WO2006135096A1 - 部位特異的にタンパク質にチロシンアナログを導入する方法 - Google Patents

部位特異的にタンパク質にチロシンアナログを導入する方法 Download PDF

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WO2006135096A1
WO2006135096A1 PCT/JP2006/312370 JP2006312370W WO2006135096A1 WO 2006135096 A1 WO2006135096 A1 WO 2006135096A1 JP 2006312370 W JP2006312370 W JP 2006312370W WO 2006135096 A1 WO2006135096 A1 WO 2006135096A1
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WO
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trna
amino acid
tyrosine
modified
protein
Prior art date
Application number
PCT/JP2006/312370
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kazuya Nishikawa
Takashi Yokogawa
Satoshi Ohno
Original Assignee
Gifu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gifu University filed Critical Gifu University
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Publication of WO2006135096A1 publication Critical patent/WO2006135096A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing an unnatural amino acid-containing protein in which any natural amino acid is replaced with an unnatural amino acid. More specifically, the non-natural amino acid is translated to introduce a non-natural amino acid into a codon at a specific site of the gene encoding the protein.
  • the present invention relates to a method for producing a mino acid-containing protein.
  • the following methods are known as methods for preparing unnatural amino acid-containing proteins.
  • a method has been developed in which a suppressor tRNA is used, and one of the three original codons (amber codon) is a non-natural amino acid codon and a non-natural amino acid is incorporated in a site-specific manner (Non-patent Reference 1: Science, 244, 182-188 (1989)).
  • the codon at the site where the unnatural amino acid in the gene is to be introduced is mutated to a codon corresponding to the suppressor tRNA, and the subletter tRNA and the unnatural amino acid are chemically combined using such a mutated gene.
  • cell-free protein translation was performed in the presence of unnatural amino acid-binding tRNA.
  • Non-Patent Document 2 JBC vol. 271, pp. 23169
  • unnatural amino acid protein (hereinafter also referred to as unnatural amino acid protein) while reusing tRNA.
  • a protein containing unnatural amino acid is synthesized in Escherichia coli using a mutant enzyme obtained by specifically mutating a tyrosyl tRNA synthetase (TyrRS) derived from the genus Methanococcus to an unnatural amino acid and endogenous tRNA.
  • TyrRS tyrosyl tRNA synthetase
  • the inventors of the present application have already added a cocoon to a protein synthesis system containing a tyrosine analog, a suppressor tRNA, and an aminoacyl tRNA synthetase variant that binds the above-mentioned thymosine analog to a suppressor tRNA.
  • a method to In this method azidotyrosine, acetyltyrosine, aminotyrosine, or dopa can be introduced as a tyrosine analog (Patent Document 2: Patented 2000-0 2 6 1 1 60).
  • a selenomethionine-substituted protein produced by, for example, the method disclosed in Non-Patent Document 4 has been conventionally used for X-ray crystal structure analysis of proteins.
  • a methionine-requiring strain of Escherichia coli and a plasmid containing the gene of the target protein are prepared, transformed, and then agarose containing antibiotics. Use a gel plate to isolate a single colony that expresses the protein of interest.
  • the isolated transformant is cultured in a medium containing selenomethionine instead of methionine to express and purify the target protein.
  • Patent Document 1 Patent No. 3 3 1 7 9 8 3
  • Patent Document 2 Japanese Patent Laid-Open No. 2 0 0 4-2 6 1 1 6 0
  • Non-Patent Document 1 Science, 244, 182-188 (1989)
  • Non-Patent Document 4 Toshiyuki Shimizu, Kengo Okada, Toshio Hakoshima, Chapter 17 X-ray crystal structure analysis Expression and preparation of selenomethionine-substituted protein, “Basic Biochemical Experimental Method 3 Protein Quality I. Detection / Structural Analysis ”, Tokyo Chemical Co., Ltd., 1st edition, 1st edition 2 0 0 February 15, 1 p. 1 8 9 — 1 90. Disclosure of the invention
  • the method of using a suppressor tRNA and an aminoacyl tRNA synthetase that binds the amino acid analog to a suppressor tRNA in a protein synthesis system is desirable for efficiently producing an unnatural amino acid protein.
  • a suppressor tRNA and an aminoacyl tRNA synthetase that binds the amino acid analog to a suppressor tRNA in a protein synthesis system is desirable for efficiently producing an unnatural amino acid protein.
  • tyrosin analogs analogs
  • alanine analogs etc. For this reason, it is necessary to introduce an amber codon mutation into the target protein gene.
  • the present invention provides a method for producing a mutant protein containing a tyrosine analog in a codon encoding an amino acid other than a stop codon such as amber codon without introducing a mutation into the target gene.
  • a mutant protein containing a tyrosine analog in a codon encoding an amino acid other than a stop codon such as amber codon without introducing a mutation into the target gene.
  • the inventors of the present application examined the requirements for developing a method for producing a mutant protein containing a tyrosin analog in a codon encoding an amino acid other than the stop codon. For example, if Ser Codon AGU / AGC (AGY) is assigned for tyrosine analogs, the following problems occur.
  • novel mutant enzyme must not recognize the tRNA originally present in the cell-free protein synthesis system.
  • novel tRNA can be used in cell-free protein synthesis systems. It must not be a substrate for the aminoacyl tRNA synthetase that originally exists.
  • tRNA 5 for AGU (anticodon GCU: As mentioned above, anticodon ACU usually does not exist) that is originally present in the cell-free protein synthesis system such as E. coli cell extraction system. And tRNA to which tyrosine analog is bound and tRNA to which Ser is bound compete for the above AGU or AGC codon. On the other hand, tRNA Seirs other than those for AGU are used as they are and must not be removed.
  • the inventors have developed a technology that introduces a non-natural amino acid (tyrosine analog) that has already been found by the inventors in a specific manner of a suppressor codon. I found a solution.
  • tRNA Tyr tyrosine tRNA
  • AGY antiicodon ACU or GCU
  • non-natural amino acid-containing proteins can be synthesized from DNA-type DNA in the presence of tyrosine analogs in a cell-free protein synthesis system derived from E. coli excluding AGU tRNA. . '
  • Figure 1 shows the results of examining conditions for removing all types of tRNA from E. coli cell extracts. : 5 times the amount of Q-sepharose HP resin was packed in a spin column and then centrifuged at 1000 rpm for 3 min at 4 ° C. Solutions prepared by adding 0 to 0.7 M acetic acid lithium to Buffer S30 were prepared, and each was used to equilibrate the resin. E. coli cell extract was loaded and the flow through was collected. 10% polyatariate containing 7M urea The nucleic acid was stained by electrophoresis on a amide gel.
  • FIG. 2 shows the results of protein synthesis using E. coli cell extracts treated with different concentrations of potassium acetate.
  • E. coli cell extract (S30) is treated at a concentration of 0.4 to 0.6M acetic acid, when a mixture of all types of tRNA (hereinafter sometimes referred to as tRNA Mix ) is added to the reaction solution Since only protein synthesis can be confirmed, it is confirmed that within this range, it was confirmed that all types of tRNA could be removed from the E. coli cell extract (S30) without reducing the protein synthesis ability.
  • tRNA Mix a mixture of all types of tRNA
  • Fig. 4 shows the detection result of tRNA Ser (AGY) by Northern hybridization.
  • Figure 5-1 shows the measurement results of tyrosine reception. : Tyrosine uptake of WT tRNA Tyl "and tRNA variant by calculating pmol / OD from radioactivity value and specific activity value of tyrosine after 5 min, 10 min and 15 min for each sample The following shows the results of comparison : Each tRNA Tyl: variant is represented by its respective anticodon.
  • Figure 5-2 is the same as Figure 5-1.
  • Figure 5-3 is the same as Figure 5-1.
  • Figure 5-4 is the same as Figure 5-1.
  • Figure 5-5 is the same as Figure 5-1.
  • Figure 6-1 shows the measurement results of amino acid reception corresponding to anticodon. : Using the 14 C amino acid corresponding to the anticodon of the tRNA variant, the radioactivity was measured after 5 minutes, 10 minutes and 15 minutes, and compared with the incorporation of that amino acid using tRNA Mix. tRNA Tyi "variants are indicated by their respective anticodons.
  • Figure 6-2 is the same as Figure 6-1.
  • Figure 6-3 is similar to Figure 6-1.
  • Figure 6-4 is the same as Figure 6-1.
  • Figure 6-5 is the same as Figure 6-1.
  • Figure 6-6 is the same as Figure 6-1.
  • Figure 6-7 is similar to Figure 6-1.
  • Figure 6-8 is the same as Figure 6-1.
  • the upper graph shows the tyrosine acceptability and the lower graph shows the amino acid acceptability corresponding to the anticodon.
  • Figure 8 shows the tyrosine acceptability of the tRNA Tyir variant using the yeast TyrRS mutant (D321R TyrRS).
  • Figure 9 shows the tyrosine acceptability of the tRNA variant using the yeast TyrRS mutant (D321Q TyrRS).
  • FIG. 10 shows the tyrosin acceptability of the tRNA TyI “variant using the yeast TyrRS mutant (D321N TyrRS).
  • Figure 11 shows the tyrosin acceptability of t.RNA T variants using the yeast TyrRS mutant (D321K TyrRS).
  • Figure 12 shows that tyrosine was successfully introduced into the AGU codon in the GFPuv gene.
  • the present invention relates to a method for synthesizing an unnatural amino acid-containing protein in which a non-natural amino acid is introduced in a codon-specific manner using a cell-free protein synthesis system.
  • the present invention includes (I) a non-natural amino acid-containing protein synthesis system that introduces a codon-specific non-natural amino acid prepared by the following steps (i) and (2): .
  • Tyrosine tRNA (tRNA Tyr ), which is not a substrate for aminoacyl tRNA synthetase contained in the basic cell-free protein synthesis system, is mutated to a specific anticodon (a) in the tyrosine tRNA anticodon site.
  • certain Anchiko Don (a) preparing a modified tRNA Ty r was modified tRNA for codon corresponding to.
  • the present invention comprises (II) a gene encoding a target protein and a tyrosine analog added to the above-mentioned unnatural amino acid-containing protein synthesis system,
  • It includes a method of synthesizing a protein containing an unnatural amino acid that specifically introduces a tyrosine analog into the codon corresponding to (a).
  • the present invention also relates to a method for synthesizing a non-natural protein using a cell-free protein synthesis system in which amino acids are changed in a codon-specific manner without modifying the gene.
  • a cell-free protein synthesis system in which amino acids are changed in a codon-specific manner without modifying the gene.
  • tRNA Tyr A tyrosine tRNA (tRNA Tyr ), which is not a substrate for the aminoacyl tRNA synthetase contained in the basic cell-free protein synthesis system, is introduced into a specific anticodon (a) by introducing a mutation into the anticodon site of the tyrosine tRNA. Modifying the tyrosine tRNA for codon corresponding to a specific anticodon (a),
  • the unnatural amino acid-containing protein synthesis system prepared by adding the modified tRNA Tyr and TyrRS mutants to the treated cell-free protein synthesis system, the gene encoding the target protein and It includes a method of synthesizing a non-natural amino acid-containing protein in which an oral syn analogue is added and a non-natural amino acid is specifically introduced into a codon corresponding to the anticodon (a).
  • both an in vitro translation system that translates from a cocoon-shaped mRNA, or an in vitro transcription translation system that transcribes and translates from a cocoon-shaped DNA can be used. It is.
  • these in vitro protein synthesis systems include disruption of cells, addition of 20 kinds of amino acids, mainly A30, and ATP and GTP as energy sources, and further energy regeneration systems.
  • those prepared from Escherichia coli, wheat germ, and rabbit reticulocytes, and reconstituted protein synthesis systems purely reconstituted from each component have been widely used.
  • any cell-free protein synthesis system can be used. More recently, a system constructed by purifying and mixing components necessary for translation and, if necessary, transcription can also be used. Or what was constructed
  • cell extracts that have been destroyed (deficient) or removed by immunoprecipitation such as factors that negatively affect the introduction of unnatural amino acids (eg, nucleolytic enzymes, protein degrading enzymes, dissociation factors, oxidative / reductive enzymes, etc.) are also preferably used.
  • Cell-free protein synthesis systems include, for example, systems containing ribosomes, initiation factors, elongation factors, dissociation factors, aminoacyl tRNA synthetases, tRNAs, amino acids, ATP, GTP, CTP, UTP, RNA polymerase, and buffers, or The system is composed of the minimum necessary factors for protein synthesis.
  • Balta tRNA is recovered by suspending cells in a suitable buffer, directly phenolic treatment, pulverization, shaking extraction, centrifugation, and precipitation of nuclear acid with ethanol from the aqueous phase. Dissolve in 1M NaCl, remove insoluble matter (rRNA), precipitate nucleic acid again with ethanol, dissolve in sodium acetate, remove DNA precipitated with isopropyl alcohol, dissolve again in sodium acetate, and contain tRNA The RNA fraction is precipitated and purified by a column such as Cefadex G-100 or DEAE-Cefadex. An ion exchange resin may also be used.
  • all types of tRNA can be removed by separating the cell extract obtained by disrupting cells by chromatography using various resins.
  • anion resin such as Q-sepharoseHP, DEAE resin, etc. is used.
  • salt cell lysate is loaded on the resin, and tRNA is adsorbed on the resin, thereby allowing the cell lysate to be absorbed.
  • salt various salts such as potassium chloride, potassium acetate and the like can be used, but preferably acetic acid lithium can be used.
  • tRNA Phe uses a method that uses hydrophobic sepharose hydrophobic chromatography first, followed by reverse-phase high-performance liquid chromatography (Nuc. Acid. Res Vol. 28, e64), etc. be able to.
  • DEAE-5PW, BD-5PW, hydroxypatite, NE0S0RB or LC-N-7 and other columns DEAE-T0Y0PEARL, which is not normally used for high performance liquid chromatography
  • butyl-T0Y0PEARL can also be used ("New Biochemistry Experiment Course 2 Nucleic Acid I Separation and Purification" edited by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Science Doujin). These methods can be used when all the specific amino acids are to be modified to unnatural amino acids.
  • the target tRNA can be collected using a probe containing a sequence sufficiently complementary to the tRNA sequence containing the anticodon portion.
  • Probes are suitable for probe recovery, for example, probes covalently bound to a support (oligo-cellulose, oligo-sepharose, origotex, etc.), or piotinated and avidin or streptavidin bound to the support. It can also be recovered by binding to the product (avidin-sepharose, streptavidin-cellulose, etc.). In this way, normal tRNA having an anticodon corresponding to the sense codon assigned to the non-natural amino acid that is unnecessary for the introduction of the non-natural amino acid can be removed.
  • the anticodon is
  • ACU, UAA, GCG, GCU, GGA or UGU normal tRNA can be removed. As mentioned above, ACU usually does not exist. 3. Preparation of tRNA Tyr and modified tRNA Tyr (also called tRNA Tyr variant)
  • tRNA T is modified to have an anticodon corresponding to the target codon to obtain a modified tRNA Tyr for the target codon.
  • Tyrosyl tRNA synthetase is mutated so that the modified tRNA Tyr for the target codon can accept the tyrosine analog.
  • it must be a substrate for the endogenous enzyme present in the cell-free protein synthesis system.
  • tRNA derived from eukaryotes such as yeast cytoplasm can be used.
  • tRNA derived from yeast mitochondria or prokaryote can be used.
  • a codon encoding the amino acid at the position where the tyrosine analog is to be introduced is identified.
  • the anticodon of tRNA Tyr is modified to the anticodon for the codon at the position where the tyrosine analog is to be introduced.
  • a gene encoding a yeast cytoplasmic tRNA Ty r a (e.g., SEQ ID NO: 3) is amplified by PCR.
  • the PCR product is purified on a 6% polyacrylamide gel and then ligated to an appropriate vector such as pGEMEX-1 vector.
  • the anti-codon site is mutated from the wild type (AGU) to the target anti-codon by the quick-change method using PCR with primers and mutant sequences.
  • a modified tRNA is prepared by transcription using a betater incorporating the above mutant into a cage.
  • a primer for stopping at the CCA at the 3 ′ end is designed.
  • the modified tRNA Tyl obtained here has an extra sequence.
  • RNaseP is an enzyme consisting of the active center M1RNA and C5 protein.
  • M1RNA or M1RNA and C5 protein are added to the recovered tRNA Tyl: Recovered material and lhr reaction at 37 ° C. .
  • Gel after electrophoresis The tRNA Tyr variant with the modified anticodon moiety can be recovered by gel extraction.
  • the modified tRNA for tyrosine analogs has an ACCA sequence at least at the 3 ′ end.
  • the anticodon is preferably ACU, UAA, GCG, GCU, GGA or UGU.
