JP2003102495A - ｉｎｖｉｔｒｏ転写／翻訳系によるペプチド等の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 in vitroのペプチド合成系において生成した
ペプチドを反応系から効率よく、しかも高純度で単離す
ることができるin vitroペプチド合成系の構築を目指す
と共に、反応系におけるエネルギー枯渇の問題を改善
し、効率的な無細胞蛋白合成系の構築を目指した。 【解決手段】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
訳系において、反応系を構成する蛋白質成分の一部又は
全部が相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベル
されており、他方の物質が吸着体として翻訳終了後に該
ラベルされた蛋白質成分を捕捉するために使用されるこ
とを特徴とするin vitro転写／翻訳系によるペプチド又
はペプチド誘導体の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、in vitroでのDNA
からの転写・翻訳系又はRNAからの翻訳系によりペプチ
ド又はペプチド誘導体を製造する方法及び該反応系を構
成するための酵素・因子キットに関わる。

【０００２】

【従来の技術】大腸菌、ウサギの網状赤血球、或いはコ
ムギ胚芽由来の無細胞蛋白合成系は既に知られている(C
urrent Opinion in Biotechnology 9: 534-548 (1998)
、J. Biotechnology 41: 81-90 (1995))。かかる無細
胞系によるペプチドの合成は、数時間でペプチドを合成
することが可能であり、宿主細胞に外来遺伝子を挿入し
て発現させる場合に比べ、短時間でタンパク質の合成が
可能である(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417
(1997), FEBS Letters 414: 268-270 (1997))。その他
にも無細胞系によるペプチドの合成は、少なくとも理論
上は、宿主細胞に外来遺伝子を挿入して発現させる場合
に比べ、数多くの技術的利点が認められ、或いは期待さ
れるに至っている。即ち、宿主細胞由来のプロテアーゼ
による分解を受け得るペプチドや宿種細胞に対して毒性
を有するペプチドの製造、更には、非天然型アミノ酸残
基でチャージされたアミノアシルｔRNAを用いて特定の
位置に非天然型アミノ酸残基を導入することによる、自
然界には存在しないペプチド誘導体の製造 (Annu. Rev.
Biophys. Biomol. Struct. 24: 435-462 (1995))、或
いは、ｍRNA、リボソーム及びペプチドよりなる複合体
（ポリソームディスプレイ）の製造が可能である。な
お、ポリソームディスプレイ及びその利用に関しては、
He M.. et al., J. Immunological Methods 231 (2000)
pp. 105-117、Schaffitzel C., J. Immunological Met
hods 231 (2000) pp. 119-135及びRoberts RW.， Curre
nt Opinion in Chemical Biology 3 (1999) pp. 268-27
3、同9(1998)pp.534−548、就中、pp.543以下に解説が
されている外、FEBS Lett. 450: 105-110 (1999)、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14130-14135 (1998)、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-4942 (1997)等に
記載がされている。

【０００３】当初は、細胞の抽出物そのものを利用して
いたが、反応が不安定であり、ペプチドの合成収量が生
細胞の0.1〜0.01％と低かった。その後、次第に抽出物
中に存在する遺伝子発現に必要な成分が明らかにされる
と共に、不要な成分や阻害物質、例えば、ｍRNAを分解
する内因性のヌクレア−ゼ(RNA 6: 1079-1090 (2000))
が含まれていることが明らかになり、それ等を除去する
試みがなされるようになった。しかし、細胞抽出物をベ
ースとし、そこから不要な成分を除くという従来の方法
では、反応に必要なエネルギーが枯渇し、バッチシステ
ムでのペプチド合成は約1時間で反応が停止してしま
う。その原因として、ヌクレオチド三リン酸の欠乏 (Bi
ochim. Biophys. Acta. 1293: 207-212 (1996) 、 J. B
iotechnol. 48: 1-8 (1996))、内在性の酵素による三リ
ン酸の加水分解物のような小さな副産物の蓄積によるも
の (Biochemistry 22: 346-354 (1983) 、 J. Biol. Ch
em. 260: 15585-15591 (1985)) 、或いは、転写・翻訳
に必要でない因子によるエネルギーの消費 (J. Fermen
t. Bioeng. 84: 7-13 (1997) 、 J. Biotechnol. 61: 1
99-208 (1998))等が挙げられる。

【０００４】転写・翻訳型ペプチド合成系を用いて基質
を連続的に供給する場合、短時間で反応が停止するとい
う問題は回避できるが、その場合においても、再現性に
欠けるという問題があった。この問題は、コムギ胚芽を
用いた系について研究が行われ、胚芽リボソームを不活
性化する物質（tritin）及び翻訳開始反応阻害物質の存
在が突き止められ、これらを胚芽から除去する方法が講
じられることで解決された（Bio Industry Vol.17, No.
5, 20-27(2000)）。しかし、依然として、翻訳に無関係
なエネルギーの消費が非常に大きい。

【０００５】かかる従来法における問題は、細胞抽出物
中には、転写・翻訳に必要でない未知の諸成分が存在
し、それ等を完全に除去することが困難であることに起
因していると考えられた。そこで、翻訳に必須な酵素・
因子だけを用いたインビトロでのペプチド合成の試みが
１９７７年に行われた（The Journal of Biological Ch
emistry Vol.252, No.19, 6889-6894(1997)）。ここで
は、DNAを用いてβ―ガラクトシダーゼを合成するため
に、大腸菌のリボソームに加えて、転写／翻訳のための
因子・酵素として、大腸菌抽出物から精製された次の３
３の成分のみが用いられた：RNAポリメラーゼ、N¹⁰‐フ
ォルミルテトラヒドロ葉酸Met‐tRNA^fトランスフォルミ
ラーゼ、２0種のアミノアシルｔRNAシンテターゼ、IF-
1、IF-2、IF-3、EF-Tu、EF-G、RF-1及び／又はRF-2、CR
P、L及びLα。しかし、当時は翻訳機構に関する情報が
乏しかったこと、そしてペプチドの精製技術が未熟であ
ったために目的物は微量しか得られなかった。

【０００６】その後、Ganozaと彼の共同研究者はあらか
じめチャージされた（活性化されたアミノ酸の結合し
た）アミノアシルtRNAと精製された翻訳因子を用いた
iｎvitroペプチド合成系を構築した（Biochem. Bioph
ys. Res. Commun. 126: 792-798 (1985)）。一方、Pavl
ovと彼の共同研究者は部分精製されたアミノアシルtRNA
シンテターゼ混合液と精製された翻訳因子を用いてin v
itroの翻訳系を構築した（Archives of Biochemistry a
nd Biophysics Vol.328, No.1, 9-16,(1996)）。また、
Pavlovらは人工的に合成した短いmRNAからin vitroで翻
訳する系を全て精製された翻訳因子を用いて構築した
（J. Mol. Biol. 273:389-401(1997)）。しかしなが
ら、本発明者等の知る限りでは、必須酵素と因子だけか
ら成るin vitroペプチド合成系で、自然界に存在するmR
NAからタンパク質が合成されたという報告はない。更
に、従来の細胞抽出物を用いる無細胞ペプチド合成系や
in vitroペプチド合成系では、生成した目的ペプチドを
反応系内に存在する蛋白性成分から単離・精製するため
に煩雑な操作を必要とし、その故に、目的ペプチドの収
率は低いレベルにとどまっていた。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】in vitroのペプチド合
成系において、エネルギー枯渇の問題を改善し、効率的
な蛋白質合成系の構築を目指すと共に、生成したペプチ
ドを反応系から効率よく、しかも高純度で単離すること
ができるin vitroペプチド合成系の提供を目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、in vitroで、
DNAを転写し次いで翻訳する系又はRNAを翻訳する系にお
いて、反応系を構成する蛋白質成分の一部又は全部が相
互に付着し合う関係にある物質の一方でラベルされてお
り、他方の物質が吸着体として翻訳終了後に該ラベルさ
れた蛋白質成分を捕捉するために使用されることを特徴
とするin vitro転写／翻訳系によるペプチド又はペプチ
ド誘導体の製造方法である。ここで、反応系を構成する
蛋白質成分の一部又は全部をラベルする物質とラベルさ
れた蛋白質成分を捕捉するための吸着体として用いられ
る物質との組合せが、当該製法において、複数の異なる
組合せで用いられてもよい。

