニル、ヘテロアリールアミノスルホニル、アラルキルアミノスルホニルなどが挙げられる。さらに、－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合したＨ原子は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。
スルファモイルアミノ（－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ）の例としては、アルキルスルファモイルアミノ、シクロアルキルスルファモイルアミノ、アルケニルスルファモイルアミノ、アルキニルスルファモイルアミノ、アリールスルファモイルアミノ、ヘテロアリールスルファモイルアミノ、アラルキルスルファモイルアミノなどが挙げられる。さらに、－ＮＨ－ＳＯ２－ＮＨＲ中のＮ原子と結合した２つのＨ原子のうちの少なくとも１つは、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群より選択される置換基で置換されていてもよい。２つのＨ原子がともに置換されている場合は、それぞれ独立して置換基を選択してもよく、また、これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。
Ｓ原子を含む置換基の例としては、チオール（－ＳＨ）、チオ（－Ｓ－Ｒ）、スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）、スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）、スルホ（－ＳＯ３Ｈ）などが挙げられる。
チオ（－Ｓ－Ｒ）の例としては、アルキルチオ、シクロアルキルチオ、アルケニルチオ、アルキニルチオ、アリールチオ、ヘテロアリールチオ、アラルキルチオなどが挙げられる。
スルフィニル（－Ｓ＝Ｏ－Ｒ）の例としては、アルキルスルフィニル、シクロアルキルスルフィニル、アルケニルスルフィニル、アルキニルスルフィニル、アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、アラルキルスルフィニルなどが挙げられる。
スルホニル（－Ｓ（Ｏ）２－Ｒ）の例としては、アルキルスルホニル、シクロアルキルスルホニル、アルケニルスルホニル、アルキニルスルホニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、アラルキルスルホニルなどが挙げられる。
Ｎ原子を含む置換基の例としては、アジド（－Ｎ３）、シアノ（－ＣＮ）、１級アミノ（－ＮＨ２）、２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）、３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ’））、アミジノ（－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ’Ｒ’’）、グアニジノ（－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）－ＮＨ２）、置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ’’’）－ＮＲ’Ｒ’’）、アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ’Ｒ’’）などが挙げられる。
２級アミノ（－ＮＨ－Ｒ）の例としては、アルキルアミノ、シクロアルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アラルキルアミノなどが挙げられる。
３級アミノ（－ＮＲ（Ｒ’））におけるＮ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ’は、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。３級アミノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）アミノなどが挙げられる。これらの２つの置換基は環を形成していてもよい。
置換アミジノ（－Ｃ（＝ＮＲ）－ＮＲ’Ｒ’’）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。置換アミジノの例としては、例えばアルキル（アラルキル）（アリール）アミジノなどが挙げられる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
置換グアニジノ（－ＮＲ－Ｃ（＝ＮＲ’’’）－ＮＲ’Ｒ’’）におけるＮ原子上の４つの置換基Ｒ、Ｒ’、Ｒ’’、およびＲ’’’は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
アミノカルボニルアミノ（－ＮＲ－ＣＯ－ＮＲ’Ｒ’’）におけるＮ原子上の３つの置換基Ｒ、Ｒ’、およびＲ’’は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
Ｂ原子を含む置換基の例としては、ボリル（－ＢＲ（Ｒ’））やジオキシボリル（－Ｂ（ＯＲ）（ＯＲ’））などが挙げられる。Ｂ原子上の２つの置換基ＲおよびＲ’は、水素原子、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、およびアラルキルからなる群よりそれぞれ独立に選択することができる。これらの置換基は互いに環を形成していてもよい。
本開示におけるアミノ酸類縁体の例として、例えばヒドロキシカルボン酸（ヒドロキシ酸）を挙げることができる。ヒドロキシカルボン酸には、α－ヒドロキシカルボン酸、β－ヒドロキシカルボン酸、γ－ヒドロキシカルボン酸などが含まれる。ヒドロキシカルボン酸におけるα位の炭素には、アミノ酸と同様に、水素原子以外の側鎖が結合していてもよい。立体構造としては、Ｌ型およびＤ型のいずれも含まれ得る。側鎖の構造は、上述の天然アミノ酸または非天然アミノ酸の側鎖と同様に定義することができる。ヒドロキシカルボン酸の例として、ヒドロキシ酢酸、乳酸、フェニル乳酸などを挙げることができる。
本開示におけるアミノ酸は、翻訳可能なアミノ酸であってもよく、アミノ酸類縁体は、翻訳可能なアミノ酸類縁体であってもよい。本明細書において「翻訳可能な」アミノ酸またはアミノ酸類縁体（まとめてアミノ酸等と呼ぶことがある）とは、翻訳合成により（例えば、本開示に記載の翻訳系を用いて）ペプチドに組み込むことが可能なアミノ酸等を意味する。あるアミノ酸等が翻訳可能か否かは、当該アミノ酸等を結合させたｔＲＮＡを用いた翻訳合成実験により確認することができる。翻訳合成実験には再構成の無細胞翻訳系を用いてもよい（例えば、ＷＯ２０１３１００１３２を参照のこと）。
本開示における非天然アミノ酸やアミノ酸類縁体は、従来公知の化学的な合成法や、後述の実施例に記載の合成法、それらに準ずる合成法によって調製することができる。
＜ｔＲＮＡの調製＞
ｔＲＮＡは、例えば、所望のｔＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡを用意し、その上流にＴ７、Ｔ３、あるいはＳＰ６などの適切なプロモーターを配置して、当該ＤＮＡを鋳型に各プロモーターに適応したＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応を行うことによって合成することができる。また、ｔＲＮＡは生物学的材料からの精製によっても調製することができる。例えば、細胞などのｔＲＮＡを含む材料から抽出液を調製して、そこにｔＲＮＡの核酸配列に相補的な配列を含むプローブを添加することによってｔＲＮＡを回収することができる。この際、所望のｔＲＮＡを発現可能な発現ベクターを用意して、当該発現ベクターで形質転換した細胞を材料に調製を行うこともできる。ｉｎ ｖｉｔｒｏの転写によって合成されたｔＲＮＡには、通常、４つの典型的なヌクレオシドであるアデノシン、グアノシン、シチジン、およびウリジンのみが含まれている。一方、細胞内で合成されたｔＲＮＡには、それらを修飾して得られた修飾ヌクレオシドなども含まれていることがある。天然ｔＲＮＡにおける修飾ヌクレオシド（例えばライシジンなど）は、ｔＲＮＡが転写により合成された後に、その修飾を行うための酵素（例えばＴｉｌＳなど）の作用によって、当該ｔＲＮＡに特異的に導入されると考えられている。あるいは、転写によって合成された断片もしくは、後述の実施例に記載のように、化学合成された断片等を酵素反応によって連結する手法によってもｔＲＮＡを調製することができる。
アミノアシルｔＲＮＡも化学的および／または生物学的な合成法によって調製することができる。例えば、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）を用いて、ｔＲＮＡにアミノ酸を結合させることによってアミノアシルｔＲＮＡを合成することができる。アミノ酸はＡＲＳの基質となり得るものであれば、天然アミノ酸であっても、非天然アミノ酸であってもよい。あるいは、天然アミノ酸をｔＲＮＡに結合させた後に、アミノ酸に化学的な修飾を加えてもよい。また、ＡＲＳにアミノ酸変異を導入することによって、非天然アミノ酸に対する作用が高められた例も多数報告されており（例えばＷＯ２００６／１３５０９６、ＷＯ２００７／０６１１３６、ＷＯ２００７／１０３３０７、ＷＯ２００８／００１９４７、ＷＯ２０１０／１４１８５１、ＷＯ２０１５／１２０２８７などを参照）、そのような変異ＡＲＳを用いて、ｔＲＮＡにアミノ酸を結合させてもよい。ＡＲＳを用いる方法以外にも、例えば、ｔＲＮＡの３’末端からＣＡ配列を除去し、そこにアミノアシル化されたｐｄＣｐＡ（デオキシシチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）をＲＮＡリガーゼを用いて結合させることによってアミノアシルｔＲＮＡを合成することができる（ｐｄＣｐＡ法；Ｈｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９７８）２５３：４５１７－４５２０）。ｐｄＣｐＡの代わりにｐＣｐＡ（シチジンおよびアデノシンから構成されるジヌクレオチド）を用いる方法も知られている（ｐＣｐＡ法；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２０１５）１０：２１８７－２１９２）。また、あらかじめエステル化により活性化した非天然型アミノ酸を人工ＲＮＡ触媒（フレキシザイム）を用いてｔＲＮＡに結合させることによってもアミノアシルｔＲＮＡを合成することができる（ＷＯ２００７／０６６６２７）。
＜翻訳系＞
一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した一揃いのｔＲＮＡを提供する。一揃いのｔＲＮＡには、複数の異なる種類のｔＲＮＡが含まれ、それらのｔＲＮＡから複数の異なる種類のアミノ酸を翻訳することができる。一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のｔＲＮＡを含む組成物を提供する。別の局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のｔＲＮＡを提供することを含む、ペプチドの翻訳方法を提供する。一局面において、本開示は、ペプチド翻訳に適した複数の異なる種類のｔＲＮＡを含む翻訳系を提供する。特定の局面において、前記の複数の異なる種類のｔＲＮＡの中に、本開示の変異ｔＲＮＡが含まれる。以下の記載は、これらのペプチド翻訳に適したｔＲＮＡ、組成物、翻訳方法、および翻訳系に関するものである。
一態様において、本開示における変異ｔＲＮＡは、アンチコドンの１文字目（Ｎ１）にライシジン（ｋ２Ｃ）、ライシジン誘導体、アグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）、またはアグマチジン誘導体のいずれかを有している。ライシジンやアグマチジンは、アデノシン（Ａ）と相補的な塩基対を形成することから、コドンにおける役割はウリジン（Ｕ）に相当するものと考えられる。いくつかの態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンとは異なるコドン、例えばＭ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、またはＭ１Ｍ２Ｇで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、およびＭ１Ｍ２Ｇで表されるいずれのコドンと比べても、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
本開示の一態様において、ある変異ｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ａのコドンの翻訳量〕が、〔当該ｔＲＮＡによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、ある変異ｔＲＮＡがＣＵＡで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＡのコドンの翻訳量〕が〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＧのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
ある特定のコドン（例えばＭ１Ｍ２Ａ）が翻訳される量と、それ以外のコドン（例えばＭ１Ｍ２Ｇ）が翻訳される量とを比較する際には、例えば、あるペプチドをコードするｍＲＮＡであって、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンが含まれているｍＲＮＡと、Ｍ１Ｍ２ＡのコドンがＭ１Ｍ２Ｇのコドンに置き換えられている以外は全て前記ｍＲＮＡと同じ核酸配列を有する別のｍＲＮＡを用意して、同じ条件下でそれらの２つのｍＲＮＡを翻訳し、その結果得られた２つのペプチドの合成量を比較することによって行うことができる。
本開示の別の態様において、ある変異ｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ａ以外のコドンの翻訳量〕が、〔ＵＮ２Ｎ３のアンチコドンを有するｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ａ以外のコドンの翻訳量〕よりも少ない、例えば１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／１５以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、あるいは１／１００以下に低下していることを意味する。ここで、ＵＮ２Ｎ３のアンチコドンとは、アンチコドンの１文字目（Ｎ１）がウリジンで、アンチコドンの２文字目（Ｎ２）および３文字目（Ｎ３）がそれぞれＭ２およびＭ１と相補的なヌクレオシドを表す。アンチコドンにおけるライシジンやアグマチジンの役割はウリジンに相当することから、ここではウリジンが比較の対象として選択されている。また、Ｍ１Ｍ２Ａ以外のコドンとは、Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、またはＭ１Ｍ２Ｇで表されるコドンのいずれかであることができる。一例として、ある変異ｔＲＮＡがＣＵＡで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＧのコドンの翻訳量〕が、〔ＵＮ２Ｎ３のアンチコドンを有するｔＲＮＡによるＣＵＧのコドンの翻訳量〕よりも少ない、例えば１／２以下、１／３以下、１／４以下、１／５以下、１／６以下、１／７以下、１／８以下、１／９以下、１／１０以下、１／１５以下、１／２０以下、１／３０以下、１／４０以下、１／５０以下、１／６０以下、１／７０以下、１／８０以下、１／９０以下、あるいは１／１００以下に低下しているか否かによって判断することができる。
別の態様において、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンは、他のｔＲＮＡよりも、本開示の変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る。他のｔＲＮＡとは、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、例えばＭ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、またはＭ１Ｍ２Ｇのいずれかのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡであることができる。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンは、Ｍ１Ｍ２Ｕのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、Ｍ１Ｍ２Ｃのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、およびＭ１Ｍ２Ｇのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡのいずれのｔＲＮＡよりも、本開示の変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る。
本開示の一態様において、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンが、ある変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ａのコドンの翻訳量〕が、〔他のｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ａのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、ＣＵＡで表されるコドンが、ある変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＡのコドンの翻訳量〕が〔ＣＵＧのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ（例えばＣＡＧのアンチコドンを有するｔＲＮＡ）によるＣＵＡのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
本開示の変異ｔＲＮＡを含む翻訳系は、前記の２つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、（ｉ）変異ｔＲＮＡが、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドンが、他のｔＲＮＡよりも、本開示の変異ｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、本開示の変異ｔＲＮＡを用いたペプチド翻訳と、それ以外のｔＲＮＡを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。天然に存在する生物の翻訳系においては、本来、コドンとアミノ酸との間に厳密な対応関係が確立されているため、直交性のない変異ｔＲＮＡがそこに加わることによって、その対応関係が崩れ、翻訳系の機能に致命的な影響が出るおそれがある。よって、本開示の翻訳系において、本開示の変異ｔＲＮＡとそれ以外のｔＲＮＡとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
一態様において、本開示における翻訳系は、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡ（以後、本ｔＲＮＡを“ｔＲＮＡ－Ｇ”とも表記する）をさらに含む。いくつかの態様において、本開示における翻訳系は、（ａ）本開示に記載の変異ｔＲＮＡ、および（ｂ）本開示に記載のｔＲＮＡ－Ｇの少なくとも２つのｔＲＮＡを含む。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばＣＮ２Ｎ３、ａｃ４ＣＮ２Ｎ３、またはＣｍＮ２Ｎ３などが挙げられる。ここで、各アンチコドンの１文字目のヌクレオシドは、シチジン（Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、または２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）であり、なおかつ２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）および３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）はそれぞれ上述のＭ２およびＭ１に相補的なヌクレオシドである。本開示に記載の変異ｔＲＮＡおよびｔＲＮＡ－Ｇは、アンチコドン以外の核酸配列がともに同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら２つのｔＲＮＡの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
いくつかの態様において、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｇは、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンとは異なるコドン、例えばＭ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、またはＭ１Ｍ２Ａで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示のｔＲＮＡ－Ｇは、Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、およびＭ１Ｍ２Ａで表されるいずれのコドンと比べても、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
本開示の一態様において、あるｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２Ｇのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ｇのコドンの翻訳量〕が、〔当該ｔＲＮＡによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、ある変異ｔＲＮＡがＣＵＧで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＧのコドンの翻訳量〕が〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＡのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
別の態様において、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンは、他のｔＲＮＡよりも、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｇによって選択的に翻訳され得る。他のｔＲＮＡとは、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、例えばＭ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、またはＭ１Ｍ２Ａのいずれかのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡであることができる。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンは、Ｍ１Ｍ２Ｕのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、Ｍ１Ｍ２Ｃのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、およびＭ１Ｍ２Ａのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡのいずれのｔＲＮＡよりも、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｇによって選択的に翻訳され得る。
本開示の一態様において、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンが、あるｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ｇのコドンの翻訳量〕が、〔他のｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２Ｇのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、ＣＵＧで表されるコドンが、あるｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＧのコドンの翻訳量〕が〔ＣＵＡのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ（例えばｋ２ＣＡＧのアンチコドンを有するｔＲＮＡ）によるＣＵＧのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
本開示におけるｔＲＮＡ－Ｇを含む翻訳系は、前記の２つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、（ｉ）ｔＲＮＡ－Ｇが、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンが、他のｔＲＮＡよりも、本開示のｔＲＮＡ－Ｇによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、ｔＲＮＡ－Ｇを用いたペプチド翻訳と、それ以外のｔＲＮＡを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、ｔＲＮＡ－Ｇとそれ以外のｔＲＮＡとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
さらなる態様において、本開示における変異ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸－Ａ”とも表記する）と、ｔＲＮＡ－Ｇに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸－Ｇ”とも表記する）とは、アミノ酸の種類が互いに異なっていてもよい。本開示における変異ｔＲＮＡとｔＲＮＡ－Ｇに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンとアミノ酸－Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇのコドンとアミノ酸－Ｇはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する（ｉ）Ｍ１Ｍ２Ａおよび（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２Ｇの２つのコドンから、２種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。
一態様において、本開示における翻訳系は、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡ（以後、本ｔＲＮＡを“ｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃ”とも表記する）をさらに含む。いくつかの態様において、本開示における翻訳系は、（ａ）本開示に記載の変異ｔＲＮＡ、（ｂ）本開示に記載のｔＲＮＡ－Ｇ、および（ｃ）本開示に記載のｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃの少なくとも３つのｔＲＮＡを含む。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２Ｕで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばＡＮ２Ｎ３、ＧＮ２Ｎ３、ＱＮ２Ｎ３、またはＧｌｕＱＮ２Ｎ３などが挙げられる。ここで、各アンチコドンの１文字目のヌクレオシドは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、キューオシン（Ｑ）、またはグルタミルキューオシン（ＧｌｕＱ）であり、なおかつ２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）および３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）はそれぞれ上述のＭ２およびＭ１に相補的なヌクレオシドである。別の態様において、Ｍ１Ｍ２Ｃで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、例えばＧＮ２Ｎ３、ＱＮ２Ｎ３、またはＧｌｕＱＮ２Ｎ３などが挙げられる。Ｍ１Ｍ２ＵおよびＭ１Ｍ２Ｃのコドンに相補的なアンチコドンは、互いに重複するものが多いため、本開示においては、これら２つのコドンを１つのコドンとみなして扱うことも可能である。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンに相補的なアンチコドンとしては、ＡＮ２Ｎ３、ＧＮ２Ｎ３、ＱＮ２Ｎ３、またはＧｌｕＱＮ２Ｎ３などが挙げられる。本開示に記載の変異ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ－Ｇ、およびｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃは、アンチコドン以外の核酸配列が全て同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これら３つのｔＲＮＡの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
いくつかの態様において、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃは、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。他のコドンとは、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンとは異なるコドン、例えばＭ１Ｍ２ＡまたはＭ１Ｍ２Ｇで表されるコドンのいずれかであることができる。特定の態様において、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃは、Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇで表されるいずれのコドンと比べても、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンを選択的に翻訳することができる。
本開示の一態様において、あるｔＲＮＡが、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃのコドンを選択的に翻訳することができるとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃのコドンの翻訳量〕が、〔当該ｔＲＮＡによる他のコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、あるｔＲＮＡがＣＵＵまたはＣＵＣで表されるコドンを選択的に翻訳することができるか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＵまたはＣＵＣのコドンの翻訳量〕が〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＡのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
別の態様において、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンは、他のｔＲＮＡよりも、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃによって選択的に翻訳され得る。他のｔＲＮＡとは、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンとは異なるコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ、例えばＭ１Ｍ２ＡまたはＭ１Ｍ２Ｇのいずれかのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡであることができる。特定の態様において、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンは、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡおよびＭ１Ｍ２Ｇのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡのいずれのｔＲＮＡよりも、本開示におけるｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃによって選択的に翻訳され得る。
本開示の一態様において、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンが、あるｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るとは、〔当該ｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃのコドンの翻訳量〕が、〔他のｔＲＮＡによるＭ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いことを意味する。一例として、ＣＵＵまたはＣＵＣで表されるコドンが、あるｔＲＮＡによって選択的に翻訳され得るか否かは、〔当該ｔＲＮＡによるＣＵＵまたはＣＵＣのコドンの翻訳量〕が〔ＣＵＡのコドンを翻訳し得るｔＲＮＡ（例えばｋ２ＣＡＧのアンチコドンを有するｔＲＮＡ）によるＣＵＵまたはＣＵＣのコドンの翻訳量〕よりも、例えば２倍以上、３倍以上、４倍以上、５倍以上、６倍以上、７倍以上、８倍以上、９倍以上、１０倍以上、１５倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、５０倍以上、６０倍以上、７０倍以上、８０倍以上、９０倍以上、あるいは１００倍以上多いか否かによって判断することができる。