  • tyrosyl tRNA synthetase also called TyrRS
  • TyrRS tyrosyl tRNA synthetase
  • TyrRS derived from yeast TyrRS derived from other eukaryotes such as humans, TyrRS derived from archaea, etc.
  • the amino acid sequence of yeast-derived TyrRS has an identity of 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and more preferably 99% or more.
  • mutations can be introduced into a protein having tyrosyl-tRNA synthesis activity.
  • the tyrosyl tRNA synthetase mutant is an enzyme that specifically binds the tyrosine analog (hereinafter also referred to as Y analog) to the modified tRNA Tyr having the target anticodon (sometimes referred to as tyrosine analog tRNA synthetase). It is.
  • the aminoacyl tRNA synthetase mutant is not particularly limited as long as it uses the tyrosine analog as a substrate, but it is necessary not to recognize the tRNA present in the cell-free protein synthesis system.
  • Tyrosyl tRNA synthetase mutant modified from wild-type thymusyl tRNA synthetase, such as those described in JP-A-2004-261160 Can be.
  • wild-type tyrosyl tRNA synthetase include a tyrosifure tRNA synthetase derived from the yeast Saccharo ces cerevisiae) comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. The gene encoding this enzyme is shown in SEQ ID NO: 2.
  • This yeast-derived tyrosyl-tRNA synthetase mutant that is, a yeast TyrRS mutant, is a Y43G tyrosyl-tRNA synthetase mutation in which the 43rd Tyr of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 was replaced with Gly. (Y43G TyrRS), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Q186I TyrRS or a Q186I tyrosyl tRNA synthetase mutant (Q186I TyrRS) in which the 186th Gin of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is substituted with lie.
  • Mutants consisting of amino acid sequences 1 to 364 of TyrRS can also be used because they have similar enzyme activity. Furthermore, the first Met at the N-terminus may be deleted. Eventually, one or more amino acids are deleted from, added to, and added to the protein represented by SEQ ID NO: 1.
  • the protein represented by SEQ ID NO: 1 is a protein in which 1 to 50 amino acids are deleted, added, and Z or substituted, wherein (321st amino acid residue is changed) And those having tyrosyl-tRNA synthesis activity. More preferred is a protein in which 1 to 10 amino acids are deleted, added, and Z ′ or substituted with respect to the protein represented by SEQ ID NO: 1, wherein the amino acid residue at position 321 And having tyrosyl-tRNA synthesis activity.
  • Another mutation can be introduced into the TyrRS mutant to improve aminoacylation efficiency. For example, to convert tRNA Tyr modified from the above anticodon into an anticodon of other amino acids such as AGU of serine, etc.
  • the first aspartic acid is arginine, asparagine, glutamine, lysine, D321R TyrRS-modified D321R TyrRS, D321N TyrRS, D321K TyrRS, D321K TyrRS, and D321E TyrRS can be used, and D321R TyrRS can be used particularly preferably.
  • the recognition site for substrate amino acids is 43. , 81, 126, 174, 177, 181, 186, 186. Since this site is subject to mutation, 43, 81, 126 (S126T), 174, 177 A mutant tyrosyl-tRNA synthetase obtained by introducing a mutation at positions 181, 181, 186, 186, and 321 or a combination thereof into the enzyme of SEQ ID NO: 1 is raised.
  • the combination of mutations at positions 43 and 321; the combination of mutations at positions 81 and 321; the combination of mutations at positions 186 and 321; the combination of mutations at positions 43, 126, and 321 is also important. It is.
  • the 321st aspartic acid in SEQ ID NO: 1 is replaced with arginine or asparagine.
  • D321R TyrRS, D321N TyrRS, D321Q TyrRS, D32 IK TyrRS, and D321E TyrRS modified to glutamine, lysine, glutamic acid, etc. can be used, and D321R TyrRS can be used particularly preferably.
  • SEQ ID NO: 1 into which the mutations D321R, D321N, D321Q, D321K, and D321E are introduced are introduced,
  • a TyrRS mutant having 60% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and capable of tyrosylating modified tRNA Tyi ", In line (2)
  • a TyrRS mutant capable of tyrosylating a modified tRNA Tyr represented by a sequence in which one or several amino acids are substituted, added and / or deleted can also be used.
  • the gene sequence encoding the TyrRS mutant is that of SEQ ID NO: 2 in which the 961st to 963rd bases are modified, specifically, the base sequence represented by SEQ ID NOs: 47 to 51 is Can be mentioned. Furthermore, as a gene encoding a TyrRS variant, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 47 to 51 is
  • the above-mentioned stringent conditions may include, for example, the following conditions: DNA is bound by treatment at 120 ° C for 20 minutes. Hybond N + Naiguchi membrane (Amersham Pharmacia) was treated in phosphate buffer (0.5M Na 2 HP0 4 lmM EDTA and 7% SDS) at 65 ° C for 5 minutes, pre-, ', and hybrididase.
  • Hybridization is performed for 17 hours at 65 ° C after adding the gene represented by SEQ ID NOs: 48-51 in the same buffer, and the membrane after hybridization is at room temperature for 20 minutes, 0.1. % 2x SSC with SDS (standar d sal ine citrate; lx SSC is 150 mM NaCl,
  • Hybridization was performed at 65 ° C in the presence of 0.7 to 1 M NaCl using a filter on which DNA or DNA fragments were immobilized, and then 0.1 to 2x SSC solution (lx
  • SSC solution examples include DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C using 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate).
  • TyrRS mutant it is preferable to use a TyrRS mutant in which a tag such as a histidine tag is bound to the C-terminal of the TyrRS mutant because of its ease of purification.
  • the Y43G TyrRS is disclosed in S. Ohno et. Al., Changing the amino acid specificity of Yeast tyrosyl-tRNA synthetase by genetic engineering, J. Biochem. 130, 417-423 (2001). Yes. All of the TyrRS mutants use the nonsense suppressor tRNA Tyr (sup. TRNA Tyr ) (amber, ocher or opal) as a substrate.
  • the saddle type is a site-directed mutagenesis of a stop codon recognized by the sup.tRNA.
  • DNA is a polynucleotide artificially placed in the translation region and used in the form of DNA or mRNA.
  • DNA include double-stranded DNA containing a sequence essential for transcription, and it is most convenient to introduce the DNA into various vectors and plasmids.
  • the termination codon located at the 3 'end of the coding region', the sup. Is codon of different base sequences are arranged in a tRNA Ty r recognizes termination codons.
  • Y analogs include azido-tyrosine, acetyl-tyrosine, amino-tyrosine; amino- tyrosine .;
  • R 2 represents an azide group, a acetyl group or an amino group.
  • the Y analog shown in ⁇ ⁇ 1 has an azido group (—N 3 ), a acetyl group (one COCH) as the substituent R 1 at the 3 (meth) position of the phenolic aromatic ring constituting the side chain of tyrosine. 3 ) It has an amino group (one NH 2 ) or a hydroxyl group (one OH).
  • the Y analog shown in Fig. 2 has an azide group, a acetyl group or an amino group as a substituent R 2 at the 2 (alt) position of the phenolic aromatic ring constituting the side chain of tyrosine.
  • These Y analog substituents may be bonded to either the meta position or the ortho position, but the reaction to form a modified Y analog is performed at the end of the side chain. It is preferably bonded to the meta position.
  • These Y analogs may be either L-type or D-type optical isomers, but are preferably L-type because of high protein synthesis efficiency.
  • the modified ⁇ analog is an organic compound in which a modified product is bonded to the side chain of the Y analog (position 2 or position 3 of the phenolic aromatic ring).
  • the modified product includes a modifying group and a reactive group bonded to the modifying group. Examples of the reactive group include orthoalkoxycarbonyl aryl dialphosphine (trial aryl phosphine).
  • the modifying group is not particularly limited. However, since it is easy to expand practical applications, fluorescent substances, hydrophobic macromolecules, hydrophilic substances, charged substances, hydrogen-bonding substances, chemical reactivity Substances having a bioactivity, physiologically active substances (enzymes, etc.), biological constituents (proteins, sugar chains, polynucleotides, fatty acids, etc.), biotin, antibodies or parts thereof are preferably used.
  • a functional carrier used for a drug delivery system (DDS) such as polyethylene glycol may be used as the modifying group.
  • This modified Y analog can be obtained by chemically or biochemically bonding (covalently bonding) a substituent of Y analog and a reactive group of the modified product.
  • the reactive group when the substituent is an azide group, the reactive group is a triarylphosphine derivative.
  • the reactive group is hydrazine
  • the reactive group when the substituent is an amino group, the reactive group is succinic acid imide ester, isothiocyanate, sulfonyl chloride, aldehyde, or carboxylic acid. It becomes acid halide or its acid anhydride.
  • the reaction between these substituents and reactive groups is a chemical reaction.
  • the hydroxyl groups at the 3rd and 4th positions of the funolic aromatic ring are bonded to the amino group as a reactive group using an enzymatic reaction by dopoxidase (D0PA oxidase).
  • D0PA oxidase dopoxidase
  • the modified product binds to form a modified Y analog.
  • the reaction for modifying the substituents of these Y analogs can be carried out under physiological conditions (for example, conditions under which general bacteria such as Escherichia coli and yeast or single cell organisms can survive). 6. Production of unnatural amino acid-containing proteins containing tyrosine analogs that are codon specific.
  • the unnatural amino acid-containing protein can be prepared according to the method of the prior application by the present inventors (Japanese Patent Laid-Open No. 2004-261160).
  • a codon corresponding to the amino acid to be substituted in the protein or protein-encoding gene to which the unnatural amino acid is to be contained Desirably, UUA, CGC, AGU, CGA, ACA, and anticodon are selected as ACU, UAA, GCG, GCU, and UGU for leucine, arginine, serine, and threonine.
  • the tRNA having the selected anticodon is removed from the cell-free protein synthesis system to be used, and the remaining tRNA is added again to the cell-free protein synthesis system.
  • the tRNA Tyr variant has a high tyrosine-receptive capacity and does not accept the corresponding amino acid at all.
  • the tRNA Tyl variant is desirable. Specifically, anticodons are ACU, UAA, GCG. , GCU, that is desirable to select a tRNA Tyr modified body is UGU. the tRNA Tyr variant is added to the cell-free protein synthesis system.
  • the C5 protein gene (rnpA) was amplified by PCR from the genomic DNA of E. coli strain JM109.
  • the primers used to add Ndel and Xhol sites were 5 'and 1 GGG GCT GCA GCA TAT GGT TAA GCT CGC ATT TCC CAG -3, (SEQ ID No: 4) and 5, respectively.
  • the PCR fragment was cloned into pET21a (+) (this is called PETC5).
  • the Escherichia coli BL21 (DE3) strain transformed with pETC5 was cultured in 1 liter of LB medium until 0D600 reached 0.5-0.8, and expression was induced with 0.5 mM IPTG. After incubating for 4 hours, the expressed cells were collected and frozen.
  • the frozen cells were suspended in 50 ml of 50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 5 mM EDTA, and 10 Glycerol 1M NaCl solution, and crushed with an ultrasonic crusher (Biolabter, Tohoku Denki Japan '). After centrifugation at 30, OOOx for 30 minutes, the supernatant was subjected to 50% saturated ammonium sulfate precipitation. After centrifuging with 17, OOOx for 15 minutes, the supernatant was subjected to 80% saturated ammonium sulfate precipitation. 17. The precipitate recovered by centrifugation in OOOx for 15 minutes is dissolved in buffer A (50 mM sodium acetate (pH 6.5), 5 mM EDTA, 0.25 M NaCl), and the solution is further buffered.
  • buffer A 50 mM sodium acetate (pH 6.5), 5 mM EDTA, 0.25 M NaCl
  • dialyzed protein solution was purified using 10 ml of SP Sepharose column (Amersham). NaCl linear concentration gradient at a flow rate of 2 ml / min
  • Collect fraction containing C5 protein concentrate with Amicon Ultra, 20 mM Tris-HC1 (pH7.6), Im MgCL, 40 mM
  • the genome of M1RNA was amplified by PCR from the genomic DNA of E. coli strain JM109. Primers are used to fuse the EcoR I site with the T7 promoter 5, -GGG GGA ATT CTA ATA CGA CTC ACT ATA GAA GCT GAC CAG ACA GTC GC-3, (SEQ ID No: 6) (underlined) and To incorporate BamHI, 5′-GGG GGG ATC CGG ATG ACG TAA ATC AGG TGA AAC TG-3 ′ (SEQ ID No: 7) was used. The fragment after PCR was cloned into pUC19 plasmid to produce pUCMl.
  • the template for in vitro transcription of Ml RNA consists of a T7 promoter region (TAATACGACTCACTATA (SEQ ID No: 43)) and a hybridizing T7 primer and a primer complementary to the 3 'end region of Ml RNA.
  • Glycerol-stocked Escherichia coli Q13 strain is LB The plate was streaked. One of the colonies that emerged was inoculated into LB medium and cultured with shaking at 37 ° C. This was used as a preculture. In the main culture, a volume of pre-culture solution corresponding to 10% of 2 X TY medium (Tryptone 16 g / l, Yeast extract 10 g / l, NaCl 5 g / l) was transferred and cultured at 37 ° C with shaking. The medium was cooled when the absorbance at 600 nm reached 0.4. Bacteria were collected by centrifugation at 5,000 rpm for lOmin.
  • the supernatant was removed as much as possible, the amount of cells was measured, and the cells were suspended in 2 volumes of Buffer S30 (20 mM Hepes-K0H ( ⁇ 7.5), 20 mM ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 10 mM ⁇ -ercaptoethanol). Transfer to a glass tube (Iwaki Glass Co., Ltd.) containing glass beads of the same volume as the suspension (B. BRAUN Co., Ltd. 0.45) and crush the cells with MSK cel l homogeni zer (B. BRAUN Co.) did. The disrupted solution was centrifuged at 30,000 X for 30 minutes, and the supernatant was used as the E. coli cell extract. This was aliquoted and stored frozen in liquid nitrogen.
  • Buffer S30 (20 mM Hepes-K0H ( ⁇ 7.5), 20 mM ammonium acetate, 10 mM magnesium acetate, 10 mM ⁇ -ercaptoethanol). Transfer to a glass
  • the spin column was packed with 5 times the amount of Q-sepharose HP resin compared to the E. coli cell extract, and centrifuged at 4 ° C. Prepare solutions (8 types) by adding 0M, 0.1M, 0.2M, 0.3M, 0.4, 0.5M, 0.6M, or 0.7M acetic acid potassium to Buffer S30. Was used to equilibrate the resin. E. coli cell extract was loaded and the flow through was collected. The removal of tRNA was confirmed with a 10% polyacrylamide gel containing 7M urea. ( Figure 1)
  • a method of removing tRNA with a specific sequence from a mixture of all types of tRNA (tRNA Mix ) The following describes the method for removing tRNA Ser (AGY) with GCU as an anticodon from a mixture of all types of tRNA (tRNA Mix ) S, and the same operation using a DNA probe corresponding to the tRNA having a specific sequence.
  • TRNA having a specific sequence can be removed.
  • both AGU and AGC assigned to serine, that is, AGY are read using only one type of tRNA Ser (tRNA Ser (AGY) ) whose codon is GCU.
  • tRNA Mix from which tRNA Ser ( AGY ) has been removed from tRNA Mix is called tRNA Mix — Se " AGY ).
  • Biotin DNA probe (sequence CGG TGA GGC GGG GAT TCG AAC CCC GGA TGC-biot in) SOOpmol equivalent was diluted to 400 il with 20 mM Tri s-HCl buffer (pH 7.6), and this amount was 3 times ( total 1200 ⁇ 1) Make it. Measure the absorbance of this DNA solution ( 0.619 A 260 units / ml), add 400 1 each to a filter container containing Streptavidinase mouth resin, and shake at room temperature. I left it for about 10 minutes. This was centrifuged at 6000x5 "to remove unbound DNA probes. The absorbance of the DNA solution that had come out of the A, B, and C tubes was also measured.
  • Tube B 0. 135A 260unit / ml
  • Tube C 0. 130A 260unit / ml
  • the tRNA solution was incubated at 65 ° C for 5 minutes.
  • the corresponding tRNA solutions were added to the previously prepared filter containers A, B, and C, and further incubated at 65 ° C for 2 minutes. After that, it was slowly cooled to 25 ° C to bind the target tRNA to the resin. Centrifuge at 6000x ⁇ for about 10 seconds to remove the unbound tRNA solution. The absorbance of the removed tRNA solution was also measured, and the amount of tRNA was calculated.
  • Primer 1 and Primer 2 were selected from the combinations shown in [Table 7] below (for example, a set of a corresponding forward primer and reverse primer such as TNT-F and TNT-R).
