JP4850064B2

JP4850064B2 - 無細胞タンパク質生合成用溶解物の産生法

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Publication number: JP4850064B2
Application number: JP2006522291A
Authority: JP
Inventors: ゲルリッツ，マイケル; ストレイ，ヤン; スティーゲ，ヴォルフガング
Original assignee: キアゲンゲーエムベーハー
Priority date: 2003-08-06
Filing date: 2004-07-27
Publication date: 2012-01-11
Anticipated expiration: 2024-07-27
Also published as: US20150140603A1; EP1651767A1; WO2005017166A1; US20190284599A1; JP2007501007A; US20180187228A1; US20090087879A1; US20130115655A1; DE10336705A1; US20210032670A1; US20170152539A1; EP1651767B1

Description

本発明は溶解物の産生法とその溶解物の使用に関し、溶解物は低活性の必須翻訳産物を有し、合成タンパク質の無細胞タンパク質生合成に用いる。

高純度、特に又大量のタンパク質が生命工学や医療への応用に必要である。多くの場合伝統的合成はとにかく非経済的で不可能である。これは特に変性タンパク質や非天然アミノ酸含有タンパク質の産生と関連する。

タンパク質大量産生の一つの可能性は遺伝子による産生である。この目的のために所望タンパク質をコード化するクローンＤＮＡを細胞、特に外来ＤＮＡとしてベクターかプラスミドの形で原核細胞に導入する。これら細胞を次いで培養し、外来ＤＮＡによりコードしたタンパク質を発現し抽出する。このようにしてより大量のタンパク質が得られるが、今まで知られている方法、特にクローン化は高価である。更に殆ど場合細胞は一過的に移入され、例外的な場合のみ安定に不死化する。更に生体外タンパク質生合成にはいくつかの欠点がある。細胞独自の発現系は異種遺伝子構造の発現を抑制するか、各伝令ＲＮＡか遺伝子産物は不安定で細胞内核酸分解酵素かタンパク質分解酵素により破壊される。毒性最終産物のため発現により生命体の阻害或いは死さえももたらす。これらの問題が原因で所望タンパク質の明確な過剰産生を殆ど不可能になる。

無細胞タンパク質生合成は、上記の現象を避けることができるので、遺伝子修飾生命体によるタンパク質合成の有効な代替えとなる。既知の無細胞タンパク質生合成としてはウサギ網状赤血球の溶解物、小麦の芽からの溶解物及び細菌性Ｓ３０抽出物がある。溶解物産生法は技術の熟知者にはよく知られている。しかし溶解物が所望タンパク質産生をかく乱するように働きその結果収率を低下する成分を含有する溶解物を用いる場合、その方法の問題は継続される。この負に作用する成分を阻害か除去して溶解物から取り除ける。溶解物産生時の妨害活性はタンパク質生合成にとって重要成分の処理時に細胞含有物の分別によってのみ除去できる。例えば膜や細胞壁成分の処理時に、染色体ＤＮＡと低分子成分の大部分が分離される。残留活性は以後の処理段階で除去するか、前もって生命体の遺伝子修飾で阻止しておく必要がある。

文献米国特許６，３３７，１９１では選択肢として妨害酵素活性を望ましくない酵素の阻害か除去により追加的に取り除いたエネルギー再生系改良のタンパク質産生用溶解物を用いることが技術的に知られている。見込みある方法としては遺伝子破壊法、アンチセンス法、アフィニティークロマトグラフィーのようなタンパク質除去の他の既知法がある。

更にある活性が欠損した遺伝子修飾細胞株からの溶解物も技術的に知られており、例としてノバゲン社のロンプロテアーゼとｏｍｐＴプロテアーゼ欠損の遺伝子修飾大腸菌株エコブロ（EcoPro）Ｔ７をここに挙げる。

特別な場合には生体外タンパク質生合成を妨害するタンパク質が生命体の成長に不可欠である。酵素の不活性化は必然的に生命体に死をもたらす。この場合には酵素を不活性化するか後で除去せねばならない。上記文献米国特許６，３３７，１９１にはこの目的のための種々の方法が示されている。