本開示におけるｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃを含む翻訳系は、前記の２つの特徴を併せ持っていてもよい。すなわち、特定の態様において、本開示の翻訳系においては、（ｉ）ｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃが、他のコドンに比べて、Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンを選択的に翻訳することができ、なおかつ、（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンが、他のｔＲＮＡよりも、本開示のｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃによって選択的に翻訳され得る。このような関係が成立している場合、本開示の翻訳系においては、ｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃを用いたペプチド翻訳と、それ以外のｔＲＮＡを用いたペプチド翻訳とが、互いに相互作用を起こさない独立した関係、すなわち直交性を有する（オルソゴナルな）関係にあるということができる。本開示の翻訳系において、ｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃとそれ以外のｔＲＮＡとの間に直交性が確立されていることは、重要な特徴の一つになり得る。
さらなる態様において、本開示における変異ｔＲＮＡに結合しているアミノ酸（“アミノ酸－Ａ”）、ｔＲＮＡ－Ｇに結合しているアミノ酸（“アミノ酸－Ｇ”）、およびｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃに結合しているアミノ酸（以後、本アミノ酸を“アミノ酸－Ｕ／Ｃ”とも表記する）は、アミノ酸の種類がいずれも互いに異なっていてもよい。本開示における変異ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ－Ｇ、およびｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃに関して、上述のようなオルソゴナルな関係が成立している場合、本翻訳系においては、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンとアミノ酸－Ａ、Ｍ１Ｍ２Ｇのコドンとアミノ酸－Ｇ、およびＭ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃのコドンとアミノ酸－Ｕ／Ｃはいずれも一対一の対応関係にある。すなわち、本開示の翻訳系においては、同じコドンボックス内に存在する（ｉ）Ｍ１Ｍ２Ａ、（ｉｉ）Ｍ１Ｍ２Ｇ、および（ｉｉｉ）Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃの３つのコドンから、３種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。あるいは、本開示の翻訳系においては、Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２Ｃ、Ｍ１Ｍ２Ａ、およびＭ１Ｍ２Ｇによって構成されるコドンボックスから、３種類の異なるアミノ酸を翻訳することが可能である。
いくつかの態様において、本開示における変異ｔＲＮＡ、ｔＲＮＡ－Ｇ、およびｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃのうち、少なくとも一つに非天然アミノ酸が結合していてもよい。
いくつかの態様において、遺伝暗号表における少なくとも１つのコドンボックスを構成するコドンに、本開示の変異ｔＲＮＡが割り当てられていてもよい。さらなる態様において、遺伝暗号表における複数のコドンボックスを構成するコドンに、本開示の変異ｔＲＮＡが割り当てられていてもよい。複数のコドンボックスとしては、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、または１６個のコドンボックスであることができる。変異ｔＲＮＡに加えて、ｔＲＮＡ－Ｇが同じコドンボックスを構成する他のコドン（変異ｔＲＮＡが割り当てられるコドンとは異なるコドン）に割り当てられていてもよく、あるいは、さらにｔＲＮＡ－Ｕ／Ｃが同じコドンボックスを構成する他のコドン（変異ｔＲＮＡが割り当てられるコドンおよびｔＲＮＡ－Ｇが割り当てられるコドンとは異なるコドン）に割り当てられていてもよい。それぞれのｔＲＮＡがどのコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるかは、当該ｔＲＮＡが有するアンチコドンの２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）および３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）によって決定される。異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるｔＲＮＡどうしであれば、互いに異なるＮ２およびＮ３を有している。また、異なるコドンボックスを構成するコドンに割り当てられるｔＲＮＡどうしは、アンチコドン以外の核酸配列が同一であってもよいし、互いに異なっていてもよい。アンチコドン以外の核酸配列が同一である場合、これらのｔＲＮＡの物理化学的性質が互いに類似したものになり得るため、反応性がより均質で安定した翻訳系を構築できる可能性がある。
いくつかの態様において、本開示の翻訳系から、１種類、２種類、３種類、４種類、５種類、６種類、７種類、８種類、９種類、１０種類、１１種類、１２種類、１３種類、１４種類、１５種類、１６種類、１７種類、１８種類、１９種類、または２０種類のアミノ酸を翻訳することができる。あるいは、本開示の変異ｔＲＮＡを用いて、１つのコドンボックスにおけるＭ１Ｍ２ＡとＭ１Ｍ２Ｇのコドンの読み分けを行えば、２０種類より多くのアミノ酸を翻訳することも可能である。さらなる態様において、本開示の翻訳系から、例えば２１種類、２２種類、２３種類、２４種類、２５種類、２６種類、２７種類、２８種類、２９種類、３０種類、３１種類、３２種類、３３種類、３４種類、３５種類、３６種類、３７種類、３８種類、３９種類、４０種類、４１種類、４２種類、４３種類、４４種類、４５種類、４６種類、４７種類、または４８種類のアミノ酸を翻訳することが可能である。
いくつかの態様において、本開示の翻訳系は、無細胞翻訳系である。さらなる態様において、本開示の翻訳系は、再構成型の無細胞翻訳系である。無細胞翻訳系における細胞抽出液やペプチド翻訳に必要な因子（例えばリボソームなど）は、種々の生物材料に由来するものを利用することができる。そのような生物材料として、例えば、大腸菌、酵母、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、ＨｅＬａ細胞、あるいは昆虫細胞などを挙げることができる。
一局面において、本開示は、ペプチドの製造方法であって、本開示に記載の翻訳系を用いて核酸を翻訳することを含む方法を提供する。２つ以上のアミノ酸がアミド結合によって結合した化合物が、本開示のペプチドに含まれ得る。また、アミノ酸の代わりにヒドロキシカルボン酸などのアミノ酸類縁体がエステル結合によって結合した化合物も、本開示のペプチドに含まれ得る。ペプチドに含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は２個以上であれば特に限定されないが、例えば２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上などが挙げられ、また、１００個以下、８０個以下、５０個以下、３０個以下、２５個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下などが挙げられる。あるいは、９個、１０個、１１個、１２個の中から選択することもできる。
一態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸を含んでいてもよく、ペプチドに含まれるＮ置換アミノ酸の数は、例えば２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個などであることができる。また、別の態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換されていないアミノ酸を含んでいてもよく、Ｎ置換されていないアミノ酸の数は、例えば１個、２個、３個、４個などであることができる。さらなる態様において、本開示のペプチドは、Ｎ置換アミノ酸とＮ置換されていないアミノ酸の両方を含んでいてもよい。
いくつかの態様において、本開示のペプチドは、直鎖状のペプチドであってもよいし、環状部を有するペプチドであってもよい。環状部を有するペプチドとは、ペプチド鎖上に存在するあるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖が、同じペプチド鎖上に存在する別のアミノ酸またはアミノ酸類縁体の主鎖あるいは側鎖と結合することによって、分子内に環状構造が形成されたペプチドを意味する。環状部を有するペプチドは、環状部のみから構成されていてもよいし、環状部と直鎖部をともに含んでいてもよい。環状部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上などであり、また、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下などであることができる。あるいは、９個、１０個、１１個の中から選択することもできる。また、直鎖部に含まれるアミノ酸またはアミノ酸類縁体の数は、例えば０個以上であり、また、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下などであることができる。あるいは、０個、１個、２個、３個の中から選択することもできる。
環状部を形成するための結合としては、例えば、アミノ基とカルボキシル基から形成されるペプチド結合を利用することができる。それ以外にも、適切な官能基の組合せから形成されるアミド結合、ジスルフィド結合、エーテル結合、チオエーテル結合、エステル結合、チオエステル結合、炭素－炭素結合、アルキル結合、アルケニル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、アミン結合、Ｃ＝Ｎ－Ｃ結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、チオアミド結合、スルフィニル結合、スルホニル結合、トリアゾール結合、ベンゾオキサゾール結合などを利用することができる。炭素－炭素結合は、鈴木（Ｓｕｚｕｋｉ）反応、ヘック（Ｈｅｃｋ）反応、薗頭（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ）反応などの遷移金属を触媒とした反応によって形成することができる。一態様において、本開示のペプチドは、分子内において上記の結合を形成することが可能な少なくとも１組の官能基を含んでいる。環状部の形成は、本開示の翻訳系を用いて直鎖状のペプチドが製造された後に、上記の官能基どうしを結合させるための反応を別途行うことによってなされてもよい。環状部を有するペプチドの合成については、ＷＯ２０１３／１００１３２、ＷＯ２０１２／０２６５６６、ＷＯ２０１２／０３３１５４、ＷＯ２０１２／０７４１３０、ＷＯ２０１５／０３００１４、ＷＯ２０１８／０５２００２、Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ（２０１０）１３：７５－８７、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００９）５：５０２－５０７、Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ（２００９）５：８８８－９０、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ（２００７）１８：４６９－４７６、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ（２００９）１０：７８７－７９８、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）（２０１１）４７：９９４６－９９５８なども参照することができる。
いくつかの態様において、本開示の翻訳系において翻訳される核酸はｍＲＮＡである。ｍＲＮＡには、所望のアミノ酸配列を有するペプチドがコードされていてもよい。ｍＲＮＡを本開示の翻訳系に添加することによって、当該ｍＲＮＡのペプチドへの翻訳を行うことができる。一方、ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するためのＲＮＡポリメラーゼが翻訳系に含まれている場合、ＤＮＡを本開示の翻訳系に添加することによって、当該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写、および当該ｍＲＮＡのペプチドへの翻訳を併せて行うことができる。
翻訳されるペプチドのＮ末端には通常、開始アミノ酸としてメチオニンが存在しているが、メチオニン以外のアミノ酸をＮ末端に導入するための方法もいくつか報告されている。それらを本開示に記載のペプチドの製造方法と組み合わせて用いてもよい。そのような方法として、例えば、メチオニン以外のアミノ酸でアミノアシル化された開始ｔＲＮＡを用いて、所望のアミノ酸から開始されるペプチドを翻訳する方法が挙げられる（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）。特に、外来性のアミノ酸を許容し得る程度としては、ペプチド鎖の伸長時よりも翻訳開始時の方が高いことから、Ｎ末端では、天然アミノ酸と大きく構造の異なるアミノ酸であっても利用できる可能性がある（Ｇｏｔｏ ＆ Ｓｕｇａ，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ（２００９）１３１（１４）：５０４０－５０４１）。他の方法として、翻訳系から開始メチオニルｔＲＮＡを除去することにより、あるいは、開始アミノ酸をメチオニン以外の翻訳効率の低いアミノ酸に置き換えることにより、２番目以降のコドンから翻訳を開始する方法が挙げられる（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｒｅａｄ－ｔｈｒｏｕｇｈ；開始コドンの読み飛ばし）。さらに別法として、ペプチドデホルミラーゼ（ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｆｏｒｍｙｌａｓｅ）およびメチオニンアミノペプチダーゼ（Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）などの酵素を作用させることによって、ペプチドのＮ末端のメチオニンを削除する方法を挙げることもできる（Ｍｅｉｎｎｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９９３）７５：１０６１－１０７５）。メチオニンから開始されるペプチドライブラリーを用意し、これに上記の酵素を作用させることによって、Ｎ末端がランダムなアミノ酸から開始されるペプチドライブラリーを調製することができる。
別の局面において、本開示は、本開示に記載のペプチドの製造方法によって製造されたペプチドを提供する。本開示に記載の方法により製造されたペプチドに対して、さらに化学修飾を行うなどして得られたペプチドもまた、本開示が提供するペプチドに含まれる。
一局面において、本開示は、ペプチドライブラリーの製造方法であって、本開示に記載の翻訳系を用いて核酸ライブラリーを翻訳することを含む方法を提供する。ペプチドをそれぞれコードする核酸分子であって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を用意し、それらをそれぞれペプチドに翻訳することによって、アミノ酸配列の多様性に富んだ複数のペプチド分子を製造することができる。ライブラリーのサイズは特に限定されないが、例えば、１０６以上、１０７以上、１０８以上、１０９以上、１０１０以上、１０１１以上、１０１２以上、１０１３以上、１０１４以上などであることができる。核酸はＤＮＡであってもよいし、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡは通常ｍＲＮＡである。ＤＮＡはｍＲＮＡへの転写を介してペプチドへの翻訳が行われる。そのような核酸ライブラリーは、当業者に公知の方法またはそれに準ずる方法によって調製することができる。核酸ライブラリーを合成する際、所望の位置に混合塩基を用いることによって、核酸配列の多様性に富んだ複数の核酸分子を容易に調製することができる。混合塩基を用いたコドンの例として、例えばＮＮＮ（ここで、ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４塩基の混合を表す）やＮＮＷ（ここで、ＷはＡ、Ｔの２塩基の混合を表す）、ＮＮＭ（ここで、ＷはＡ、Ｃの２塩基の混合を表す）、ＮＮＫ（ここで、ＫはＧ、Ｔの２塩基の混合を表す）、ＮＮＳ（ここで、ＳはＣ、Ｇの２塩基の混合を表す）などを挙げることができる。あるいは、コドンの３文字目で用いられる塩基を、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃのうちのいずれか１種類に限定することで、一部の特定のアミノ酸のみがコードされた核酸ライブラリーを合成することも可能である。さらに、混合塩基を含むコドンを作成する際、複数の塩基を等比ではなく異なる比率で混合することによって、そのコドンから得られるアミノ酸の出現頻度を任意に調節することも可能である。上記のようなコドンを１単位（ユニット）として、種類の異なるコドンユニットを複数用意し、それらを所望の順序で連結すれば、含まれるアミノ酸の出現位置や出現頻度が制御されたライブラリーをデザインすることも可能となる。
いくつかの態様において、本開示に記載のペプチドライブラリーは、ペプチドが核酸上に提示されたライブラリー（核酸ディスプレイライブラリー、あるいは単にディスプレイライブラリー）である。ディスプレイライブラリーは、ペプチドとそれをコードする核酸が結合して１つの複合体を形成することによって、表現型と遺伝子型が対応付けられていることを特徴とするライブラリーである。主なディスプレイライブラリーの例として、ｍＲＮＡディスプレイ法（Ｒｏｂｅｒｔｓ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９７）９４：１２２９７－１２３０２）、ｉｎ ｖｉｔｒｏウィルス法（Ｎｅｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ（１９９７）４１４：４０５－４０８）、ｃＤＮＡディスプレイ法（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００９）３７：ｅ１０８）、リボソームディスプレイ法（Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４）９１：９０２２－９０２６）、ｃｏｖａｌｅｎｔディスプレイ法（Ｒｅｉｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ（２００５）３３：ｅ１０）、ＣＩＳディスプレイ法（Ｏｄｅｇｒｉｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（２００４）１０１：２８０６－２８１０）などで作製されたライブラリーを挙げることができる。あるいは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ法（Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９８）１６：６５２－６５６）を用いて作製されたライブラリーも、ディスプレイライブラリーの一態様として挙げることができる。
別の局面において、本開示は、本開示に記載のペプチドライブラリーの製造方法によって製造されたペプチドライブラリーを提供する。
一局面において、本開示は、標的分子に対して結合活性を有するペプチドの同定方法であって、本開示に記載のペプチドライブラリーに標的分子を接触させることを含む方法を提供する。標的分子は特に限定されず、例えば低分子化合物、高分子化合物、核酸、ペプチド、タンパク質、糖、脂質などの中から適宜選択することができる。標的分子は細胞外に存在する分子であってもよく、細胞内に存在する分子であってもよい。あるいは細胞膜に存在する分子であってもよく、その場合、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、細胞内ドメインのいずれが標的となってもよい。ペプチドライブラリーと標的分子を接触させる工程において、通常、標的分子は何らかの固相担体（例えばマイクロタイタープレートやマイクロビーズなど）に固定される。その後、標的分子に結合していないペプチドを除去して、標的分子に結合しているペプチドのみを回収することによって、標的分子に対して結合活性を有するペプチドを選択的に濃縮することができる（パニング法）。用いたペプチドライブラリーが核酸ディスプレイライブラリーの場合、回収されたペプチドにその遺伝情報がコードされた核酸が結合しているので、それらを単離し解析することによって、回収されたペプチドをコードする核酸配列およびアミノ酸配列を容易に同定することができる。さらに、得られた核酸配列あるいはアミノ酸配列をもとに、化学合成あるいは遺伝子組み換え手法などにより、同定されたペプチドを個別に製造することもできる。
一局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
（ｉ）ペプチドをコードする核酸配列の中に、Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇの２つのコドンが含まれていて、かつ、
（ｉｉ）ペプチドのアミノ酸配列において、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンに対応するアミノ酸およびＭ１Ｍ２Ｇのコドンに対応するアミノ酸の種類が互いに異なる。
ここで、Ｍ１およびＭ２は、ある特定のコドンの１文字目および２文字目をそれぞれ表す（ただし、Ｍ１がＡであり、かつＭ２がＵであるコドンは除く）。
さらなる局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
（ｉ）ペプチドをコードする核酸配列の中に、Ｍ１Ｍ２Ｕ、Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇの３つのコドンが含まれていて、かつ、
（ｉｉ）ペプチドのアミノ酸配列において、Ｍ１Ｍ２Ｕのコドンに対応するアミノ酸、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンに対応するアミノ酸、およびＭ１Ｍ２Ｇのコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。
ここで、Ｍ１およびＭ２は、ある特定のコドンの１文字目および２文字目をそれぞれ表す。
別の局面において、本開示は、ペプチドおよび該ペプチドをコードする核酸を含む核酸－ペプチド複合体であって、以下の特徴を有する複合体を提供する：
（ｉ）ペプチドをコードする核酸配列の中に、Ｍ１Ｍ２Ｃ、Ｍ１Ｍ２ＡおよびＭ１Ｍ２Ｇの３つのコドンが含まれていて、かつ、
（ｉｉ）ペプチドのアミノ酸配列において、Ｍ１Ｍ２Ｃのコドンに対応するアミノ酸、Ｍ１Ｍ２Ａのコドンに対応するアミノ酸、およびＭ１Ｍ２Ｇのコドンに対応するアミノ酸の種類がいずれも互いに異なる。
ここで、Ｍ１およびＭ２は、ある特定のコドンの１文字目および２文字目をそれぞれ表す。
いくつかの態様において、上述の核酸－ペプチド複合体は、ペプチドライブラリー（特に核酸ディスプレイライブラリー）を構成する要素の１つとしてそこに含まれ得る。一態様において、本開示は、本開示に記載の核酸－ペプチド複合体を含むライブラリー（ペプチドライブラリーあるいは核酸ディスプレイライブラリー）を提供する。特定の態様において、上述の核酸－ペプチド複合体およびライブラリーは、本開示に記載の変異ｔＲＮＡ、あるいは本開示に記載の翻訳系を用いて作製され得る。
一局面において、本開示は以下の化合物、即ちライシジン－ジホスフェート（ｐＬｐ）、またはその塩を提供する。
Figure 2023182649000035
このような化合物は、ライシジンが導入された変異ｔＲＮＡの調製に用いることができる。したがって本開示は、ライシジン‐ジホスフェートを用いて、ライシジンが導入された変異ｔＲＮＡを製造する方法、および当該方法によって製造される変異ｔＲＮＡに関する。また本開示は、ライシジン‐ジホスフェートを用いて、ライシジンが導入された変異ｔＲＮＡであって、アミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異ｔＲＮＡ（アミノアシル変異ｔＲＮＡ）を製造する方法、および当該方法によって製造されるアミノアシル変異ｔＲＮＡに関する。このような変異ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル変異ｔＲＮＡは、本開示における翻訳系において使用することができる。したがって本開示は、このような変異ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル変異ｔＲＮＡを含む翻訳系に関する。さらに本開示は、当該翻訳系を使用してペプチドまたはペプチドライブラリーを製造する方法をも提供する。また本開示は、当該方法によって製造されるペプチドまたはペプチドライブラリーをも提供する。
本開示においては、ライシジンはｔＲＮＡの３４位（ｔＲＮＡナンバリング則に基づく）に導入されていてもよい。一態様において、ｔＲＮＡナンバリング則の３４位にライシジンが導入された変異ｔＲＮＡは、１または複数（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のｔＲＮＡの核酸断片とライシジン‐ジホスフェートを調製し、これらを当業者に公知の手法によりライゲーションすることにより取得することができる。具体的には、一例として、ｔＲＮＡの１位から３３位の塩基からなる核酸断片、ライシジン‐ジホスフェート、ｔＲＮＡの３５位から７６位（またはｔＲＮＡの３５位から７５位、ｔＲＮＡの３５位から７４位）の塩基からなる核酸断片を、５’側からこれらの順にライゲーションすることが挙げられる。３’末端のＣＡ配列は除去されていてもよい。
一局面において、本開示は以下の化合物、即ちアグマチジン‐ジホスフェート（ｐ（Ａｇｍ）ｐ）、またはその塩を提供する。
Figure 2023182649000036
このような化合物は、アグマチジンが導入された変異ｔＲＮＡの調製に用いることができる。したがって本開示は、アグマチジン‐ジホスフェートを用いて、アグマチジンが導入された変異ｔＲＮＡを製造する方法、および当該方法によって製造される変異ｔＲＮＡに関する。また本開示は、アグマチジン‐ジホスフェートを用いて、アグマチジンが導入された変異ｔＲＮＡであって、アミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している変異ｔＲＮＡ（アミノアシル変異ｔＲＮＡ）を製造する方法、および当該方法によって製造されるアミノアシル変異ｔＲＮＡに関する。このような変異ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル変異ｔＲＮＡは、本開示における翻訳系において使用することができる。したがって本開示は、このような変異ｔＲＮＡおよび／またはアミノアシル変異ｔＲＮＡを含む翻訳系に関する。さらに本開示は、当該翻訳系を使用してペプチドまたはペプチドライブラリーを製造する方法をも提供する。また本開示は、当該方法によって製造されるペプチドまたはペプチドライブラリーをも提供する。
本開示においては、アグマチジンはｔＲＮＡの３４位（ｔＲＮＡナンバリング則に基づく）に導入されていてもよい。一態様において、ｔＲＮＡナンバリング則の３４位にアグマチジンが導入された変異ｔＲＮＡは、１または複数（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）のｔＲＮＡの核酸断片とアグマチジン‐ジホスフェートを調製し、これらを当業者に公知の手法によりライゲーションすることにより取得することができる。具体的には、一例として、ｔＲＮＡの１位から３３位の塩基からなる核酸断片、アグマチジン‐ジホスフェート、ｔＲＮＡの３５位から７６位（またはｔＲＮＡの３５位から７５位、ｔＲＮＡの３５位から７４位）の塩基からなる核酸断片を、５’側からこれらの順にライゲーションすることが挙げられる。３’末端のＣＡ配列は除去されていてもよい。
本開示の化合物は、遊離体であることも塩であることもできる。本開示の化合物の塩としては、例えば、塩酸塩；臭化水素酸塩；ヨウ化水素酸塩；リン酸塩；ホスホン酸塩；硫酸塩；メタンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩などのスルホン酸塩；酢酸塩、クエン酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、サリチル酸塩などのカルボン酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩、アルキルアンモニウム塩、ジアルキルアンモニウム塩、トリアルキルアンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩などのアンモニウム塩などが挙げられる。本開示の化合物の塩は、例えば、本開示の化合物を酸や塩基と接触させることにより製造される。本開示の化合物は、水和物となる場合があり、そのような水和物も本開示の化合物の塩に含まれる。また本開示の化合物は、溶媒和物となる場合があり、そのような溶媒和物も、本開示の化合物の塩に含まれる。
一局面において、本発明は、下記式Ａで表されるライシジン二リン酸もしくはその誘導体、またはアグマチジン二リン酸もしくはその誘導体の製造方法に関する。
Figure 2023182649000037
式Ａ中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、Ｒ１およびＲ２が共にＨであることが好ましい。
式Ａ中、Ｌは、ヒドロキシおよびＣ１－Ｃ３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよい。Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンはＣ４－Ｃ５直鎖アルキレンであることが好ましく、またＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンは、Ｃ４－Ｃ５直鎖アルケニレンであることが好ましい。このようなＬとして具体的には、たとえば、－（ＣＨ２）３－、－（ＣＨ２）４－、－（ＣＨ２）５、－（ＣＨ２）２－Ｏ－ＣＨ２－、－（ＣＨ２）２－Ｓ－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）２－、または－ＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ－（シスまたはトランス）などが挙げられる。
式Ａ中、Ｍは、単結合、
Figure 2023182649000038
である。波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示す。Ｍが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。たとえば、Ｍが
Figure 2023182649000039
である場合、式Ａの化合物は、以下：
Figure 2023182649000040
のとおりに表すことができ、Ｍが
Figure 2023182649000041
である場合、式Ａの化合物は、以下：
Figure 2023182649000042
のとおりに表すことができ、Ｍが単結合である場合、式Ａの化合物は以下：
Figure 2023182649000043
のとおりに表すことができる。
式Ａで表される化合物として好ましくは、ライシジン二リン酸、アグマチジン二リン酸、またはこれらの塩である。
ある態様において、式Ａで表される化合物は、以下のスキーム１に沿って製造することができる。
スキーム１：
Figure 2023182649000044
Figure 2023182649000045
Figure 2023182649000046
Figure 2023182649000047
スキーム１の工程１は、式Ｂ１で表される化合物を分子内で環化して、式Ｃ１で表される化合物を得る工程である。この工程は、分子内環化試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
式Ｂ１で表される化合物は、商業的供給業者から入手するか、あるいは文献既知の方法を用いて製造することができる。式Ｂ１中のＰＧ１１は、アミノ基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ１１として具体的には、たとえば、ｐ－ブロモベンゾイル、置換されていてもよいベンゾイル、ピリジンカルボニル、アセチルなどが例示される。
分子内環化試薬は、特に限定されないが、アゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンを好ましく用いることができる。
溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンを好ましく用いることができる。
スキーム１の工程２は、式Ｃ１で表される化合物に式Ｄ１で表されるアミンを導入して、式Ｅ１で表される化合物を得る工程である。この工程は、アミン導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
アミン導入試薬は、特に限定されないが、塩化リチウムおよびＤＢＵを好ましく用いることができる。
溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、本工程ではテトラヒドロフランが好ましく用いられる。
スキーム１の工程３Ａおよび工程３Ｂは、式Ｅ１で表される化合物にＰＧ１２および／またはＰＧ１３を導入して、式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂで表される化合物を得る工程である。式Ｅ１のＲ２がアルキルである場合には、ＰＧ１３のみが導入されて式Ｆ１Ａとなり、式Ｅ１のＲ２が水素である場合には、ＰＧ１２およびＰＧ１３が導入されて、式Ｆ１Ｂとなる。この工程は、保護基導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
ＰＧ１２はアミノ基の保護基であり、ＰＧ１３はカルボキシル基またはイミノ基の保護基である。これらの保護基は、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ１２としてはＦｍｏｃが好ましく用いられ、ＰＧ１３としてはＭが
Figure 2023182649000048
の場合にはメチル、エチル、または置換されていてもよいベンジルが、Ｍが
Figure 2023182649000049