  • TNC — F GCCCGATCTCAAGATTGRAAGTCTTGCGCC3 '(SEQ ID No 11)
  • TNA- — R 5 'GGCGCAAGACTTRAAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 14)
  • GNT- — F 5 GCCCGATCTCAAGATTARCAGTCTTGCGCC3 '(SEQ ID No 17)
  • GNT- — R 5 GGCGCAAGACTGRTAATCTTGAGATCGGGC3 '(SEQ ID No 18)
  • GNC- — F 5
  • GNC- — R 5 GGCGCAAGACTGRCAATCTTGAGATCGGGC3 '(SEQ ID No 20)
  • GNA- — R 5 GGCGCAAGACTGRAAATCTTGAGATCGGGC3 '(SEQ ID No 22)
  • GNG- — F 5
  • GNG- — R 5 GGCGCAAGACTGRGAATCTTGAGATCGGGC3 '(SEQ ID No 24)
  • CNG-I F 5 GCCCGATCTCAAGATTCRGAGTCTTGCGCC3 '(SEQ ID No 31)
  • CNG--R 5, GGCGCAAGACTCRGAATCTTGAGATCGGGC3 ′ (SEQ ID No 32) In the sequence, R represents A or G.
  • R represents A or G.
  • a reaction solution having the above composition was prepared, and plasmid DNA containing the modified tRNA gene was amplified by PCR.
  • the plasmid DNA containing the wild-type tRNA Tyr gene before modification used in PCR is 5, GGG GTC TAG ACT CTC GGT AGC CAA GTT GGT TTA AGG CGC AAG ACT GTA AAT CTT GAG ATC GGG C-3, (SEQ ID No: 44) and 5 '-GGG GAA GCT TGG TCT CCC GGG GGC GAG TCG AAC GCC CGA TCT CAA GAT TT-3' (underlined complementary sequence: SEQ ID NO: 45) was annealed, and then Klenow A double strand was formed by fragment and incorporated into pGEMEX_l (Promega) using Xba I and Hindlll sites.
  • Dpnl 0.51 was added to the PCR product, incubated for 1 hour, and placed in a competent cell 'DH5alpha' for transformation. Plasmid DNA was prepared from the resulting colonies. The sequence of the obtained plasmid DNA was confirmed with a Hitachi sequencer (SQ5500E).
  • the 5'- ⁇ 7 primer and 3-'0ME primer are as follows.
  • 5 '- ⁇ 7 primer 5' GGGGCTGCAGTAATACGACTCACTATA3 '(SEQ ID No: 33)
  • 3-'OME primer TGmGTCTCCCGGGGGCGAGT (SEQ ID No: 34)
  • a reaction solution was prepared with the composition described above, and PCR was performed to amplify the site necessary for transcription.
  • the PCR product was treated with phenol 'chloroform, ethanol precipitated, dried and stored at -30 ° C.
  • composition of 10XTDM Buffer, 10XSB Buffer, and lOXNTP Buffer is as follows.
  • the transcription type DNA obtained in (2) above was used, and the transcription reaction was carried out at a reaction time of 1 hour and a reaction temperature of 42 ° C.
  • DEPC-treated Gel Elution Buffer was prepared as follows.
  • an aminoacylation reaction was performed using “C tyrosine”. Incubate the reaction solution at 30 ° C for 5 min with the following reaction composition, with the enzyme removed, add the enzyme, incubate at 30 ° C, and add 5% TCA for each time of 0, 5, 10, 15 min. Spotted on moistened filter paper and soaked in 5% TCA. When the reaction solution for each hour was spotted, 5% TCA was discarded at once, and a new 5% TCA was added to the beaker and shaken for lOmin. When this was repeated twice, 100% ethanol was added and lightly shaken and dried under an electric lamp.
  • WTtRNA tyr 0.09A 260unit was used in place of the modified tRNA as a positive control for dH 20 Up to 30.
  • an aminoacylation reaction was performed using each 14 C amino acid. Incubate the reaction solution at 30 ° C for 5 min with the following reaction composition after removing the enzyme, add the enzyme, incubate at 30 ° C, and add 5% TCA for each time of 0, 5, 10, 15 min. Spotted on moistened filter paper and soaked in 5% TCA. After spotting the reaction solution for each hour, discard 5% TCA, add new 5% TCA to the beaker and shake for lOmin. When this was repeated twice, 100% ethanol was added and lightly shaken and dried under an electric lamp.
  • FIG. 5 and FIG. 6 are combined, and the measurement result of tyrosine acceptability is shown in the upper part of FIG. 7, and the measurement result of amino acid acceptability is shown in the lower part.
  • anticodone is highly tyrosine-receptive for tAARNA Tyr variants of UAA, GCG, GCU, and UGU, and the corresponding amino acids leucine, arginine, serine, and threonine are completely accepted. Therefore, it may be used as a useful tRNA for transporting unnatural amino acids. Even if these modified tRNA Ts are assigned to the genetic code table for unnatural amino acids, there are still leucine, arginine, serine, and threonine codons, so several unnatural amino acids are assigned to the genetic code table. It will be possible.
  • pET-Ful l-yYRStag is used as a templete, and a primer for the following mutants is synthesized.
  • -To- pQE-3 '(CCCCAAGCTTTGTTAGCAGCCGGA (SEQ ID No: 36)) and a + primer were used for PCR reaction and purified by agarose gel and glass powder.
  • 3% GTG agarose gel was used for the PCR product generated by the combination of the 3 'primer and + primer, the target band was cut out, the gel was frozen at 80 ° C, and the DNA fragment was recovered using a filtered Eppendorf tube.
  • the PCR product on the-side and the PCR product on the + side are combined, and ethanol precipitation is performed.
  • the primers used are as follows.
  • D321R-Primer / 27mer ACCAATTTTTAGGCGAGGTGGGGACAA (SEQ ID No: 37)
  • the yeast TyrRS mutant gene into which site-specific mutation was introduced by PCR was introduced into PUC19, and the sequence was confirmed with a DNA sequencer.
  • Each enzyme mutant gene whose sequence was revealed was transferred to the expression vector pET21-a (+) to construct a pETD321 mutant vector.
  • the yeast TyrRS mutant expressed by fusing the 6x His-Tag was purified by affinity chromatography and ion exchange column chromatography in the following manner.
  • the collected cells are suspended in 15 ml of buffer A, and the suspension is subjected to ultrasonic treatment for 20 seconds using an ultrasonic crusher, then left to cool for 40 seconds, and repeated 30 times to disrupt the cells. .
  • the disrupted solution was centrifuged with Avant iTM J-25 I (manufactured by BECKMAN) at 30 and OOOx for 30 minutes to obtain S30 (supernatant).
  • the obtained S30 was loaded onto Ni-NTA resin (lml) equilibrated with bufferA in advance, and washed with bufferA until absorption at 280 nm was observed.
  • Elution buffer as shown below was added to collect a sample with absorption at 280 nm.
  • the collected sample was equilibrated with 0.05 M KC1 in advance.
  • SP- Sepharose HP lml (Amersham Almacia). Separation of the target protein at a concentration gradient from 0. 05M to 1M KC1 and a flow rate of lml / min. I got it. The eluate was collected every 0.5 minutes (0.5 ml). The fractionated sample was analyzed by 10% SDS PAGE, and the fraction containing the target protein was recovered.
  • a sample concentrated to about 1 ml using Amicon Ultra was placed in a dialysis tube, and dialyzed using the external dialysis solution as a stock buffer. The protein concentration was calculated by the method of measuring at 228.5-234.5 nm.
  • the composition of buffer A and B, Elution buffer, and stock buffer is shown below.
  • the tRNA Tyr variant was modified so that the corresponding a Anchiko Don yeast tRNA Tyr in codon encoding various Amino acids, Table 2 3 is Aminoashiru of at 37 ° C for the following composition
  • E. coli S30 extract (S30 / -tRNA Mix ) excluding all kinds of tRNA prepared by the method described in each example, tRNA s "( AGY ) was removed from the mixture of all kinds of tRNA (thigh Mix ).
  • Tyrosine was introduced into the AGU codon in the GFPuv gene by using the tRNA mixture (tRNA Mix — Ser (ACY) ), the modified tRNA Tyl ”in which the anticodon was modified to GCU, and the D321R TyrRS mutant. Both AGU and AGC assigned to serine, that is, AGY force and anticodon are read by the modified tRNA Tyr type of GCU. However, there is no AGC codon in the GFPuv gene.
  • the reaction conditions were Hepes buffer (Hepes_KOH (pH7.5) 55 mM), magnesium acetate (10.7 mM), ammonium acetate (27.5 mM), dithiothreitol (DTT 1.7 mM), nucleotide triphosphate ( ATP 1. 25mM, GTP 0. 83mM, UTP 0. 83mM, CTP 0.
  • Hepes buffer Hepes_KOH (pH7.5) 55 mM
  • magnesium acetate (10.7 mM)
  • ammonium acetate (27.5 mM
  • DTT 1.7 mM dithiothreitol
  • ATP nucleotide triphosphate
  • E.coli S30 extract (S30 / -tRNA Mix ) excluding all types of tRNAs plus a mixture of all types of tRNAs (tRNA Mix ) confirms the synthesized product (second lane from the left).
  • TRNA When tRNA mixture excluding Ser (ACY ) was added (tRNA Mix — Ser (ACY) ), synthesis could not be confirmed (third lane from the left).

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Abstract

　目的の遺伝子に変異を導入することなく、アンバーコドン等ストップコドン以外の、アミノ酸をコードするコドンにチロシンアナログを含む変異タンパク質の製造方法を提供することを1つの課題とする。（イ）　酵母由来のチロシンtRNAに変異を導入し、AGU用に改変し、（ロ）　酵母由来のチロシルtRNA合成酵素の変異体を利用し、（ハ）　大腸菌細胞抽出液タンパク質合成系から全種類tRNAを選択的に分離し、全種類tRNAからAGU用のtRNAのみを除去し、AGU用tRNA以外を再度大腸菌由来無細胞タンパク質合成系に戻す。　上記tRNATyr改変体及びチロシルtRNA合成酵素の変異体を用いて、AGU用tRNAを除いた大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系により、非天然アミノ酸含有タンパク質を合成できることを見い出した。

Description

部位特異的にタンパク質にチロシンアナログを導入する方法
技術分野
本願発明は、 任意の天然アミノ酸を非天然アミノ酸に代えた非天然アミノ酸含 有タンパク質を合成方法に関する。 より具体的には、 タンパク質をコードする遺 伝子の特定部位のコ ドンに非天然アミノ酸を導入するように翻訳する、 非天然ァ 明
ミノ酸含有蛋白質の製造方法に関する。 書
背景技術
非天然ァミノ酸含有タンパク質の調製方法としては次のような方法が知られて レヽる。