無細胞タンパク質生合成により、特に非天然アミノ酸含有の合成タンパク質が産生できる。アミノ酸コドンを突然変異により終止コドンのナンセンスコドンに形質転換する。非天然アミノ酸の組み入れは転移ＲＮＡが非天然アミノ酸を合成的に添加した終止コドンに相補的な転移ＲＮＡにより実施する。終止コドンＵＡＧはアンバーコドンで、それ故終止コドンＵＡＧに相補的な転移ＲＮＡはアンバーサブレサー転移ＲＮＡと呼ばれる。アンバーサプレッサー転移ＲＮＡによるＵＡＧ終止コドンでの非天然アミノ酸の組み入れは、天然終止因子１（ＲＦ１）による連鎖停止と直接競合する。ある条件下ではこの競争は非常に強く、アミノアシル基転移ＲＮＡの一部しかタンパク質合成に使用されず、翻訳系能力の好ましくない大部分が終結ペプチド合成に用いられる。この競争行動の結果非天然アミノ酸の組み入れに乏しく、その結果妨害又は終結が早すぎたタンパク質鎖からなる多数の望ましくない副生物と関連して、修飾タンパク質が低収率となる。

文献ネーチャーバイオテクノロジー (Nature Biotech.)、１９巻（８）、７５１−７５５頁、１９９１年に、清水ら（Shimizu et al.）はＲＦ１を除去するとサプレサー転移ＲＮＡが有効に働く純粋系を記述している。ショートら（Short et al.）のバイオケミストリー（Biochemistry）、３８巻、８８０９−８８１９頁、１９９９年の文献で、大腸菌の温度感受性終止因子１が、溶解物の穏和な加熱により不活性化することが知られている。非天然アミノ酸による修飾タンパク質の収率増加は重要である。同様にジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）タンパク質を産生する場合、副生物との出会いが減らねばならない。この方法で溶解物を加熱するのは不利であり、それによりタンパク質組織の熱感受性因子が更に破壊される。

本発明の技術目的は無細胞タンパク質生合成に用いる簡単な溶解物産生法を提供することであり、この溶解物により通常の無細胞タンパク質生合成での合成タンパク質収率が増加できる。

用語“溶解物”は真核細胞か原核細胞の分解で生ずる全活性細胞抽出物を含む。

“必須翻訳産物”は細胞生存及び／又は増殖での必須遺伝子産物である。

“合成タンパク質”は無細胞法で産生するタンパク質である。

“低減収率”とは必須翻訳産物含有溶解物中の無細胞タンパク質生合成による合成タンパク質の収率が、同型でその他は同一条件で必須翻訳産物を溶解物から分離した溶解物中の同じ合成タンパク質収率より重量で１０％少ない、好ましくは２０乃至８０％、特に好ましくは９０％以上少ないことを意味する。

“マーカー配列”は分子、とりわけタンパク質の同定に役立つ構造を表す。この構造としてはアミノ酸の短い配列であり、アミノ酸数は好ましくは１０以下、特に４と８の間である。この構造の例としてはタグである。マーカー配列で酵素をコードし、このコード法で標識化分子を同定し又分離できる。

“選択配列”は構造をコードし、ある環境下ではこの選択配列の担体みが生存を許される。通常これらはある抗生物質に関する耐性遺伝子である。更なる選択配列は核酸代謝又はアミノ酸代謝から始まる。

用語“溶解”とは溶菌酵素の寄与、機械的影響又は化学的影響による細胞壁又は細胞膜破壊による細胞の溶解を表す。

本発明ではこの技術目的達成のための無細胞タンパク質生合成に用いる溶解物産生法を教示し、以下の手続きを含む。a）無細胞タンパク質生合成収率を減少する必須翻訳産物をコードする生命体のゲノム配列を、適切な調節エレメント下に位置する外来ＤＮＡにより置換し、この外来ＤＮＡは追加にマーカー配列を含有する必須翻訳産物をコードし、ｂ）手続きa）によりクローン化した生命体を培養し、ｃ）手続きｂ）で得た培養物から生命体を溶解し、ｄ）手続きｃ）で得た溶解物からマーカー配列に選択的な分離工程で必須翻訳産物を分離する。調節エレメントは又外来でも良いが、天然に存在の調節エレメントでも良い。最初の場合には調節エレメントは外来ＤＮＡの導入と同じ手続きかそれとは異なる手続きで導入する必要がある。

本発明による溶解物産生は簡単であり、得られた溶解物により無細胞タンパク質生合成法で合成タンパク質を高収率で、特に非天然アミノ酸タンパク質を高収率で得ることができる。

これは必須翻訳産物をマーカー配列の親和性により溶解物から除去するか、活性を阻害することにより、必須翻訳産物にマーカー配列が備わる。必須翻訳産物の修飾は必須翻訳産物がマーカー配列との融合で発現するようタンパク質の染色体遺伝子で行う。マーカー配列は精製用分離系の結合部（大部分は固定化されている）や阻害剤に高親和性を有する構造をコードする。その結果必須翻訳産物の活性をタンパク質混合物やマーカー配列を含有しない任意分子の混合物から除去できる。