の場合には置換されていてもよいベンジル、Ｃｂｚまたは置換されていてもよいベンジルオキシカルボニルが好ましく用いられる。ＰＧ１２とＰＧ１３は同時に導入してもよく、順番に導入してもよい。順番に導入する場合には、ＰＧ１２とＰＧ１３のどちらを先に導入してもよいが、ＰＧ１２を導入し、次いでＰＧ１３を導入することが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ１２がＦｍｏｃである場合には、その導入に、炭酸（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチルおよび炭酸ナトリウムを用いることが好ましく、ＰＧ１３がメチルである場合には、その導入にＮ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド、メタノール、およびＮ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジンを用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、Ｆｍｏｃの導入にはジオキサンが、メチルの導入にはジクロロメタンがそれぞれ好ましく用いられる。
スキーム１の工程４Ａおよび工程４Ｂは、式Ｆ１Ａまたは式Ｆ１Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ１４およびＰＧ１５を導入して式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物を得る工程である。アセトニドの除去は酸の存在下で、保護基の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
ＰＧ１４およびＰＧ１５はそれぞれ独立して水酸基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、例えばフッ化物イオンによって脱保護されるシリル系の保護基を好ましく用いることができる。ＰＧ１４およびＰＧ１５としてはこれらが一緒になって二価の保護基を形成することが好ましく、そのような保護基として具体的には、たとえば、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルが挙げられる。アセトニドの除去、および保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができるが、アセトニドの除去に用いる酸としてはＴＦＡが好ましい。またＰＧ１４およびＰＧ１５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する場合には、その導入には、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを用いることが好ましい。
アセトニドの除去に用いる溶媒としては、水、カルボン酸系溶媒を挙げることができ、水とＴＦＡの混合溶媒を好ましく用いることができる。また、ＰＧ１４およびＰＧ１５の導入には、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＤＭＦが好ましく用いられる。
スキーム１の工程５Ａおよび工程５Ｂは、式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物にＰＧ１６を導入して式Ｈ１Ａまたは式Ｈ１Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ１６の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
ＰＧ１６は、水酸基および／またはアミノ基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、フッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ１６としてはＴＯＭが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ１６がＴＯＭである場合には、その導入に、ＤＩＰＥＡ、および塩化（トリイソプロピルシロキシ）メチルを用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンが好ましく用いられる。
スキーム１の工程６Ａおよび工程６Ｂは、式Ｇ１Ａまたは式Ｇ１Ｂで表される化合物からＰＧ１４およびＰＧ１５を除去して式Ｉ１Ａまたは式Ｉ１Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ１４およびＰＧ１５の除去は脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
脱保護試薬は、ＰＧ１４およびＰＧ１５のみを選択的に除去することができれば、任意の試薬を用いることができるが、ＰＧ１４およびＰＧ１５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する場合には、その除去にフッ化物イオンを生じる試薬、具体的には、たとえばフッ化水素ピリジンコンプレックスを用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＴＨＦが好ましく用いられる。
スキーム１の工程７Ａおよび工程７Ｂは、式Ｉ１ＡまたはＩ１Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂで表される化合物を得る工程である。亜リン酸エステル化は、亜リン酸エステル化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。酸化は、酸化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。亜リン酸エステル化後に化合物を単離してもよいが、亜リン酸エステル化反応と酸化反応をワンポットで行うことが好ましい。
式Ｊ１ＡまたはＪ１Ｂ中、ＰＧ１７は、水酸基の保護基であり、上記スキーム１に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３と同時に脱保護できる保護基が好ましい。ＰＧ１７としては具体的には、たとえば、シアノエチルが挙げられる。水酸基が保護基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いてもよく、無保護の亜リン酸エステル化試薬を用いたのちに、水酸基に保護基を導入してもよい。保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができる。水酸基がシアノエチル基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いる場合、亜リン酸エステル化試薬としては、ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノホスホルアミジットが好ましく用いられる。亜リン酸エステル化に続く酸化に用いる酸化剤は、特に限定されないが、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドを好ましく用いることができる。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、アセトニトリルが好ましく用いられる。
スキーム１の工程８Ａおよび工程８Ｂは、式Ｊ１Ａで表される化合物からＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、およびＰＧ１７を除去して、あるいは式Ｊ１Ｂで表される化合物からＰＧ１１、ＰＧ１３、およびＰＧ１７を除去して、式Ｋ１で表される化合物を得る工程である。これら保護基の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
脱保護試薬は、上記の保護基が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができる。このような試薬として、具体的には、たとえば、ビス－（トリメチルシリル）アセトアミドおよびＤＢＵを組み合わせて用いることが挙げられる。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、アミン系溶媒を挙げることができ、ピリジンが好ましく用いられる。
スキーム１の工程９は、式Ｋ１で表される化合物からＰＧ１６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程である。ＰＧ１６の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
脱保護試薬は、ＰＧ１６が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができ、フッ化アンモニウムを好ましく用いることができる。
溶媒としては、例えば、水、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、水とアセトニトリルの混合溶媒を好ましく用いることができる。
ある態様において、式Ａで表される化合物は、以下のスキーム２に沿って製造することができる。
スキーム２：
Figure 2023182649000050
Figure 2023182649000051
Figure 2023182649000052
Figure 2023182649000053
スキーム２の工程１は、式Ｂ２で表される化合物を分子内で環化して、式Ｃ２で表される化合物を得る工程である。この工程は、分子内環化試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
式Ｂ２で表される化合物は、商業的供給業者から入手するか、あるいは文献既知の方法を用いて製造することができる。式Ｂ２中のＰＧ２１は、アミノ基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、酸やフッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ２１として具体的には、たとえば、Ｃｂｚ、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、または置換されていてもよいベンジルなどが例示される。
分子内環化試薬は、特に限定されないが、アゾジカルボン酸ジイソプロピルおよびトリフェニルホスフィンを好ましく用いることができる。
溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンを好ましく用いることができる。
スキーム２の工程２は、式Ｃ２で表される化合物に式Ｄ２ＡまたはＤ２Ｂで表されるアミンを導入して、式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物を得る工程である。この工程は、アミン導入試薬の存在下、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
アミン導入試薬は、特に限定されないが、塩化リチウムおよびＤＢＵを好ましく用いることができる。
溶媒としては、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒を挙げることができ、本工程ではＴＨＦが好ましく用いられる。
スキーム２の工程３Ａおよび工程３Ｂは、式Ｅ２ＡまたはＥ２Ｂで表される化合物からアセトニドを除去し、ＰＧ２４およびＰＧ２５を導入して、式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物を得る工程である。アセトニドの除去は酸の存在下で、保護基の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
ＰＧ２４およびＰＧ２５はそれぞれ独立して水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、例えばフッ化物イオンによって脱保護されるシリル系の保護基を好ましく用いることができる。ＰＧ２４およびＰＧ２５としてはこれらが一緒になって二価の保護基を形成することが好ましく、そのような保護基として具体的には、たとえば、ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルが挙げられる。アセトニドの除去、および保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができるが、アセトニドの除去に用いる酸としてはＴＦＡが好ましい。またＰＧ２４およびＰＧ２５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する場合には、その導入には、ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを用いることが好ましい。
アセトニドの除去に用いる溶媒としては、水、カルボン酸系溶媒を挙げることができ、水とＴＦＡの混合溶媒を好ましく用いることができ、ＰＧ２４およびＰＧ２５の導入には、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＤＭＦが好ましく用いられる。
スキーム２の工程４Ａおよび工程４Ｂは、式Ｆ２ＡまたはＦ２Ｂで表される化合物にＰＧ２６を導入して、式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ２６の導入は保護基導入試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
ＰＧ２６は、水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、たとえば、フッ化物イオンによって脱保護されない保護基が好ましい。ＰＧ２６としてはテトラヒドロピラニル、テトラヒドロフラニル、またはメトキシメチルが好ましい。保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができるが、ＰＧ１６がテトラヒドロピラニルである場合には、その導入に、ＴＦＡ、および３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピランを用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ジクロロメタンが好ましく用いられる。
スキーム２の工程５Ａおよび工程５Ｂは、式Ｇ２ＡまたはＧ２Ｂで表される化合物からＰＧ２４およびＰＧ２５を除去して、式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を得る工程である。ＰＧ２４およびＰＧ２５の除去は脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
脱保護試薬は、ＰＧ２４およびＰＧ２５のみを選択的に除去することができれば、任意の試薬を用いることができるが、ＰＧ２４およびＰＧ２５が一緒になってジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリルを形成する場合には、その除去にフッ化物イオンを生じる試薬、具体的には、たとえばテトラブチルアンモニウムフルオリドを用いることが好ましい。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、アミド系溶媒を挙げることができ、ＴＨＦが好ましく用いられる。
スキーム２の工程６Ａおよび工程６Ｂは、式Ｈ２ＡまたはＨ２Ｂで表される化合物を亜リン酸エステル化し、次いで酸化して、式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂで表される化合物を得る工程である。亜リン酸エステル化は、亜リン酸エステル化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。酸化は、酸化試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。亜リン酸エステル化後に化合物を単離してもよいが、亜リン酸エステル化反応と酸化反応をワンポットで行うことが好ましい。
式Ｉ２ＡまたはＩ２Ｂ中、ＰＧ２７は、水酸基の保護基であり、上記スキーム２に沿った反応の進行に支障がないかぎり、任意の保護基を使用することができ、ＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３と同時に脱保護できる保護基が好ましい。ＰＧ２７としては具体的には、たとえば、ベンジルが挙げられる。水酸基が保護基で保護された亜リン酸エステル化試薬を用いてもよく、無保護の亜リン酸エステル化試薬を用いたのちに、水酸基に保護基を導入してもよい。保護基の導入には、例えば、「Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ，“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第５版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ２０１４）」に記載の方法を利用することができる。水酸基がベンジルで保護された亜リン酸エステル化試薬を用いる場合、亜リン酸エステル化試薬としては、ジベンジルＮ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイトが好ましく用いられる。亜リン酸エステル化に続く酸化に用いる酸化剤は、特に限定されないが、デス－マーチンペルヨージナンを好ましく用いることができる。
溶媒としては、例えば、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、アセトニトリルが好ましく用いられる。
スキーム２の工程７Ａおよび工程７Ｂは、Ｉ２Ａで表される化合物からＰＧ２１、ＰＧ２２、ＰＧ２３、およびＰＧ２７を除去して、あるいは式Ｉ２Ｂで表される化合物からＰＧ２１、ＰＧ２３、およびＰＧ２７を除去して、式Ｊ２で表される化合物を得る工程である。これら保護基の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
上記の保護基を選択的に除去することができれば、脱保護には任意の方法を使用することができる。このような方法として具体的には、たとえば、接触水素化が挙げられる。接触水素化には、Ｐｄ系触媒、例えばパラジウム／炭素を好ましく用いることができる。
溶媒としては、例えば、水、アルコール系溶媒、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒、アミン系溶媒を挙げることができ、水とメタノールの混合溶媒を好ましく用いることができる。
スキーム２の工程８は、式Ｊ２で表される化合物からＰＧ２６を除去して、式Ａで表される化合物を得る工程である。ＰＧ２６の除去は、脱保護試薬の存在下で、溶媒中、－２０℃～溶媒の沸点付近の温度、好ましくは０℃～１８０℃の温度で、反応混合物を１５分～４８時間攪拌することで行うことができる。
脱保護試薬は、ＰＧ２６が選択的に除去することができれば任意の試薬を使用することができ、塩酸を好ましく用いることができる。
溶媒としては、例えば、水、ハロゲン化溶媒、エーテル系溶媒、ベンゼン系溶媒、エステル系溶媒、ケトン系溶媒、ニトリル系溶媒を挙げることができ、水を好ましく用いることができる。
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、下記の実施例に限定されるものではない。
なお、実施例中では以下の略号を使用した。
ＡＡ 酢酸アンモニウム
ＣＨ２ＣＮ シアノメチル基
ＤＢＵ １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＩＣ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＦＡ ギ酸
Ｆｍｏｃ ９－フルオレニルメチルオキシカルボニル基
Ｆ－Ｐｎａｚ ４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジルオキシカルボニル基：
Figure 2023182649000054
ＨＦＩＰ １，１，１，３，３，３－ヘキサフルオロ－２－プロパノール
ＭｅＣＮ アセトニトリル
ＮＭＰ Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＦＥ ２，２，２－トリフルオロエタノール
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
また、本実施例では、以下の略号を用いた。ＧｌｙまたはＧ（グリシン）、ＩｌｅまたはＩ（イソロイシン）、ＬｅｕまたはＬ（ロイシン）、ＰｈｅまたはＦ（フェニルアラニン）、ＰｒｏまたはＰ（プロリン）、ＴｈｒまたはＴ（トレオニン）。これらに加えて、表２に記載の略号を用いた。
Figure 2023182649000055
また、ＬＣＭＳの分析条件を、下記の表３及び表３－１に示す。
Figure 2023182649000056
Figure 2023182649000057
実施例１．ｌｉｇａｔｉｏｎ法によりｔＲＮＡ断片の３’末端にＵｒｉｄｉｎｅユニットを導入するためのＵｒｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの合成
ｔＲＮＡ断片の３’末端にＵｒｉｄｉｎｅユニットをｌｉｇａｔｉｏｎ法により導入するために、文献（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００３，３１（２２），ｅ１４５）記載の方法を参考にしＵｒｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＳ０１、ｐＵｐ）を合成した。
リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－３－（ホスホノオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ＳＳ０２）とリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ヒドロキシ－４－（ホスホノオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ＳＳ０３）の混合物（化合物ＳＳ０１、ｐＵｐ）の合成
Figure 2023182649000058
１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン（１０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）およびピロリン酸テトラクロリド（５６．６μＬ、０．４０９ｍｍｏｌ）を氷浴下で混合した。反応混合物を０℃で５時間撹拌後、氷冷した純水（３８ｍＬ）および重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー（１Ｍ、２ｍＬ）を氷冷下で加えた。混合物をＤＥＡＥーＳｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５カラムクロマトグラフィー（０．０５Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー⇒１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムバッファー）にて精製し、集めた溶液を減圧下で濃縮した。得られた残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて精製し、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－３－（ホスホノオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ＳＳ０２）とリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（２，４－ジオキソ－３，４－ジヒドロピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－ヒドロキシ－４－（ホスホノオキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ＳＳ０３）の混合物（化合物ＳＳ０１、ｐＵｐ）の水溶液（１００μＬ、４０．３０ｍＭ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４０３（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．７９分、１．８９分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０１）
実施例２．ｌｉｇａｔｉｏｎ法によりｔＲＮＡ断片の３’末端にＬｙｓｉｄｉｎｅユニットを導入するためのＬｙｓｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの合成
ｔＲＮＡ断片の３’末端にＬｙｓｉｄｉｎｅユニットをｌｉｇａｔｉｏｎ法により導入するために、Ｌｙｓｉｄｉｎｅのｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＳ０４、ｐＬｐ）を合成した。
Figure 2023182649000059
Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）の合成
Figure 2023182649000060
窒素雰囲気下、（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｌ－リシン 塩酸塩（８１３ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（２１３ｍｇ、５．０２ｍｍｏｌ）および文献（Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ．２０１２，１４（１６），４１１８－４１２１）記載の方法で合成したＮ４－ｐ－ブロモベンゾイル－２’，３’－Ｏ－イソプロピリデン－Ｏ２，５’－シクロシチジン（３００ｍｇ、０．６７ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（６．７ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、ＤＢＵ（１．５０ｍＬ、１０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌後、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ水溶液／０．１％ＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）（３３５．６ｍｇ、７１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５９４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）の合成
Figure 2023182649000061
Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０５）（３１１．１２ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）および炭酸（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（１４８．０９ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（２．７５ｍｌ）と超純水（１．６５ｍｌ）の混合溶媒に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後炭酸ナトリウム（１８６．２２ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）（３２８．７８ｍｇ、８０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝８１６（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０７）の合成
Figure 2023182649000062
窒素雰囲気下、Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン化合物 ２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物ＳＳ０６）（４３８．６０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４．７１ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（２２１．４０μｌ、１．４１ｍｍｏｌ）、メタノール（３８２．０７μｌ、９．４２ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ－ジメチル－４－アミノピリジン（１１．５１ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で２時間攪拌した。反応液を濃縮し、残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０７）（４０５．００ｍｇ、９１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ ８２８（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）の合成
Figure 2023182649000063
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチルテトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０７）（３０８．７０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（８．７１ｍｌ）と超純水（４．３６ｍｌ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で４５分間攪拌した。反応液を濃縮し、粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）（２９６．００ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝７９０（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－ヒドロキシテトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ０９）の合成
Figure 2023182649000064
窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート ２，２，２－トリフルオロアセタート（化合物ＳＳ０８）（２９６．００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．２７ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（２１１．８０μｌ、０．６５ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で１時間攪拌した。さらにビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（１５８．８５μｌ、０．４９ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で３０分間攪拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ＤＣＭで得られた混合物の抽出操作を行い有機層を飽和食塩水で洗浄した。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮した。得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ノルマルヘキサン／酢酸エチル、ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－ヒドロキシテトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ０９）（２７３．８０ｍｇ、９０％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝９２８．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１０）の合成
Figure 2023182649000065
窒素雰囲気下、メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－ヒドロキシテトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ０９）（３８６．１５ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（８．３０ｍｌ）に室温にて溶解し、ＤＩＰＥＡ（７２２．８８μｌ、４．１５ｍｍｏｌ）および塩化（トリイソプロピルシロキシ）メチル（４８１．４０μｌ、２．０７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を４５℃で３時間撹拌後、室温に戻しＤＩＰＥＡ（７２２．８８μｌ、４．１５ｍｍｏｌ）および塩化（トリイソプロピルシロキシ）メチル（４８１．４０μｌ、２．０７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４５℃で４時間攪拌した。室温に戻し、ＤＭＳＯを加えた後に窒素を吹き付けＤＣＭを除き、得られたＤＭＳＯ溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製した。得られたフラクションを飽和炭酸水素ナトリウムで中和し、酢酸エチルで目的化合物の抽出操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、減圧濃縮し、メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１０）（２９１．５５ｍｇ、５４％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１３０３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．８４分（分析条件ＳＱＤＦＡ５０）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１１）の合成
Figure 2023182649000066