( 1 ) サプレッサー tRNA を用レ、、 本来 3つある終始コ ドンの 1つ（アンバーコ ド ン）を非天然アミノ酸コ ドンとして、部位特異的に非天然アミノ酸を組み込む方法 が開発された (非特許文献 1 ： Science, 244， 182- 188 (1989) )。 本方法は、 遺伝子 中の非天然アミノ酸を導入したい部位のコ ドンをサプレッサー tRNA に対応する コドンに変異させ、 かかる変異遺伝子を用いて、 サブレッサー tRNAと非天然アミ ノ酸を化学的に結合された非天然アミノ酸結合 tRNA の存在下で無細胞タンパク 質翻訳を行わせることにより調製された。
その後、 変異遺伝子を用いて、 サブレッサー tRNAと非天然アミノ酸を化学的に 結合された非天然ァミノ酸結合 tRNAを XEN0PUS卵母細胞へ注入し、非天然ァミノ 酸を部位特異的に含むタンパク質が合成されている（非特許文献 2： JBC vol. 271, pp. 23169) o
また、 サプレッサー tRNAを利用する方法では、 非天然アミノ酸の導入率が限ら れるということで、種々の tRNAの一部に非天然ァミノ酸を結合させる方法（特許 文献 1参照） がある。 この製造法は、 無細胞タンパク質合成系下で、 特定のアミ ノ酸に対応するアイソァクセプティング tRNAのうち、一部のもののみを非天然ァ ミノ酸と結合させたものと、 タンパク質構成アミノ酸 （以下標準アミノ酸もしく は天然アミノ酸と呼ぶこともある） とを用いてタンパク質合成を行って、 非天然 アミノ酸を特定のコ ドングループに組込むものである。
更に、 最近では、 特定のァミノアシル tRNA合成酵素と tRNAを組み合わせて用 いることにより、 tRNAを再利用しつつ、 非天然アミノ酸含有タンパク質 （以下非 天然アミノ酸タンパク質とも呼ぶ） を合成することが行われている。 メタノコッ カス属由来のチロシル tRNA合成酵素 （TyrRS) を非天然アミノ酸に特異的に変異 させた変異体酵素と内生 tRNA を用いて大腸菌内で非天然アミノ酸含有タンパク 質の合成を行っている . (非特許文献 3： Science vol. 292， pp. 498- 500)。
本願発明者らも、 すでに、 チロシンアナログと、 サブレッサー tRNAと、 前記チ 口シンアナログをサプレッサー tRNAに結合させるアミノアシル tRNA合成酵素変 異体とを含有するタンパク質合成系に、 錄型を加えてタンパク質合成させる方法 を発明している。 本方法は、 チロシンアナログとして、 アジドチロシン、 ァセチ ルチロシン、 アミノチロシン又はドーパを導入できるものである（特許文献 2：特 開 2 0 0 4— 2 6 1 1 6 0 )。
一方、 従来より、 タンパク質の X線結晶構造解析には、 例えば非特許文献 4に 開示されている方法により製造されたセレノメチォ二ン置換タンパク質が用いら れている。 このセレノメチォニン置換タンパク質を製造する際には、 まず、 大腸 菌のメチォニン要求株と目的タンパク質の遺伝子が揷入されているプラスミ ドを 準備して形質転換を行った後、 抗生物質を含むァガロースゲルプレートを用いて 目的タンパク質を発現する単一コロニーを単離する。 次に、 単離された形質転換 体をメチォニンの代わりにセレノメチォニンを含む培地中で培養することにより 目的タンパク質を発現させて精製するものである。
特許文献 1 特許第 3 3 1 7 9 8 3号
特許文献 2 特開 2 0 0 4— 2 6 1 1 6 0号
非特許文献 1 Science, 244, 182-188 (1989)
非特許文献 2 JBC vol. 271, pp. 23169
非特許文献 3 Science vol. 292, pp. 498-500
非特許文献 4 清水敏之、 岡田健吾、 箱嶋敏雄、 第 1 7章 X線結晶構造解析 セレノメチォニン置換タンパク質の発現と調製、 「基礎生化学実験法 3 タンパク 質 I . 検出 ·構造解析法」、 株式会社東京化学同人、 第 1版第 1刷 2 0 0 1年 2 月 1 5 日、 p . 1 8 9— 1 9 0。 発明の開示
上述したように、 サプレッサー tRNAと、 前記アミノ酸アナログをサプレッサー tRNAに結合させるアミノアシル tRNA合成酵素をタンパク質合成系に利用する方 法は、 非天然アミノ酸タンパク質を効率的に生産する上で望ましい。 しかしなが ら、 現在までのところ、 導入できる非天然アミノ酸の種類に限定があり、 チロシ ンのアナログ （類縁体）、 ァラニンのアナログなどに限られ、 アンバーコ ドン特異 的な非天然アミノ酸の導入であるため、 目的タンパク質遺伝子にアンバーコ ドン 変異を導入する必要があるなどの問題点があげられる。
そこで、 本願発明は、 目的の遺伝子に変異を導入することなく、 アンバーコ ド ン等ス トップコ ドン以外の、 ァミノ酸をコードするコ ドンにチロシンアナログを 含む変異タンパク質の製造方法を提供することを 1つの課題とする。
本願発明者らは、 ストップコドン以外のアミノ酸をコードするコ ドンにチロシ ンアナログを含む変異タンパク質の 造方法を開発するための要件を検討した。 たとえば、 Ser コ ドン AGU/AGC (AGY) をチロシンアナログ用に割り当てようと すると、 以下の問題が生じる。
( 1 ) AGU又は AGCをチロシンアナ口グ用に割り当てた新規 tRNA、 つまりアンチ コ ドンに ACU/GCUを有し、 チロシンアナログを結合させることができる新規 tRNA を合成する必要がある。 通常、 AGU、 AGC (AGY) コドンは、 アンチコドン GCU の tRNA l種類のみを利用して両方とも読まれている。通常アンチコドン ACUの tRNA は存在しない。 したがって、以下では、単に AGU用ということもあるが、 これは、 AGU/AGC用、 つまり AGY用のことである。
( 2 )上記新規 tRNAをチロシンアナログでアミノアシル化する必要がある。 そこ で、上記新規 tRNAをチロシンアナログでァミノアシル化する新規変異酵素 （新規 チロシンアナログ tRNA合成酵素） を作成する必要がある。
( 3 ) 前記新規変異酵素は、 前記無細胞タンパク質合成系にもともと存在する tRNAを認識してはならない。 また、 上記新規 tRNAは無細胞タンパク質合成系に もともと存在するアミノアシル tRNA合成酵素の基質となってはならない。
( 4 ) また、 大腸菌細胞抽出系等の上記無細胞タンパク質合成系にもともと存在 している AGU用の tRNA5 (アンチコドン GCU： なお、 上記したように通常アンチ コ ドン ACUは存在しない）を除かないとチロシンアナログが結合した新規 tRNAと Serが結合した tRNAが上記 AGU又は AGCコ ドンを巡って競合することになる。他 方、 AGU用以外の tRNASeirは、 そのまま使用するので、 除いてはならない。
そこで、 発明者らは、 既に発明者らが見出している非天然アミノ酸 （チロシン アナログ） をサブレッサーコ ドン特異的に導入する技術を開発しているので、 こ れを利用することにより、 つぎのような解決手段を見出した。
たとえば、 大腸菌細胞抽出液によるタンパク質合成系においては、
(ィ） 酵母由来のチロシン tRNA (tRNATyr) に変異を導入し、 AGY用 （アンチコ ド ン ACU又は GCU) に改変し （改変型 tRNA と呼ぶ）、
(口） 酵母由来のチロシル tRNA合成酵素の変異体 （TyrRS変異体とも呼ぶ） を調 製し、
(ハ）大腸菌細胞抽出液によるタンパク質合成系から全種類 tRNAを選択的に分離 し、 全種類 tRNA混合物から AGU用の tRNAのみを除去し、 AGU用 tRNA以外を再度 タンパク質合成系に戻した無細胞タンパク質合成系を調製する。
上記改変型 tRNATyr及び TyrRS変異体を用いて、 AGU用 tRNAを除いた大腸菌由 来の無細胞タンパク質合成系により、 チロシンアナログの存在下、 铸型 DNAより 非天然ァミノ酸含有タンパク質を合成できる。 '
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-174097号の明細書 および Zまたは図面に記載される內容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 大腸菌細胞抽出液から全種類 tRNA を除去する条件の検討結果を示 す。：大腸菌細胞抽出液に対しその 5倍量の Q-sepharoseHP樹脂をスピンカラムに 詰め 1000rpm X 3min 4°Cで遠心した。 Buffer S30に 0〜0. 7M酢酸力リ ゥムを加え た溶液を用意し、 それぞれを用い樹脂を平衡化した。 大腸菌細胞抽出液をロード し、 素通りを回収した。 各条件における回収物を 7M尿素を含む 10%ポリアタリ ルアミ ドゲルにて泳動し、 核酸を染色した。
図 2は、 各濃度の酢酸カリゥムで処理した大腸菌細胞抽出液を用いてタンパク 質合成を行った結果を示す。：大腸菌細胞抽出液（S30) を酢酸力リ ウム 0. 4〜0. 6M の濃度で処理した場合、 全種類 tRNAの混合物 （以下 tRNAMixと呼ぶこともある） を反応液に加えた場合にのみタンパク質の合成が確認できることから、 この範囲 であれば大腸菌細胞抽出液 （S30) からタンパク質合成能を低下させず、 全種類 tRNAを除けることが確認できたことを示す。
図 3は、 tRNASe"AGY)除去処理を行った tRNAMix (tRNAMix— Se"AGY)) と、 回収した tRNASer (AGY)の純度の確認を示す。
図 4は、 ノーザンハイブリダイゼーションによる tRNASer (AGY)の検出結果を示す。 図 5— 1は、 チロシン受容の測定結果を示す。 ：各サンプルについて 5分後、 10 分後、 15分後の放射能の値とチロシンの比活性値から pmol/ODを算出することに より、 WTの tRNATyl"と tRNA 改変体とのチロシン取り込みを比較した結果を示す。。 各 tRNATyl:改変体は、 それぞれのアンチコ ドンにより示されている。
図 5 — 2は、 図 5 — 1 と同様である。
図 5— 3は、 図 5— 1 と同様である。
図 5 — 4は、 図 5 — 1 と同様である。
図 5 — 5は、 図 5 — 1と同様である。
図 6— 1は、 アンチコ ドンに対応するアミノ酸受容の測定結果を示す。 ： tRNA 改変体のアンチコ ドンに対応する 14 Cアミノ酸を用いて、 5分後、 10分後、 15分 後の放射能を測定し、 tRNA Mix を用いたそのアミノ酸の取り込みと比較した。 tRNATyi "改変体は、 それぞれのアンチコ ドンにより示されている。
図 6 — 2は、 図 6 — 1 と同様である。
図 6— 3は、 図 6 — 1と同様である。
図 6— 4は、 図 6— 1 と同様である。
図 6— 5は、 図 6— 1 と同様である。
図 6 — 6は、 図 6 — 1 と同様である。
図 6— 7は、 図 6 — 1 と同様である。
図 6 — 8は、 図 6 — 1と同様である。 図 7は、 上段のグラフはチロシン受容能、 下段のグラフはアンチコドンに対応 するアミノ酸受容能をあわせて示す。
図 8は、 酵母 TyrRS変異体 （D321R TyrRS) を用いた tRNATyir改変体のチロシン 受容能を示す。
図 9は、 酵母 TyrRS変異体 （D321Q TyrRS) を用いた tRNA 改変体のチロシン 受容能を示す。
図 1 0は、 酵母 TyrRS変異体 （D321N TyrRS) を用いた tRNATyI"改変体のチロシ ン受容能を示す。
図 1 1は、 酵母 TyrRS変異体 （D321K TyrRS) を用いた t.RNAT 改変体のチロシ ン受容能を示す。
図 1 2は、 GFPuv遺伝子中 AGUコドンにチロシンが導入できたことを示す。 発明を実施するための最良の形態
本願発明には、 無細胞タンパク質合成系を用いて、 コドン特異的に非天然アミ ノ酸を導入する非天然アミノ酸含有タンパク質合成方法に関する。
より具体的には、 本願発明には、 （I) 以下の（ィ）一（二）の工程により調製され るコ ドン特異的に非天然アミノ酸を導入する非天然アミノ酸含有タンパク質合成 系を包含する。
(ィ）基本となる無細胞タンパク質合成系に含まれるアミノアシル tRNA合成酵素 の基質とはならないチロシン tRNA (tRNATyr) について、 チロシン tRNAのアンチ コ ドン部位を特定のアンチコ ドン（a)へと変異を導入し、特定のアンチコ ドン（a) に対応するコ ドン用の tRNAに改変した改変型 tRNATyrを調製する工程。
(口） 前記改変型 tRNATyrをアミノアシル化することができるチロシル tRNA合成 酵素の変異体 (TyrRS変異体）を調製する工程。
(ハ） 前記無細胞タンパク質合成系から全種類 tRNA を選択的に分離し、 全種類 tRNA混合物 （tRNAMix) から前記特定のアンチコ ドン'（a)を有する tRNAのみを除去 し、 前記特定のアンチコ ドン（a)を有する tRNA以外を再度無細胞タンパク質合成 系に戻す工程。
(二）上記改変型 tRNATyr及び TyrRS変異体を前記処理された無細胞タンパク質合 成系に添加する工程。
本願発明は、 （II) 上記した非天然アミノ酸含有タンパク質合成系に、 目的のタ ンパク質をコードする遺伝子及びチロシンアナログを添加し、 前記アンチコ ドン
(a)に対応するコ ドンに特異的にチロシンアナログを導入する非天然アミノ酸含 有タンパク質を合成する方法を包含する。
また、 本願発明は、 無細胞タンパク質合成系を用いて、 遺伝子を改変すること なく、 コ ドン特異的にアミノ酸を変更した非天然タンパク質合成方法に関する。 具体的には、
(ィ）基本となる無細胞タンパク質合成系に含まれるアミノアシル tRNA合成酵素 の基質とはならないチロシン tRNA (tRNATyr) について、 チロシン tRNA のアンチ コドン部位に変異を導入し特定のアンチコ ドン （a) に改変し、 特定のアンチコド ン （a) に対応するコ ドン用のチロシン tRNAに改変する工程、
(口） 前記改変型 tRNATyl"をアミノアシル化することができるチロシル tRNA合成 酵素の変異体（TyrRS変異体）を調製する工程、
(ハ） 前記無細胞タンパク質合成系から全種類 tRNA を選択的に分離し、 全種類 tRNA混合物 （tRNAMix) から前記特定のアンチコ ドン'（a)を有する tRNAのみを除去 し、 前記特定のアンチコ ドン（a)を有する tRNA以外を再度無細胞タンパク質合成 系に戻す工程、 及び
(二）上記改変型 tRNATyr及び TyrRS変異体を前記処理された無細胞タンパク質合 成系に添加する工程により調製された非天然アミノ酸含有タンパク質合成系に、 目的のタンパク質をコードする遺伝子及びチ口シンアナログを添加し、 前記ァン チコ ドン （a) に対応するコドンに特異的に非天然アミノ酸を導入する非天然アミ ノ酸含有タンパク質を合成する方法を包含する。
基本となる無細胞タンパク質合成系
本発明で用いる無細胞タンパク質合成系としては、铸型としての mRNAからの翻 訳を行わせるインビトロ翻訳系、 又は铸型としての DNAから転写及び翻訳を行わ せるインビトロ転写翻訳系の両者とも利用可能である。 これらインビトロタンパ ク質合成系としては、 従来は、 細胞を破砕し、 S30 を中心に、 2 0種類のァミノ 酸並びにエネルギー源としての ATP及び GTPを添加し、 更に、 エネルギー再生系 を加えた系が用いられてきており、 特に大腸菌、 小麦胚芽、 ゥサギ網状赤血球か ら調製したもの、 さらに純粋に各構成成分から再構成された再構成タンパク質合 成系が広く用いられてきている。 本発明では、 どのような無細胞タンパク質合成 系であっても、 用いることができる。 更に最近では翻訳、 必要に応じ転写に必要 な成分をそれぞれ精製し、 混合することにより構築された系も用いることができ る。 又は、 前記両者の系を混合することにより構築されたものも用いることがで きる。
また、 非天然アミノ酸の導入に負に働く因子 （例えば核酸分解酵素、 蛋白質分 解酵素、 解離因子、 酸化 ·還元酵素等） を破壊 （欠損）、 又は免疫沈降等により取 り除いた細胞抽出液も好適に用いられる。
無細胞タンパク合成系としては、 例えば、 リボソーム、 開始因子、 伸長因子、 解離因子、 アミノアシル tRNA合成酵素、 tRNA、 アミノ酸、 ATP、 GTP、 CTP、 UTP、 RNA polymerase, 及び緩衝液等を含む系、 あるいは、 タンパク質合成に最低限必 要な因子から構成された系があげられる。
1. 無細胞タンパク質合成系からの全種類 tRNAの抽出分離方法
従来より、バルタの tRNAは、細胞を適当な緩衝液に懸濁し直接フエノール処理 し粉砕し、 振とう抽出し、 遠心分離後、 水相に可溶性の区分からエタノールで核 酸を沈殿し回収され、 1M NaCl に溶解し、 不溶物 （rRNA) を除去し、 再度エタノ ールで核酸を沈殿し、 酢酸ナトリウムに溶解後、 イソプロピルアルコールで析出 する DNAを除去し、再度酢酸ナトリゥムに溶解後、 tRNA含有 RNA分画を析出させ、 セフアデックス G - 100又は DEAE-セフアデックスなどのカラムで精製し、 入手さ れている。 イオン交換樹脂なども用いられることもある。
本発明の方法においては、 調製した無細胞タンパク質合成系から、 他の成分を 失活させることなく、 全種類 tRNAを除去することが必要である。 たとえば、 細胞 を破砕した細胞抽出液を、 種々の樹脂を用いたクロマトグラフィ一により分離す ることにより、 全種類 tRNAが除去できる。 クロマトグラフィーとしては、 陰ィォ ン樹脂、 たとえば、 Q-sepharoseHP、 DEAE 樹脂等を用い、 塩存在下で前記樹脂に 細胞破砕液をロードし、 tRNAを樹脂に吸着させることにより、 前記細胞破碎液よ り、 全種類 tRNAを分離することができる。 塩としては、 種々の塩、 たとえば、 塩化カリウム、 酢酸カリウムなどが用いる ことができるが、 好適には酢酸力リゥムを用いることができる。
2 . 全種類 tRNAの混合物からの特定コドン用 tRNAの除去
全種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) から、 特定のァミノ酸用の tRNAを分離するこ とは、 たとえば、 RP-HPLC 逆相高速液体クロマトグラフィーなどを用いて行われ てきた。 具体的には、 たとえば、 tRNAPheは、 まずフエ-ルセファロース疎水性ク ロマトグラフィーを用い、 次に逆相高速液体クロマトグラフィーを用いる方法 (Nuc. Acid. Res Vol. 28, e64) などを用いることができる。 また、 高速液体クロマ トグラフィ—には、 DEAE- 5PW、 BD-5PW、 ヒ ドロキシァパタイ ト、 NE0S0RB 又は LC-N-7などのカラムのほか、通常高速液体クロマトグラフィ一には用いられてい ない、 DEAE- T0Y0PEARL、 又はブチル -T0Y0PEARL なども用いることができる （「新 生化学実験講座 2核酸 I分離精製」 日本生化学会編、 東京科学同人)。 特定のアミ ノ酸をすベて、 非天然型アミノ酸に改変する場合は、 これらの方法を用いること ができる。
他方、 同じアミノ酸用の tRNAの内、 特定のコ ドン用 tRNAのみを分離する場合 には、 特定コ ドン用のそれぞれのコドンに対応したプローブを用いて分離するこ とができる。
たとえば、アンチコドン部分を含む tRNA配列に十分に相補的な配列を含むプロ ーブを用いて目的とする tRNAを採取することができる。 プローブは、プローブの 回収に好適な手段たとえば、 プローブを支持体 （オリゴ -セルロース、 オリゴーセ ファロース、 origotexなど） に共有結合したもの、 又はピオチン化しものとアビ ジン若しくはストレブトァビジンを支持体と結合させたもの （ァビジンーセファ ロース、 ストレプトアビジン一セルロースなど） と結合させて回収することもで きる。 このようにして、 非天然型アミノ酸の導入に不必要な、 非天然型アミノ酸 用に割り当てるセンスコドンに相当するアンチコ ドンを持つ通常の tRNA を除去 することができる。
例えば、タンパク質にチロシンアナログを導入する場合には、アンチコドンが、
ACU、 UAA、 GCG、 GCU、 GGA又は UGUの通常の tRNAを除去することができる。 なお、 上述したように、 通常は、 ACUはもともと存在しない。 3 . tRNATyr及ぴ改変型 tRNATyr (tRNATyr改変体とも呼ぶ） の調製