【０００９】そして、相互に付着し合う関係にある物質
の一方でラベルされている蛋白質成分が、転写／翻訳の
ための因子・酵素の一部又は全部であることことがで
き、具体例として、開始因子、延長因子、終結因子、ア
ミノアシルｔRNAシンテターゼ、メチオニルｔRNAトラン
スフォルミラーゼ及びRNAポリメラーゼを挙げることが
できる。

【００１０】更に、相互に付着し合う関係にある物質の
一方でラベルされている蛋白質成分が、転写／翻訳のた
めの因子・酵素及びそれ等以外の反応系の構成に必要と
される酵素類であって、ここで、転写／翻訳のための因
子・酵素以外の酵素類であって反応系の構成に必要とさ
れる酵素類の具体例として、反応系においてエネルギー
を再生するための酵素及び転写・翻訳で生じる無機ピロ
リン酸の分解のための酵素を挙げることができる。

【００１１】なお、本発明によれば、in vitroでのDNA
転写・翻訳系又はRNA翻訳系において、終結因子を含ま
せないことにより、所望の位置に非天然型アミノ酸残基
が挿入された非天然型ペプチドやポリソームディスプレ
ーといったペプチド誘導体を製造することができる。

【００１２】本発明において、アフィニティークロマト
グラフィーにおける相互作用物質の関係にある物質の組
合せは、蛋白質又はペプチド断片と金属イオンとの組合
せ、抗原と抗体との結組合せ、蛋白質と蛋白質又はペプ
チド断片との組合せ、蛋白質と特定のアミノ酸、ＤＮ
Ａ、色素、ビタミン、レクチン等の低分子化合物との組
合せ、蛋白質と糖との結合、蛋白質又はペプチド断片と
イオン交換樹脂との組合せから選ぶことができ、中で
も、蛋白質又はペプチド断片と金属イオンとの結合性を
利用する、ヒスチジンタグとニッケル錯体やコバルト錯
体等の金属キレートとの組合せが好ましい例である。

【００１３】本発明において使用し得る、相互に付着し
合う関係にある物質は、アフィニティークロマトグラフ
ィーにおける相互作用物質の関係にある物質に限られる
ことなく、例えば、磁力により付着し合う関係にある物
質であってもよい。

【００１４】更に、本発明は、in vitroでのDNA転写・
翻訳系又はRNA翻訳系を構成する蛋白質成分の一部又は
全部であって、相互に付着し合う関係にある物質の一方
でラベルされている蛋白質成分を含むことを特徴とする
in vitro転写／翻訳系によりペプチド又はペプチド誘導
体を製造するための酵素・因子キットである。ここで、
反応系を構成する蛋白質成分は、転写／翻訳のための因
子・酵素及び／又はそれ等以外の酵素類であって反応系
の構成に必要とされる酵素類であり、転写／翻訳のため
の因子・酵素の具体例として、開始因子、延長因子、終
結因子、アミノアシルｔRNAシンテターゼ、メチオニル
ｔRNAトランスフォルミラーゼ及びRNAポリメラーゼを挙
げることができ、転写／翻訳のための因子・酵素以外の
酵素類であって反応系の構成に必要とされる酵素類の具
体例として、反応系においてエネルギーを再生するため
の酵素及び転写・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解の
ための酵素を挙げることができる。そして、本発明の酵
素・因子キットは、相互に付着し合う関係にある物質の
一方でラベルされている蛋白性成分を捕捉するための吸
着体を含むことができる。

【００１５】また、本発明の酵素・因子キットは、反応
系を構成する蛋白質成分の一部又は全部をラベルする物
質とラベルされた蛋白質成分を捕捉するための吸着体と
して用いられる物質との組合せにおいて、異なる組合せ
を含んでいてもよい。

【００１６】本発明は、また、次の発明を含む：(1) in
vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻訳系を構成するた
めの、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベル
されている開始因子。(2) in vitroでのDNA転写・翻訳
系又はRNA翻訳系を構成するための、相互に付着し合う
関係にある物質の一方でラベルされている延長因子。
(3) in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻訳系を構成
するための、相互に付着し合う関係にある物質の一方で
ラベルされている終結因子。(4) in vitroでのDNA転写
・翻訳系又はRNA翻訳系を構成するための、相互に付着
し合う関係にある物質の一方でラベルされているアミノ
アシルｔRNAシンテターゼ。(5) in vitroでのDNA転写・
翻訳系又はRNA翻訳系を構成するための、相互に付着し
合う関係にある物質の一方でラベルされているメチオニ
ルｔRNAトランスフォルミラーゼ。(6)in vitroでのDNA
転写・翻訳系を構成するための、相互に付着し合う関係
にある物質の一方でラベルされているRNAポリメラー
ゼ。(7) in vitroでのDNA転写・翻訳系を構成するため
の、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベルさ
れているT7RNAポリメラーゼ。(8) in vitroでのDNA転写
・翻訳系を構成するための、ヒスチジンタグでラベルさ
れているT7RNAポリメラーゼ。(9) in vitroでのDNA転写
・翻訳系又はRNA翻訳系を構成するための、相互に付着
し合う関係にある物質の一方でラベルされている反応系
においてエネルギーを再生するための酵素。(10) in vi
troでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻訳系を構成するため
の、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベルさ
れている転写・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のた
めの酵素。(11) in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA
翻訳系により製造されたペプチド又はペプチド誘導体を
単離するに当たり、相互に付着し合う関係にある物質の
一方でラベルされている反応系を構成する蛋白質成分を
捕捉するための吸着体。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明におけるin vitroでのDNA
転写・翻訳系又はRNA翻訳系とは、細胞そのものを使用
することなく、DNAからの転写・翻訳、或いは、RNAの翻
訳を行わせるペプチド合成のための反応系である。本発
明にいうペプチドとは、2個以上の天然型または非天然
型アミノ酸がペプチド結合によって結合したものをい
い、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む。更に、ポリ
ペプチドが特定の立体構造をとったタンパク質と呼ばれ
る状態にあるものも含む。本発明にいうRNAは合成され
たRNA及びｍRNAを含み、DNAは、合成されたDNA及びｃDN
Aを含む。

【００１８】本発明におけるin vitroでのDNA転写・翻
訳系又はRNA翻訳系は、原核細胞または真核細胞が備え
ている反応系であり、リボソーム、転写／翻訳のための
因子・酵素、それ等以外に反応系の構成に必要な酵素
類、各種基質、緩衝液及び塩類から構成される。本発明
は、人為的に完全に再構成された反応系において優れた
効果を発揮するが、これら構成要素の幾つかが細胞抽出
液由来の形で加えられた反応系であっても利用可能であ
る。

【００１９】転写／翻訳のための因子・酵素としては、
大腸菌等の原核細胞由来のものに限らず、真核細胞由来
のものも使用でき、（１）RNAの翻訳の場合は、開始因
子、延長因子、終結因子、２０種のアミノアシルｔRNA
シンテターゼ、天然型または非天然型アミノ酸と結合し
たｔRNAであり、大腸菌由来の反応系である場合はメチ
オニルｔRNAトランスフォルミラーゼを含む；（２）DNA
からの転写／翻訳の場合は、（１）に加えてRNAポリメ
ラーゼ、例えば、T７RNAポリメラーゼを含む。なお、上
記（１）及び（２）から終結因子を除くことにより翻訳
反応を制御することが可能である(後述)。

【００２０】転写／翻訳のための因子・酵素以外の酵素
類としては、エネルギーの再生のための酵素、例えば、
クレアチンキナーゼ、ミヨキナーゼ又はヌクレオシドジ
フォスフェートキナーゼ（NDK）、転写・翻訳反応で生
じる無機ピロリン酸の分解のための酵素、例えば、無機
ピロフォスファターゼが挙げられる。

【００２１】各種基質としては、天然型または非天然型
アミノ酸、エネルギー源としてのヌクレオチド三リン
酸、クレアチンフォスフェート及びフォルミル葉酸が挙
げられる。ここで、ヌクレオチド三リン酸には、ATP、G
TP、CTP、UTPが挙げられ、上記（１）の場合は、ATP及び
GTPが用いられ、（２）の場合は、ATP、GTP、CTP及びUT
Pが用いられる。

【００２２】緩衝液としては、リン酸カリウム緩衝液
（ｐH 7.3）が通常使用され、塩類としては、グルタミ
ン酸カリウム、塩化アンモニウム、酢酸マグネシウム、
塩化カルシウム、プトレッシン（putrecine）、スペル
ミジン（spermidine）、ジチオトレイトール(DTT)等が
通常使用される。なお、上記以外にも、適宜選択して使
用できることはいうまでもない。