窒素雰囲気下、メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジ－ｔｅｒｔ－ブチル－７－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１０）（１４１．５５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．１７ｍｌ）に室温にて溶解し、―８０℃に冷却した。フッ化水素ピリジンコンプレックス（～３０％ピリジン、～７０％フッ化水素）（９．８５μｌ）をピリジン（１３４．４１μｌ）で希釈したものを―８０℃で加え、反応混合物を―１５℃で１５分間撹拌した。―８０℃に冷却後、メトキシトリメチルシラン（７．０ｍｌ）を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製した。得られたフラクションを飽和炭酸水素ナトリウムで中和し、酢酸エチルで目的化合物の抽出操作を行った。得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過後、トルエンを加えて減圧濃縮し、粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１１）（６１．５３ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１１）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１６２．８（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１２）の合成
Figure 2023182649000067
窒素雰囲気下、粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１１）（６１．５３ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（４４．４８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．５３ｍｌ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルアミノ ホスホルアミジット（８２．７７μｌ、０．３２ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で３時間攪拌した。ｔｅｒｔ－ブチル ヒドロペルオキシド，５－６Ｍ ｉｎ デカン（３０３．９２μｌ、３．１７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１０分間攪拌した後に、反応液を濃縮し、得られた残渣を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ノルマルヘキサン／酢酸エチル、ジクロロメタン／メタノール）にて精製し、粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１２）（５４．３３ｍｇ）を得た。得られた粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１２）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１５３４．９（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：３．６２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５ｌｏｎｇ）
Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ１３）の合成
Figure 2023182649000068
窒素雰囲気下、粗生成物メチル Ｎ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）－５－（（（ビス（２－シアノエトキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（４－ブロモ－Ｎ－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）ベンズアミド）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシナート（化合物ＳＳ１２）（５４．３３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）をピリジン（２．３６ｍｌ）に室温にて溶解し、ビス－（トリメチルシリル）アセトアミド（３４５．９８μｌ、１．４２ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（８４．６４μｌ、０．５７ｍｍｏｌ）を加えて室温で４５分間攪拌した。反応液に超純水を加え、ジエチルエーテルおよびノルマルヘキサンで洗浄した。得られた水層にトルエンおよびアセトニトリルを加えて減圧濃縮し、粗生成物Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ１３）を得た。得られた粗生成物Ｎ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ１３）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝９０４．７（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
Ｎ６－（４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の合成
Figure 2023182649000069
粗生成物メチルＮ６－（１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）－３－（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メトキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）－４－（（（（トリイソプロピルシリル）オキシ）メチル）アミノ）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ１３）をアセトニトリル（８８５μｌ）と超純水（８８５μｌ）の混合溶媒に室温にて溶解し、フッ化アンモニウム（１５．７３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２．５時間攪拌した。室温に戻し、フッ化アンモニウム（１５．７３ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加し６０℃で１時間攪拌した。室温に戻し、窒素を吹き付けアセトニトリルを除き、得られた水溶液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて精製し、Ｎ６－（４－アミノ－１－（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－（ホスホノオキシ）－５－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２（１Ｈ）－イリデン）－Ｌ－リシン（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の水溶液（１００μｌ、１７．２０ｍＭ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５３０（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）
実施例３．ｌｉｇａｔｉｏｎ法によりｔＲＮＡ断片の３’末端にＬｙｓｉｄｉｎｅユニットを導入するためのＬｙｓｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの合成 別法
ｔＲＮＡ断片の３’末端にＬｙｓｉｄｉｎｅユニットをｌｉｇａｔｉｏｎ法により導入するために用いるＬｙｓｉｄｉｎｅのｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの合成法を改良した。すなわち、以下のスキームに従い、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＳ０４、ｐＬｐ）を合成した。
Figure 2023182649000070
（（３ａＲ，４Ｒ，１２Ｒ，１２ａＲ）－２，２－ジメチル－３ａ，４，１２，１２ａ－テトラヒドロ－５Ｈ，８Ｈ－４，１２－エポキシ［１，３］ジオキソロ［４，５－ｅ］ピリミド［２，１－ｂ］［１，３］オキサゾシン－８－イリデン）カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）の合成
Figure 2023182649000071
窒素雰囲気下、文献（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２００３，１４（４），１８３－１９４）既知化合物２’，３’－Ｏ－イソプロピリデン－４－Ｎ－（ベンジル－オキシ－カルボニル）－シチジン（７１８．２ｍｇ、１．７２ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（４７４ｍｇ、１．８１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＣＭ（１７．２ｍＬ）を添加した。混合物を氷浴で冷却後、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（３８５μＬ、１．９８ｍｍｏｌ）を加えて室温に昇温後室温で１．５時間攪拌した。反応液を濃縮し、トルエン（２０ｍＬ）を加えたのち、生じた沈殿物をろ過により回収した。トルエンを用いて得られた固体を３回洗浄し、（（３ａＲ，４Ｒ，１２Ｒ，１２ａＲ）－２，２－ジメチル－３ａ，４，１２，１２ａ－テトラヒドロ－５Ｈ，８Ｈ－４，１２－エポキシ［１，３］ジオキソロ［４，５－ｅ］ピリミド［２，１－ｂ］［１，３］オキサゾシン－８－イリデン）カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（５２５．７ｍｇ、７６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４００．３（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．４８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）の合成
Figure 2023182649000072
窒素雰囲気下、（（３ａＲ，４Ｒ，１２Ｒ，１２ａＲ）－２，２－ジメチル－３ａ，４，１２，１２ａ－テトラヒドロ－５Ｈ，８Ｈ－４，１２－エポキシ［１，３］ジオキソロ［４，５－ｅ］ピリミド［２，１－ｂ］［１，３］オキサゾシン－８－イリデン）カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（３００ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（１５９ｍｇ、３．７６ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（７．５ｍＬ）を添加し氷浴で冷却した。その混合物に、ベンジル（（ベンジルオキシ）カルボニル）－Ｌ－リシナート ベンゼンスルホナート（８１３ｍｇ、２．０１ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（６７３μＬ、４．５１ｍｍｏｌ）の混合物にＴＨＦ（７．５ｍＬ）を加えたものを氷浴下で添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。反応液に氷浴下でＤＭＳＯを加え、室温に昇温後反応液を濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）（７２６．６ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝７６８．６（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル （２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）の合成
Figure 2023182649000073
ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２５）（２８１．１ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（４．２４ｍＬ）と超純水（２．１２ｍＬ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で５０分間攪拌した。トルエンおよびアセトニトリルを加え反応液を濃縮した。この操作を数回繰り返して水およびＴＦＡを留去し、粗生成物ベンジル （２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）（２７２．６ｍｇ）を得た。得られた粗生成物ベンジル （２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝７２８．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）の合成
Figure 2023182649000074
窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル （２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２６）（２５８ｍｇ、０．３０６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（３．０６ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（３９６μｌ、１．２２ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で２時間攪拌した。反応液に氷浴下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）（２３４．０ｍｇ、７８％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝８６８．８（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）の合成
Figure 2023182649000075
窒素雰囲気下、ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２７）（３０ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＴＦＡ（６．９８μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（６１０μＬ）に室温にて溶解し、３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（８３μＬ、０．９１５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１３時間撹拌後、トルエンを加え反応液を濃縮し、粗生成物ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られた粗生成物ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝９５２．８（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．１７分、３．３８分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）
（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）の合成
Figure 2023182649000076
窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル （２Ｓ）－６－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ヘキサノアート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ２８）をＴＨＦ（６１０μＬ）に室温にて溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオリド（～１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液）（３０５μＬ、～０．３０５ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。反応液にＤＭＳＯを加えて濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ ＡＡ水溶液／１０ｍＭ ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）（２１．５１ｍｇ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝８１２．７（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．７４分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）
（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）の合成
Figure 2023182649000077
窒素雰囲気下、（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ２９）（２１．５１ｍｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（２２．２２ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１．０６ｍＬ）に室温にて溶解し、ジベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（５３．２μｌ、０．１５９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１時間攪拌した。デス－マーチンペルヨージナン（１３５ｍｇ、０．３１７ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分間攪拌した後に、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ ＡＡ水溶液／１０ｍＭ ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）（３６．５９ｍｇ、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１３３２．８（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．０８分、３．１１分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）
（２Ｓ）－２－アミノ－６－［［４－アミノ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－ホスホノオキシ－５－（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の合成
Figure 2023182649000078
（２Ｓ）－２－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－６－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸ベンジル（化合物ＳＳ３０）（３６．５９ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）をメタノール（６４９μＬ）と超純水（１５２μＬ）の混合溶媒に室温にて溶解し、窒素雰囲気下でパラジウム／炭素（Ｐｄ１０％）（５．８４ｍｇ、５．４８μｍｏｌ）を加えた。水素雰囲気下、室温で１８時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。得られたろ液（２４．６６ｍＬ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２．７４ｍＬ、２．７４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１時間静置した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。ろ液を凍結乾燥したのち得られた粉体を再度超純水（１．５２ｍＬ）を用いて溶解し、遠心分離を行い上澄みを回収することで（２Ｓ）－２－アミノ－６－［［４－アミノ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３－ヒドロキシ－４－ホスホノオキシ－５－（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ヘキサン酸（化合物ＳＳ０４、ｐＬｐ）の水溶液（１．３７ｍＬ、１７．４７ｍＭ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５３０．１（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６０分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）
実施例２にて合成した化合物ＳＳ０４を分析してから実施例３にて合成した化合物ＳＳ０４を分析するまでの間にカラムの交換を実施している。実施例２にて合成した化合物ＳＳ０４をカラム交換後に再分析し、実施例３にて合成した化合物ＳＳ０４と同一であることを確認した。その結果を以下に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５３０．１（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．６０分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）
実施例４．ｌｉｇａｔｉｏｎ法によりｔＲＮＡ断片の３’末端にＡｇｍａｔｉｄｉｎｅユニットを導入するためのＡｇｍａｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅの合成
ｔＲＮＡ断片の３’末端にＡｇｍａｔｉｄｉｎｅユニットをｌｉｇａｔｉｏｎ法により導入するために、Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅのｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅを合成した。すなわち、以下のスキームに従い、Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ－ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）を合成した。
Figure 2023182649000079
ベンジル Ｎ－［（４－アミノブチルアミノ）－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；塩酸塩（化合物ＳＳ３２）の合成
Figure 2023182649000080
窒素雰囲気下、文献（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，２１（２６），９３７０－９３７９）既知化合物Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（２４１ｍｇ、０．４８３ｍｍｏｌ）に氷浴下にて４Ｎ－ＨＣｌ／１，４－Ｄｉｏｘａｎｅ（３．６３ｍＬ）を添加し、室温に昇温後２０分間攪拌した。ｎ－ヘキサンを加えたのち、反応液を濃縮しベンジル Ｎ－［（４－アミノブチルアミノ）－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；塩酸塩（化合物ＳＳ３２）（２５６．５ｍｇ）を定量的に得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝３９９．４（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：０．６１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）の合成
Figure 2023182649000081
窒素雰囲気下、ベンジル Ｎ－［（４－アミノブチルアミノ）－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；塩酸塩（ＳＳ３２）（６５．１ｍｇ、０．１５０ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（１１２μＬ、０．７４８ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＴＨＦ（０．９９８ｍＬ）を添加し氷浴で冷却した。その混合物に、（（３ａＲ，４Ｒ，１２Ｒ，１２ａＲ）－２，２－ジメチル－３ａ，４，１２，１２ａ－テトラヒドロ－５Ｈ，８Ｈ－４，１２－エポキシ［１，３］ジオキソロ［４，５－ｅ］ピリミド［２，１－ｂ］［１，３］オキサゾシン－８－イリデン）カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ２４）（４９．８ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ）および塩化リチウム（２６．４ｍｇ、０．６２４ｍｍｏｌ）の混合物にＴＨＦ（１．４９７ｍＬ）を加えたものを氷浴下で添加し、反応混合物を超音波洗浄機で粉砕後氷浴下で６０分間撹拌した。反応液に氷浴下でＤＭＳＯを加え、室温に昇温後反応液を濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）（７４．０ｍｇ、６５％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝７９６．６（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）の合成
Figure 2023182649000082
ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（３ａＲ，４Ｒ，６Ｒ，６ａＲ）－６－（ヒドロキシメチル）－２，２－ジメチル－３ａ，４，６，６ａ－テトラヒドロフロ［３，４－ｄ］［１，３］ジオキソール－４－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３３）（１０９．５ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（１．６０ｍＬ）と超純水（０．８０ｍＬ）の混合溶媒に氷浴で冷却しながら溶解し、混合物を室温で４５分間攪拌した。トルエンを加え反応液を濃縮する操作を数回繰り返して水およびＴＦＡを留去し、粗生成物ベンジル Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）（１０５ｍｇ）を得た。得られた粗生成物ベンジル Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝７５６．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）の合成
Figure 2023182649000083
窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ジヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３４）（１０５ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．２０ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（７８μＬ、０．２４１ｍｍｏｌ）を加えて氷浴下で１時間攪拌した。さらにビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（７８μＬ、０．２４１ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で３０分間攪拌した。さらにビス（トリフルオロメタンスルホン酸）ジ－ｔｅｒｔ－ブチルシリル（１９．５μＬ、０．０６０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で１５分間攪拌した。反応液に氷浴下で飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、得られた混合物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ＴＦＡ水溶液／０．０５％ＴＦＡアセトニトリル溶液）にて精製し、ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）（１０８．０２ｍｇ、８９％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝８９６．７（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９１分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）の合成
Figure 2023182649000084
窒素雰囲気下、ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＳ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－ヒドロキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３５）（６４．５１ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）および３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（１７３μＬ、１．９１２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１．２８ｍＬ）に溶解し、混合物を氷浴で冷却後ＴＦＡ（１４．６０μＬ、０．１９１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に昇温し２２．５時間撹拌後、トルエンを加え反応液を濃縮し、粗生成物ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られた粗生成物ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をそのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝９８０．９（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：３．５１分、３．７２分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）
Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）の合成
Figure 2023182649000085
窒素雰囲気下、前工程にて得られた粗生成物ベンジル Ｎ－［［４－［［１－［（４ａＲ，６Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）－２，２－ジテルト－ブチル－７－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－４ａ，６，７，７ａ－テトラヒドロ－４Ｈ－フロ［３，２－ｄ］［１，３，２］ジオキサシリン－６－イル］－４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）メチレン］カルバマート；２，２，２－トリフルオロ酢酸（化合物ＳＳ３６）をＴＨＦ（１．２８ｍＬ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後テトラブチルアンモニウムフルオリド（～１ｍｏｌ／Ｌテトラヒドロフラン溶液）（６３８μＬ、～０．６３８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温に昇温し３０分間撹拌後、反応液にＤＭＳＯを加えて濃縮しＴＨＦを留去した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ ＡＡ水溶液／１０ｍＭ ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）（４０．６２ｍｇ、７６％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝８４０．７（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：２．２７分（分析条件ＳＱＤＡＡ５０ｌｏｎｇ）
Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）の合成
Figure 2023182649000086
窒素雰囲気下、Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ヒドロキシ－５－（ヒドロキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３７）（４０．６２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）および１Ｈ―テトラゾール（４０．６ｍｇ、０．５７９ｍｍｏｌ）をトルエンに溶解し濃縮した。その残渣をアセトニトリル（１．９３ｍＬ）に室温にて溶解し、混合物を氷浴で冷却後ジベンジル Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロアミダイト（９７μｌ、０．２８９ｍｍｏｌ）を加えて反応混合物を室温に昇温し２．５時間撹拌した。デス－マーチンペルヨージナン（２４６ｍｇ、０．５７９ｍｍｏｌ）を加えて室温で１５分間攪拌した後に、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（１０ｍＭ ＡＡ水溶液／１０ｍＭ ＡＡアセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）（５９．６６ｍｇ、９１％、２ｓｔｅｐｓ）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１３６３．０（Ｍ＋Ｈ）＋
保持時間：４．１１分、４．１４分（分析条件ＳＱＤＡＡ０５ｌｏｎｇ）
リン酸二水素 ［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－［４－アミノ－２－（４－グアニジノブチルイミノ）ピリミジン－１－イル］－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル］（化合物ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）の合成