任意のコ ドンにチロシンアナログを割り当てるために、 tRNAT を、 標的とする コ ドンに対応するアンチコ ドンを有するように改変し、 標的コ ドン用改変型 tRNATyrとする。そしてこの改変した標的コドン用改変型 tRNATyrがチロシンアナ口 グを受容できるように、 チロシル tRNA合成酵素を変異させる。 なお、 この場合、 上記の無細胞タンパク質合成系に存在する内在性の酵素の基質となってはならな レ、。通常利用されている大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系に用いる場合には、 例えば、 酵母細胞質由来など真核生物由来の tRNAを用いることができる。 また、 小麦胚芽由来の無細胞タンパク質合成系など真核生物由来無細胞タンパク質合成 系の場合は、酵母ミ トコンドリア由来、 もしくは原核生物由来の tRNAを用いるこ とができる。
具体的には、 まず、 チロシンアナログを導入しょうとする遺伝子において、 当 該チロシンアナログ導入予定位置のァミノ酸をコードするコ ドンを同定する。 そ して tRNATyrのアンチコ ドンを当該チロシンアナログ導入予定位置のコ ドンに対 するアンチコ ドンに改変する。
より具体的には、 たとえば、 酵母細胞質 tRNATyr (tRNATyr) をコードする遺伝子 (例えば、 配列番号 3) を PCR法により増幅させる。
PCR産物を 6%ポリアク リルアミ ドゲルで精製後、 適宜なべクター、 たとえば、 pGEMEX-1 vector にライゲーシヨンする。 ベクターに組み込まれたものを、 変異 配列を持つプライマーと PCRを利用したクイックチェンジ法により、 アンチコド ン部位を野生型 (AGU) から目的のアンチコ ドンに変異させる。
上記変異体を組み込んだベタターを铸型に転写法により改変型 tRNA を調製 する。 まず、 (Kao, C. , Zheng, M. and Rudi sser, S. 1999 RNA, 5, 1268-1272) に従い 3'末端の CCAでストップさせるためのプライマーを設計する。
これらのプライマーを用いて PCR 反応を行う。 ここで得られた改変型 tRNATyl: は余分な配列を持っているので活性型の改変型 tRNA を得るには RNasePで余分 な配列を切らなければならない。 RNasePは活性中心である M1RNAと C 5タンパク 質からなる酵素であり、 M1RNA又は M1RNA及び C5タンパク質を上記した余分の配 列を含む改変型 tRNATyl:回収物に加え、 37°Cで lhr反応させる。 電気泳動後、 ゲル を切り出し、 ゲル'ェリューシヨンにより、 アンチコ ドン部分を改変した tRNATyr 改変体が回収できる。
なお、 チロシンアナログ用の改変型 tRNA には、 少なく とも 3 ' 末端が ACCA の配列を有することが望ましい。 例えば、 チロシン又はチロシンアナログ用の改 変型 tRNATyrは、 アンチコ ドンが、 ACU、 UAA、 GCG、 GCU、 GGA又は UGUであること が望ましい。
4一 1 . 前記 tRNATyr及び改変型 tRNATyirをチロシン化又はチロシンアナログ化す る変異型チロシル tRNA合成酵素 （チロシル tRNA合成酵素変異体もしくは TyrRS 変異体とも呼ぶ） の調製
変異を導入するチロシル tRNA合成酵素 （TyrRSとも呼ぶ） としては、 無細胞タ ンパク質合成系に内在する tRNAを認識しないことが必要であることから、たとえ ば、大腸菌由来の無細胞タンパク質合成系を用いるのであれば、酵母由来の TyrRS、 人など他の真核生物由来の TyrRS、 古細菌由来の TyrRSなどをあげることができ る。 以下、 酵母由来 TyrRS及び TyrRS変異体の調製について、 具体的に説明する が、 他の生物由来のものも同様にして行うことができる。 なお、 酵母由来 TyrRS のアミノ酸配列に対して 60%以上、好適には 80%以上、更に好適には 90%以上、 更に好適には 95%以上、 更に好適には 99%以上の同一性を有し、 且つチロシル tRNA合成活性を有するタンパク質に変異を導入することができる。
4一 2 . 酵母由来チロシル tRNA合成酵素及び変異型チロシル tRNA合成酵素の調 製
前記チロシル tRNA合成酵素変異体は、前記チロシンアナログ（以下 Yアナログ とも記載する） を前記標的アンチコドンを有する改変型 tRNATyrに特異的に結合 させる酵素 （チロシンアナログ tRNA合成酵素と呼ぶこともある） である。 このァ ミノアシル tRNA合成酵素変異体としては、前記チロシンアナログを基質とするも のであれば特に限定されないが、無細胞タンパク質合成系に内在する tRNAを認識 しないことが必要であり、 標準型アミノ酸に対する基質特異性が低くなりやすく 有用であることから野生型のチ口シル tRNA合成酵素を改変したチロシル tRNA合 成酵素変異体 （TyrRS変異体）、 たとえば、 特開 2004- 261160号に記載のものも用 いることができる。 具体的には、 野生型のチロシル tRNA合成酵素としては、 例えば、 配列番号 1で 表されるァミノ酸酉己列からなる酵母 Saccharo町 ces cerevisiae) 由来チロシフレ tRNA合成酵素が挙げられる。 本酵素をコードする遺伝子を配列番号 2に示す。 こ の酵母由来チロシル tRNA合成酵素の変異体、即ち酵母 TyrRS変異体としては、配 列番号 1で表されるァミノ酸配列の 43番目の Tyrが Glyに置換された Y43Gチ口 シル tRNA合成酵素変異体 （Y43G TyrRS)、 配列番号 1で表されるァミノ酸配列の
81番目の Hisが Valに置換された H81Vチロシル tRNA合成酵素変異体（H81V TyrRS) 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 186番目の Ginが Valに置換された Q186V チ口シル tRNA合成酵素変異体 （Q186V TyrRS)、 配列番号 1で表されるァミノ酸配 列の 186番目の Gin が Thr に置換された Q186T チロシル tRNA合成酵素変異体
(Q186T TyrRS)、又は配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 186番目の Ginが lie に置換された Q186Iチロシル tRNA合成酵素変異体（Q186I TyrRS)が挙げられる。 また、 前記 Y43G TyrRS, H81V TyrRS, Q1S6V TyrRS, Q186T TyrRS若しくは Q186I
TyrRSの 1〜364番目のアミノ酸配列からなる変異体も同様の酵素活性があること から用いることができる。 更に、 N末の最初の Metは欠失していてもよい。結局、 配列番号 1で表されるタンパク質に対して 1以上のアミノ酸が欠失、 付加、 及び
/又は置換されたタンパク質であって、 （321 番目のアミノ酸残基を含み、） チロ シル tRNA合成活性を有するものであればよい。 更に、 好適には、 配列番号 1で表 されるタンパク質に対して 1以上 50以下のァミノ酸が欠失、付加、及び Z又は置 換されたタンパク質であって、 （321番目のアミノ酸残基を含み、） チロシル tRNA 合成活性を有するものが挙げられる。 更に好適なものとしては、 配列番号 1で表 されるタンパク質に対して 1以上 10以下のアミノ酸が欠失、付加、及び Z'又は置 換されたタンパク質であって、 （321番目のアミノ酸残基を含み、） チロシル tRNA 合成活性を有するものが上げられる。
また、 tRNATyr導入したアンチコ ドンへの変異の種類により、 上記 TyrRSおよび
TyrRS 変異体には、 さらに別の変異を導入し、 アミノアシル化効率を改善するこ とすることができる。 たとえば、 上記アンチコ ドンをセリンの AGU等、 他のアミ ノ酸のアンチコドンに改変した tRNATyrをチロシルアナログ化するためには、 3 2
1番目のァスパラギン酸をアルギニン、 ァスパラギン、 グルタミン、 リジン、 グ ルタミン酸などに改変した D321R TyrRSヽ D321N TyrRS, D321Q TyrRS、 D321K TyrRS、 及び D321E TyrRSなどを用いることができ、 特に好適には、 D321R TyrRS を用い ることができる。
そこで、 改変型 tRNA をチロシンアナログ化する変異型チロシル tRNA合成酵 素としては、 配列番号 1について言えば、 チロシンアナログ （非天然アミノ酸） の導入を考慮した場合、 基質アミノ酸 （チロシン） 認識部位は 43位、 81位、 126 位、 174位、 177位、 181位、 186位であり、 この部位が変異の対象となることか ら、 43位、 81位、 126位（S126T)、 174位、 177位、 181位、 及ぴ又は 186位、 と 321位の変異又はその組み合わせ変異を配列番号 1の酵素に導入した変異型チロ シル tRNA合成酵素が上げられる。 具体例としては、 (Y43G, D321R) TyrRSヽ (H81V, D321R) TyrRSヽ (Q186V, D321R) TyrRS, (Q186T, D321R) TyrRS若しくは (Q186I, D321R) TyrRSの 1〜364番目のアミノ酸配列が挙げられ、好ましくは、 43位と 321 位の変異を組み合わせ、 81位と 321位の変異の組み合わせ、 186位と 321位の変 異の組み合わせが挙げられ、 43位 126位 321位の変異の組み合わせも重要である。 なお、 配列番号 1に上記した変異を導入した配列に対して （1 ) 60%以上、 好 適には 80%以上、 更に好適には 90%以上、 更に好適には 95%以上の同一性を有 し、 且つ改変型 tRNA をチロシンアナログ化できる TyrRS変異体、 並びに （2 ) 1又は数個のアミノ酸が置換、 付加及び/又は欠失した配列で示される、 改変型 tRNATyrをチロシンアナ口グ化できる TyrRS変異体も用いることができる。
なお、 無細胞タンパク質合成系を用いて、 遺伝子を改変することなく、 コ ドン 特異的にアミノ酸を変更したタンパク質合成を目的とする場合には、 配列番号 1 において 321番目のァスパラギン酸をアルギニン、 ァスパラギン、 グルタミン、 リ ジン、 グルタ ミ ン酸な どに改変した D321R TyrRS, D321N TyrRS, D321Q TyrRS, D32 IK TyrRS,及び D321E TyrRSなどを用いることができ、 特に好適には、 D321R TyrRSを用いることができる。 更に、 前記 D321R · D321N · D321Q · D321K · D321Eの変異を導入した配列番号 1に対して、
( 1 ) 60%以上、 好適には 80%以上、更に好適には 90%以上、更に好適には 95% 以上の同一性を有し、 且つ改変型 tRNATyi "をチロシル化できる TyrRS変異体、 並び に ( 2 ) 1又は数個のアミノ酸が置換、 付加及び 又は欠失した配列で示される、 改変型 tRNATyrをチロシル化できる TyrRS変異体も用いることができる。
また、 TyrRS 変異体をコードする遺伝子配列としては、 配列番号 2のものにお いて、 第 961から 963番目の塩基を改変したもの、 具体的には、 配列番号 47〜51 で示される塩基配列が挙げられる。 更に、 TyrRS 変異体をコードする遺伝子と しては、 配列番号 47〜 51で示される塩基配列に対して、
( 1 ) 60%以上、好適には 80°/。以上、更に好適には 90%以上、更に好適には 95%、 更に好適には、 99%以上以上の同一性を有し、 且つ改変型 tRNAT をチロシ 'ル化で きる TyrRS変異体をコードする塩基配列、 又は
( 2 ) ス トリ ンジヱントな条件下で、前記配列番号 47〜51で示される DNAの相補 鎖に対してハイブリダイズすることができ、改変型 tRNATyI "をァミノアシル化でき る TyrRS変異体をコードする塩基配列で示されるものも用いることができる。 なお上記ス トリンジェントな条件下としては、 例えば、 次のような条件を挙げ ることができる。 120°Cで 20分間処理して DNAを結合させた Hybond N+ ナイ口ン メンブレン（アマシャムファルマシァ）をリン酸塩緩衝液 （0. 5M Na2HP04 lmM EDTA および 7% SDS) 中、 65°Cで 5分間処理し、 プレ, '、ィブリダイゼ一シヨンを行う。 ハイブリダイゼーションは同緩衝液中に配列番号 48-51で表される遺伝子を添加 後、 65°Cで 17時間行う。 ハイブリダーゼーション後のメンブレンは室温で 20分 間、 0. 1% SDSを含む 2x SSC (standard sal ine citrate ; lx SSCは 150mM NaCl、
15mM sodium citrate, pH7. 0)で処理下後、 0. 1% SDSを含む lx SSC中 65°Cで 20 分間の洗浄を 2回行う。 さらに 0. 1% SDSを含む 0. lx SSC、 65°Cで 20分間処理し 洗浄を完了する。 X線フィルムへの感光は- 80°Cで 24時間行う。
なお、 ストリンジヱントな条件としては、 また、 次のような一般的方法による こともできる。 DNA又は D N Aの断片を固定化したフィルターを用いて、 0. 7〜1M の NaCl存在下、 65°Cでハイブリダイゼーションを行った後、 0. l〜2x SSC溶液（lx
SSC溶液は、 150mMNaCl、 15mMクェン酸ナトリ ゥム） を用い、 65°C条件下でフィル ターを洗浄することにより同定できる DNA等を挙げることができる。 ハイブリダ ィゼ一ンョン f 、 Molecular Cloning : A laboratory Mannual, 2nd Ed.， Cold Soring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. , 1989 (以下、 モレキュラークロ 一二ング第 2版と略す)、 Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wi ley & Sons (1987-1997) (以下、 力レント ·プロ トコールズ ·ィ ン · モレキュラー ·バイオロジーと略す） 等に記載されている方法に準じて行う ことができる。
さらに、 この TyrRS変異体としては、精製が容易であること等から、前記 TyrRS 変異体の C末端にヒスチジンタグ等のタグ（tag)が結合したものを用いるとよレ、。 なお、 前記 Y43G TyrRSにつレヽては、 S. Ohno et. al. , Changing the amino acid specificity of Yeast tyrosyl-tRNA synthetase by genetic engineering, J. Biochem. 130， 417-423 (2001)に開示されている。 また、 前記 TyrRS変異体はい ずれも、 ナンセンスサプレッサー tRNATyr (sup. tRNATyr) (アンバー、 オーカ一又 はオパール） を基質とする。
前記铸型は、 前記 sup. tRNA が認識する終止コ ドンを、 部位特異的突然変異
(s ite-directed mutagenesi s)等により人為的に翻訳領域に配したポリヌクレオ チドであり、 DNA又は mRNAの形態で用いられる。 前記 DNAとしては、 転写に必須 な配列を含む二本鎖 DNAが挙げられ、 種々のベクターやプラスミ ド等に導入して 利用するのが最も簡便である。 なお、 '前記翻訳領域の 3 ' 末端に位置する終止コ ドンは、 前記 sup. tRNATyrが認識する終止コ ドンとは異なる塩基配列のコ ドンが 配される。
5 . チロシンアナログ
本発明者らによる先願（特開 2004— 261160)に記載のチロシン'アナログを利用 できる。
具体的には、 Yアナログとしては、 アジドチロシン （azido- tyrosine)、 ァセチル テロシ'ン (acetyl-tyrosine)、 ァ ノチロシ 'ン' (amino— tyrosine.; 又（まドーノ
(D0PA； 3, 4-dihydroxy- phenylalanine) が用いられる。 これらの Yアナログは、 下記化 1又は化 2に示される構造を有している。
化 1
Figure imgf000017_0001
Figure imgf000017_0002
但し、 R 2はアジド基、 ァセチル基又はアミノ基。
即ち、 ィ匕 1.に示される Yアナログは、 チロシンの側鎖を構成するフエノール性 芳香族環の 3 (メタ） 位に置換基 R 1 としてアジド基 （― N 3 )、 ァセチル基 （一 C O C H 3 )、 アミノ基 （一N H 2 ) 又は水酸基 （一 O H) を有している。 ィ匕 2に 示される Yアナログは、チロシンの側鎖を構成するフエノール性芳香族環の 2 (ォ ルト） 位に置換基 R 2としてアジド基、 ァセチル基又はアミノ基を有している。 なお、 これらの Yアナログの置換基は、 メタ位又はオルト位のいずれに結合され ていても構わないが、 側鎖の端部側に位置し Yアナログ修飾体にする反応が進行 しゃすいことからメタ位に結合されているのが好ましい。 また、 これらの Yアナ ログは、 L型又は D型のいずれの光学異性体であっても構わないが、 タンパク質 合成効率が高いことから L型であるのが好ましい。
γアナログ修飾体は、 前記 Yアナログの側鎖 （フエノール性芳香族環の 2位又 は 3位） に修飾物が結合した有機化合物である。 前記修飾物は、 修飾基と、 その 修飾基に結合した反応基とを備えている。 前記反応基としては、 オルトアルコキ シカルボ二ルァ リ ールジァ リ ールホスフィ ン （ ト リ ア リ ールホスフィ ン
(triarylphosphine) 誘導体)、 ヒ ドラジン (hydrazine) , コノヽク酸ィミ ドエステ ノレ' 、succimidyl ester)、 イソチォシアン酸 (i sothiocyanate) 塩、 塩ィ匕スノレホニ ル （sulfonyl chloride)、 アルデヒ ド (aldehyde) , 又はカルボン酸ゃ酸ハライ ド 若しくはその酸無水物が挙げられる。 前記修飾基は、 特に限定されないが、 実用 的な用途拡大が容易であることから、蛍光物質、疎水性の巨大分子、親水性物質、 電荷を有する物質、 水素結合能を有する物質、 化学反応性を有する物質、 生理活 性物質 （酵素等）、 生体構成物質 （タンパク質、 糖鎖、 ポリヌクレオチド、 脂肪酸 等）、 ピオチン （Biotin)、 抗体又はその一部等が好適に用いられる。 また、 修飾 基として、 ポリエチレングリコール等のドラッグデリバリーシステム （DDS) に用 いられる機能性担体を用いてもよい。
この Yアナログ修飾体は、 Yアナログの置換基と、 前記修飾物の反応基とを化 学的又は生物化学的に結合 （共有結合） させることにより得られる。
前記置換基と反応基との組合わせとしては、 置換基がアジド基の場合には反応 基としてはトリアリールホスフィン誘導体となる。 また、 置換基がァセチル基の 場合には反応基がヒ ドラジンとなり、 置換基がアミノ基の場合には反応基がコハ ク酸イミ ドエステル、 イソチォシアン酸塩、 塩化スルホニル、 アルデヒ ド、 又は カルボン酸ゃ酸ハライ ド若しくはその酸無水物となる。 これら置換基と反応基と の反応は化学的反応である。 また、 前記 Yアナログがドーパの場合には、 そのフ ュノール性芳香族環の 3位及び 4位の水酸基を ドーパォキシダーゼ （D0PA oxidase) による酵素反応を利用しつつ反応基としてのアミノ基と結合（生物化学 的反応） させることにより、 修飾物が結合して Yアナログ修飾体となる。 これら の Yアナログの置換基を修飾する反応は、 生理的条件下 （例えば大腸菌や酵母等 の一般細菌又は単細胞生物が生存可能な条件下）で行うことが可能となっている。 6 . チロシンアナログをコ ドン特異的に含む非天然アミノ酸含有タンパク質の製 造
非天然ァミノ酸含有蛋白質は、本発明者らによる先願（特開 2004— 261160)の方 法に準じて行うことができる。
例えば、 上記した 1 . 「無細胞タンパク質合成系からの全種類 tRNAの抽出分離 方法」 により、 全種類 tRNA が除去された無細胞タンパク質合成系に、 上記 2 .