【００２３】本発明の第1の特徴は、DNAからの転写・翻
訳又はRNAからの翻訳によりin vitroで ペプチドを合成
する系において、反応系を構成する蛋白質成分の一部又
は全部が相互に付着し合う関係にある物質の一方でラベ
ルされており、且つ、合成反応終了後に、他方の物質を
吸着体として用いて、該ラベルされた蛋白質成分を捕捉
することである。かくして、目的生成物であるペプチド
は、容易に反応系を構成する蛋白質成分から分離され、
且つ、極めて高純度で得られる。

【００２４】反応系を構成する蛋白質成分、中でも、転
写／翻訳のための因子・酵素の個々については、その製
造と精製のためにヒスチジンタグを利用することは行わ
れた例がある。例えば、延長因子の、EF-Tuの製造と精
製（Eur. J. Biochem. 210: 177-183 (1992)）、EF-Gの
製造と精製(Cell 92: 131-139 (1998))及びEF-Tsの製造
と精製(Archives of Biochemistry and Biophysics 34
8: 157-162 (1997))、終結因子のRF2の製造と精製(Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8165-8169 (1998))、或
いは、フェニルアラニルtRNAシンテターゼの製造と精製
(Protein Expression and Purification 8: 347-357 (1
996))等においてヒスチジンタグが使用されている。し
かし、これらは、in vitroペプチド合成系の構築が目的
ではなく、それぞれのタンパクの機能や性質を調べるこ
とを目的として製造・精製がされたに過ぎない。

【００２５】従来、遺伝子を大腸菌等で発現させて得ら
れたタンパクを分離する際に、ヒスチジンタグ／ニッケ
ルカラム、グルタチオンS―トランスフェラーゼ／グル
タチオン−セファロース樹脂カラム、エピトープタグ／
抗体等のアフィニティークロマトグラフィー等が利用さ
れてきたが、かかる場合は、目的とするペプチドに吸着
カラムに対し選択的結合能を有する残基を導入してい
た。また、市販されている、細胞抽出液を使用する無細
胞系では、目的とするペプチドにヒスチジンタグを導入
するベクターが用いられている。それ故、生成物はヒス
チジンタグと目的ペプチドとの融合蛋白であり、合成後
にペプチドからヒスチジンタグを酵素により切り離す必
要がある。

【００２６】本発明者等は、従来の方法とは逆に、目的
とするペプチドではなく、in vitroペプチド合成系を構
成する蛋白質成分に、相互に付着し合う関係にある物質
の一方を導入した。これは、転写／翻訳のための因子・
酵素やそれ以外の酵素類を相互に付着し合う関係にある
物質の一方でラベルしても転写／翻訳の反応が進行する
という新たな発見に基づくものである。

【００２７】本発明において使用し得る、相互に付着し
合う関係にある物質の組合せは、転写／翻訳反応を阻害
しないものであれば、何れであっても使用可能である。
相互の付着は可逆的であっても、非可逆的であっても良
いが、反応系を構成する蛋白質成分を繰り返し使用する
ためには、可逆的な付着を行う関係にある物質の組合せ
を用いることが好ましい。

【００２８】相互に付着し合う関係にある物質の組合せ
の例として、吸着カラムと吸着カラムに対し選択的に結
合し得る物質との組合せを挙げることができる。代表的
な例として、アフィニティークロマトグラフィーにおけ
る相互作用物質の関係にある物質群が挙げられる。例え
ば、吸着カラムのリガンドがニッケルやコバルト等の金
属錯体であり、吸着カラムに対し選択的に付着し得る物
質がヒスチジンタグである。これ以外にも、後に詳述す
るように、反応を阻害しない限り、種々のリガンドとこ
れに選択的に吸着し得る物質との組合せを使用すること
ができる。即ち、本発明において、アフィニティークロ
マトグラフィーにおける相互作用物質の関係にある物質
の組合せは、蛋白質又はペプチド断片と金属イオンとの
組合せ、抗原と抗体との組合せ、蛋白質と蛋白質又はペ
プチド断片との組合せ、蛋白質と特定のアミノ酸、ＤＮ
Ａ、色素、ビタミン、レクチン等の低分子化合物との組
合せ、蛋白質と糖との組合せ、蛋白質又はペプチド断片
とイオン交換樹脂との組合せ等から選ぶことができる。

【００２９】本発明において使用し得る、相互に付着し
合う関係にある物質は、アフィニティークロマトグラフ
ィーにおける相互作用物質の関係にある物質に限られる
ことなく、合目的的に選ぶことができ、例えば、磁力に
より付着し合う関係にある物質であってもよい。そのよ
うな例としては、磁気ビーズでラベルされた蛋白質とマ
グネットとの組合せを挙げることができる。即ち、ペプ
チド合成系を構成する蛋白質成分の夫々に磁気ビーズを
結合させ、マグネットで吸着することにより捕捉するこ
とができる。

【００３０】本発明において、吸着体は、必要に応じ、
カラム、マトリックス、フィルター、ビーズ等の形で、
或いは、担体（支持体）に結合させて用いられる。担体
への結合は、吸着体の性質に応じて、既知の手段から適
宜選択して行うことができる。

【００３１】反応系を構成する蛋白質成分の一部又は全
部をラベルする物質とラベルされた蛋白質成分を捕捉す
るための吸着体として用いられる物質との組合せが幾通
りも存在するが、一つの反応系において、それ等の互い
に異なる組合せが用いられてもよい。寧ろ、蛋白質成分
の種類に応じて最適のラベル物質を選び、それに対応す
る吸着体を選ぶことは好ましい態様であると言える。

【００３２】反応系構成成分である転写／翻訳のための
因子・酵素やその他の酵素類を、相互に付着し合う関係
にある物質の一方でラベルしたため、反応系を構成する
各蛋白質成分が高純度の状態で得られ、未知の不要又は
阻害成分が反応系内に持ち込まれることがなくなり、反
応系の構成が確立できるようになった。その結果、反応
効率が大幅に改善された。また、ペプチド合成反応終了
後にこれら反応系構成成分から速やかに目的ペプチドを
分離することが可能となった。従来の無細胞系では反応
産物であるペプチドの方を抽出することによって精製を
行ってきたため、精製方法は反応産物の物理的性質や化
学的性質に応じて個々に工夫しなければならなかった。
本発明は、反応系成分の方を吸着体により除去し、その
結果として反応産物を精製することが出来るため、物理
的・化学的性質にかかわらず理論上全ての反応産物に対
して同一の精製方法が適用できる。しかも、得られる目
的ペプチドの純度は極めて高い。

【００３３】更に、本発明により、反応系成分のコント
ロールが確実に出来るようになった結果、終結因子を含
まない系を確立することができる。このことは、種々の
タイプのポリソームディスプレーを作ることを可能と
し、in vitroペプチド合成系の利用場面を拡大した。即
ち、種々のDNA又はRNAを、終結因子を除いた本発明のin
vitroペプチド合成系において発現させ、ペプチド・RNA
・リボソームの３者複合体（ポリソームディスプレー）
を得ることができる。これを、ペプチドをターゲットに
して他の複合体から分離すれば、目的ペプチドとRNAと
が同時に得られる。これに終結因子を作用させることに
より対応するRNAが得られる。この場合も、相互に付着
し合う関係にある物質の一方でラベルした終結因子を作
用させれば、リボソームから切り離されたペプチド及び
それに対応するRNAを容易に単離することができる。或
いは、例えば、Curent Opinion in Biotechnology 9:53
4-548(1998)に記載されているように、単離されたポリ
ソ−ムディスプレイから、RT−PCR法を適用して対応す
るDNAを得ることができ、また、該ポリソ−ムディスプ
レイをEDTAで分解させることによりRNAを得ることもで
きる。特に、ランダム発現において、選択された目的ペ
プチドに対応するRNA又はDNAの取得が容易となること
は、技術的メリットが高い。従来より、ウサギ網状赤血
球キットを用いた、セミランダムDNA及びRNAの無細胞反
応系における発現が知られているが、その操作は複雑で
ある（特表平５−503000号公報／WO91/05058）。