マーカー配列を生命体必須翻訳産物の染色体遺伝子に組み込みを達成するには生命体の安定な形質転換による。この条件下では遺伝子修飾生命体の培養が追加遺伝子情報を失うことなしに、淘汰圧さえなしで可能になる。

本発明の好ましい様態ではマーカー配列は必須翻訳産物のタンパク質物性に影響しない。活性必須産物は遺伝子修飾生命体の培養が成功するのに好都合である。マーカー配列を備えた必須翻訳産物の機能性は必須翻訳産物機能に特異的なアッセイにより決定される。この目的のために必須翻訳産物とマーカー配列“をコードするＤＮＡ断片を発現ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により翻訳する。その機能性は必須翻訳産物を含む合成で産物の合成率を基に評価する。未変性必須翻訳産物存在下での合成率を修飾必須翻訳産物存在下での合成率比較し、その機能性を評価する。標識化必須翻訳産物の産物合成速度が未変性必須翻訳産物の合成速度の１０％、好ましくは４０−６０％、特に９０％以上であると、この必須翻訳産物の機能性はマーカー配列により影響されない。

本発明による安定な形質転換生命体からの溶解物はマーカー配列と融合した必須翻訳産物を１００重量／重量％（翻訳産物全量に関して）含有し、仮にあったとしても未変性必須翻訳産物をわずかしか（翻訳産物全量に関して１０重量／重量％以下、１重量／重量％以下でさえ）混入されない。マーカー配列により溶解物中の望まない必須翻訳産物を溶解物から容易に効果的に除去できる。その結果非天然アミノ酸を組み込んだ合成タンパク質のタンパク質生合成がより迅速に、より高収率で、より少なくい副産物で実施できる。

本発明の他の利点は望まない成分の一つだけを特異的に溶解物から除去できることである。しかし数個の望まない翻訳産物に異なるマーカー配列を備えることも可能であるが、有利には同じマーカー配列を備える。この範囲では本法の手続きa）を異なる翻訳産物に実施でき、マーカー配列はそれぞれ同一か異なってもよい。

生命体のクローニングは微量注入や電気穿孔のような技術の熟知者にはよく知られた形質転換法かＤＮＡの化学的仲介による受理で実施できる。

クローンに成功した生命体の単離は技術の熟知者に知られた形質転換法やＤＮＡの化学的仲介受け入れにより実施する。

クーロン化に成功した生命体の単離は技術の熟知者が知る方法で実施する。

生命体の培養はバッチ法、流下法又は連続法で実施できる。

同様に非天然アミノ酸含有合成タンパク質のタンパク質生合成はバッチ法、流下法又は連続法で実施できる。

細胞の溶解は例えば高圧均質化、超音波或いはボールミルでの分解のような機械的作用で起こる。

別の好ましい実施形態では必須翻訳産物は終止コドンＵＡＧを検出する終止因子ＲＦ１である。必須翻訳産物は又無細胞タンパク質生合成用溶解物の機能を低下又は妨害する他のタンパク質からも選択できる。例えば必須翻訳産物は他の終止因子や終止因子、例えばＨｅｍｋと相互作用するタンパク質であっても良い。翻訳の他因子でその不活性化は生きた細胞には致命的であるが、その除去は溶解物の翻訳や他の応用効率に好ましい影響を与えるものは、本発明の目的には溶解物から除去できる。例えば必須翻訳産物はアミノアシル基転移ＲＮＡ合成酵素を含有しても良く、その除去によりついにはあるアミノ酸が選択コドンで他のアミノ酸により置換できるよう合成酵素検出の各転移ＲＮＡを不活性化する。この状況で好ましいものは例えばシステイン転移ＲＮＡ合成酵素で、溶解物の除去によりシステイン用の二つのコドンがお互いに他のアミノ酸、特に非天然アミノ酸か修飾アミノ酸に利用できる。原則として全アミノアシル基転移ＲＮＡ合成酵素、特にタンパク質に含有のアミノ酸を比較的まれにしか活性化しないものが考えられる。他の必須翻訳産物としては原核生物のメチオニル開始転移ＲＮＡ（Ｍｅｔ−転移ＲＮＡｆ）のホルミル化を触媒するメチオニル転移ＲＮＡホルミル基転移酵素がある。この酵素又はホルミル化経路の他酵素を無細胞タンパク質生合成系から除去すると、天然メチオニンの翻訳開始が実質的に減少するか完全に除去さえ起こす。その結果Ｎ−ホルミル化修飾アミノ酸又は非天然アミノ酸、例えば蛍光性アミノ酸やビオチン化アミノ酸で前もってアシル化した開始転移ＲＮＡの効率はかなり増加し、同時翻訳Ｎ−末端修飾タンパク質の合成は非常に向上する。この修飾タンパク質の標識化度も又非常に増加し、おそらくほぼ１００％になる。他の可能性としては特異的に開始に介入するためにこの系から開始因子を取り出すことである。例えばこの因子を前もってアシル化した転移ＲＮＡと共に系に戻すか、他の開始因子で置換する。必須翻訳産物の他例としては脱リン酸化酵素群から選択でき、例えば溶解物のエネルギー消費にプラスに影響する。アミノ酸代謝酵素の操作、例えばアミノ酸転移酵素や異性化酵素の除去はスクランブルすることなしに各標識化アミノ酸種を導入するのに適している。勿論必須翻訳産物は真核生物タンパク質群から選択しても良い。ここで例えばeIF2のような真核生物翻訳阻害剤が挙げられる。この因子は調節サブユニットeIF2αを有し、リン酸化型で翻訳開始を阻害する。eIF2は又このサブユニットなしでも活性なため、eIF2α除去により翻訳開始が改善されその結果無真核細胞系でのタンパク質収率の向上をもたらす。核酸分解酵素、タンパク質分解酵素、キナーゼ、ラセミ化酵素、異性化酵素、脱水素酵素や重合酵素の一群の因子も又原生生物系や真核生物系の好ましい標的である。