「tRNAMixから特定コ ドン用の tRNAの除去」 により、 特定コ ドン用の tRNAが除去 された残りの tRNAを添加してなる無細胞タンパク質合成系に、 3 .「改変型 tRNA の調製」 で調製された特定コ ドンにチロシンもしくはチロシンアナログを割り当 てる改変型 tRNAtyl:、 4 . 「改変型 tRNAT をチロシン化もしくはチロシンアナログ 化するされたチロシル tRNA合成酵素変異体の調製」 で調製された TyrRS変異体、 及び前記 5 . のチロシンアナログの存在下で、铸型 mRNA又は鎳型 DNAを元に非天 然アミノ酸（ァミノ酸アナログ）を含有する非天然タンパク質を製造することがで さる。
言い換えれば、
( 1 ) 非天然アミノ酸を含有させたいタンパク質又はタンパク質をコードする遺 伝子中で置換させたいアミノ酸に対応するコドンを選択する。 望ましくは、 ロイ シン、 アルギニン、 セリン、 スレオニンに対するコ ドンで、 UUA、 CGC、 AGU、 CGA、 ACA、 アンチコ ドンが、 ACU、 UAA、 GCG、 GCU、 UGUを選択することが望ましい。 該 選択されたアンチコドンを有する tRNAを、使用する無細胞タンパク質合成系から 除去し、 残りの tRNAを該無細胞タンパク質合成系に再度添加する。
( 2 ) tRNATyr改変体については、 チロシン受容能も高く、 本来対応するアミノ酸 は全く受容しない tRNATyl "改変体が望ましレ、。具体的には、アンチコ ドンが、 ACU、 UAA、 GCG、 GCU、 UGUである tRNATyr改 体を選択することが望ましい。 当該 tRNATyr 改変体を、 前記無細胞タンパク質合成系に添加する。
( 3 ) 改変型 tRNATyrをチロシンアナログ化する変異型チロシン tRNATy):合成酵素 としては、 配列番号 1に対し 4 3位、 8 1位、 1 2 6位（31260、 1 7 4位、 1 7 7位、 1 8 1位及び 186位から選ばれる 1以上の変異、 と 3 2 1位の変異の組み 合わせ変異を導入した変異型チロシル tRNATyf合成酵素が上げられる。具体例とし ては、 (Y43G, D321R) TyrRSヽ (H81V, D321R) TyrRS, (Q186V, D321R) TyrRSヽ (Q186T, D321R) TyrRS若しくは （Q186I， D321R) TyrRSの 1〜364番目のアミノ酸配列が挙 げられ、 好ましくは、 43位と 321位の変異を組み合わせ、 81位と 321位の変異の 組み合わせ、 186位と 321位の変異の組み合わせが挙げられ、 43位 126位 321位 の変異の組み合わせも重要である。
( 4 ) 上記 （1 ) で調製した無細胞タンパク質合成系に （2 ) の tRNA 改変体お よび （3 ) の改変型 tRNATyrをチロシンアナログ化する変異型チロシン tRNATyr合 成酵素を添加し、 チロシンアナログの存在下で、 非天然アミノ酸を含有させたい タンパク質をコードする遺伝子を加えて、 非天然アミノ酸 （チロシンアナログ） 含有タンパク質を合成することができる。
例えばより具体的には、 GFPuv遺伝子 （Clonetech) 中 AGUコ ドンにチロシンァ ナログを導入するためには、（1) tRNAを除いた大腸菌 S30抽出液（S30/-tRNA)、（ 2 ) tRNA 混合物からセリンに割り当てられているコ ドンのうち特定のコドン （AGY) を読み取る tRNASer (AGY) を除いた tRNA混合物（tRNAMix— s" (AGY) ) , ( 3 ) AGU コ ドン にチロシンを割り当てた改変型 tRNA 及び （ 4 ) (Y43G, D321R) TyrRS変異体を 利用すればよい。
[実施例]
[参考例 1] C5タンパク質の調製
C5タン'パク質遺伝子（rnpA)は大腸菌 JM109株のゲノム DNAから PCRによつて増 幅した。 Ndel と Xholサイ トを付加するために、使用したプライマーはそれぞれ 5 ' 一 GGG GCT GCA GCA TAT GGT TAA GCT CGC ATT TCC CAG -3， (SEQ ID No : 4)と 5，
-GGG GCT CGA GCC TGG GCG CTC GGT CCG CTG-3 ' (SEQ ID No : 5) (下線部が Ndel と Xholサイ ト）である。 PCRしたフラグメントは pET21a (+)にクローニングした（こ れを PETC5と呼ぶ）。 pETC5をトランスフォーメーションした大腸菌 BL21 (DE3) 株は 1 リツ トルの LB培地で 0D600が 0. 5-0. 8になるまで培養し、 0. 5mMの IPTG によって発現誘導した。 4 時間保温した後、 発現菌体は集菌、 冷凍した。 冷凍さ れた菌体は 50mlの 50mM Tris-HCl (pH7. 6) , 5mM EDTA, 10 Glycerol 1M NaCl溶液で 懸濁し、 超音波破砕機 （バイオラブター、 トウショウデンキジャパン'） で破砕し た。 30， OOOx で 30分遠心した後、 上清は 50%飽和硫酸アンモニゥム沈殿処理を 行った。 17, OOOx で 15分遠心した後、 上清は 80%飽和硫酸アンモニゥム沈殿処 理を行った。 17， OOOx で 15分遠心して回収した沈殿は、 バッファー A (50mM酢酸 ナトリゥム（pH6. 5) , 5mM EDTA, 0. 25M NaCl)に溶解し、 その溶液をさらにバッファ
— Aに対して透析した。 透析したタンパク質溶液は、 10mlの S Pセファロースカ ラム （アマシャム） を用いて精製を行った。 流速 2ml/minで NaClの直線濃度勾配
(0. 25-1. 0M, トータル 200ml) で溶出操作を行った。 C5タンパク質を含むフラク シヨンを回収、 アミコンウルトラで濃縮、 20mM Tris- HC1 (pH7. 6) , Im MgCL, 40mM
KC1, 6mM 2-mercaptoethanol and 50% Glycerol に対してー晚透析し、 — 30。Cで保 存した。
(結果)
C5タンパク質遺伝子の揷入が確認された PETC5を用いて、 C5タンパク質の発現 を行った。発現確認のため少量の S30画分を Ni_NTA agaroseを用いて精製したも のを 15%ァクリルァミ ドゲルを用いて、 SDS-PAGEで行った。 結果は Elutionに見 られるバンドがーつであった。
[参考例 2 ] M1RNAの調製
M1RNAのゲノム （rnpB) は、大腸菌 JM109株のゲノム DNAから PCRで増幅した。 プライマーは、 EcoR Iサイ トと T7プロモーターを融合させるために 5，-GGG GGA ATT CTA ATA CGA CTC ACT ATA GAA GCT GAC CAG ACA GTC GC- 3， (SEQ ID No : 6) (下 線部）そして BamH Iを組み込むために 5' -GGG GGG ATC CGG ATG ACG TAA ATC AGG TGA AAC TG-3' (SEQ ID No : 7)を用いた。 PCR後の断片は pUCMlを作成するために、 pUC19プラスミ ドにクローニングした。 Ml RNAの in vitroでの転写のためのテン プレートは、 T7 プロモーター領域 （TAATACGACTCACTATA (SEQ ID No : 43) ) とハイ ブリダィズする T7 プライマーと Ml RNA の 3'末端領域と相補的なプライマー
(5' -AGG TGA AAC TGA CCG ATA AG_3， (SEQ ID No : 8) ) によって、 pUCMlから PCR 増幅で調製した。 In vitro 転写は、 （Sampson, J. R. and Uhlenbeck, 0. C. 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 1033- 1037)に従って行った。転写後、反応混合物は、 lmlの Qセファロースカラム（アマシャム）で精製した。 0. 5ml/minの流速で、 NaCl の直線グラジェント（0. 4-1. 0M, ト一タル 20ml)によつて溶出操作を行った。 Ml RNA は溶出液からェタノール沈殿によって回収した。
(結果)
Ml RNA遺伝子の挿入が確認された pUCMlから PCR増幅を用いて錚型の調製を行 つた。 これを用い Ml RNAの転写調製を行った。 確認を 6 %アクリルアミ ドゲルを 用いて行った。 結果、 目的の長さに相当するバンドが確認できた。
実施例 1
大腸菌細胞抽出液から全種類 tRNAを除く方法
1 - 1 . 大腸菌細胞抽出液の調製
グリセロールス トックされた大腸菌 Q13株 （RNase I欠損株） を白金耳で、 LB プレートに画線培養した。 現れたコロニーの一つを LB 培地に植菌して 37°Cで一 晚振とう培養し、これを前培養液とした。本培養は、 2 X TY培地（Tryptone 16g/l、 Yeast extract 10g/l、 NaCl 5g/l) の 10%に相当する容量の前培養液を移し、 37°C で振とう培養した。 600nm の吸光度が 0. 4 になったところで培地を冷やした。 5，000rpmで lOmin遠心して集菌した。 上清をできるだけ取り除き、 菌体量を測定 し、 2倍量の Buffer S30 (20mMHepes- K0H (ρΗ7· 5)、 20mM酢酸アンモニゥム、 10mM 酢酸マグネシウム、 10mM β - ercaptoethanol) に菌体を懸濁した。 懸濁液と同 容量のガラスビーズ（B. BRAUN社製、 0. 45議）を入れたガラス管（岩城硝子社製） に移し、 MSK cel l homogeni zer (B. BRAUN社）で細胞を破砕した。 破砕液を 30， 000 X で 30min遠心し、 その上清を大腸菌細胞抽出液とした。 これを小分けし、 液 体窒素で凍結させて保存した。
1 - 2 . 大腸菌細胞抽出液からの全種類 tRNAの除去
大腸菌細胞抽出液に対しその 5倍量の Q- sepharoseHP樹脂をスピンカラムに詰 め lOOOrpm X 3min 4 °C で 遠 心 し た 。 Buffer S30 に 0M, 0. 1M, 0. 2M, 0. 3M, 0. 4 , 0. 5M, 0. 6M,又は 0. 7M酢酸力リウムを加えた溶液 (8 種 類）を用意し、 それぞれを用い樹脂を平衡化した。 大腸菌細胞抽出液をロードし、 素通りを回収した。 7M尿素を含む 10%ポリアクリルアミ ドゲルにて tRNAの除去 を確認した。 （図 1)
2 - 1 . 全種類 tRNAを除去した大腸菌細胞抽出液を用いたタンパク質合成 以下の反応組成に全種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) を加えない場合と、 加えた場 合とでタンパグ質（GFPuv)合成を行い、 電気泳動によって全種類 tRNA除去とタン パク質合成能力を確認した。
表 1
( in vi troタンパク質合成反応液組成〉
55 mM Hepes KOH ( H 7. 5)
10. 7 mM Mg (0Ac) 2
27. 5 mM NH40Ac
210 mM KOAc
1. 7 mM DTT
1 mM アミノ酸 20種
68 mM ホリン酸
1. 25 mM ATP
0. 83 mM CTP， GTP, UTP
80 mM CP
0. 25 mg/ml CK
4 % PEG
80D/cc E. coli側 Amix
6b. 6 mg/ml T7 RNA Polymerase
細胞抽出液
30 %
(除去に用いた塩濃度によって異なる）
20 mg/ml プラスミ ド DNA
dH20 up to 50 μ 1
結果を図 2に示す。
大腸菌細胞抽出液 （S30) を酢酸力リウム 0. 4〜0. 6Μの濃度で処理した場合、 全 種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) を加えた場合にのみタンパク質の合成が確認できる ことから、 この範囲であれば大腸菌細胞抽出液 （S30) から全種類 tRNAを除ける ことが確認できた。
実施例 2
全種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) から特定の配列を持つ tRNAを除く方法 以下では、 アンチコドンとして GCU を持つ tRNASer(AGY)を全種類 tRNAの混合物 (tRNAMix)から除去する方法について記載する力 S、特定の配列を持つ tRNAに応じた DNAプローブを用い同様の操作にて特定の配列を持つ tRNAを除去することができ る。 なお、 通常、 セリンに割り当てられている AGU及び AGCの両者、 つまり AGY は、 アンチコドンが GCUの tRNASer (tRNASer (AGY)) 1種類のみを利用して、 両方が読 まれている。 tRNAMixから tRNASer(AGY)が除去された tRNAMixを、 tRNAMix— Se"AGY)と呼ぶ。 ( 1 ) ビォチン化 DNA結合樹脂の作製
1. 5mlのろ過チューブのフィルター容器 3本（A，B, Cとする） に 50 W 1のストレ プトアビジンァガロース懸濁液 （樹脂量 25 μ 1) を加え、 6000χ で 10秒ほど遠 心し、 緩衝液を除いた。 400 1の 20mM Tri s-HCl緩衝液 （pH7. 6) をフィルタ一 溶液に加え、 樹脂を懸濁した。 その後、 6000x で遠心し、 緩衝液を除いた。 こ の操作を 2度繰り返した。 ビォチン化ォリゴ DNAプローブ（配列 CGG TGA GGC GGG GAT TCG AAC CCC GGA TGC-biot in) SOOpmol相当を、 20mM Tri s-HCl緩衝液 （pH7. 6) で 400 i lに希釈し、 これを 3倍量 （total 1200 μ 1) 作っておく。 この DNA溶液 の吸光度を測定しておき （0. 619 A260unit/ml)、 これをストレブトァビジンァガ口 ース樹脂が入ったフィルター容器に各々 400 1ずつ加え、たびたび振りながら室 温で 10分ほど放置した。 これを 6000x 5"で遠心し、 結合しなかった DNAプローブ を除いた。 A，B，Cのチューブから抜けてきた DNA溶液の吸光度も測定した。
結果は次の表 2のとおりであった。
表 2
Tube A 0. 154A260unit/ml
Tube B 0. 135A260unit/ml
Tube C 0. 130A260unit/ml
( 2 ) 固相化プローブ法による tRNAの回収
35A260unitの E. coli全種類 tRNAの混合物 (tRNAMix) に X 12 Buffer A, B, Cを各々 200 μ 1加え、 RNaseFree水で 400 μ 1とした。
なお、 12 Buffer A、 B、 及び Cの組成を以下に示す。 表 3
12 BufferA ISOmM Tris-HCl、 1800mM NaCl、 12mM EDTA
X 12 BufferB ISOmM Tris- HC1、 1800mM NaTCA, 12mM EDTA
X 12 BufferC 180mM Tris-HCl , ISOOmM TMAC1、 12mM EDTA
65°Cで 5分間、 tRNA溶液を保温した。 先に作製したフィルター容器 A， B， Cに、 各々対応する tRNA溶液を加え、 さらに 65°Cで 2分間保温した。 その後 25°Cまで ゆつく り冷やし、 目的の tRNAを樹脂に結合させた。 6000x ^で 10秒ほど遠心し、 結合しなかつた tRNA溶液を取り除いた。抜けてきた tRNA溶液の吸光度も測定し、 tRNA量を算出した。
表 4
<樹脂に結合しなかつた tRNA量〉
A (NaCl Buffer) 16. 4A260unit
B (NaTCA Buffer) 19. 3n260unit
C (TMAC1 Buffer) 丄 1 .り n260unit
. 400 μ 1の 3x SSCをフィルター容器に加え樹脂を攪拌し、 6000x で 10秒程度 遠心して 3x SSC を除き、 樹脂を洗った。 抜けてく る 3x SSC の吸光度が 0. 01A260unit/ml 以下になるまでこの操作を繰り返した。 あらかじめ 65°Cで保温し ておいた 0. lx SSC 200 1をフィルター容器に加え、 65°Cで 5分間保温した。 溶 液が冷えないうちに 6000x で 10秒程度遠心。 tRNA溶液を回収した。 この操作 をもう一度繰り返した。 回収された tRNA溶液の吸光度を測定した。
表 5
<回収された tRNASer量 >
A (NaCl Buffer) 0. 0o"A260uni t
B (NaTCA Buffer) 0. 085A260uni t
C (T AC1 Buffer) 0. 203A260unit ( 3) 回収した tRNASeI "の純度の確認
各 Bufferを用いて回収した tRNAの純度および、全種類 tRNAの混合物（tRNAMix) からの回収率を確認するため、 15%アクリルアミ ド 7MUreaゲルを用いた電気泳 動にて確認した。 （図 3)
固相化プローブ法による tRNASer(AGY)の回収量は、 吸光度測定の結果より、 TMAC1> NaTCA>NaClであった。
更に、 図 3より、 電気泳動のレーン （2)、 （3)、 （4) を比較すると、 （2)、 ( 3)、 （4 ) の順に tRNAs だと思われる位置のバンドの濃さが減少している。 (tRNAs "のバンドの位置の特定は （5) 〜 （7) より）
この結果は、 先の吸光度からの回収量の特定の結果を支持する。
さらに、 ノーザンハイブリダイゼ一ションによる tRNASer(AGY)の検出結果 （図 4 ) でも、 tRNASer(AGY)のバンドの濃さは （2)、 （3)、 （4) の順に減少している。 以上の結果より、 TMAC1を用いた調製法が適当と思われる。
実施例 3
改変したアンチコ ドンを有する tRNATyl "の調製
3— 1 . QuikChangeによる改変型 tRNATyr遺伝子を含むプラスミ ド DNAの調製 表 6 lOXPyrobest Buffer 5μ ϋ
dNTPMix(2.5mM) 4μ β
30merプライマー 1 Ι^β
30merプライマー 2 Ιμ Ά
野生型 tRNA遺伝子を含むプラスミ
ド DNA(0.106A260unit/ml)
Pyrobest(5U/ μ β) 0.5 μ &
dH20 37.5 μ&