【００３４】反応系の構成成分を確実に制御できること
は、in vitroペプチド合成系による非天然型アミノ酸残
基を有するペプチドの合成をも可能とした。即ち、本発
明の製造方法において、非天然型アミノ酸残基でチャー
ジされていると共にC末端の終止コドンとは異なった終
止コドンに対応するサプレッサーｔRNAを反応系に加
え、且つ、非天然型アミノ酸残基の導入が所望される個
所に該サプレッサーｔRNAに対応する終止コドンを挿入
することにより改変されたDNA又はRNAを転写／翻訳させ
ることにより、非天然型アミノ酸残基を有するペプチド
を合成することができる。より具体的に説明すれば、次
の通りである。まず、非天然型アミノ酸残基を導入する
ために、オープンリーディングフレーム(ORF)内部の所
望の位置に、終止コドン（UAA, UAG, UGA）のうち、例
えば、UGA又はUAGを挿入し、翻訳の停止のためにはUAA
を用いる。次いで、例えば、UGA及び／又はUAGに対応す
るアンチコドンを有するサプレッサーtRNAをin vitro転
写で作成し、非天然アミノ酸をチャージさせる。このRN
AとサプレッサーtRNAを用いて本発明の製造方法を実行
して、翻訳させれば部位特異的に非天然アミノ酸を挿入
したペプチドを合成することができる。或いは、対応す
るDNAを別途合成して転写・翻訳させることによっても
合成することができる。

【００３５】上記反応系から終結因子を除いた反応系を
用いれば、所望の個所に１又は複数個の非天然型アミノ
酸残基を有するペプチド・ｍRNA・リボソームよりなる
ポリソームディスプレイを得ることができる。前述と同
様に、これに、相互に付着し合う関係にある物質の一方
でラベルした終結因子を作用させれば、リボソームから
切り離されたペプチド及びそれに対応するRNAを容易に
単離することができる。或いは、例えば、Curent Opini
on in Biotechnology 9:534-548(1998)に記載されてい
るように、該ポリソ−ムディスプレイから、RT−PCR法
を適用して対応するDNAを得ることができ、また、該ポ
リソ−ムディスプレイをEDTAで分解させることによりRN
Aを得ることもできる。

【００３６】かくして、本発明の製造方法により製造さ
れるペプチド誘導体には、ポリソ−ムディスプレイや所
望の位置に非天然型アミノ酸残基を有する非天然型ペプ
チドが含まれる。

【００３７】本発明のペプチド又はペプチド誘導体の製
造方法は、常法に従い、バッチ式で行うことができる
外、連続的に基質等を供給し、或いは反応生成物を随時
除去するフロー方式や透析法等、様々な方式で行うこと
ができる（例えば、特公平7−110236号公報、蛋白質 核
酸 酵素Vol.44, No.4, 598-605(1999)、Current Opini
on in Biotechnology 9:534-548(1998) 参照）。

【００３８】以下に、例を挙げて、本発明を更に具体的
に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるもので
はない。

【００３９】（１）本発明により製造することが出来る
ペプチド及びペプチド誘導体 本発明の製造方法によれば、あらゆるタイプの天然型ペ
プチド及び非天然型ペプチドを製造することができ、宿
主細胞内酵素で分解され得るもの、例えば、ジヒドロ葉
酸還元酵素（DHFR）、リゾチーム（λ phage由来）、緑
色蛍光蛋白質(GFP)等も製造することができる外、宿種
細胞に対して毒性を示すものも製造することができる。
ここに、天然型ペプチドとは、遺伝暗号で使われる２０
種の天然アミノ酸よりなるペプチドを言い、それ以外の
αアミノ酸を含むペプチドを非天然型ペプチドと言うこ
とにする。

【００４０】また、本発明の製造方法において、反応系
に終結因子を含ませないことにより、ペプチド・RNA・
リボソームの３者複合体（ポリソームディスプレー）を
容易に得ることができる。

【００４１】本発明の製造方法により製造することがで
きる非天然型ペプチドの例を挙げれば、修飾された天然
アミノ酸、修飾された非荷電アミノ酸、修飾された酸性
アミノ酸、修飾された塩基性アミノ酸、非アルファー型
アミノ酸、Φ、Φ角を変換したアミノ酸、或いは、ニト
ロ、アミジン、ヒドロキシルアミン、キノン、脂肪族化
合物、環状及び不飽和炭化水素残基等から選ばれた官能
基を含むアミノ酸等を有するペプチドを挙げることがで
きる。これ等を、細胞抽出物を用いて無細胞蛋白合成系
で合成する方法は既に知られている（例えば、特表平４
−504651号公報／WO90/05785参照）。非天然型ペプチド
の具体例の一つとして、保護基の付いたシステインが適
当な個所に挿入されたDHFR（自然界には存在しない）を
挙げることができる。更には、p-フルオロフェニルアラ
ニン、p-ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニ
ン等の非天然型アミノ酸残基を所望の位置に導入したペ
プチドを挙げることができる。即ち、これ等3種の非天
然型アミノ酸残基がβ-ラクタマーゼの66番目のフェニ
ルアラニン残基の部位に導入され、充分な酵素活性が見
られたことは既に知られているが（Bio Industry 8: 74
9-759 (1991)）、かかる非天然型ペプチドも本発明の製
造方法により容易に製造することができる。

【００４２】（２）リボソーム リボソームは、ペプチド合成の場であり、mRNAと結合
し、アミノアシルtRNAをA部位に、ホルミルメチオニルt
RNAまたはペプチジルtRNAをP部位に配位してペプチド結
合を形成させる反応を行う(Science 289: 920-930 (200
0))。本発明においては、かかる機能を有するものであ
れば、由来を問わず使用することが可能である。即ち、
通常は、大腸菌由来のリボソームが使用されるが、真核
細胞由来のものも使用できる。本発明において用いられ
るリボソームの好ましい例は、大腸菌由来のものであ
り、例えば大腸菌A19株、MRE600株から得られるものを
挙げることができる。

【００４３】(３) 本発明のin vitroペプチド合成系で
使用される転写／翻訳のための因子・酵素 (３−１) 開始因子 開始因子は、ペプチド合成の過程において、翻訳開始複
合体の形成に必須であるか、又は、これを著しく促進す
る因子であり、大腸菌由来のものとして、IF1、IF2及び
IF3が知られている(Biochemistry 29: 5881-5889 (199
0))。開始因子IF3は、翻訳の開始に必要な段階である、
リボソームの30Sサブユニットと50Sサブユニットへの解
離を促進し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、フォ
ルミルメチオニルtRNA以外のtRNAのP部位への挿入を阻
害する。開始因子IF2は、フォルミルメチオニルtRNAと
結合し、30SリボソームサブユニットのP部位へフォルミ
ルメチオニルtRNAを運び、翻訳開始複合体を形成する。
開始因子IF1は開始因子IF2,IF3の機能を促進する。本発
明において用いられる開始因子の好ましい例は、大腸菌
由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られるも
のを挙げることができるが、真核細胞由来のものも使用
できる。

【００４４】(３−２) 延長因子 延長因子EF-Tuは、GTP型とGDP型の2種類があり、GTP型
はアミノアシルtRNAと結合してこれをリボソームのA部
位へ運ぶ。EF-Tuがリボソームから離れる際にGTPが加水
分解され、GDP型へ転換する。(EMBO J. 17: 7490-7497
(1998))。延長因子EF-Tsは、EF-Tu（GDP型）に結合し、
GTP型への転換を促進する(Archives of Biochemistry
and Biophysics 348: 157-162 (1997))。延長因子EF-G
は、ペプチド鎖伸長過程において、ペプチド結合形成反
応の後の転位（translocation）反応を促進する(Nature
Structural Biology 6: 643-647 (1999), FEMS Microb
iology Reviews 23: 317-333 (1999))。本発明において
用いられる延長因子の好ましい例は、大腸菌由来のもの
であり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げる
ことができるが、真核細胞由来のものも使用できる。

【００４５】(３−３) 終結因子：終結因子は蛋白質合
成の終結、翻訳されたペプチド鎖の解離、さらに次のmR
NAの翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。これ
を含まない反応系でタンパク合成を行った場合は、終始
コドンの手前で反応が止まり、リボソーム・ペプチド・
mRNAの安定な3者複合体（ポリソームディスプレイ）の
形成が容易に行われる。またペプチド鎖への非天然アミ
ノ酸の導入は、RF1, RF2のいずれかを反応系から省くこ
とにより行われる。即ち、RF1を省いた場合はUAGコド
ン、RF2を省いた場合はUGAコドンへの非天然アミノ酸の
導入が高い効率で行なわれる。