特別な実施形態ではマーカー配列を“ストレプタグＩＩ、ポリヒスチジン、フラグ（ＦＬＡＧ）、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン、ポリフェニルアラニン、ポリシスチン、Ｍｙｃ、グルタチオンＳ転移酵素、プロテインＡ、麦芽糖結合プロテイン、ガラクトース結合プロテイン、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素”の一群から選択する。更なる例は請求項で記載する。
必須翻訳産物のマーカー配列と染色体遺伝子は融合タンパク質として発現する。好ましい実施形態ではマーカー配列はストリプタクチン親和性の８つのアミノ酸からなるペプチド構造のスプレプタグＩＩである。例えば発現終止因子ＲＦ１はｃ−末端のストレプタグＩＩを含んでも良い。ＲＦ１−ストレプタグＩＩ融合タンパク質の分離は従ってストリプタアクチンか他のストレプタグＩＩ（Ｓ−ＩＩ）結合基質を添加した親和性基質で実施する。分離はカラムクロマトグラフィー法を基礎とするがバッチ法で行っても良い。他のマーカー配列やその各親和性パートナーを用いても良いことが分かる。例としてはポリヒスチジン（Ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ）タグがある。ポリヒスチジンは通常６つの連続ヒスチジン残基からなるが、長さ４乃至１０個の残基でも良い。他の好ましい実施形態では必須翻訳産物の単離は相当の抗体、抗体断片又はアプタマーにより実施する。ある条件下では結合パートナーの親和性により必須翻訳産物の活性阻害を起こす。

タンパク質分離法の選択については、溶解物の翻訳活性に影響しない、即ち翻訳系の重要な反応成分を分離しない方法を選ぶ。

原則的には生命体は真核生物でもか原生生物でも良い。溶解物産生用生命体が原生生物である場合は特に役立つ。このことに関しては文献を特許請求の範囲に加えてある。特に大腸菌の翻訳系が適切である。

本発明は更に必須翻訳産物活性が低下した無細胞タンパク質生合成用溶解物と、その非天然アミノ酸か修飾天然アミノ酸含有の合成アミノ酸産生への使用を教示する。好ましい実施形態では溶解物は終止関与因子、好ましくはＲＦ１の活性を低下するものを含む。修飾合成タンパク質の例としてはアミノ酸産生によるアミノアシル化アンバーサプレッサー転移ＲＮＡによるビオチンーリジン（ビオシイチン）の組み込みである。ビオチン化タンパク質か他のストリプタアクチン結合タンパク質の合成と精製に関してこの系は他の利点がある。内在性ビオチン化タンパク質は又ＲＦ１−ＩＩ分離時に分離されるので、ストレプトアビジンや類似基質により精製した合成タンパク質が産生株からのビオチン化タンパク質で混入されるのを防ぐ。溶解物は又他の官能基をより効率的にタンパク質に組み込みことができ、特に好ましくはフルオロフォアや普遍的な反応基を組み込みことができ、他の機能を選択的に且つ位置特異的に共役できる。代用としては例えば同位元素標識化構造かセレン含有構造を有する天然アミノ酸の組み入れがある。