Up to 50 上記プライマー 1及びプライマー 2は以下 [表 7 ] に示される組み合わせ （例 えば、 TNT— F及び TNT— Rのように対応するフォヮ一ドプライマ一とリバースプ ライマーのセット） から選択された。
表 7
TNT — F 5， GCCCGATCTCAAGATTARAAGTCTTGCGCC3 ' (SEQ ID No 9)
TNT -R 5， GGCGCAAGACTTRTAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 10)
TNC — F 5， GCCCGATCTCAAGATTGRAAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 11)
TNC — R 5' GGCGCAAGACTTRCAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 12)
TNA — F 5' GCCCGATCTCAAGATTTRAAGTCTTGCGCC3， (SEQ ID No 13)
TNA- — R 5' GGCGCAAGACTTRAAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 14)
TNG- — F 5， GCCCGATCTCAAGATTCRAAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 15)
TNG — R 5， GGCGCAAGACTTRGAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 16)
GNT- — F 5， GCCCGATCTCAAGATTARCAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 17)
GNT- — R 5， GGCGCAAGACTGRTAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 18)
GNC- — F 5， GCCCGATCTCAAGATTGRCAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 19)
GNC- — R 5， GGCGCAAGACTGRCAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 20)
GNA- -F 5' GCCCGATCTCAAGATTTRCAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 21)
GNA- — R 5， GGCGCAAGACTGRAAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 22)
GNG- — F 5， GCCCGATCTCAAGATTCRCAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 23)
GNG- — R 5， GGCGCAAGACTGRGAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 24)
CNT- -F 5， GCCCGATCTCAAGATTARGAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 25)
CNT- — R 5， GGCGCAAGACTCRTAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 26)
CNC- — F 5， GCCCGATCTCAAGATTGRGAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 27)
CNC- -R 5， GGCGCAAGACTCRCAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 28)
CNA-一 F 5' GCCCGATCTCAAGATTTRGAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 29)
CNA-一 R . 5， GGCGCAAGACTCRAAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 30)
CNG-一 F： 5， GCCCGATCTCAAGATTCRGAGTCTTGCGCC3' (SEQ ID No 31)
CNG- -R： 5， GGCGCAAGACTCRGAATCTTGAGATCGGGC3' (SEQ ID No 32) なお、 配列中の Rは A又は Gを示す。
(R' AorG) なお、 配列中の Rは A又は Gを示す。
(R， AorG)
上記組成で反応液を調製し、 PCRにより改変型 tRNA 遺伝子を含むプラスミ ド DNAを増幅させた。 PCRに用いた改変前の野生型 tRNATyr遺伝子を含むプラスミ ド DNAは、 5，一 GGG GTC TAG ACT CTC GGT AGC CAA GTT GGT TTA AGG CGC AAG ACT GTA AAT CTT GAG ATC GGG C- 3， (SEQ ID No： 44) と 5' - GGG GAA GCT TGG TCT CCC GGG GGC GAG TCG AAC GCC CGA TCT CAA GAT TT-3' (下線部は相補的な配列： SEQ ID NO: 45) をァニーリ ング処理後、 Klenow fragment により 2本鎖を形成させ、 Xba I， Hindlll サイ トを利用して pGEMEX_l (プロメガ社） に組み込み作製した。
PCR産物に Dpnlを 0.5 1加え、 1時間保温し、 コンビテントセル' DH5alphaに 投入し形質転換をおこなった。 そして生じたコロニーからプラスミ ド DNAを調製 した。得られたプラスミ ド DNAの配列を、 日立のシーケンサー（SQ5500E)で確認し た。
3 - 2.転写反応とプロセシングによる野生型および改変型 tRNAT 47種類の調製 3 - 2 - 1. 転写用铸型 DNAの調製
表 8
10XPCR Buffer 5μ Ά
dNTP Mix (2.5mM) 4μβ
5' — T7プライマー（100 pmol/μ β) Ι^ β
3 -' 0MEプライマー（100 pmol/μβ) 1 μ β
改変型 tRNAプラスミ ド DNA溶液（100倍希釈液） Ιμβ
rTaq DNAポリメラーゼ（5U/ μ β) 0.5μ β dH20 37.5μβ
Up to 50 μ なお、 5' -Τ7プライマー、 3-' 0MEプライマー次の通りである。
5' - Τ7プライマー： 5' GGGGCTGCAGTAATACGACTCACTATA3' (SEQ ID No： 33) 3 -' OMEプライマー： TGmGTCTCCCGGGGGCGAGT (SEQ ID No :34)
上記の組成で反応液を調製し、 PCR を行うことにより転写に必要な部位の増幅 を行った。
PCR 産物をフエノール ' クロ口ホルム処理し、 エタノール沈殿して、 乾燥させ -30°Cで保存した。
3 - 2 - 2.転写反応とプロセシング
表 9
組成
Figure imgf000030_0001
なお、 10XTDM Buffer, 10XSB Buffer, 及び lOXNTP Bufferの組成は下記の 通りである。
表 1 0
10 TDM Buffer 40mM Tris-HCl(pH 7.9)
50m DTT
200mM MgCl2
10 X SB Buffer lOmM スペル'ミジン
0.5mg/ml BSA
lO NTP Buffer lOOniM GTP
lOOmM UTP
lOOmM CTP
lOOmM ATP · 上記の組成で、 上記 （2 ) で得た転写用錶型 DNAを用い、 反応時間は 1時間、 反 応温度は 42°Cで転写反応を行つた。
反応後、 Ml RNAを 80pmol, C 5タンパク質を SOpmol加え、 37°Cで 1時間保温し プロセシング反応を行つた。
転写とプロセシングが正しく行われていることが確認できたら反応液に EDTA (0. 5M)を反応液の 1/20量加え 15000rpmで 5min遠心した後、エタノール沈殿 した。
3— 3 . Gel Elution法による RNAの精製
プロセシング後の RNA乾燥物を 50ん ί 1の UreaLSに溶角？し、 15000rpmで 5min遠 心した後、 上清を 10%ポリアクリルアミ ドゲル （7 M Urea) で電気泳動した。 ゲ ルから切り出した後、 DEPC処理 Gel Elution Bufferを 450 1加え、 ー晚振とう 後エタノール沈殿し、 乾燥させ dH20 50 μ ΐに溶解し.、 tRNA溶液を調製した。 なお、 DEPC処理 Gel Elution Bufferは以下のように調製した。
表 1 1
組成
0. 5M NH4 (OAc)
0. 1% SDS
Im EDTA
100ml で上記の組成になるように調製し.、 ジェチルピロカーボネート（DEPC)を 100 μ 1 加えた。 ー晚攪拌後、 オートクレープにかけジェチルピロカーボネート (DEPC)を分解、 除去した。
結果を以下の表に示す。 表 1 2
Figure imgf000032_0001
3 - 4 .改変型 tRNAを用いてチロシン受容能の測定とそのアンチコドンに対応す るアミノ酸受容能の測定
( 1 ) チロシン受容能の測定
各 tRNATyI"のチロシン受容能を測定するために "Cチロシンを使ってアミノアシ .ル化反応を行った。 下記の反応組成で酵素を除いた状態で反応液を 30°Cで 5min 程度保温した後、 酵素を加え 30°Cでインキュベートし、 0、 5、 10、 15minの各時 間で 5% TCAを湿らせておいた濾紙にスポッ トし、 5% TCAに浸した。 各時間の反 応液をスポッ トし終わったら、 5% TCAをいつたん捨て、 新たな 5% TCAをビーカ 一に加え lOmin間振とうした。 これを 2回繰り返したら 100%エタノールを加え て軽く振とうし、 電熱灯下で乾燥させた。 その後、 シンチレ一ターに浸し、 液体 シンチレ '一シヨンカウンターでカウントを測定した。 シンチレ一ターは、 Dotite DPO 4g、 Dotite P0P0P 0. lgをトルエンで 1Lに調製した。
放射能の値とチロシンの比活性値から pmol/0D を算出することにより、 WT の tRNATyrと tRNATyl:改変体とのチロシン取り込みを比較した。 表 1 3
組成
5 X AA ら μ
改変型 tRNA 0· 09n260unit
14Cチロシン 1. 5 μ β
酵母 TyrRS (0. 19mg/ml)
dH20 Up to 30 ポジテイブコント口ールとして改変型 tRNAの変わりに WTtRNAtyrを 0. 09A260unit 用いた。
結果を図 5-1から図 5-5に示した。 （改変型 tRNAについては、 アンチコ ドンに より示されている。）
( 2 ) アンチコ ドンに対応するアミノ酸受容能の測定
アミノ酸受容能の測定
改変した tRNAT のアンチコ ドンに対応するアミノ酸受容活性を測定するため にそれぞれの 14C ァミノ酸を使ってァミノアシル化反応を行った。 下記の反応組 成で酵素を除いた状態で反応液を 30°Cで 5min程度保温した後、 酵素を加え 30°C でインキュベートし、 0、 5、 10、 15minの各時間で 5% TCAを湿らせておいた濾紙 にスポッ トし、 5% TCAに浸した。各時間の反応液をスポッ トし終わったら、 5% TCA をいつたん捨て、 新たな 5% TCAをビーカーに加え lOmin間振とうした。 これ,を 2 回繰り返したら 100%エタノールを加えて軽く振とうし、電熱灯下で乾燥させた。 その後、 シンチレ一ターに浸し、 液体シンチレーシヨンカウンターでカウントを 測定し、 全種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) を用いたそのアミノ酸の取り込みと比較 した。 シンチレ一ターは、 Dotite DPO 4g、 Dotite P0P0P 0. lg をトルエンで 1L に調製した。 表 1 4
組成
5 X AA 6 μ β 改変型 tRNA 0. 09^260unit
14C 各アンチコドンに対応するアミノ酸 1. 5 & 大腸菌ァミノアシル合成酵素（20種のうち 1種類） (lmg/ml)
dH20 Up to 30 μ β ポジティブコントロールとして tRNA改変体の代わりに tRNAMix を 0. 6A260unit トリプトファンの場合は tRNAMix を 3. 0A26。units用いた。
なお、 5 X AAMは以下の通りである。
表 1 5
組成
500mM Tri s-HCl (pH 7. 6)
50mM MgCl2
200raM KC1
•20mM ATP 結果を図 6 - 1から図 6-8に示した。
更に、 図 5及び図 6をあわせて、 図 7の上段にチロシン受容能の測定結果、 下 段にアミノ酸受容能の測定結果をしめした。
TyrRSはアンチコドンの 1文字目の Gを強く認識することから、 チロシン受容 能の高い改変体はアンチコドンの 1文字目が Gであるものが多い。 また、 アンチ コドン UGU、 UAA で受容能が高かった理由としては、 tRNATyrのアンチコ ドン部位 の両隣の塩基、 すなわち 35番目と 39番目の塩基に注目すると、 35番目から 37 番目の塩基配列は UGU、 37番目から 39番目の塩基配列は UAAであり、 TyrRSがァ ンチコドン部位だけでなく、 その両隣を含めた 3塩基を認識して、 チロシンが受 容されることにより、 受容能が高くなることが考えられた。 今回得られた結果からアンチコ ドンが、 UAA、 GCG、 GCU、 UGU の t.RNATyr改変体 については、 チロシン受容能も高く、 本来対応するアミノ酸であるロイシン、 ァ ルギニン、 セリン、 スレオニンは全く受容しないことから、 有用な非天然アミノ 酸運搬用 tRNA として利用できる可能性がある。 これらの改変型 tRNAT を非天然 アミノ酸用に遺伝暗号表に割り当てても、 まだロイシン、 アルギニン、 セリン、 スレオニンのコ ドンはまだ余っていることから、 数種類の非天然アミノ酸を遺伝 暗号表に割り当てることも可能になるだろう。
実施例 4
改変したアンチコドンを有する tRNAをァミノアシル化する酵素の調製
( 1 ) D321R TyrRS、 D321N TyrRS、 D321Q TyrRS, D321K TyrRS、 及び D321E TyrRS 変異体発現用べクタ一の作製
( 1一 1 ) PCR法を用いた部位特異的変異の導入による酵母チロシル -tRNA合成酵 素変異体遺伝子の作製
pET-Ful l-yYRStagを templete とし、 以下のような変異体用プライマ一を合成 し、 pET- to- pQE- 5， (CCCCGAATTCTAACTTTAAGAAGGAGAT (SEQ ID No : 35) ) と-プライ マ一の組み合わせ、 pET- to- pQE- 3' (CCCCAAGCTTTGTTAGCAGCCGGA (SEQ ID No : 36) ) と +プライマーの組み合わせで PCR 反応を行いァガロースゲルとガラスパウダー により精製を行った。 ただし 3'側プライマーと +プライマーの組み合わせにより 生じた PCR産物は 3% GTGァガロースゲルを使い、 目的のバンドを切り出し- 80°C でゲルを凍結し濾過エツペンドルフチューブにより DNA 断片を回収した。 -側の PCR産物と +側の PCR産物を合わせエタノール沈殿を行い、 以下のように Klenow fragment反応液を調製した後 95°Cで 5分保温し、 その後氷中に移し急冷（氷中 5 分）した。 この反応溶液に Klenow fragmentを 6units加え 37°Cで 1. 5時間反応し た。 さらにこの Klenow fragment反応液の一部を用いて以下のように Full length PCR反応液を調製し Full length PCR反応を行った。. この PCR産物をァガロース ゲルにより精製を行い、 部位特異的変異を導入された酵母 TyrRS変異体遺伝子を 得た。
用いたプライマーは次のとおりである。
D321R用-プライマー /27mer： ACCAATTTTTAGGCGAGGTGGGGACAA (SEQ ID No : 37) D321R用 +プライマー /27mer： TTGTCCCCACCTCGCCTAAAAATTGGT (SEQ ID No: 38) D321N · D321Q用 -プライマ一 /27mer： AACACCAATTTTGTTAGGTGGGGACAA (SEQ ID No： 39) D32 IN · D321Q用 +プライマ一 /27mer： TTGTCCCCACCTCAGAAAATTGGTGTT (SEQ ID No： 40) D321K · D321E用-プライマ一 /27mer： ACCAATTTTTAGTTTAGGTGGGGACAA (SEQ ID No： 41) D321K-D321E用 +プライマー /27mer : TTGTCCCCACCTGAACTAAAAATTGGT (SEQ ID No: 42) 表 1 6
+, - primer を用いた PCR 反応液
10x PCR Buffer ( 酵素に添付 ） 5 i l
2.5 m dNTP mixture ( 酵素に添付 ) 4 ix 1
5 primer / + primer 1 i 1 100 pmol
- primer 13' primer 1 1 100 pmol
pETYRS ( Mini-Prep.1/100 希釈） 1 μ 1
Pyrobest 0.5 μ 1 2.5 U
dH20 up to 50 μ 1 表 1 7
Klenow fragment 反 j¾、液
lOx Klenow Buffer ( 酵素に添付 ） 5 μ 1
2.5 mM dNTP mixture ( 酵素に添付 ) 4 μ 1
5' and - primer PCR 産物 沈殿
+ and 3' primer PCR 産物 沈殿
Klenow fragment 1. 5 μ 1 6 U
dH20 Up to 50 μ 1 表 1 8
Ful l l ength PCR 反応液
10x PCR Buffer ( 酵素に添付 ） 5 μ 1
2. 5 mM dNTP mixture ( 酵素に添付 ) 4 μ 1
5' primer DNA 2 μ 1 100 pmol