【００４６】終結因子RF1及びRF2は、リボソームのA部
位に停止コドン（UAA, UAG, UGA）が来た時、A部位に入
ってぺプチジルtRNA（P部位にある）からのペプチド鎖
の解離を促進する。RF1は停止コドンのうちUAA, UAGを
認識し、RF2はUAA, UGAを認識する。終結因子RF3は、RF
1, RF2によるペプチド鎖の解離反応後の、RF1, RF2のリ
ボソームからの解離を促進する。リボソーム再生因子
（RRF）は、蛋白質合成の停止後、P部位に残っているtR
NAの脱離と、次の蛋白質合成へのリボソームの再生を促
進する。本発明においては、RRFも終結因子の一つとし
て取扱うことにする。なお、終結因子RF1, RF2, RF3及
びRRFの機能については、EMBO J. 16: 4126-4133 (199
7)、EMBO J. 16: 4134-4141 (1997)に解説されている。
本発明において用いられる終結因子の好ましい例は、大
腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られ
るものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも
使用できる。

【００４７】(３−４) アミノアシルｔRNAシンテター
ゼ アミノアシルtRNAシンテターゼは、ATPの存在下でアミ
ノ酸とtRNAを共有結合させ、アミノアシルtRNAを合成す
る酵素である(RNA 3: 954-960 (1997) , 蛋白質 核酸
酵素39: 1215-1225 (1994))。本発明において用いられ
るアミノアシルｔRNAシンテターゼの好ましい例は、大
腸菌由来のものであり、例えば大腸菌K12株から得られ
るものを挙げることができるが、真核細胞由来のものも
使用できる。

【００４８】(３−５) メチオニルｔRNAトランスフォ
ルミラーゼ 原核生物におけるタンパク質合成系においては、メチオ
ニンの端のアミノ基にフォルミル基がついたN-フォルミ
ルメチオニン(fMet)が開始アミノ酸となる。このフォル
ミル基はメチオニルtRNAトランスフォルミラーゼ(MTF)
によりメチオニルtRNAのメチオニンに付加される。即
ち、メチオニルtRNAトランスフォルミラ―ゼは、N¹⁰‐
フォルミルテトラヒドロ葉酸のフォルミル基を、開始コ
ドンに対応するメチオニルtRNAのN末端に転移させ、フ
ォルミルメチオニルtRNAにする(Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 96: 875-880 (1999))。付加されたフォルミル
基は開始因子IF2により認識され、タンパク質合成の開
始シグナルとして作用する。真核生物の細胞質における
合成系にはMTFはないが、真核生物のミトコンドリア及
び葉緑体における合成系には存在する。本発明において
用いられるメチオニルｔRNAトランスフォルミラーゼの
好ましい例は、大腸菌由来のものであり、例えば大腸菌
K12株から得られるものである。

【００４９】(３−６) RNAポリメラーゼ RNAポリメラーゼは、DNA配列をRNAに転写する酵素であ
り、様々な生物に存在することが知られている。その一
例として、T7ファージ由来の、T7RNAポリメラーゼを挙
げることができ、このポリメラーゼはT7プロモーターと
呼ばれる特異的なDNA配列に結合してその下流のDNA配列
をRNAに転写する酵素である。本発明者等は、T7RNAポリ
メラーゼのN末端にヒスタグを付加して、融合タンパク
質として大腸菌BL21株において大量発現を行い、ニッケ
ルカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィーによ
り精製を行った。得られた、ヒスタグ(His‐ta)を有す
るT7RNAポリメラーゼは新規である。本発明において
は、T7RNAポリメラーゼ以外にも種々のRNAポリメラーゼ
を用いることができる。例えば、T3RNAやSP6 RNAポリメ
ラーゼが市販されており、これ等を利用することができ
る。

【００５０】（３−７）非天然型アミノ酸と結合したア
ミノアシルｔRNA 自然界に存在する蛋白質を構成する20種のアミノ酸以外
のアミノ酸残基を蛋白質に導入することにより、本来の
蛋白質が持つ機能を向上させたり、新たな有用な機能や
性質を付加することが出来る。非天然型アミノ酸と結合
したアミノアシルｔRNAは、サプレッサーtRNAの3'末端
のCAが欠けたものをin vitro転写により合成し、これ
に、有機化学的に合成された、非天然アミノ酸を結合し
たアミノアシル−pCpAをRNA ligaseを用いて結合する
ことにより製造される（バイオサイエンスとインダスト
リー 47: 16-24 (1989)）。

【００５１】（４）本発明のin vitroペプチド合成系で
使用される、転写／翻訳のための因子・酵素以外の酵素
類であって反応系の構成に必要とされる酵素類 （４−１）反応系においてエネルギーを再生するための
酵素 クレアチンキナーゼ、ミヨキナーゼ、ヌクレオシドジフ
ォスフェートキナーゼ(NDK)等が挙げられる。クレアチ
ンキナーゼはクレアチンホスホキナーゼ(CPK)とも呼ば
れ、ATPからクレアチンへのリン酸基の転移反応を触媒
する。ミヨキナーゼは、アデニル酸キナーゼとも呼ば
れ、ADPからATPを再生させると同時にAMPを生成させる。
NDKは、ヌクレオシド二リン酸とヌクレオシド三リン酸
の間のγ−リン酸転移を触媒する。本発明において用い
られるこれ等酵素の好ましい例は、大腸菌由来のもので
あり、例えば大腸菌K12株から得られるものを挙げるこ
とができるが、真核細胞由来のものも使用できる。

【００５２】（４−２）転写／翻訳で生じる無機ピロリ
ン酸の分解のための酵素 無機ピロフォスファターゼを挙げることができ、本発明
において用いられる好ましい例は、大腸菌由来のもので
あり、例えば大腸菌K12株から得られるものであるが、
真核細胞由来のものも使用できる。

【００５３】以上、（３）〜（４）に記載した、反応系
の構成要素の内、蛋白質成分は、そのN末端またはC末端
に、下記に詳述する相互に付着する関係にある物質の一
方よりなる物質でラベルされた蛋白質、例えば、ヒスタ
グを結合させた融合蛋白質として、大腸菌、例えば、市
販されている大腸菌BL21株を用いて大量発現させ、他方
の物質を含む吸着体、例えば、fast protein liquid ch
romatography(FPLC)に接続したニッケル固定化カラムを
用いて精製し、反応系に供される。大腸菌以外にも、動
物細胞、酵母、枯草菌等で発現させることも可能であ
り、或いは、in vitroペプチド合成系で生産することも
可能である。

【００５４】(５) 相互に付着し得る関係にある物質に
よるラベルと吸着体 本発明においては、上記(３)〜(４)で説明した反応系を
構成する蛋白質成分の全部または一部を相互に付着し得
る関係にある物質の一方でラベルしておき、他方を吸着
体として用いて該ラベルされた蛋白質成分を捕捉するこ
とにより、反応系で生成した目的ペプチドを単離する。
かかる相互に付着し得る関係にある物質の代表的な例と
して、アフィニティークロマトグラフィーにおける相互
作用物質を挙げることができる。更に、本発明は、アフ
ィニティークロマトグラフィーにおける相互作用物質に
限らず、該蛋白質成分を捕捉するために使用できる相互
に付着し得る関係にある物質であれば、何れの使用も含
む。

【００５５】蛋白質は何らかの物質と特異的な相互作用
をすることによって生理的な役割を果たしている。この
ような蛋白質と特定の物質(リガンド)との特異的な相互
作用(親和性)を利用した吸着クロマトグラフィーをアフ
ィニティ-クロマトグラフィーという。例えば、蛋白質
又はペプチド断片と金属イオン乃至キレート化合物、抗
原と抗体、サイトカインやホルモンと受容体、酵素と基
質やインヒビターは互いに特異的に結合する。更に、特
定のアミノ酸、ＤＮＡ、色素、ビタミン、レクチン等は
これらに親和性を持つ一群のタンパク質と相互に結合す
る。