非天然アミノ酸によるアンバーサプレッサー転移ＲＮＡの添加は所謂化学的アミノアシル化か又は酵素、例えば合成酵素やリボザイムにより実施できる。又酵素法と異なる化学的方法を互いに組み合わすこともできる。例えば転移ＲＮＡを先ずリジン、シスチインや側鎖に反応性基含有のアミノ酸と化学的か酵素的にアミノアシル化できる。次いでこのアミノ酸の反応性基により対応アミノアシル化転移ＲＮＡに興味の官能基、例えばフルオロフォアを在来の化学的方法で共役する。例えばシスチインのスルフヒドリル基をマレイミドやアミノ基によりＮＨＳエステルに修飾できる。転移ＲＮＡのアミノアシル結合はこの修飾時に、例えばα―アミノ基の保護基の存在により安定化できる。

本系はタンパク質研究の科学的問題に答え且つ解決するのに適する。更に本系は終止因子除去後各コドンを解読できないので原則的にリボソーム表示に適し、転移ＲＮＡの合成タンパク質とリボソームのリボソーム錯体の安定性が増加する。本系は又ピューロマイシンやその誘導体を上記コドン位に明確に導入できる。ピューロマイシンは通常三者共有結合体や終止因子と競合し、統計的に成長タンパク質鎖末端に付加する。終止因子除去による“飢餓コドン“の生成によりピューロマイシンを規定位置に組み込むことができる。このようにしてこの機能、ピューロマイシンと共役した機能を合成タンパク質、例えばＤＮＡオリゴマー、糖や他成分に付加できる。

他実施形態では溶解物は他の必須翻訳産物活性を低下するもの、例えば脱リン酸化酵素、核酸分解酵素、合成酵素やタンパク質分解酵素群の一つがある。その結果この合成タンパク質の産生を改善でき、この合成を終止因子活性以外の必須翻訳産物活性により制限する。

本開示法によりある科学的問題の解決法を妨げる必須翻訳産物を溶解物から除去するか、ある問題の研究が可能な必須翻訳産物を除去することで可能になる。

以下に本発明を制限なしの実施例でより詳細に説明する。

ＲＦ１とアンバーサプレッサー転移ＲＮＡの競争行動
図１にＲＦ１とアンバーサプレッサー転移ＲＮＡの競争行動を図式的に表示する。二つの分子のいずれがコドンＵＡＧと対になるかにより、タンパク質は終結するかアミノ酸に組み込まれ、抑制産物を形成して翻訳を続ける。

ＲＦ１−ＳＩＩの機能性の予備研究：発現ＰＣＲ
終止因子ＲＦ１の不活性化は生命体に致命的なので、付加ストレプタグＩＩのＲＦ１活性に対する影響を調べた。この研究のためにＲＦ１を全てでＰＣＲ産物にだけ翻訳した。図２にＲＦ１−ＳＩＩの調整発現と精製を示す。Ｒは体外翻訳反応を、Ｄは試験番号を、Ｗ１、Ｗ２及びＷ３は洗浄画分をＥ１、Ｅ２及びＥ３は溶出画分を表す。

ＲＦ１−ＳＩＩの機能性の予備研究：アンバーサプレッサーアッセイ
図３にアンバーサプレッサーアッセイのＲＦ１−ＳＩＩの機能性試験を示す。図３Ａの数字１はサプレッサー転移ＲＮＡ添加なしでのバッチ配列の実行を示す。数字２から５はサプレッサー転移ＲＮＡ（１μＭ）でのバッチである。バッチ２はＲＦ１−ＳＩＩを全く含有していない。バッチ３から５は精製ＲＦ１−ＳＩＩ（３：０．０６２５μＭ、４：０．１３μＭ、５：０．２６μＭ）で濃縮されている。図Ｂは転移ＲＮＡ選択率のＲＦ１−ＳＩＩ添加依存性を示す。“転移ＲＮＡ選択率”はホスホイメージ（PhosphoImage）を基に合成抑制と合成終止のモル量を決定して計算し、この二つの値の比を計算する。バッチでのＲＦ１−ＳＩＩ分が増加すると、終止産物の産生増加をもたらす。図３Ｂは転移ＲＮＡ選択率のバッチ中のＲＦ１−ＳＩＩ量への依存性を示す。転移ＲＮＡ選択率はＲＦ１−ＳＩＩ添加により３．５．から１以下に下がり、ＲＦ１−ＳＩＩ分の増加と共に更に減少する。これによりＲＦ１−ＳＩＩが原則的に活性であることが確認される。