3' primer DNA 2 μ 1 100 pmol
Kl enow fragment £ 応液 1 μ 1
Pyrobest 0. 5 ix 1 2. 5U
dH20 up to 50 μ 1
( 2 ) ベクターの構築
前述の方法に従い、 PCR法により部位特異的変異を導入された酵母 TyrRS変異 体遺伝子を PUC19に導入し、 DNAシークェンサ一で配列を確認した。 配列の明ら かにされた各酵素変異体遺伝子を発現ベクターの pET21 - a (+)に乗せ換え pETD321 変異体 ベクターを構築した。
( 3 ) D321変異体の発現と精製
. 6x Hi s- Tagを融合して発現させた酵母 TyrRS変異体を、 ァフィ二ティークロマ トグラフィ一とイオン交換カラムクロマトグラフィ一により以下のような操作で 精製を行った。
集菌した菌体を 15mlの bufferAに懸濁し、 懸淘液を超音波破砕機を用いて 20秒 超音波処理を行い、 40秒静置し冷却するという操作を 30回繰り返し菌体を破砕 した。 破砕液を Avant iTM J- 25 I (BECKMAN製）で 30， OOOx で 30分間遠心分離し て S30 (上清）を得た。 あらかじめ bufferAで平衡化しておいた Ni - NTA樹脂（lml) に、 得られた S30をロードし 280nmの吸収がおちつくまで bufferAで洗浄した。 以下のような Elut i on bufferを加え 280nmの吸収がみられるサンプルを回収した, さらなる精製として、 回収したサンプルをあらかじめ 0. 05M KC1で平衡化した陽 イオン交換カラム SP- Sepharose HP lml (アマシャムフアルマシア製）にロードし た。 0. 05Mから 1M KC1までの濃度勾配、 流速 lml/分で目的タンパク質の分離を行 つた。 溶出液は 0. 5分（0. 5ml)ごとに分取した。 分画したサンプルを 10%SDS PAGE により分析し、 目的タンパク質を含むフラクションを回収した。 アミコンウルト ラを用いて約 1ml に濃縮したサンプルを透析チューブに入れ、 透析外液を stock bufferにして透析した。 タンパク質濃度は 228. 5-234. 5nmで測定する方法により 算出した。 なお、 bufferA及び B、 Elution buffer, 並びに stock bufferの組成 を以下に示す。
表 1 9
buffer A
HEPES-KOH ( pH7. 0 ) 20 mM
gCl2 1 mM
KC1 50 mM
グリセリン 5 % 表 2 0
Elution buffer
HEPES-KOH ( pH7. 0 ) 20 mM
MgCl 1 mM
KC1 50 mM
グリセリン' 5 %
ィミダゾール 250 mM 表 2 1
buffer B
HEPES-KOH ( pH7. 0 ) 20 mM
MgCl2 1 mM
グリセリン 5 %
KC1 1 表 2 2
stock buffer
Tri s-HCl ( pH7. 6 ) 20 mM
MgCl2 1 mM
KC1 40 mM
グリセリン 50 %
( 4 ) アミノアシル化測定
酵母 TyrRS変異体を用いた tRNATyJ改変体のチロシン受容能の測定
酵母 tRNATyrのアンチコ ドンを各種ァミノ酸をコードしているコ ドンに対応す るように改変させた tRNATyr改変体を、 以下の組成で 37°Cでァミノアシル化させ 表 2 3
5x AAM 2 μ 1
tRNATyr 改変体 0· 01 A260unit
TyrRS変異体 （ 1 mg/ml )
14Cチロシン 1 μ 1
dH20 up to 10 μ 1 計測は 10分後に行い 9 , 1をサンプリングした。 また、 ポジテイブコントロー ルとして、 大腸菌で発現させて得た tRNATyr とアンバーサプレッサー tRNATyrを各 0. 01A26。uni t用いたもの、ネガティブコントロールとして tRNAを入れないものを用 意し実験を行った。 表 2 4
*5x AAM ( Amino Acylation Mixture )
Tri s-HCl ( H7. 6 ) 5x 100 mM
MgCl2 5x 10 mM
KC1 5x 40 mM
ATP 5x 4 mM 得られた結果を図にまとめると図 8から図 1 1に示される通りとなる。 太い斜 め線（左上から右下方向の斜線）をアミノアシル化能力が高い、細い斜め線（左上か ら右下方向根の斜線）をァミノアシル化能力が次に高い、薄く太い十文字線をァミ ノアシル化能力がその次に高い、 点線がアミノアシル化能力が低い、 塗りつぶさ れている部分がアミノアシル化能力一番低い（ほとんどない）で示した。 結果とし て、 D321Rはコ ドンとして CGG，GAG，GGGを認識する tRNA以外の幅広い tRNAを基 質として認識し、 アミノ酸を受容させることが可能であることがわかった。
実施例 5
セリン用コ ドンへのチロシンの導入
. 各実施例に記載の方法にて調製した全種類 tRNA を除いた大腸菌 S30 抽出液 (S30/ - tRNAMix)、 全種類 tRNAの混合物 (t腿 Mix) から tRNAs" (AGY)を除いた tRNA 混合物（tRNAMix— Ser (ACY) ) , アンチコ ドンを GCUに改変した改変型 tRNATyl "及び D321R TyrRS変異体を利用して、 GFPuv遺伝子中 AGUコ ドンにチロシンの導入を行った。 なお、 セリンに割り当てられている AGU及び AGCの両者、 つまり AGY力 、 アンチ コ ドンが GCUの改変型 t RNATyrl種類により読まれる。ただし、 GFPuv遺伝子には、 AGCのコ ドンは存在しない。
反応条件は、 へぺス緩衝液 （Hepes_KOH (pH7. 5) 55mM)、 酢酸マグネシウム ( 10. 7mM) , 酢酸アンモニゥム （27. 5mM)、 ジチオスレィ トール （DTT 1. 7mM)、 ヌ クレオチド三リン酸 （ATP 1. 25mM, GTP 0. 83mM, UTP 0. 83mM, CTP 0. 83mM)、 クレア チンリン酸 （80mM)、 クレアチンキナーゼ （0. 21mg/ml)、 T7 RNAポリメラーゼ （主 発明者らが単離 0. lmg/ml)、全種類 tRNA混合物から tRNASer (AGY)を除いた tRNA混合 物（tRNAMix- Ser ） ） (本発明者らが実施例 2 に準じて単離 3. 4A。fin /ml) , 標準型 アミノ酸 20種 （each l mM)、 ホリン酸 （68 ^α Μ)、 酢酸カリウム （210mM)、 ポリエ チレングリコール wt. 8000 (4°/。）、 TyrRS変異体（D321R TyrRS) (本発明者らが作製 0. 02mg/ml)、改変型 tRNA r (本発明者らが実施例 3に準じて作製 0. 2A260unit/ral)、 铸型 DNA (20 / g/ml)、 全種類 tRNAを除いた大腸菌 S30抽出液 （S30/- tRNA) 及び 脱イオン水を、 括弧内に記載された終濃度となるように試験管内に入れて混合し た後、 30°Cで 1時間ィンキュベートした。
反応後ゲル電気泳動を行い、 蛍光イメージヤーにて解析した。
結果を図 12に示す。図 12より、全種類 tRNAを除いた大腸菌 S30抽出液（S30/ - tRNAMix) に全種類 tRNAの混合物 （tRNAMix) を加えたものは合成物が確認でき （左 から 2レーン目）、 tRNASer (ACY) を除いた tRNA混合物（tRNAMix—Ser (ACY) )を加えた場合 は合成が確認できなかった （左から 3レーン目）。 また、 S30/-tRNAMix、 tRNAMix"Ser (AGY)、 改変型 tRNATyr、 及び TyrRS変異体 (D321R) 全てを加えた場合、 合成が確認 できた （左から 4レーン目）。 このことから、 セリン用コ ドン AGUコドンをチロシ ンに割り当てることが可能となった。 また、 我々はチロシンアナログを導入する ための変異体の作製にも成功しており、 これと組み合わせることで、 AGU コドン に非天然アミノ酸 （チロシンアナログ等） を導入できる。
産業上の利用可能性
本発明により、 変異ァミノ酸を導入しようとするタンパク質をコードする遺伝 子を変異させる必要なく、 確実にコドン特異的に変異アミノ酸を入れた非天然ァ ミノ酸蛋白質を効率的に製造できるようになった。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 無細胞タンパク質合成系に、
( 1 ) タンパク質をコードする遺伝子、
( 2 ) 改変型 tRNATyr、 および
( 3 )前記改変型 tRNA をチロシンアナログ化することができる変異型チロシル tRNA合成酵素
を添加して、 前記タンパク質中の特定部位のアミノ酸を非天然アミノ酸に変異さ せた非天然アミノ酸含有タンパク質を製造する方法。
2 . 前記改変型 tRNAT がアンチコ ドンを前記タンパク質中の前記特定部位を コードするコ ドンに対応させた請求項 1記載の非天然アミノ酸含有タンパク質を 製造する方法。
3 . 前記無細胞タンパク質合成系が、 前記タンパク質の非天然アミノ酸に変 異させる特定部位のアミノ酸コ ドンに対応する天然の tRNA を選択的に減少又は 除去された無細胞タンパク質合成系を用いる請求項 1又は 2記載の非天然ァミノ 酸含有タンパク質を製造する方法。 '
4 . 変異させる特定部位のアミノ酸コ ドンに対応する tRNAを固定化プローブ DNAを用いて無細胞タンパク質合成系から減少又は除去された請求項 3記載の方 法。
5 . 前記無細胞タンパク質合成系が、 非天然型アミノ酸の導入に不必要な因 子を選択的に減少又は除去された無細胞タンパク質合成系を用いる請求項 1又は 2記載の非天然ァミノ酸含有タンパク質を製造する方法。
6 . 前記無細胞タンパク質合成系が、 タンパク質合成に最低限必要な因子か ら構成され、 非天然型アミノ酸の導入に不必要な因子を選択的に減少又は除去さ れた無細胞タンパク質合成系及び/又は非天然型ァ.ミノ酸の導入に必要な因子を 1又は数種類含むタンパク質合成系を用いる請求項 1又は 2記載の非天然ァミノ 酸含有タンパク質を製造する方法。
7 . 変異型チロシル tRNA合成酵素が D321R変異体である請求項 1〜 6いずれ か 1項記載の方法。
8. 改変型 tRNATyI"のアンチコドン部分がコ ドン AGY用に変更された改変型 tRNA である請求項 1〜 7いずれか 1項記載の方法。
9. 変異型チロシル tRNA合成酵素が、 以下の（1)、 (2) 又は（3)のいずれ かからなる変異体である請求項 1〜 6いずれか 1項記載の方法。
( 1 )配列番号 1で示される酵母由来チロシル tRNA合成酵素のァミノ酸配列のァ ミノ酸残基長 100以上の部分配列に対して、 1又は数個のアミノ酸が置換、 付加 及びノ又は欠失した配列で示される、改変型 tRNA をチロシンアナログ化できる 変異型チ口シル tRNA合成酵素
(2)配列番号 1で示されるチロシル tRNA合成酵素のアミノ酸配列に対し、 1又 は数個のアミノ酸が置換、 付加及び Z又は欠失した配列で示される、 改変型 tRNATyrをチロシンアナログ化できる変異型チロシ 'ル tRNA合成酵素
( 3 ) 配列番号 1で示される酵母由来チロシル tRNA合成酵素と同一性が 90%以 上のアミノ酸配列で示され、改変型 tRNA をチロシンアナ口グ化変異型チ口シル tRNA合成酵素
1 0. 改変型 tRNA が以下の（ 1 )、 及び Z又は（ 2 )からなる改変型 tRNATyf である請求項 1〜 6いずれか 1項記載の方法。
. (1) 酵母 tRNATyrの塩基配列において、 アンチコドン部位及び Z又はその他塩基 が変更された塩基配列で表される改変型 tRNATyl"
(2) tRNA の塩基配列において、 少なくとも 3' 末端に ACCAの配列を有する塩 基配列で表される改変型 tRNATyr
1 1. 改変型 tRNATyj:が以下の（1)又は（1)及び （2)からなる改変型 tRNATyr である請求項 1〜 6いずれか 1項記載の方法。
( 1) 酵母 tRNATyrの塩基配列において、 アンチコドン部位が、 ACU、 UAA、 GCG、 GCU、 GGA、 及び UGUから選択されるいずれかのアンチコドンである改変型 tRNA
(2) 少なくとも 3' 末端に ACCAの配列を有する改変型 tRNA
1 2. 無細胞タンパク質合成系に、
(1) タンパク質をコードする遺伝子、
(2) 改変型 tRNATyr、 および
( 3 ) 前記改変型 tRNATyrをチロシル化することができる変異型チロシル tRNA合 成酵素を添加し、 前記タンパク質中の特定部位のァミノ酸を他のァミノ酸に変異 させた非天然タンパク質を製造する方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017063672A (ja) * 2015-09-29 2017-04-06 国立大学法人 東京大学 タンパク質を製造するための翻訳系、及びタンパク質の製造方法
WO2019217727A3 (en) * 2018-05-10 2019-12-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for proteome labeling
WO2020138336A1 (ja) 2018-12-26 2020-07-02 中外製薬株式会社 コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
WO2021261577A1 (ja) 2020-06-25 2021-12-30 中外製薬株式会社 改変された遺伝暗号表を有する翻訳系
WO2024118477A1 (en) * 2022-11-28 2024-06-06 Trustees Of Boston College Enhanced mutants of a bacterial suppressor tyrosyl trna and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05236987A (ja) * 1991-08-20 1993-09-17 Nippon Sanso Kk 非天然型アミノ酸組み込み蛋白質とその製造法及び試薬キット
JP2004261160A (ja) * 2003-03-04 2004-09-24 Gifu Univ 非天然蛋白質、その製造方法、固定化方法及びキット

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05236987A (ja) * 1991-08-20 1993-09-17 Nippon Sanso Kk 非天然型アミノ酸組み込み蛋白質とその製造法及び試薬キット
JP2004261160A (ja) * 2003-03-04 2004-09-24 Gifu Univ 非天然蛋白質、その製造方法、固定化方法及びキット

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAYAMA E. ET AL.: "New chromatographic and biochemical strategies for quick preparative isolation of tRNA", NUCLEIC ACIDS RES., vol. 28, no. E64, 2000, XP003002662 *
KAO C. ET AL.: "A simple and efficient method to reduce nontemplated nucleotide addition at the 3 terminus of RNAs transcribed by T7 RNA polymerase", RNA, vol. 5, 1999, pages 1268 - 1272, XP003002663 *
MA C. ET AL.: "In vitro protein engineering using synthetic tRNA(Ala) with different anticodons", BIOCHEMISTRY, vol. 32, 1993, pages 7939 - 7945, XP003002661 *
WANG L. ET AL.: "Expanding the genetic code of Escherichia coli", SCIENCE, vol. 292, 20 April 2001 (2001-04-20), pages 498 - 500, XP002904367 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017063672A (ja) * 2015-09-29 2017-04-06 国立大学法人 東京大学 タンパク質を製造するための翻訳系、及びタンパク質の製造方法
WO2017057633A1 (ja) * 2015-09-29 2017-04-06 村上　裕 ポリペプチドを製造するための新遺伝暗号と翻訳系、及びポリペプチドの製造方法
WO2019217727A3 (en) * 2018-05-10 2019-12-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for proteome labeling
US11921118B2 (en) 2018-05-10 2024-03-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for proteome labeling
WO2020138336A1 (ja) 2018-12-26 2020-07-02 中外製薬株式会社 コドン拡張のための変異ｔＲＮＡ
WO2021132546A1 (ja) 2019-12-26 2021-07-01 中外製薬株式会社 翻訳用組成物及びペプチドの製造方法
WO2021261577A1 (ja) 2020-06-25 2021-12-30 中外製薬株式会社 改変された遺伝暗号表を有する翻訳系
WO2024118477A1 (en) * 2022-11-28 2024-06-06 Trustees Of Boston College Enhanced mutants of a bacterial suppressor tyrosyl trna and uses thereof

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