【００５６】これらの組合せの一方をリガンドとして担
体又は支持体に固定して吸着体とし、そこに他方の物質
でラベルされた物質（本発明においては、反応系を構成
する蛋白質成分）を流すと、ラベル物質がリガンドに特
異的に結合する。この特異的結合に基づくアフィニティ
-クロマトグラフィーは、タンパク質の精製手段として
常用されており、各種の担体が多くのメーカーから販売
されており、利用し易い技術手段である。例えば、抗原
抗体反応を利用する蛋白質の精製手段として、構造が明
らかな抗原決定基(エピトープ)と抗体(エピトープに特
異的な抗体)の組合せが用いられており、種々の組合せ
を実施するために必要なベクターや吸着体が市販されて
いる。本発明の好ましい実施態様においては、かかるア
フィニティ-クロマトグラフィーで用いられている相互
に吸着する関係にある物質の組合せが利用される。本発
明で使用されるラベルされた蛋白質成分を製造する際
に、その精製のために当該ラベル物質が役立つ。しか
し、蛋白質性分を同時に複数種のラベルを付しておき、
製造時の精製のために役立てたラベルを切除し、残りの
ラベルを、in vitro 合成系で生成した目的蛋白質と分
離するために役立てることも可能である。

【００５７】以下に、相互に付着する関係にある物質の
組合せの一部について、具体例を挙げながら本発明の実
施態様を説明するが、もとよりこれらは例示であり、本
発明がこれらに限定されるものではない。

【００５８】(５−１) 蛋白質又はペプチド断片と金属
イオン乃至キレート化合物との結合を利用する方法 Ａ．His tagとニッケル錯体、コバルト錯体等の金属錯
体 His tagとニッケル錯体、コバルト錯体等の金属錯体と
の結合性を利用して蛋白質を精製することは通常行われ
ている。即ち、発現させるDNAにHis tag配列を結合させ
ておき、His tagを有する融合蛋白を得、これをニッケ
ル錯体、コバルト錯体、銅や亜鉛錯体のカラムで捕捉し
精製する方法である。カラムからの溶出はイミダゾール
を含む溶出剤により行うことができる(例えば、羊土社
発行、タンパク質実験ノート(上) 139頁以下、第5章
１．Hisタグタンパク質の発現と精製(安光、和久井)、
J. A. Bornhorst and J. J. Falke, Purification of P
roteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods
in Enzymology 326:245-254, (2000)、その他にも、Pr
oteins 41:144-53 (2000)、FEMS Microbiol. Lett. 18
8:147-51 (2000)、J. Bacteriol. 182: 4304-9 (2000)
参照)。本発明において、かかる組合せを用いることが
できる。

【００５９】His tagが付された蛋白質成分をコードす
る遺伝子を発現させる場合に、大腸菌(M.W.Van Dyke,
M.Sirito, and M.Sawadogo, Gene 111:95, 1992), Sacc
haromyces cerevisiae (D.C.Kaslow and J.Shiloach, B
io/Technology 12:494, 1994), mammalian cell (R.Jan
knecht and A.Nordheim, Gene 121:321, 1992), バキュ
ロウイルスが感染した昆虫細胞 (A.Kuusinen, M.Arvol
a, C.Oker-Blom, and K.Keinanen, Eur. J. Biochem. 2
33:720, 1995)等の使用例が知られており、適宜使用で
きる。

【００６０】一例として、His tagとニッケルカラムを
利用した、His tagを付したタンパク質成分の精製方法
の概略を示せば次の通りである。これ以外にも様々なヴ
ァリエーションが知られており、適宜選択して使用でき
る。 １．遺伝子工学的手法により、目的タンパク質のN末にH
is tag（6個のHisよりなる）を結合させた融合タンパク
質を得る。 ２．タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中
で超音波処理し、ローディングバッファー（300 mM NaC
l, 50 mM NaH₂PO₄, pH 8.0）に懸濁させる。 ３．細胞の溶解物を遠心分離する（30,000 g、4℃で30
分間）。 ４．上記で得られた上清に、氷で冷やしたローディング
バッファーの中で平衡化した50%のNi²⁺-NTA slurry (Qi
agen社製)を加える。4℃で1時間撹拌する。 ５．樹脂をカラムにロードし、カラム容量の20倍のロー
ディングバッファーで、４℃でカラムの洗浄を行う。 ６．カラム容量の20倍のローディングバッファー（10 m
M imidazole, pH 8.0を含む）で、４℃でカラムの洗浄
を行う。 ７．カラム容量の20倍のローディングバッファーを用い
て、imidazoleの濃度勾配を10から250 mMになるように
設定し、カラムから目的タンパク質の溶出を行わせ、1
mlずつフラクションを集める。SDS-PAGEで目的タンパク
質を確認する。

【００６１】Ｂ．Thioredoxin とphenylarsine oxide
(PAO) thioredoxin とPAO との結合性を利用する方法であり、
目的タンパク質をthioredoxinとの融合タンパク質と
し、PAO 固定化アガロース（Invtrogen社製ThioBond^TM
resin）に吸着させ、β-mercaptoehtanol（β-ME）で溶
出させる(A. Alejo, R. J. Yanez, J. M. Rodriguez,
E. Vinuela, and M. L. Salas, African Swine Fever V
irus trans-Prenyltransferase. The Journal of Biolo
gical Chemistry 272: 9417-9423, 1997参照)。本発明
においても、この方法を利用することができる。

【００６２】以下に、この方法による蛋白質の精製例を
示す。 1. 形質転換体(E. coli／ベクター pTrxFus（Invitrog
en社製）)の終夜培養液を２０倍希釈になるように100
μg/mlのアンピシリン（終濃度）を含むRM培地（0.6 %
Na₂HPO₄, 0.3 % KH₂PO₄, 0.05 % NaCl, 0.1 % NH₄Cl
, 2 %Casamino Acids, 0.0095 % MgCl₂）に加え、３
０℃で培養する。 2. A₅₅₀=0.5になるまで培養を続け、融合タンパク質の
発現を誘導させるために、100 μg/ml tryptophan（終
濃度）を加え、３４℃でさらに２時間培養する。 3. 遠心分離で菌体を集め、菌体ペレットを5 mlのRunni
ng Buffer [100 mM Tris-HCl (pH 7), 150 mM NaCl, 1
mM EDTA, 1 mM β-mercaptoethanol] に懸濁し、超音波
処理により細胞を破砕する。 4. 細胞懸濁液を遠心分離（10,000 g, １５分間）し、
上清を集める。 5. 上清に含まれる融合タンパク質を2 mlのThioBond^TM
resinに結合させるために、４℃で６０分間インキュベ
ーションする。 6. スラリーをカラムに充填し、カラムの３０倍ベット
ボリュームのRunningBuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7),
150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM β-mercaptoethanol]
で洗浄する。 7. β-mercaptoethanolの濃度勾配により、Running Buf
ferで目的タンパク質を溶出させる。

【００６３】(５−２) 抗原又は抗原断片（エピトープ
タグ）と抗体の結合性を利用する方法 Ａ． T7-tagとT7-tagに特異的なモノクローナル抗体 T7-Tag とは、phage T7由来のgene 10に存在する11個の
アミノ酸配列をいい、これに対する抗体との組合せが、
タンパク質の精製手段として採用されている。即ち、目
的タンパク質の発現に先立ち、遺伝子にT7-Tagをコード
するDNA配列を結合して発現させ、生成したT7-Tag 融合
タンパク質をT7-tagに特異的なモノクローナル抗体を吸
着体として用いて捕捉することで精製する方法である。
吸着体は、例えば、T7-Tag Antibody Agarose (Novagen
社製)が市販されている。溶出にはcitric acid が用い
られる。本発明において、かかる組合せを用いることが
できる。なお、R. Deora, T. Tseng, and T. K. Misra,
Alternative Transcription Factor σ^SB of Staphylo
coccus aureus: Characterization and Role in Transc
ription of the Global Regulatory Locus sar. Journa
l of Bacteriology179:6355-6359, 1997参照。