Figure 2023182649000087
Ｎ－［ベンジルオキシカルボニルアミノ－［４－［［４－（ベンジルオキシカルボニルアミノ）－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－４－ジベンジルオキシホスホリルオキシ－５－（ジベンジルオキシホスホリルオキシメチル）－３－テトラヒドロピラン－２－イルオキシ－テトラヒドロフラン－２－イル］ピリミジン－２－イリデン］アミノ］ブチルアミノ］メチレン］カルバミン酸ベンジル（化合物ＳＳ３８）（３０．５９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）をメタノール（７２７μＬ）と超純水（１７１μＬ）の混合溶媒に室温にて溶解し、窒素雰囲気下でパラジウム／炭素（Ｐｄ１０％）（４．７８ｍｇ、４．４９μｍｏｌ）を加えた。水素雰囲気下、室温で７時間攪拌した。反応液をセライトろ過し、超純水を用いて数回洗浄した。得られたろ液（２５ｍＬ）に１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（２．７８ｍＬ、２．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて４５分間静置した。反応液を凍結乾燥したのちに得られた粉体を超純水を用いて溶解し、セライトろ過し超純水を用いて数回洗浄した。ろ液を凍結乾燥したのちに得られた粉体を超純水（１．７ｍＬ）を用いて溶解し、遠心分離を行い上澄みを回収することでリン酸二水素［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－［４－アミノ－２－（４－グアニジノブチルイミノ）ピリミジン－１－イル］－４－ヒドロキシ－２－（ホスホノオキシメチル）テトラヒドロフラン－３－イル］（化合物ＳＳ３１、ｐ（Ａｇｍ）ｐ）の水溶液（１．６１ｍＬ、１２．１１ｍＭ、８７％、２ｓｔｅｐｓ）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５１４．１（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：１．５８分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０２）
実施例５．無細胞翻訳系に用いるｐＣｐＡ－アミノ酸の合成
以下のスキームに従い、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４、ＳＳ１５、ＳＳ１６、ＳＳ３９、ＳＳ４０）を合成した。
Figure 2023182649000088
（Ｓ）－１－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ピペリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000089
窒素雰囲気下、（Ｓ）－ピペリジン－２－カルボン酸（４２．６ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（１４０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＦ（３３０μＬ）を添加した。室温で５分撹拌した後、トリエチルアミン（１０５．６μＬ、２．２５ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。反応混合物を室温において３０分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）－１－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ピペリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）（９２ｍｇ、６７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４１３（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
（Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボン酸 １－（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル） ２－（シアノメチル）（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000090
窒素雰囲気下、（（Ｓ）－１－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）ピペリジン－２－カルボン酸（化合物ＳＳ１７、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＨ）（３０ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（２０．２３μＬ、０．１１６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（９０μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（５．３４μＬ、０．０８０ｍｍｏｌ）を０℃において加え、室温で２時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボン酸 １－（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル） ２－（シアノメチル）（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（２．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４５２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７９分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
（２Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボン酸 １－（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル） ２－（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル）（化合物ＳＳ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000091
緩衝液Ａ（４０ｍＬ）に、文献（Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，９０，２９７－３１０）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１１３ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）－ピペリジン－１，２－ジカルボン酸 １－（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル） ２－（シアノメチル）（化合物ＳＳ１８、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ＯＣＨ２ＣＮ）（３５．４ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（２．００ｍＬ）を投与し、室温で１５０分撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（２．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で４５分撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１４、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｐｉｃ２－ｐＣｐＡ）（６．０ｍｇ、７．３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１０４７．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５０分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
なお、緩衝液Ａは以下のように調製した。
Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム 塩化物（６．４０ｇ、２０ｍｍｏｌ）とイミダゾール（６．８１ｇ、１００ｍｍｏｌ）の水溶液に酢酸を添加し、ｐＨ８、２０ｍＭ Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルヘキサデカン－１－アミニウム、１００ｍＭイミダゾールの緩衝液Ａ（１Ｌ）を得た。
Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000092
窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成したＯ－（２－クロロフェニル）－Ｌ－セリン（化合物ａａ６３）（１．２５ｇ、５．８０ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（０．９５ｇ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）（１．８ｇ、７３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５２３（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．２６分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ１）
シアノメチル Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000093
窒素雰囲気下、Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ１９、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＨ）（８００ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．４１２ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１５ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（７６０ｍｇ、６．３４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で１６時間撹拌した。反応液を濃縮し、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、シアノメチル Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２２０ｍｇ、２６％）を得た。得られた生成物をアセトニトリル（５ｍＬ）に溶解し、次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５６２（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．１５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ２）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000094
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル Ｏ－（２－クロロフェニル）－Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ２０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２２０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを使い１５分以上かけて滴下し、室温で５分撹拌した。続いて、反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥した後に、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１５、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳＰｈ２Ｃｌ－ｐＣｐＡ）（２０．７ｍｇ、２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１３３．４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000095
特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成した（Ｓ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ａａ１１）（１５０ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）に室温にてＤＣＭ（９０３μＬ）、水（９０３μＬ）およびピペリジン（１７８μＬ、１．８０５ｍｍｏｌ）を室温にて添加した。反応混合物を室温において３０分間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（５５ｍｇ、７９％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１９２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．１５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000096
窒素雰囲気下、（（Ｓ）－２－（メチルアミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２１、ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（３５．１ｍｇ、０．１８２ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（８５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（７２７μＬ）を添加した。トリエチルアミン（７６μＬ、０．５４５ｍｍｏｌ）を５０℃にて添加した。反応混合物を４０℃において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（８０ｍｇ、９２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４７７（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000097
窒素雰囲気下、（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸（化合物ＳＳ２２、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＨ）（７７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３１μＬ、０．１７６ｍｍｏｌ）の混合物にアセトニトリル（５３３μＬ）を室温にて加えた。その後、２－ブロモアセトニトリル（８６μＬ、１．２８０ｍｍｏｌ）を室温において加え、反応混合物を４０℃において１時間撹拌した。反応液を濃縮し、粗生成物（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ２ＣＮ）を得た。得られた粗生成物をアセトニトリル（５．００ｍＬ）に溶解し、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５１６（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．９２分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（２Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ＳＳ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000098
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（１２７ｍｇ、０．１７６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）（メチル）アミノ）－４－フェニルブタン酸シアノメチル（化合物ＳＳ２３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ＯＣＨ２ＣＮ）（８３ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５．００ｍＬ）を投与し、室温で１時間撹拌した。反応液を０℃に冷却した後に、トリフルオロ酢酸（５．００ｍＬ）を加えた。反応液を０℃で１時間撹拌したのちに、反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、その後さらに逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ１６、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＭｅＨｐｈ－ｐＣｐＡ）（２６ｍｇ、１４．６％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１１１．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．６４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000099
窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の方法で合成した（Ｓ）－２－アミノ－３－（３－クロロフェニル）プロパン酸（Ｈ－Ｐｈｅ（３－Ｃｌ）－ＯＨ）（２．１７ｇ、１０．８７ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（３．０ｇ、７．０７ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．４３ｇ、１４．１３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）（０．７ｇ、２０％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５０７（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．０６分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）
（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000100
窒素雰囲気下、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸（化合物ＳＳ４１、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＨ）（６５０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（０．３４６ｇ、２．６８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２８ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（６４０ｍｇ、５．３４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（３３０ｍｇ、４７％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５４６（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．１３分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）
（２Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸 （２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル（化合物ＳＳ３９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000101
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，９０，２９７－３１０）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（５５２ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（Ｓ）－３－（３－クロロフェニル）－２－（（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）アミノ）プロパン酸シアノメチル（化合物ＳＳ４２、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ＯＣＨ２ＣＮ）（２００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で３０分撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ３９、Ｆ－Ｐｎａｚ－Ｆ３Ｃｌ－ｐＣｐＡ）（２５．３ｍｇ、１％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１１７．４（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000102
窒素雰囲気下、特許文献（ＷＯ２０１８２２５８６４）記載の化合物Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリン（Ｈ－Ｓｅｒ（ｉＰｅｎ）－ＯＨ）（１ｇ、５．７１ｍｍｏｌ）、特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した炭酸－（４－ニトロフェニル）－４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル（化合物ｔｓ１１）（２ｇ、４．７１ｍｍｏｌ）の混合物に室温にてＤＭＳＯ（１５ｍＬ）、トリエチルアミン（１．３ｍＬ、９．４２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温において１６時間撹拌したのち、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ギ酸水溶液／０．１％ギ酸アセトニトリル溶液）にて精製し、Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）（１．８ｇ、８３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４８３（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．０４分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ３）
シアノメチル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000103
窒素雰囲気下、Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリン（化合物ＳＳ４３、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＨ）（１．８ｇ、３．９１ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（１ｇ、７．７４ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４０ｍＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１．９ｇ、１５．８４ｍｍｏｌ）を室温において加え、室温で４８時間撹拌した。反応液を濃縮し、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／石油エーテル）にて精製し、シアノメチル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１．６ｇ、８２％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝５２２（Ｍ＋Ｎａ）＋
保持時間：１．３５分（分析条件ＳＭＤ ｍｅｔｈｏｄ４）
（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（ホスホノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ４０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000104
緩衝液Ａ（１００ｍＬ）に、文献（Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ，９０，２９７－３１０）記載の方法で合成したリン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（４００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）を溶解させ、シアノメチル Ｎ－（（（４－（２－（４－フルオロフェニル）アセトアミド）ベンジル）オキシ）カルボニル）－Ｏ－イソペンチル－Ｌ－セリナート（化合物ＳＳ４４、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１３９ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（５ｍＬ）をシリンジポンプを用いて１５分以上かけて滴下し、室温で３時間撹拌した。反応液にトリフルオロ酢酸（２．３ｍＬ）を加えた。反応液を凍結乾燥したのちに、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％トリフルオロ酢酸水溶液／０．０５％トリフルオロ酢酸アセトニトリル）にて精製し、表題化合物（化合物ＳＳ４０、Ｆ－Ｐｎａｚ－ＳｉＰｅｎ－ｐＣｐＡ）（３９．５ｍｇ、３％）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１０９３．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
実施例６．ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ（ＭＴ０１）の合成
（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000105
窒素雰囲気下、３－（２－カルボキシエチル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム（２００ｍｇ，０．６８５ｍｍｏｌ）と１－ヒドロキシピロリジン－２，５－ジオン（８７ｍｇ，０．７５３ｍｍｏｌ） のＮＭＰ（４．５ｍｌ）溶液にＤＩＣ（０．１２８ｍｌ，０．８２２ｍｍｏｌ）を室温で加えたのち、４０℃で終夜撹拌した。室温に戻したのち、反応液にＬ－フェニルアラニン（１１３ｍｇ，０．６８５ｍｍｏｌ）とＴＥＡ（０．１９１ｍｌ，１．３６９ｍｍｏｌ）を加え、４０℃で終夜撹拌した。反応液を逆相カラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＨ）（１０２ ｍｇ， ３４％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４３８．３（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７８分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ ２ ＣＮ）の合成
Figure 2023182649000106
窒素雰囲気下、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン（５０ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ）およびＮ－エチル－イソプロピルプロパン－２－アミン（ＤＩＰＥＡ）（３１．０μＬ，０．１７７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（５００μＬ）に溶解し、２－ブロモアセトニトリル（１２μＬ，０．１７７ｍｍｏｌ）を０℃で加えたのち、４０℃で３時間撹拌した。反応液を濃縮し、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０２、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）を粗生成物として得た。得られた粗生成物は、そのまま次工程に用いた。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝４７７．３（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
３－（３－（（（２Ｓ）－１－（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－２－（（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－４－ヒドロキシ－２－（（フォスフォノオキシ）メチル）テトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）（ヒドロキシ）フォスフォリル）オキシ）メチル）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－４－ヒドロキシテトラヒドロフラン－３－イル）オキシ）－１－オキソ－３－フェニルプロパン－２－イル）アミノ）－３－オキソプロピル）－５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－４－イウム（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ）の合成
Figure 2023182649000107
緩衝液Ａ（１１．３ｍＬ）に、リン酸二水素（（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（４－アミノ－２－オキソピリミジン－１（２Ｈ）－イル）－３－（（（（（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－５－（６－アミノ－９Ｈ－プリン－９－イル）－３，４－ジヒドロキシテトラヒドロフラン－２－イル）メトキシ）（ヒドロキシ）ホスホリル）オキシ）－４－（（テトラヒドロフラン－２－イル）オキシ）テトラヒドロフラン－２－イル）メチル（化合物ｐｃ０１）（３３．２ｍｇ、０．０４６ｍｍｏｌ）を溶解させ、（３－（５，５－ジフルオロ－７，９－ジメチル－５Ｈ－４λ４，５λ４－ジピロロ［１，２－ｃ：２’，１’－ｆ］［１，３，２］ジアザボリニン－３－イル）プロパノイル）－Ｌ－フェニルアラニン シアノメチルエステル（化合物ＭＴ０３、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ＯＣＨ２ＣＮ）（１１ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル溶液（０．１３ｍＬ）を加えたのち、室温で４５分撹拌した。反応液に０℃でＴＦＡ（０．５６ｍＬ）を加え、５分撹拌したのち、室温にて１０分撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．０５％ ＴＦＡ ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（化合物ＭＴ０１、ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｐＣｐＡ）（２．１ｍｇ、８．５％収率）を得た。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１０７２．５（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．５６分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０２）
実施例７．ＬＣＴ－１２のペプチド合成機によるペプチド合成に用いる（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ）の合成
Figure 2023182649000108
（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－ヒドロキシブタン酸一水和物（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨの一水和物、東京化成より購入、５．０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）とｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム（ＰＰＴＳ、０．１７５ｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の混合物にトルエン（５０ｍＬ）を加えて、減圧下トルエンを留去することで共沸により含まれている水分を除去した。得られた残渣に超脱水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、２８ｍＬ）と３，４－ジヒドロ－２Ｈ－ピラン（８．８ｍＬ、９７ｍｍｏｌ）を加え、窒素雰囲気下、５０℃にて４時間攪拌した。ＬＣＭＳ（ＳＱＤＦＡ０５）にて原料の消失を確認後、混合物を２５℃まで冷却し、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えた。続いて飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えて有機層を洗浄し、水層を酢酸エチル（３０ｍＬ）で抽出した。得られた全ての有機層を混合し、これをさらに飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥し、溶媒を減圧下留去し、粗生成物（９．３ｇ）を得た。