ＲＦ１−ＳＩＩの機能性の予備研究：天然ＲＦ１との活性比較
図４はアンバーサプレッサーアッセイでの標識化ＲＦ１と天然ＲＦ１の機能性と活性の比較を示す。ＲＦ１−ＳＩＩはＲＦ１と同程度の活性を示す。図４ＢによりＲＦ１−ＳＩＩの基質添加量への依存はＲＦ１より合成率が小さいことを示す。ＲＦ１−ＳＩＩと天然ＲＦ１の合成率を考慮して、転移ＲＮＡ選択率をレポータータンパク質ＦＡＢＰＡｍｂ８８発現時の両タンパク質存在下にホスホイメージから決定した（図４Ａ）。レポータータンパク質をコードする基質（ｐＨＭＦＡＡｍｂ８８）はアミノ酸位８８でのアンバー突然変異を含む。ＲＦ１−ＳＩＩ存在下での転移選択率は天然ＲＦ１存在下の場合とほぼ同一である（図４Ｃ）。両タンパク質は従って同等の活性を有する。

溶解物からのＲＦ１−ＳＩＩ除去シミュレーション
溶解物からのＲＦ１−ＳＩＩ除去シミュレーションするためにＲＦ１−ＳＩＩを予備的に産生し放射性炭素原子１４標識（^１４Ｃ）ロイシン（１００dpm/mole）で標識化した。その後合成精製ＲＦ１−ＳＩＩをＳ３０溶解物に加え、最終濃度を０．１μＭとした（１ｘＴＬＭ緩衝液中２１５Ａ_２６０／ｍｌ）。ＲＦ１−ＳＩＩの分離はストレプタアクチンカラムにより実施し、全部で５００μｌの溶解物（＝大略１１０Ａ_２６０）を１６６μｌずつ三回に２００μｌのカラムに添加した。洗浄液量は各２００μｌであった。図５に溶解物成分、特に食塩添加又は無添加でのＲＦ１−ＳＩＩの溶出挙動と溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩの各分量を示す。図５Ａに溶解物成分の溶出挙動を示す。図５Ａから溶解物成分が大部分はカラムに結合しないか非特異的にのみ結合することが分かる。非特異的に結合した溶解物成分は洗浄（洗浄画分）により再度わずかに溶出した。用いた方法は従って所望の溶解物成分の分離により溶解物活性を低下しない。図５Ｂにその溶出挙動を示し、ＲＦ１−ＳＩＩがストレプタアクチンカラムに特異的に結合し、溶出溶液だけでカラムから溶出することが明らかになる（溶出画分、図５Ｂ）。試験画分と洗浄画分にはＲＦ１はわずかしか含まれない。図Ｃ１とＣ２に溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩ分の各分離段階への依存性を示す。図Ｃ１は溶解物の光学濃度２６０／ｍｌ（ＯＤ２６０／ｍｌ）に関するＲＦ１／ｍｌ壊変毎分（ｄｐｍ）値を含む。図５Ｃ１の純溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩ分（ｄｐｍ／ＯＤ２６０）を図５Ｃ２の１００％に設定したので、図５Ｃ２は溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩのパーセント分を表す。図５Ｃ２は分離段階“試験”と“洗浄画分”後には溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩが明らかに少なくなることを示す。

遺伝子修飾生命体のゲノム構造
図６に本発明による置換タンパク質のクローン前後での染色体遺伝子の概略図を示す。ＲＦ１遺伝子、調節エレメントとＨｅｍＫ用遺伝子からなる最初のゲノム状態（図６Ｂ）とストレプタグＩＩのマーカー配列をＲＦ１遺伝子に付加した所望の遺伝子状態（図６Ａ）が見られる。更に所望の遺伝子状態は選択配列を含み、この場合はカナマイシンに対する抗生物質耐性とその他の調節エレメントである。本発明による生命体はブタペスト条約に基づく“微生物と細胞培養物に関するドイツコレクション社”に番号ＤＳＭ１５７５６（大腸菌／ＲＦ１−ＳＩＩ）として寄託している。