【００６４】一例として、T7-tagを付したタンパク質成
分の精製方法の概略を示せば次の通りである。これ以外
にも様々なヴァリエーションが知られており、適宜選択
して使用できる。 １．20 μg/mlのクロラムフェニコールと30 μg/mlのカ
ナマイシンを含んだ2xYT培地 [1.6 % Bact Trypton, 1
% yeast extract, 0.5 % NaCl, 0.4 % glucose] で形質
転換体（E. coli／ベクターpET（Novagen社製）)を培養
する。 ２．細胞の懸濁度がA₆₀₀＝0.6になるまで培養し、目的
タンパク質の発現を誘導させるためにIPTGを加え、さら
に2時間培養する。 3. 遠心分離で菌体を集め、10 mlのice-cold T7-Tag B
ind/Wash緩衝液 [4.29mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄, 2.
7 mM KCl, 137 mM NaCl, 1 % Tween-2 0, 0.02 % sodi
um azide (pH 7.3)] に菌体ペレットを懸濁する。 4.. 氷中で細胞懸濁液を超音波処理し、粘性がなくな
るで、細胞を破砕する。 5. 遠心分離（39,000 g, 20分間）で細胞小片を除き、
得られた上清を0.45 μm膜でフィルターろ過する。 6. T7-Tag Bind/Wash緩衝液で平衡化したT7-Tag Antib
ody Agaroseカラム(Novagen社製)に細胞抽出液を供し、
同緩衝液でカラムを洗浄し、非特異的に結合したタンパ
ク質を除く。 7. 溶出緩衝液 [0.1 M citric acid (pH 2.2)] で目的
タンパク質を溶出する。

【００６５】Ｂ．FLAGペプチドtag(シグマ社商品名) と
anti-FLAG antibody(シグマ社商品名)との結合性を利用
する方法 FLAGペプチドtag(シグマ社商品名／以下同)は、８個の
アミノ酸からなるペプチドであり、所謂、エピトープタ
グとして、それに対する抗体と共に蛋白質の精製に利用
されている。即ち、N末位にFLAGペプチドtagをもつタン
パク質を構築し、FALG antibody カラムで捕捉する。溶
出はFLAG peptideで行う。なお、P. J.Woodring and J.
C. Garrison, Expression, Purification, and Regula
tion ofTwo Isoforms of the Inositol 1,4,5-Trisphos
phate 3-Kinase. The Journalof Biological Chemistry
272: 30447-30454, 1997参照。

【００６６】下記に、方法の概略を示すが、これ以外に
も適宜変更することが可能である。 １．目的タンパク質が発現した細胞(ホスト：B31 cell
(Rat-1 fibroblast cell line)、ベクター：pDouble-Tr
ouble (pDT) mammalian 発現ベクター)を遠心分離で集
め、プロテアーゼ阻害剤（10 μg/ml calpain inhibito
rs I and II, 100μg/ml Pefabloc, 2.5 μg/ml leup
eptin, 2μg/ml aprotinin, 2 μg/ml bacitracin, 2
0μg/ml benzamidine）の入った8 mlの低張性リシス緩
衝液(hypotonic lysis buffer)でホモジナイズする。 ２．遠心分離（2,000 g）で細胞小片や核酸を取り除
き、上清を集める。 ３．さらに遠心分離し、得られた細胞抽出液を1 mlのFL
AG antibody カラムに供し、35 mlのTBSC [50 mM Tris-
HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1 % (v/v) CHAPS] でカ
ラムを洗浄する。 ４．200μg/mlのFLAG peptideを含んだ5 mlのTBSCで目
的タンパク質を溶出する。

【００６７】Ｃ．Protein A と IgG Staphylococal Protein A (SPA)とその抗体IgG との結
合性を利用する方法であり、目的タンパク質をSPAとの
融合蛋白とし、IgG Sepharoseカラムで捕捉する。溶出
は低pH 緩衝液で行う。なお、B. Nilsson and L. Abrah
msen, Fusion toStaphylococcal Protein A. Methods i
n Enzymology 185: 144-161, 1990参照。

【００６８】下記に、方法の概略を示すが、これ以外に
も適宜変更することが可能である。 1. 形質転換体(ホスト：E. coliあるいはS. aureus、ベ
クター：pRIT20ある いはpRIT30シリーズ)の終夜培養
液を終濃度が１％になるように、25 mlのLB 培地（LB
培地 + 0.1 % (w/v) glucose, 250 mg/l ampicillin）
に加え、37℃ で4時間培養する。 2. 遠心分離（10,000 g, 5℃で20分間）で菌体を集め、
上清を0.45 μm膜の フィルターでろ過する。 3. TST [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.05
% (v/v) Tween 20] で平衡化した5 mlのIgG Sepharose
カラムに供する。 4. カラムを15 mlのTSTで2回、さらに5 mlの1 mM ammon
ium acetateで洗浄 する。 5. 1 mlの0.5 M ammonium acetate (pH 3.3) で目的タ
ンパク質を溶出する。

【００６９】Ｄ．蛋白質とMonoclonal antibody Bovin Retina（網膜）由来の蛋白質Cyclic nucleotide-
gated (CNG) channelをモノクローナル抗体PMc 6E7(α
サブユニットのN末領域；63- kDa polypeptide)を用い
て精製する方法が知られている(R. S. Molday and L.
L. Molday, Purification, Characterization, and Rec
onstitution of Cyclic Nucleotide- Gated Channels.
Methods in Enzymology 294: 246-260, 1999参照)。吸
着体としてモノクローナル抗体を定着させたSepharose
2B(ファルマシア社製)が用いられ、目的タンパク質の溶
出には、6E7 competing peptide（モノクローナル抗体
と競合的に結合するペプチドで、Ser- Asn- Lys- Glu-
Gln- Glu- Pro- Lys- Glu- Lys- Lys- Lys- Lys- Lysな
るアミノ酸配列を有する）が用いられる。本発明におい
ても、この組合せを利用することが可能である。

【００７０】以下に、Bovin Retina（網膜）由来の蛋白
質をモノクローナル抗体により精製する方法を示す。 1.Bovin Retinaのホモジネートから、30-50 % (w/v) の
ショ糖密度勾配遠心分離[20 mM Tris-acetate (pH 7.
4), 10 mM glucose, 1 mM MgCl₂; 82,500 g, 4℃で45分
間] により、rod outer segment(ROS)画分を集めた。 2.ROS画分を5容量のHomogenizing Buffer [20 % (w/v)
sucrose, 20 mM Tris-acetate (pH 7.4), 10 mM glucos
e, 1 mM MgCl₂] に希釈し、遠心分離する （20,000 g,
4℃で20分間）。 3.ROSペレットを8 mlのHomogenizing Bufferに再懸濁
し、ROS粗抽出物とする。 4.ROSを10容量のHypotonic Lysis Buffer [10 mM HEPES
- KOH (pH 7.4), 1 mMEDTA, 1 mM DTT] に懸濁し、遠心
分離（20,000 g, 10分間）する。 5.膜ペレットを同上Bufferに懸濁し、洗浄操作をさらに
2回繰り返す。 6.ペレットを10 mM HEPES- KOH (pH 7.4) に懸濁する。 7.ROS膜をCHAPS (3 - [3- (Cholamidopropyl) dimethyl
ammonio] -1- propanesulfonate) Solubilization Buff
er [10 mM HEPES- KOH (pH 7.4), 10 mM CaCl₂, 0.15 M
KCl, 18 mM CHAPS, 2 mg/ml asolectin (soybean phos
phatidylcholine, type IV-S; Sigma) protease inhibi
tor (0.1 mM diisoprophylfluorophosphate, 5 μg/ml
aproteinin, 1 μg/ml leupeptin, 2 μg/ml pepst at
in or 20 μM Pefabloc SC)] に加え、ゆっくりと撹拌
する。 8.遠心分離（27,000 g, 4℃で30分間）で細胞小片を除
く。 9.PMc 6E7(抗体)を固定化したSepharose 2Bカラムに20
mlの可溶化したROS膜を供し、10容量のCHAPS Column Bu
ffer [10 mM HEPES- KOH (pH 7.4), 1 mM CaCl₂, 0.15
M KCl, 12 mM CHAPS, 2 mg/ml asolectin] で洗浄す
る。 10.0.1 mg/ml 6E7 competing peptideを含んだCHAPS Co
lumn Bufferで目的タンパク質を溶出する。

【００７１】(５−３) 蛋白質と蛋白質又はペプチド断
片との結合性を利用する方法 Ａ．Strep-TagとStreptavidin、 Strep-Tag (Streptavidinに親和性をもつオリゴペプチ
ド)を付加したタンパク質をstreptavidin-agarose colu
munでアフィニティ精製する方法は知られている(例え
ば、A. Skerra and T. G. Schmidt, Use of the Strep-
Tag and Streptavidin for Detection and Purificatio
n of Recombinant Proteins. Methods in Enzymology 3
26: 271-311(2000)、BioTechniques 28: 338-344 (200
0)参照)。本発明において、かかる組合せを用いること
ができる。