得られた粗生成物のうち、４．６５ｇをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、３０ｍＬ）に溶解させ、次いでｐＨ８．０に調整した１．０Ｍリン酸緩衝液（３０ｍＬ）を加えた。この混合物を５０℃で４時間攪拌した。２５℃まで冷却した後、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて抽出を行った後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）で２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去し、さらにポンプにて減圧下、２５℃で３０分乾燥させた。
得られた残渣をジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解させ、次いでヘプタン（５０ｍＬ）を加えた。制御した減圧下（～１００ｈＰａ）、ジエチルエーテルのみを留去し、得られた混合物をろ過して固体を得た。このヘプタンでの洗浄操作を２度繰り返した。得られた固体をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩（２．８０ｇ、６．２６ｍｍｏｌ）を得た。
得られた全量のＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨのナトリウム塩に酢酸エチル（５０ｍＬ）とｐＨ２．１の０．０５Ｍリン酸水溶液（１４０ｍＬ）を加えて、２５℃にて５分間攪拌した後、有機層と水層を分離した。水層に酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて抽出した後、得られた全ての有機層を混合し、飽和塩化ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）にて２度洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、減圧下溶媒を留去した。残渣をポンプにて減圧下、２５℃で２時間乾燥させた後、得られた固体をｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ、５０ｍＬ）に溶解させ、溶媒を減圧下留去した。さらにポンプにて減圧下、２５℃で１時間乾燥させることで、（２Ｓ，３Ｒ）－２－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）アミノ）－３－（（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－２－イル）オキシ）ブタン酸（Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、２．７０ｇ、３０ｍｏｌ％のｔ－ブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）が残留）をＴＨＰ保護上の不斉炭素に由来するジアステレオマー混合物として得た。得られたＦｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨは－２５℃の冷凍庫にて保存した。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ＝４２４．２（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．８４分、０．８５分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
実施例８．ＬＣ／ＭＳの標品として用いるＮ末端にＢｄｐＦＬを持つペプチド（ＬＣＴ－１２）の合成
Figure 2023182649000109
Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨを担持させた２－ク口口卜リチルレジン（１００ｍｇ）を用い、Ｆｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ＴＨＰ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨを用いてペプチド合成機にてペプチドの伸長を行った（アミノ酸の略号については本明細書中に別途記載）。Ｆｍｏｃ法によるペプチド合成法に従い、ペプチドの伸長を行った（ＷＯ２０１３１００１３２Ｂ２）。ペプチドの伸長後、Ｎ末端のＦｍｏｃ基の除去をペプチド合成機上にて行った後、レジンをＤＣＭにて洗浄した。
レジンにＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、２ｍＬ）を加えて１時間振とうし、ペプチドのレジンからの切り出しを行った。反応終了後、チューブ内の溶液を合成用カラムでろ過することによりレジンを除き、レジンをＴＦＥ／ＤＣＭ（１：１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）にて２回洗浄した。全ての抽出液を混合し、ＤＭＦ（２ｍＬ）を加えた後、減圧下濃縮した。得られた残査をＮＭＰ（０．５ｍＬ）に溶解し、そのうち１／４（１２５μＬ）を次の反応に使用した。ペプチドのＮＭＰ溶液に７６．５ｍＭに調製したＢｄｐＦＬスクシンイミドエステル（１４０μＬ）を室温にて加え、４０℃で終夜撹拌した後、減圧下濃縮した。得られた残査を０．０５Ｍ テトラメチルアンモニウム硫酸水素塩 ｉｎ ＨＦＩＰ（１．２ｍｌ，０．０６０ｍｍｏｌ）に溶解し、室温で２時間撹拌した。反応液を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．１％ＦＡ ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ）にて精製し、表題化合物（ＬＣＴ－１２）（０．３ｍｇ）を得た。ＬＣＴ－１２のアミノ酸配列を配列番号：５３に示す。
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１９７２．９（Ｍ－Ｈ）－
保持時間：０．７４分（分析条件ＳＱＤＦＡ０５＿０１）
実施例９ ライゲーション反応によるｔＲＮＡ－ＣＡの作製
ｔＲＮＡ５’断片、ｐＮｐ（ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐ）、およびｔＲＮＡ３’断片を以下に記載の手順により、ライゲーション反応を用いて連結することで各種ｔＲＮＡ－ＣＡを作製した。ｔＲＮＡ５’断片およびｔＲＮＡ３’断片は化学合成品（株式会社ジーンデザイン）を用いた。各ｔＲＮＡ断片および全長の配列と、ライゲーションに用いたサンプルの組み合わせ（表４）を下記に示す。
配列番号：５４（ＦＲ－１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）５’ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵ
配列番号：５５（ＦＲ－２）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ｇａ ＲＮＡ配列
ＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：５６（ＵＲ－１）
ｌｉｇ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＵＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：５７（ＬＲ－１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：５８（ＦＲ－３）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ａｇ ＲＮＡ配列
ＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：５９（ＬＲ－２）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：６０（ＦＲ－４）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ａｃ ＲＮＡ配列
ＡＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：６１（ＬＲ－３）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＡＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：６２（ＦＲ－５）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ｃｃ ＲＮＡ配列
ＣＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：６３（ＬＲ－４）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＣＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：１３２（ＦＲ－６）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）５’ ＲＮＡ配列
ＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵ
配列番号：１３３（ＦＲ－７）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）３’ａｇ ＲＮＡ配列
ＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ
配列番号：１３４（ＬＲ－５）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）Ｌａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵＬＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ
配列番号：１３５（ＦＲ－８）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）５’ ＲＮＡ配列
ＧＧＣＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＵＵ
配列番号：１３６（ＦＲ－９）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）３’ａｇ ＲＮＡ配列
ＡＧＧＵＵＣＣＧＵＡＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
配列番号：１３７（ＬＲ－６）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）Ｌａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＧＣＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＵＵＬＡＧＧＵＵＣＣＧＵＡＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
配列番号：１３９（ＦＲ－１０）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ｃｇ ＲＮＡ配列
ＣＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：１４０（ＬＲ－７）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＣＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：１４１（ＦＲ－１１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）３’ａｕ ＲＮＡ配列
ＡＵＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
配列番号：１４２（ＬＲ－８）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｕ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＬＡＵＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ配列番号：１３８（ＡＲ－１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）（Ａｇｍ）ａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵ（Ａｇｍ）ＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
Figure 2023182649000110
５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．１２５～０．２５ｍＭ ｐＮｐ（ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐ）、２５μＭ ｔＲＮＡ５’断片、０．６Ｕ／μＬ Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０％ ＤＭＳＯの組成の反応溶液を１５℃にて一晩静置する事によりｔＲＮＡ断片５’とｐＮｐ（ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐ）とのライゲーション反応を行った。ライゲーション産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。
未反応のｔＲＮＡ５’断片が次のライゲーション反応に持ち越されないようにするため、過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）により、ｔＲＮＡ５’断片の３’末端のリボースを開裂させた。具体的には、１０μＭ ライゲーション産物、１０ｍＭ 過ヨウ素酸ナトリウム存在下で、氷上、暗所で３０分静置することにより開裂反応を行った。反応後、１００ｍＭグルコースを１／１０体積量加え、氷上、暗所で３０分静置することにより過剰な過ヨウ素酸ナトリウムを分解した。反応産物は、エタノール沈殿によって回収した。
過ヨウ素酸処理後のライゲーション産物の５’末端をリン酸化、３’末端を脱リン酸化するためＴ４ ＰＮＫ（Ｔ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ）処理を行った。１０μＭの過ヨウ素酸処理後のライゲーション産物、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＤＴＴ、３００μＭ ＡＴＰ、０．５Ｕ／μＬ Ｔ４ ＰＮＫ（ＴａＫａＲａ）の組成の反応溶液を３７℃にて３０分から６０分静置することにより反応を行った。反応産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。
ＰＮＫ処理後の反応産物とｔＲＮＡ３’断片とのライゲーション反応を行った。まず、１０μＭのＰＮＫ処理後の反応産物、１０μＭ ｔＲＮＡ３’断片、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２の組成の溶液を６５℃にて７分間加熱後、室温で３０分から１時間静置することでＰＮＫ処理後の反応産物とｔＲＮＡ３’断片とのアニーリングを行った。次に、ｔＲＮＡ３’断片の５’末端をリン酸化するためＴ４ ＰＮＫ処理を行った。Ｔ４ ＰＮＫ処理は、アニーリングを行った溶液に、ＤＴＴ（終濃度３．５ｍＭ）、ＡＴＰ（終濃度３００μＭ）、Ｔ４ ＰＮＫ（終濃度０．５Ｕ／μＬ）を加え、３７℃にて３０分静置する事で行った。続いて、この溶液に、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を終濃度０．９Ｕ／μＬとなるよう加え、３７℃にて３０分から４０分静置することでライゲーション反応を行った。ライゲーション産物は、フェノール・クロロホルム抽出を行い、エタノール沈殿によって回収した。
ライゲーション法により作製したｔＲＮＡ－ＣＡは、高速逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰの水溶液／１５ｍＭ ＴＥＡと４００ｍＭ ＨＦＩＰのメタノール溶液）にて分取精製を行った後、変性尿素１０％ポリアクリルアミド電気泳動にて目的の長さを有していることを確認した。
実施例１０ ＲＮａｓｅＴ １ により切断したｔＲＮＡ断片の分析
ライゲーション反応を利用して調製した各種ｔＲＮＡ－ＣＡをＲＮａｓｅで断片化し分析することで、ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐで導入したＵ、Ｌ、あるいは（Ａｇｍ）がそれぞれ目的の部位に導入されていることを確認した。
各ｔＲＮＡ－ＣＡの配列番号と、ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐで導入したＵ、Ｌ、あるいは（Ａｇｍ）を含むＲＮＡ断片の配列の組み合わせを下記の表５に示す。
Figure 2023182649000111
１０μＭ ｔＲＮＡ－ＣＡ、５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＴ１（ＥｐｉｃｅｎｔｒｅまたはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ ５．３）を含む反応溶液を３７℃にて１時間静置する事によりＲＮＡをＧ塩基の３’側で特異的に切断し、ｐＵｐ、ｐＬｐ、あるいはｐ（Ａｇｍ）ｐで導入したＵ、Ｌ、あるいは（Ａｇｍ）を含むＲＮＡ断片を分析した。
ＣＣＣＵＵＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝９４４（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．２２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＵｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＵｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図１）。
ＣＣＣＵＬＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１００８（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：２．３４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図２）。
ＣＣＣＵＬＡＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１７２（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：３．８１分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＡＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＡＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図３）。
ＣＣＣＵＬＡＣＡＣＧｐ（配列番号：１９７）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１６４２（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．７８分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＡＣＡＣＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＡＣＡＣＧｐ／配列番号：１９８）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図４）。
ＣＣＣＵＬＣＣＡＣＧｐ（配列番号：１９９）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１６３０（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．６４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＣＣＡＣＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＣＣＡＣＧｐ／配列番号：２００）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図５）。
ＣＵＵＬＡＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１０２０（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：３．８４分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＵＵＡＧｐ）とＲＮＡの他の部分由来の断片（ＵＵＣＡＧｐ）の分子量が等しいため、断片化していない状態のＲＮＡの分析も併せて行った。
ｐＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵＬＡＧＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ（配列番号：１３４）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１０９（（Ｍ－２２Ｈ）／２２）－
保持時間：３．９２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０１）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定されるＲＮＡおよびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定されるＲＮＡのマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図６）。
ＡＵＵＬＡＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１０３２（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．１６分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＡＵＵＡＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＡＵＵＵＡＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図７）。
ＣＣＣＵＬＣＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１６０（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．２１分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＣＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＣＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図８）。
ＣＣＣＵＬＡＵＡＣＧｐ（配列番号：２０２）
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１６４２（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：５．９５分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐＬｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＡＵＡＣＧｐ）およびＬｙｓｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＡＵＡＣＧｐ／配列番号：２０３）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐＬｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図９）。
ＣＣＣＵ（Ａｇｍ）ＡＧｐ
ＬＣＭＳ（ＥＳＩ） ｍ／ｚ＝１１６４（（Ｍ－２Ｈ）／２）－
保持時間：４．０２分（分析条件ＬＴＱＴＥＡ／ＨＦＩＰ０５＿０３）
ｐ（Ａｇｍ）ｐがｌｉｇａｔｉｏｎされていない場合に想定される断片（ＣＣＣＵＡＧｐ）およびＡｇｍａｔｉｄｉｎｅの代わりにＵｒｉｄｉｎｅが入っていた場合に想定される断片（ＣＣＣＵＵＡＧｐ）のマスクロマトグラムと比較し、大部分ｐ（Ａｇｍ）ｐのｌｉｇａｔｉｏｎが進行したことを確認した（図１０）。
実施例１１ アミノアシルｔＲＮＡの合成
鋳型ＤＮＡ（配列番号：６４（Ｄ－１）～配列番号：７６（Ｄ－１３）、配列番号：１４３（Ｄ－２６）～配列番号：１５２（Ｄ－３５））から、Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応によりｔＲＮＡ（配列番号：７７（ＴＲ－１）～配列番号：８９（ＴＲ－１３）、配列番号：１５３（ＴＲ－１４）～配列番号：１６２（ＴＲ－２３））を合成し、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６４（Ｄ－１）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６５（Ｄ－２）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６６（Ｄ－３）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６７（Ｄ－４）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＡＡＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６８（Ｄ－５）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＴＡＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：６９（Ｄ－６）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７０（Ｄ－７）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７１（Ｄ－８）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＴＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７２（Ｄ－９）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７３（Ｄ－１０）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７４（Ｄ－１１）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７５（Ｄ－１２）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：７６（Ｄ－１３）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＡＧＣＴＣＧＴＣＧＧＧＣＴＣＡＴＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＧＧＴＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４３（Ｄ－２６）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴａａｇＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＴＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４４（Ｄ－２７）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴＴａｇＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＴＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４５（Ｄ－２８）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＴＡＧＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＴｃａｇＧＴＧＣＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＧＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＣＧＴＣＣＧＴＴＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４６（Ｄ－２９）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＴＴａａｇＧＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４７（Ｄ－３０）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＴＴｔａｇＧＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４８（Ｄ－３１）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＣＴＧＴＡＧＴＴＣＡＧＴＣＧＧＴＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＴＴｃａｇＧＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１４９（Ｄ－３２）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴｇｃｇＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１５０（Ｄ－３３）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴｃｃｇＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１５１（Ｄ－３４）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴａａｕＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１５２（Ｄ－３５）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＴｃａｕＡＣＧＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣＣＣＣＴＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：７７（ＴＲ－１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａｇａ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：７８（ＴＲ－２）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＵＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：７９（ＴＲ－３）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｇａ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＣＧＡＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８０（ＴＲ－４）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＡＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８１（ＴＲ－５）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＵＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８２（ＴＲ－６）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＣＡＧＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８３（ＴＲ－７）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８４（ＴＲ－８）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＵＡＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８５（ＴＲ－９）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＣＡＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８６（ＴＲ－１０）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＧＣＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８７（ＴＲ－１１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｃｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＵＣＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８８（ＴＲ－１２）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｃ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵＣＣＣＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：８９（ＴＲ－１３）
ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）ｃａｕ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＣＧＧＧＧＵＧＧＡＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＵＣＧＵＣＧＧＧＣＵＣＡＵＡＡＣＣＣＧＡＡＧＡＵＣＧＵＣＧＧＵＵＣＡＡＡＵＣＣＧＧＣＣＣＣＣＧＣＡＡ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５３（ＴＲ－１４）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ａａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵａａｇＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５４（ＴＲ－１５）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｕａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵｕａｇＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５５（ＴＲ－１６）
ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｃａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＡＧＣＧＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＵＡＧＡＡＵＡＣＣＵＧＣＵＵｃａｇＧＵＧＣＡＧＧＧＧＧＵＣＧＣＧＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＣＧＵＣＣＧＵＵＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５６（ＴＲ－１７）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ａａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＣＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＵＵａａｇＧＵＵＣＣＧＵＡＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５７（ＴＲ－１８）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｕａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＣＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＵＵｕａｇＧＵＵＣＣＧＵＡＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５８（ＴＲ－１９）
ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｃａｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＧＣＵＣＵＧＵＡＧＵＵＣＡＧＵＣＧＧＵＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＡＵＵｃａｇＧＵＵＣＣＧＵＡＵＧＵＣＡＣＵＧＧＵＵＣＧＡＧＵＣＣＡＧＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１５９（ＴＲ－２０）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵｇｃｇＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１６０（ＴＲ－２１）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｇ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵｃｃｇＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１６１（ＴＲ－２２）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｕ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵａａｕＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
ｔＲＮＡ 配列番号：１６２（ＴＲ－２３）
ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｕ－ＣＡ ＲＮＡ配列：
ＧＵＣＣＣＣＵＵＣＧＵＣＵＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＣＵｃａｕＡＣＧＧＣＧＧＵＡＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＣＵＡＧＧＧＧＡＣＧＣ
アミノアシルｐＣｐＡを用いたアミノアシルｔＲＮＡ混合液の調製
２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａｇａ－ＣＡ（配列番号：７７（ＴＲ－１））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）記載の方法で合成した化合物ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡ（配列番号：７８（ＴＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－２を調製した。
同様に、ｌｉｇ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ－ＣＡ（配列番号：５６（ＵＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－３を調製した。
同様に、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａ－ＣＡ（配列番号：５７（ＬＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－４を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｇａ－ＣＡ（配列番号：７９（ＴＲ－３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４；特許文献（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）に記載の方法により合成）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－５を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｇ－ＣＡ（配列番号：８０（ＴＲ－４））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－６を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－７を調製した。
同様に、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－８を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｇ－ＣＡ（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－９を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｃ－ＣＡ（配列番号：８３（ＴＲ－７））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１０を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｃ－ＣＡ（配列番号：８４（ＴＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１１を調製した。
同様に、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｃ－ＣＡ（配列番号：６１（ＬＲ－３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１２を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｃ－ＣＡ（配列番号：８５（ＴＲ－９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１３を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を等量で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｃ－ＣＡ（配列番号：８６（ＴＲ－１０））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１４を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｃｃ－ＣＡ（配列番号：８７（ＴＲ－１１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１５を調製した。
同様に、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｃ－ＣＡ（配列番号：６３（ＬＲ－４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１６を調製した。
同様に、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｃ－ＣＡ（配列番号：８８（ＴＲ－１２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出を行い、化合物ＡＡｔＲ－１７を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を１：２：１の比率になるように混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の３種類のフェノール・クロロホルム抽出液を１：２：１で混合し、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）をエタノール沈殿により回収した。
アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液は、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１９を調製するために、２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ａａｇ－ＣＡ（配列番号：１５３（ＴＲ－１４））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２０を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：１５４（ＴＲ－１５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２１を調製するために、ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：１３４（ＬＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２２を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｃａｇ－ＣＡ（配列番号：１５５（ＴＲ－１６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
具体的には、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液）を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－２３を調製するために、２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ａａｇ－ＣＡ（配列番号：１５６（ＴＲ－１７））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２４を調製するために、転写ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：１５７（ＴＲ－１８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２５を調製するために、ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：１３７（ＬＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２６を調製するために、転写ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｃａｇ－ＣＡ（配列番号：１５８（ＴＲ－１９））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
具体的には、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－６を調製するために、２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｇ－ＣＡ（配列番号：８０（ＴＲ－４））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－９を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｇ－ＣＡ（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２７を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２８を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１６）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－２９を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ３９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３０を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ３９）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３１を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３２を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ－ＣＡ（配列番号：５９（ＬＲ－２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ４０）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を混合し、混合物の状態で、もしくは単一の状態のまま、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
具体的には、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の３種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－９のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡを調製した。
化合物ＡＡｔＲ－３３を調製するために、２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｇ－ＣＡ（配列番号：１５９（ＴＲ－２０））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（特許記載（ＷＯ２０１８１４３１４５Ａ１）の方法で合成した化合物ＴＳ２４のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３４を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｇ－ＣＡ（配列番号：１４０（ＬＲ－７））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３５を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｇ－ＣＡ（配列番号：１６０（ＴＲ－２１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３６を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｕ－ＣＡ（配列番号：１６１（ＴＲ－２２））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３７を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｕ－ＣＡ（配列番号：１４２（ＬＲ－８））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３８を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｕ－ＣＡ（配列番号：１６２（ＴＲ－２３））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を混合し、混合物の状態で、もしくは単一の状態のまま、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
具体的には、化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の２種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の混合液）を調製した。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の２種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、等量で混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の混合液）を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－３４、化合物ＡＡｔＲ－３７のそれぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡを調製した。
化合物ＡＡｔＲ－６を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｇ－ＣＡ（配列番号：８０（ＴＲ－４））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ｔｓ１４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－９を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｇ－ＣＡ（配列番号：８２（ＴＲ－６））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＴＳ２４）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた段階で、各ｌｉｇａｔｉｏｎ産物を１：２になるように混合し、混合物の状態でフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
具体的には、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の２種類のｌｉｇａｔｉｏｎ産物に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加え、フェノール・クロロホルム溶液を加えた液を、１：２となるように混合し、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を調製した。
化合物ＡＡｔＲ－３９を調製するために、転写ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ－ＣＡ（配列番号：８１（ＴＲ－５））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
同様に、化合物ＡＡｔＲ－４０を調製するために、ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）（Ａｇｍ）ａｇ－ＣＡ（配列番号：１３８（ＡＲ－１））に対して、アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＳＳ１５）を前述の方法でライゲーション反応を行った。
それぞれのｌｉｇａｔｉｏｎ反応後の溶液に０．３Ｍ酢酸ナトリウムを加えたあと、フェノール・クロロホルム溶液を加えた後、フェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行い、回収した。
アミノアシルｐＣｐＡを用いたｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡの調製
２５μＭ 転写ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）ｃａｕ－ＣＡ（配列番号：８９（ＴＲ－１３））、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＡＴＰ、０．６ｕｎｉｔ／μｌ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ ｅｎｇｌａｎｄ ｂｉｏ ｌａｂ．社）、０．２５ｍＭ アミノアシル化ｐＣｐＡ（ＭＴ０１のＤＭＳＯ溶液）となるように、Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒでメスアップした反応液を調製し、１５℃で４５分間ライゲーション反応を行った。ただし、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼおよびアミノアシル化ｐＣｐＡを加える前の反応液は、９５℃で２分間加熱後、室温で５分間放置し、予めｔＲＮＡのリフォールディングを行った。
ライゲーション反応液に、酢酸ナトリウムを０．３Ｍになるように加え、フェノール・クロロホルム抽出し、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシルｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）をエタノール沈殿により回収した。
ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡは、翻訳混合物に添加する直前に１ｍＭ酢酸ナトリウムに溶解した。
化合物ＡＡｔＲ－１ 配列番号：９０
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａｇａ
Figure 2023182649000112
化合物ＡＡｔＲ－２ 配列番号：９１
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ
Figure 2023182649000113
化合物ＡＡｔＲ－３ 配列番号：９２
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｌｉｇ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｇａ
Figure 2023182649000114
化合物ＡＡｔＲ－４ 配列番号：９３
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｇａ
Figure 2023182649000115
化合物ＡＡｔＲ－５ 配列番号：９４
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｇａ
Figure 2023182649000116
化合物ＡＡｔＲ－６ 配列番号：９５
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｇ
Figure 2023182649000117
化合物ＡＡｔＲ－７ 配列番号：９６
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ
Figure 2023182649000118
化合物ＡＡｔＲ－８ 配列番号：９７
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ
Figure 2023182649000119
化合物ＡＡｔＲ－９ 配列番号：９８
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｇ
Figure 2023182649000120
化合物ＡＡｔＲ－１０ 配列番号：９９
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｃ
Figure 2023182649000121
化合物ＡＡｔＲ－１１ 配列番号：１００
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｃ
Figure 2023182649000122
化合物ＡＡｔＲ－１２ 配列番号：１０１
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｃ
Figure 2023182649000123
化合物ＡＡｔＲ－１３ 配列番号：１０２
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｃ
Figure 2023182649000124
化合物ＡＡｔＲ－１４ 配列番号：１０３
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｃ
Figure 2023182649000125
化合物ＡＡｔＲ－１５ 配列番号：１０４
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕｃｃ
Figure 2023182649000126
化合物ＡＡｔＲ－１６ 配列番号：１０５
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｃ
Figure 2023182649000127
化合物ＡＡｔＲ－１７ 配列番号：１０６
ＭｅＨｐｈ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｃ
Figure 2023182649000128
化合物ＡＡｔＲ－１８ 配列番号：１０７
ＢｄｐＦＬ－Ｐｈｅ－ｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ）ｃａｕ
Figure 2023182649000129
化合物ＡＡｔＲ－１９ 配列番号：１７５
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ａａｇ
Figure 2023182649000130
化合物ＡＡｔＲ－２０ 配列番号：１７６
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｕａｇ
Figure 2023182649000131
化合物ＡＡｔＲ－２１ 配列番号：１７７
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）Ｌａｇ
Figure 2023182649000132
化合物ＡＡｔＲ－２２ 配列番号：１７８
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ａｓｐ）ｃａｇ
Figure 2023182649000133
化合物ＡＡｔＲ－２３ 配列番号：１７９
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ａａｇ
Figure 2023182649000134
化合物ＡＡｔＲ－２４ 配列番号：１８０
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｕａｇ
Figure 2023182649000135
化合物ＡＡｔＲ－２５ 配列番号：１８１
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）Ｌａｇ
Figure 2023182649000136
化合物ＡＡｔＲ－２６ 配列番号：１８２
ｄＡ－ｔＲＮＡ（ＡｓｎＥ２）ｃａｇ
Figure 2023182649000137
化合物ＡＡｔＲ－２７ 配列番号：１８３
ＭｅＨｐｈ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ
Figure 2023182649000138
化合物ＡＡｔＲ－２８ 配列番号：１８４
ＭｅＨｐｈ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ
Figure 2023182649000139
化合物ＡＡｔＲ－２９ 配列番号：１８５
Ｆ３Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ
Figure 2023182649000140
化合物ＡＡｔＲ－３０ 配列番号：１８６
Ｆ３Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ
Figure 2023182649000141
化合物ＡＡｔＲ－３１ 配列番号：１８７
ＳｉＰｅｎ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ
Figure 2023182649000142
化合物ＡＡｔＲ－３２ 配列番号：１８８
ＳｉＰｅｎ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｇ
Figure 2023182649000143
化合物ＡＡｔＲ－３３ 配列番号：１８９
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｇｃｇ
Figure 2023182649000144
化合物ＡＡｔＲ－３４ 配列番号：１９０
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌｃｇ
Figure 2023182649000145
化合物ＡＡｔＲ－３５ 配列番号：１９１
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃｃｇ
Figure 2023182649000146
化合物ＡＡｔＲ－３６ 配列番号：１９２
ｎＢｕＧ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ａａｕ
Figure 2023182649000147
化合物ＡＡｔＲ－３７ 配列番号：１９３
Ｐｉｃ２－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）Ｌａｕ
Figure 2023182649000148
化合物ＡＡｔＲ－３８ 配列番号：１９４
ｄＡ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｃａｕ
Figure 2023182649000149
化合物ＡＡｔＲ－３９ 配列番号：１９５
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）ｕａｇ
Figure 2023182649000150
化合物ＡＡｔＲ－４０ 配列番号：１９６
ＳＰｈ２Ｃｌ－ｔＲＮＡ（Ｇｌｕ）（Ａｇｍ）ａｇ
Figure 2023182649000151
実施例１２ ペプチドの翻訳合成
次に、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の３種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２０（ｍＲ－１）～配列番号：１３１（ｍＲ－１２））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭ スペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２０（ｍＲ－１）、配列番号：１２１（ｍＲ－２）、もしくは配列番号：１２２（ｍＲ－３））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－２、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－３、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１、化合物ＡＡｔＲ－４、化合物ＡＡｔＲ－５の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
そのほかの配列（配列番号：１２３（ｍＲ－４），配列番号：１２４（ｍＲ－５），配列番号：１２５（ｍＲ－６））に関しても無細胞翻訳を行った。
具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭ スペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
そのほかの配列（配列番号：１２６（ｍＲ－７），配列番号：１２７（ｍＲ－８），配列番号：１２８（ｍＲ－９））に関しても無細胞翻訳を行った。