ＲＦ１欠落溶解物の産生
三つの大腸菌／ＲＦ１−ＳＩＩクローン（a、ｂ及びｄ）の培養を振とう培養により実施した。培養物を対数期で収集し、超音波法で分解した。溶解物含有ＲＦ１−ＳＩＩを二つのバッチに分け、ＲＦ１−ＳＩＩを異なる方法で分離した。バッチＡ（図５で印Ａによる）からはＲＦ１−ＳＩＩをストレプタクチンカラムでアフィニティクロマトグラフィーにより分離した。（２００μｌカラムに５００μｌ溶解物（＝大略１１０Ａ_２６０））。バッチＢ（図７では印Ｂ）は前保温（４００ｍＭ食塩）に付し、次いでＲＦ１−ＳＩＩをストレプタグカラム上で分離した。（２００μｌカラムに５００μｌ溶解物（＝大略１２５Ａ_２６０）。その後塩の除去をＮＡＰ５で実施した。結果を図７Ａと７Ｂに示し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳＰａｇｅ）と溶出体積のウエスタンブロット法によるＲＦ１−ＳＩＩの検出を示す。図７Ａにゲルのクーマシー染色物を示す。図７Ｂにアンチ―ＳＩＩ（ストレプタグに対する単クローン抗体）でのストレプトアビジンーペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によるＲＦ１−ＳＩＩの検出を示す。標準としては体外翻訳で精製されたＲＦ１−ＳＩＩである。ＬＭＷ６は分子量マーカーであり、Ｋ_ＡはバッチＡの分離法に付した遺伝子非修飾大腸菌株からの溶解物である。この結果はＲＦ１−ＳＩＩが両法により溶解物からうまく分離されたことを示す。

ＲＦ１−ＳＩＩの発現
二つの大腸菌株を実施例６（好ましい遺伝子状態）で記載の合成ＤＮＡ断片でクローン化した。発現ＰＣＲ法により、染色体ＤＮＡ（大腸菌Ｋ１２）からのタンパク質ＲＦ１とＨｅｍＫを増幅、クローン化し且つ配列した。ＰＣＲ法によりストレプタグ配列（ＳＲＩＩ）をＲＦ１用遺伝子に付加し、ＨｅｍＫ発現用の新規調節エレメントを導入した。両タンパク質はその発現能とＲＦ１の場合はその機能性を試験するため無細胞的に翻訳した。次いで染色体置換のために所望ゲノム状態の遺伝子カセットの産生が続いた。三つのＰＣＲ断片（ＲＦ１−ＳＩＩ用遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子及びＨｅｍＫ遺伝子）を産生し、互いに連結した。この連結を制限された非対称界面を用いてワンポット反応で、即ち三断片を互いに一段階で連結させた。所望ゲノム状態の生成ＤＮＡ断片をゲル溶出し、ベクターにクローンし、ＰＣＲにより配列、増幅した。次いで電気穿孔法により大腸菌Ｄ１０にＰＣＲ生成線状断片を形質転換した。カナマイシン耐性を所望ゲノム状態を持つクローンの選択に用いた。この目的に細胞をカナマイシンプレートに蒔いた。四つの陽性クローンをアンピシリン耐性保有し且つ遺伝子断片増幅に用いるプラスミドが形質転換するのを排除できるようにアンピシリン含有培地で対抗選択に付した。更に所望遺伝子断片の大腸菌染色体内での存在をコロニーＰＣＲ法により調べた。この目的のためにカセット内でハイブリッド形成したプライマーを形質転換カセット外の大腸菌染色体にハイブリッド形成したプライマーと混合した。四つの全クローンは所望の遺伝子状態を有した。図８にウエスタンブロットにおけるＲＦ１−ＳＩＩの体内発現を示す。ＲＦ１−ＳＩＩの分離はストレプタアクチンカラムで実施した。タンパク質検出をアンチーＳＩＩ（ストレプタグに対する単モノクローナル抗体）で行った。図８は二つのクローンaとｂでＲＦ１−ＳＩＩの明白な発現を示す。遺伝子非修飾株の陰性の対象“０”はＲＦ１−ＳＩＩの発現を示さなかった。試料“Ｋ”は体外翻訳のＲＦ１−ＳＩＩであり、マーカーと陽性の対象として働く。

再生可能系での抑制効率に対するＲＦ１分離の影響
図９は本発明による溶解物での体外タンパク質生合成とＲＦ１含有溶解物の結果を表す。図９Ａはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲルのホスホイメージ（ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅ）を示し、サプレッサー転移ＲＮＡ量に依存するＲＦ１の分離前後での終止産物と抑制産物のそれぞれの分量を示す。この場合酵素的にアミノアシル化可能な転移ＲＮＡを用いた。ＲＦ１欠損溶解物中のサプレッサー転移ＲＮＡ分１．２μＭで、終止産物が少量だけ検出可能である。ＲＦ１の分離により抑制産物の翻訳が増加し（図９Ｂ）、同時に抑制産物／終止産物比は抑制産物側に移動する（図９Ｃ）。更に抑制産物の合成率はより大量のサプレッサー転移ＲＮＡを添加することで増加する。その結果ＲＦ１を溶解物から分離することで抑制産物の合成率は明らかに増加し、その収率も又増加する。