具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭ スペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，３５μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２６（ｍＲ－７）、配列番号：１２７（ｍＲ－８）、もしくは配列番号：１２８（ｍＲ－９））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１１、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１０、化合物ＡＡｔＲ－１２、化合物ＡＡｔＲ－１３の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
そのほかの配列（配列番号：１２９（ｍＲ－１０），配列番号：１３０（ｍＲ－１１），配列番号：１３１（ｍＲ－１２））に関しても無細胞翻訳を行った。
具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭ スペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．０４μＭ ＬｅｕＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２９（ｍＲ－１０）、配列番号：１３０（ｍＲ－１１）、もしくは配列番号：１３１（ｍＲ－１２））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１５、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液、もしくは化合物ＡＡｔＲ－１４、化合物ＡＡｔＲ－１６、化合物ＡＡｔＲ－１７の混合液）を４０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表６に記載した。
Figure 2023182649000152
次に、前項で実施したｔＲＮＡ ｂｏｄｙ配列と異なるｂｏｄｙ配列のｔＲＮＡを使用し、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の３種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液、）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，５４μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２０、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－１９、化合物ＡＡｔＲ－２１、化合物ＡＡｔＲ－２２の混合液、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２４、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－２３、化合物ＡＡｔＲ－２５、化合物ＡＡｔＲ－２６の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表７に記載した。
Figure 2023182649000153
次に、前項でＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡにアミノアシル化したアミノ酸以外のアミノ酸を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡにアミノアシル化し、３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための翻訳実験を実施した。具体的には、同一コドンボックス内の３種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）、もしくはＬｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２７、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２８、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
同様に、上述のｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡまでの翻訳反応混合物に対して、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－２９、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３０、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液を３０μＭ、化合物ＡＡｔＲ－９を１０μＭになるように添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
同様に、上述のｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡまでの翻訳反応混合物に対して、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３１、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液、もしくは、化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－３２、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液を３０μＭ、化合物ＡＡｔＲ－９を１０μＭになるように添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表８に記載した。
Figure 2023182649000154
更に対象のコドンボックスを広げて、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡによる読み分け効果を評価するための実験を実施した。
具体的には、同一コドンボックス内の３種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１６９（ｍＲ－１３）、配列番号：１７０（ｍＲ－１４）、配列番号：１７１（ｍＲ－１５）、もしくは配列番号：１７２（ｍＲ－１６）、配列番号：１７３（ｍＲ－１７）、配列番号：１７４（ｍＲ－１８））を、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液と、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含まないアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液を用いて翻訳し、ペプチド化合物を翻訳合成した。
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１６９（ｍＲ－１３）、配列番号：１７０（ｍＲ－１４）、もしくは配列番号：１７１（ｍＲ－１５））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３３、化合物ＡＡｔＲ－３５の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３４）を１０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
もう一つのコドンボックスにおいても同様に、翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ，０．０２μＭ ＶａｌＲＳ，２．７３μＭ ＡｌａＲＳ，０．０４μＭ ＬｅｕＲＳ，０．０４μＭ ＳｅｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１７２（ｍＲ－１６）、配列番号：１７３（ｍＲ－１７）、もしくは配列番号：１７４（ｍＲ－１８））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－３６、化合物ＡＡｔＲ－３８の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３７）を１０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表９に記載した。
Figure 2023182649000155
次に、Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾の効果を確認するために、調製した３種類のアミノアシル化ｔＲＮＡが存在する状況で、１つのコドンボックスにおける３種類のアミノ酸の読み分けを確認するための実験を行った。具体的には、同一コドンボックス内の３種類のコドンのうちいずれか１つを含み、それ以外は同一配列の鋳型ｍＲＮＡ（鋳型ｍＲＮＡ配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、配列番号：１２５（ｍＲ－６））を、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）に対し、アミノアシル化ｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ－３９）、もしくはアミノアシル化Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡ（ＡＡｔＲ－４０）を加えた翻訳系で反応させ、ペプチド化合物を翻訳合成した。
翻訳系は、原核生物由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるＰＵＲＥ ｓｙｓｔｅｍを用いた。具体的には、翻訳液（１ｍＭ ＧＴＰ，１ｍＭ ＡＴＰ，２０ｍＭ クレアチンリン酸，５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ ｐＨ７．６，１００ｍＭ 酢酸カリウム，１０ｍＭ 酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．２６μＭ ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ ＲＦ２，０．１７μＭ ＲＦ３，０．５μＭ ＲＲＦ，４μｇ／ｍｌ クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ 無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，２．７μＭ ＩＦ１，０．４μＭ ＩＦ２，１．５μＭ ＩＦ３，４０μＭ ＥＦ－Ｔｕ，４９．３μＭ ＥＦ－Ｔｓ，１μＭ ＥＦ－Ｐ－Ｌｙｓ，０．４ｕｎｉｔ／μｌ ＲＮａｓｅｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｎ２１１１），１．２μＭ リボソーム，０．５ｍＭ ＰＧＡ，０．０９μＭ ＧｌｙＲＳ，０．４μＭ ＩｌｅＲＳ，０．６８μＭ ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ ＰｒｏＲＳ，０．０９μＭ ＴｈｒＲＳ）に、１μＭ 鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２３（ｍＲ－４）、配列番号：１２４（ｍＲ－５）、もしくは配列番号：１２５（ｍＲ－６））、それぞれの鋳型ｍＲＮＡにコードされている天然アミノ酸群をそれぞれ０．２５ｍＭずつ、ｉｎｉｔｉａｔｏｒアミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－１８）を１０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ混合液（化合物ＡＡｔＲ－６、化合物ＡＡｔＲ－９の混合液）を３０μＭ、アミノアシル化ｔＲＮＡ（化合物ＡＡｔＲ－３９もしくは化合物ＡＡｔＲ－４０）を２０μＭになるように翻訳反応混合物に添加し、３７℃で１時間静置することで行った。
鋳型ｍＲＮＡと期待される翻訳ペプチド化合物、その分子量（計算値）に関しては、以下の表１０に記載した。
Figure 2023182649000156
鋳型ＤＮＡ（配列番号：１０８（Ｄ－１４）～配列番号：１１９（Ｄ－２５）、配列番号：１６３（Ｄ－３６）～配列番号：１６８（Ｄ－４１））から、ＲｉｂｏＭＡＸ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｔ７（Ｐｒｏｍｅｇａ社，Ｐ１３００）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写反応により鋳型ｍＲＮＡ（配列番号：１２０（ｍＲ－１）～配列番号：１３１（ｍＲ－１２）、配列番号：１６９（ｍＲ－１３）～配列番号：１７４（ｍＲ－１８））を合成し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）により精製した。
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１０８（Ｄ－１４）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１０９（Ｄ－１５）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１０（Ｄ－１６）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＴＣＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１１（Ｄ－１７）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１２（Ｄ－１８）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１３（Ｄ－１９）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１４（Ｄ－２０）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１５（Ｄ－２１）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１６（Ｄ－２２）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１７（Ｄ－２３）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１８（Ｄ－２４）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１１９（Ｄ－２５）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＣＴＡＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６３（Ｄ－３６）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６４（Ｄ－３７）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６５（Ｄ－３８）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＧＡＴＴＡＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６６（Ｄ－３９）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＴＡＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６７（Ｄ－４０）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＡＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＴＡＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ＤＮＡ 配列番号：１６８（Ｄ－４１）
ＤＮＡ配列：
ＧＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＴＴＴＴＣＴＡＣＴＡＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＴＡＣＴＡＣＣＧＣＴＡＧＧＴＴＡＡＧＣＴＴＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２０（ｍＲ－１）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＣＵＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２１（ｍＲ－２）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＣＡＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２２（ｍＲ－３）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＵＣＧＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２３（ｍＲ－４）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＵＵＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２４（ｍＲ－５）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＵＡＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２５（ｍＲ－６）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＵＧＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２６（ｍＲ－７）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＧＵＵＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２７（ｍＲ－８）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＧＵＡＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２８（ｍＲ－９）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＧＵＧＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１２９（ｍＲ－１０）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＣＵＡＵＵＵＧＧＵＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＣＵＡＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１３０（ｍＲ－１１）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＣＵＡＵＵＵＧＧＡＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＣＵＡＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１３１（ｍＲ－１２）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＣＵＡＵＵＵＧＧＧＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＣＵＡＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１６９（ｍＲ－１３）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＧＵＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１７０（ｍＲ－１４）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＧＡＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１７１（ｍＲ－１５）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＡＵＵＡＵＵＧＧＵＵＵＵＣＧＧＡＵＵＡＵＵＣＣＧＡＵＵＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１７２（ｍＲ－１６）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＣＵＡＣＵＡＧＧＵＵＵＵＡＵＵＣＵＡＣＵＡＣＣＧＣＵＡＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１７３（ｍＲ－１７）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＣＵＡＣＵＡＧＧＵＵＵＵＡＵＡＣＵＡＣＵＡＣＣＧＣＵＡＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
鋳型ｍＲＮＡ 配列番号：１７４（ｍＲ－１８）
ＲＮＡ配列：
ＧＧＧＵＵＡＡＣＵＵＵＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＵＡＵＡＣＡＵＡＵＧＡＣＵＵＵＵＣＵＡＣＵＡＧＧＵＵＵＵＡＵＧＣＵＡＣＵＡＣＣＧＣＵＡＧＧＵＵＡＡＧＣＵＵＣＧ
実施例１３ 翻訳ペプチドの分析
実施例１２にて調製した非天然ペプチド翻訳溶液を１０倍希釈し、ＬＣ－ＦＬＲ－ＭＳの装置を用いて分析した。分析データはＭＳデータより対象となる翻訳ペプチドの保持時間を同定し、該当保持時時間の蛍光ピークを定量することで、ペプチド翻訳量を評価した。なお、定量評価は実施例８にて合成したＬＣＴ１２を標品により検量線を作成し、相対定量により含有量を算出した。ＬＣ－ＭＳは下記の表１１の条件に従い、対象となるサンプルに応じて最適な条件を選択して分析した。
Figure 2023182649000157
評価した結果、ｌｙｓｉｄｉｎｅまたはａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡを含むアミノアシル化ｔＲＮＡ混合液を用いた翻訳条件でのみ、１コドンボックスで３アミノ酸を読み分けられた。複数のコドンボックスでｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の読み分け効果が示された（図１１～図１４、図２０、図２１、表１２～表１５、表２１、表２２）。読み分けの効果は、ｔＲＮＡ ｂｏｄｙの塩基配列を他のものに置き換えた場合でも確認することができた（図１５、図１６、表１６、表１７）。また、ｔＲＮＡに連結されているアミノ酸を他の種類のものに置き換えた場合でも同様の効果が確認することができた（図１７～図１９、表１８～表２０）。ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾されたｔＲＮＡによってもｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾ｔＲＮＡと同様の読み分け効果が得られることが確認された（図２２、表２３）。
Figure 2023182649000158
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＵＣＵ，ＵＣＡ，ＵＣＧ）。
Figure 2023182649000159
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000160
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＵＵ，ＧＵＡ，ＧＵＧ）。
Figure 2023182649000161
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＧＧＵ，ＧＧＡ，ＧＧＧ）。
Figure 2023182649000162
Ａｓｐ－ｔＲＮＡ ｂｏｄｙ配列を用いた、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000163
ＡｓｎＥ２－ｔＲＮＡ ｂｏｄｙ配列を用いた、Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000164
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000165
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000166
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
Figure 2023182649000167
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＧＵ，ＣＧＡ，ＣＧＧ）。
Figure 2023182649000168
Ｌｙｓｉｄｉｎｅ修飾による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＡＵＵ，ＡＵＡ，ＡＵＧ）。
Figure 2023182649000169
Ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ修飾の有無による、１コドンボックスにおける３アミノ酸読み分けの翻訳評価結果の表である（評価したコドン：ＣＵＵ，ＣＵＡ，ＣＵＧ）。
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
一態様において、本開示の変異ｔＲＮＡは、天然の遺伝暗号表では読み分けられていないＮＮＡのコドンとＮＮＧのコドンの読み分けが可能である点で有用である。一態様において、本開示の翻訳系は、天然の遺伝暗号表を用いた翻訳系よりも多くの種類のアミノ酸を翻訳すること（コドン拡張）が可能である点で有用である。

Claims (15)

  1. ｔＲＮＡを改変することにより作製されている変異ｔＲＮＡであって、当該改変が、Ｎ１Ｎ２Ｎ３で表されるアンチコドンの改変後の１文字目のヌクレオシドＮ１がライシジン（ｋ２Ｃ）、ライシジン誘導体、アグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）、またはアグマチジン誘導体のいずれかである改変を含み、Ｎ２およびＮ３はそれぞれ、該アンチコドンの２文字目および３文字目の任意のヌクレオシドであり、
    該アンチコドンはＭ１Ｍ２Ｍ３で表されるコドン（ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３はそれぞれコドンの１文字目、２文字目および３文字目のヌクレオシドを表す）に相補的であり、
    Ｍ１およびＭ２は、天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＡであるコドンとＧであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから選択される、変異ｔＲＮＡ。
  2. 前記ライシジン（ｋ２Ｃ）、ライシジン誘導体、アグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）及びアグマチジン誘導体が、下記式Ａ’：
    Figure 2023182649000170
    （式中、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｌは、ヒドロキシおよびＣ１－Ｃ３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよく、
    Ｍは、単結合、
    Figure 2023182649000171
    であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。）
    で表される、請求項１に記載の変異ｔＲＮＡ。
  3. ｔＲＮＡを改変することにより作製されている変異ｔＲＮＡであって、当該改変が、Ｎ１Ｎ２Ｎ３で表されるアンチコドンの改変後の１文字目のヌクレオシドＮ１が下記式Ａ’：
    Figure 2023182649000172
    （式中、
    Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立してＨまたはＣ１－Ｃ３アルキルであり、
    Ｌは、ヒドロキシおよびＣ１－Ｃ３アルキルからなる群より選択される１つまたは複数の置換基によって置換されていてもよい、Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンまたはＣ２－Ｃ６直鎖アルケニレンであり、該Ｃ２－Ｃ６直鎖アルキレンの炭素原子は、１個の酸素原子または硫黄原子によって置換されていてもよく、
    Ｍは、単結合、
    Figure 2023182649000173
    であり、波線は炭素原子との結合点を示し、＊は、水素原子との結合点を示し、＊＊は窒素原子との結合点を示し、ただしＭが単結合である場合、Ｍに結合したＨは存在しない。）
    で表される改変を含み、Ｎ２およびＮ３はそれぞれ、該アンチコドンの２文字目および３文字目の任意のヌクレオシドであり、
    該アンチコドンはＭ１Ｍ２Ｍ３で表されるコドン（ここで、Ｍ１、Ｍ２およびＭ３はそれぞれコドンの１文字目、２文字目および３文字目のヌクレオシドを表す）に相補的であり、
    Ｍ１およびＭ２は、天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＡであるコドンとＧであるコドンがともに同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから選択される、変異ｔＲＮＡ。
  4. 改変前のＮ１がシチジン（Ｃ）であって、かつ当該シチジン（Ｃ）からライシジン（ｋ２Ｃ）への改変が、配列番号：５１のアミノ酸配列を有するライシジン合成酵素（ｔＲＮＡＩｌｅ－ｌｙｓｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ；ＴｉｌＳ）では触媒され得ない、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  5. 改変前のＮ１がシチジン（Ｃ）であって、かつ当該シチジン（Ｃ）からアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）への改変が、配列番号：５２のアミノ酸配列を有するアグマチジン合成酵素（ｔＲＮＡＩｌｅ－ａｇｍａｔｉｄｉｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ； ＴｉａＳ）では触媒され得ない、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  6. アンチコドンがｋ２ＣＮ２Ｎ３またはａｇｍ２ＣＮ２Ｎ３（ここで、アンチコドンの１文字目のヌクレオシドはライシジン（ｋ２Ｃ）またはアグマチジン（ａｇｍ２Ｃ）であり、２文字目のヌクレオシド（Ｎ２）、３文字目のヌクレオシド（Ｎ３）はそれぞれＭ２、Ｍ１に相補的である）で表される、請求項１～５のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  7. Ｍ１Ｍ２Ａで表されるコドン（ここで、Ｍ１およびＭ２はそれぞれコドンの１文字目および２文字目のヌクレオシドを表し、Ｍ１およびＭ２はそれぞれアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、ウリジン（Ｕ）のいずれかから選択され、３文字目のヌクレオシドはアデノシンである）に相補的なアンチコドンを有する、請求項１～６のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  8. 天然の遺伝暗号表において、３文字目のヌクレオシドがＵであるコドン、Ｃであるコドン、Ａであるコドン、およびＧであるコドンがいずれも同じアミノ酸をコードしているコドンボックスを構成するコドンから、Ｍ１およびＭ２が選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  9. Ｍ１およびＭ２が以下（ｉ）から（ｖｉ）からなる群より選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ；
    （ｉ）Ｍ１がウリジン（Ｕ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、
    （ｉｉ）Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、
    （ｉｉｉ）Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、
    （ｉｖ）Ｍ１がシチジン（Ｃ）であり、Ｍ２がグアノシン（Ｇ）である、
    （ｖ）Ｍ１がアデノシン（Ａ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、
    （ｖｉ）Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がウリジン（Ｕ）である、
    （ｖｉｉ）Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がシチジン（Ｃ）である、および
    （ｖｉｉｉ）Ｍ１がグアノシン（Ｇ）であり、Ｍ２がグアノシン（Ｇ）である。
  10. ３’末端にアミノ酸またはアミノ酸類縁体が結合している、請求項１～９のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ。
  11. 複数の異なる種類のｔＲＮＡを含む組成物であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡを含む、組成物。
  12. （ａ）請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異ｔＲＮＡ、および（ｂ）Ｍ１Ｍ２Ｇで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡを含む、請求項１１に記載の組成物。
  13. さらに、（ｃ）Ｍ１Ｍ２ＵまたはＭ１Ｍ２Ｃで表されるコドンに相補的なアンチコドンを有するｔＲＮＡを含む、請求項１１または１２に記載の組成物。
  14. 請求項１２（ａ）、請求項１２（ｂ）、および請求項１３（ｃ）に記載のｔＲＮＡに結合しているアミノ酸またはアミノ酸類縁体がいずれも互いに異なる、請求項１３に記載の組成物。
  15. 請求項１１～１４のいずれか一項に記載の組成物を用いて核酸を翻訳することを含む、ペプチドの製造方法。
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