非天然アミノ酸の組み込み
図１０に示すようにＲＦ１存在下でビオチンーリジンの脂肪酸結合蛋白（ＦＡＢＰ）への組み込みが典型的に増加する。（図１０Ａ、ホスホイメージ）。ビオチンーリジン（ビオシチン）を化学的方法でロードしたアンバーサプレッサー転移ＲＮＡを用いた。翻訳タンパク質を放射性炭素原子１４ロイシンで標識化することによりＲＦ１−欠損溶解物中のビオチン化ＦＡＢＰの合成率がより高いことが確認される（図１０Ｂと１０Ｃ）．

化学的方法で添加のアンバーサプレッサー転移ＲＮＡによるビオシチンの組み込み―ウェスタンブロットでのビオチン化蛋白の検出
図１１Ａにウェスタンブロット、図１１Ｂに化学発光検出によるウェスタンブロットの定量化を示す。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共役したストレプタグＩＩに対する単モノクローナル抗体を用いた。ウェスタンブロットは明らかにＲＦ１分離後、溶解物中の合成ビオチン化蛋白の合成が大いに増加することを示す。更にこのブロットはＲＦ１欠損溶解物産生の使用法で、内在性ビオチン化タンパク質も除去できることを示す。大腸菌溶解物中の比較的高濃度な内在性ビオチンカルボキシ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）はＲＦ１除去後殆どもはや検出されない。ウェスタンブロットの定量化により再度ＲＦ１欠損溶解物中の合成修飾タンパク質の合成が非常に増加することが示され、放射能法により実施例１０の定量化が確認できる。

ビオシチン組み込みの反応時間依存性
図１２に示すように反応時間が長くなると、ビオチンーリジン（ビオシチン）はより多く組み込まれる。その結果全産物量中の抑制産物分が増大する。反応時間が長くなるとビオチン化抑制産物収率は増加する。

ＲＦ１とアンバーサプレッサー転移ＲＮＡの競争行動を示した図である。ＲＦ１−ＳＩＩの調整発現と精製を示した図である。アンバーサプレッサーアッセイのＲＦ１−ＳＩＩの機能性試験を示した図である。アンバーサプレッサーアッセイでの標識化ＲＦ１と天然ＲＦ１の機能性と活性の比較を示した図である。溶解物成分、特に食塩添加又は無添加でのＲＦ１−ＳＩＩの溶出挙動と溶解物中のＲＦ１−ＳＩＩの各分量を示した図である。本発明による置換タンパク質のクローン前後での染色体遺伝子を示した概略図である。ゲルのクーマシー染色物と、アンチ―ＳＩＩ（ストレプタグに対する単クローン抗体）でのストレプトアビジンーペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によるＲＦ１−ＳＩＩの検出を示した図である。ウエスタンブロットにおけるＲＦ１−ＳＩＩの体内発現を示した図である。本発明による溶解物での体外タンパク質生合成とＲＦ１含有溶解物の結果を表した図である。ＲＦ１存在下でのビオチンーリジンの脂肪酸結合蛋白（ＦＡＢＰ）への組み込みの典型的な増加を示した図である。ウェスタンブロットと、化学発光検出によるウェスタンブロットの定量化を示した図である。ビオシチン組み込みの反応時間依存性を示した図である。

Claims

以下の手続きを含む無細胞タンパク質生合成に用いる溶解物の使用であって、
ａ）無細胞タンパク質生合成収率を減少する必須翻訳産物ＲＦ１をコードする生命体のゲノム配列を適切な調整エレメント下に位置する外来ＤＮＡで置換し、この外来ＤＮＡが追加的にマーカー配列を含有する必須翻訳産物ＲＦ１をコードし、
ｂ）手続きａ）による形質転換生命体を培養し、
ｃ）手続きｂ）で得た培養物の生命体を溶解し、
ｄ）必須翻訳産物ＲＦ１を手続きｃ）で得た溶解物からマーカー配列に特異的な分離工程で分離する方法であって、
前記マーカー配列がストレプタグＩＩであり、前記生命体が大腸菌であることを特徴とする使用。
マーカー配列と染色体遺伝子を融合タンパク質として発現し且つ翻訳産物配列が生命体の必須翻訳産物活性に影響しない請求項１による使用。
分離手続きがアフィニティクロマトグラフィーか抗体アッセイである請求項１から２の一つによる使用。
溶解物が減少した必須翻訳産物活性を有する請求項１から３の一つによる方法で得られる無細胞タンパク質生合成用溶解物の使用。
アンバーサプレッサー転移ＲＮＡにより天然及び／又は非天然アミノ酸、特にビオチン−リジン、蛍光アミノ酸及び／又はフェニルアラニンがタンパク質に組み込まれる、請求項１の使用。