【００７２】Strep-TagとStreptavidinとの結合性を利
用するタンパク質の精製法であり、Strep-Tagとして、A
la-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly、Asn-Trp-Ser-Hi
s-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (Strep-tag II )等が使用され
る。Strep-Tagを付した蛋白質、例えばDHFR(ジヒドロ葉
酸還元酵素)を無細胞系で合成し、固定化したStreptavi
din或いはStrepTactinに吸着させることにより精製され
る。溶出剤としてはdesthiobiotinが用いられる。

【００７３】Strep-TagとStreptavidinによる、Strep-T
agを付した蛋白質成分の製法の一例を示せば次の通りで
ある。これ以外にも様々なヴァリエーションが知られて
おり、適宜選択して使用できる。 １．E.coli形質転換体(pASK-IBAベクター使用)の終夜培
養液を2リットルの新しいLB培地（終濃度100 μg/mlの
アンピシリンを含む）に加え、OD₅₅₀=0.5になるように2
2℃で振とう（200 rpm）培養する。 ２．遺伝子の発現を誘導させるために、培養液に2 mg/m
l濃度のanhydrotetracycline−dimethylformamide(DMF)
溶液200 μlを加え、さらに3時間インキュベートする。 ３．遠心分離（4,200 g、4℃で12分間）で菌体を集め、
20 mlの緩衝液P [100 mM Tris-Cl (pH 8.0), 500 mM s
ucrose, 1mM Na₂EDTA]に懸濁し、氷上で30 分間インキ
ュベートした。 ４．遠心分離（27,000 g、4℃で15分間）によりスフェ
ロプラストを除いた。 ５．得られたペリプラズマ画分を2 lの緩衝液W [100 mM
Tris-Cl (pH 8.0), 1mM Na₂EDTA]で一晩透析する。 ６． 2 mlのStrepTactin Sepharoseカラムを緩衝液Wで
平衡化し、ペリスタポンプ、UV検出器（A₂₈₀）、フラク
ションコレクターが付属しているシステム を用いて、
タンパク質溶液をカラムに供する。 ７．A₂₈₀の値がベースラインになるまで、緩衝液Wでカ
ラムを洗浄する。 ８．目的タンパク質を2.5 mM desthiobiotinを含む緩衝
液Wで溶出した。

【００７４】Ｂ．S-peptideとS-protein リボヌクレア−ゼＳの蛋白部分(S-protein)とペプチド
部分(Sペプチド)とは、可逆的に強い結合性を示すこと
が知られており、その結合性を利用してタンパク質の精
製が行われる。即ち、目的タンパク質をS-tag(Sペプチ
ド)を有するタンパク質をとし、固定化S-proteinアガロ
ースで捕捉することができる。溶出は、3Mguanidinium
thiocyanate; 0.2 M potassium citrate buffer, pH 2;
3 M MgCl₂等によりS-tagとS-proteinの結合を切断する
ことにより行われる(R. T. Raines,M. McCormick, T.
R. V. Oosbree, R. C. Mierendorf, The S・Tag Fusion
System for Protein Purification. Methods in Enzym
ology 326:362-376, 2000参照)。

【００７５】下記に方法の概略を示すが、これ以外にも
適宜変更が可能である。 １．目的タンパク質を発現した細胞(ホスト：bacteria,
insect, mammalian、ベクター：pET, pBAC（Novagen
社）)の抽出液にS-proteinアガロース（No vagen）の
スラリー2 mlを加え、室温で30分間十分に撹拌する。 ２．遠心分離（500 g, 10分間）し、上清を除く。 ３．目的タンパク質が結合したS-proteinアガロースをB
ind/Wash緩衝液 [20 mMTris-HCl (pH 7.5), 0.15 M NaC
l, 0.1 % (v/v) Triton X-100] に懸濁する。 ４．遠心分離(500 g、 １０分間)後，上清を除き，非特
異的に結合したタンパク質を除く。 ５．S-proteinアガロースのスラリーを1.5容量の溶出緩
衝液 [bind/wash buffer + 3 M guanidinium thiocyana
te, 0.2 M potassium citrate (pH 2), or 3M MgCl₂]
に懸濁する。 ６．時々撹拌し、常に懸濁した状態を維持しながら、室
温で10分間インキュベートする。 ７．遠心分離後、溶出された目的タンパク質を集める。

【００７６】Ｃ．Calmodulin-Binding Peptide (CBP)と
Calmodulin (CaM)) Calmodulin-Binding Peptide (CBP)とCalmodulin (Ca
M))との相互作用を利用するタンパク質の精製法である
(P. Vaillancourt, Chao-Feng Zheng, D. Q. Hoang, an
d L. Breister, Affinity Purification of Recombinan
t Proteins Fusedto Calmodulin or to Calmodulin-Bin
ding Peptides. Methods in Enzymology326: 340-362(
2000)参照)。本発明において、かかる組合せを用いるこ
とができる。

【００７７】.蛋白質性成分にCBPが結合したCBP融合タ
ンパク質を製造し、Sepharose 4B-based CaM affinity
樹脂、その他市販のCaM樹脂に吸着させ、精製する。溶
出にはEGTA（Ca²⁺とキレートを形成する）が用いられ
る。

【００７８】CBPとCaMによる、CBP融合タンパク質の製
法の一例を示す。これ以外にも種々のヴァリエーション
があり、適宜選択して使用できる。 １．20 mlの形質転換体(ベクターとしてpET-11を基盤と
して構築されたpCAシリーズを使用)の終夜培養液を50
μg/mlのアンピシリンあるいはcarbenicil linを含む1
lのLB培地に加え、OD₆₀₀=0.6〜1.0になるまで培養す
る。終濃 度が1mMになるようにIPTGを加え、さらに３
〜５時間振とう培養する。 ２．菌体を遠心分離で集め、0.2 mg/ml lysozymeを含む
緩衝液A [50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10
mM 2-mercapto-ethanol, 1 mM magnesium acetate, 1 m
M imidazole, 2 mM CaCl₂] に細胞ペレットを懸濁し、
超音波で細胞を破砕する。 ３．細胞溶解物を遠心分離（25,000 g、１５分間）し、
上清を集める。 ４．10 mlのCaM-Sepharose樹脂を緩衝液Aで平衡化す
る。 ５．CaM-Sepharose樹脂と細胞溶解物を混合し、穏やか
に１時間撹拌する。非特異的結合物質は、低速遠心後ス
ラリーを除くことにより除去する。 ６．40 mlの緩衝液Aで洗浄し、20〜30 mlの緩衝液Aに再
懸濁し、カラムに充 填する。さらに、カラムの５倍ベ
ッドボリュームの緩衝液A、続いて緩衝液B [50mM Tri
s-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 10 mM 2-mercapto-etha
nol, 1 mM magnesium acetate, 1 mM imidazole, 0.1
mM CaCl₂] でUV検出器のA₂₈₀の 値がベースラインに
なるまで洗浄する。 ７．２mMEGTAを含む緩衝液Bで目的タンパク質を溶出さ
せる。

【００７９】Ｄ．HSA とABP Human Serum Albumin(HAS)とSerum Albumin Binding Af
finity Handle (ABP)との結合性を利用して蛋白質を精
製する方法が報告されている( T. Graslund, J. Nilsso
n, A. M. Lindberg, M. Uhlen, and Per-Ake Nygren, P
roduction of aThermostable DNA Polymerase by Site-
Specific Cleavage of A Heat- Eluted Affinity Fusi
on Protein. Protein Expression and Purification 9:
125-132, 1997参照)。目的タンパク質をSerum Albumin
Binding Affinity Handle (ABP) との融合タンパク質
の形で発現させ、これをHSA-Sepharoseカラムで捕捉
し、低pH緩衝液で溶出させる方法である。本発明におい
ても、この組合せを利用することができる。

【００８０】以下に本方法によるタンパク質の精製方法
の概要を示す。 1.形質転換体(ホスト：E. coli、ベクター：pET-21a (N
ovagen))の終夜培養液5 mlを500 mlのTSB + YE培地（30
g/l tryptic soy broth, 5 g/l yeast extract, 100 m
g/l ampicillin, 34 mg/l chloramphenicol）に加え、O
D₆₀₀= 0. 8− 1.5になるまで振とう培養する。 2.融合タンパク質の発現を誘導させるために、1 mM iso
propyl β-D-thiogalactoside（終濃度）を加え、さら
に３〜5時間培養する。 3.遠心分離で菌体を集め、菌体ペレットをTST [50 mM T
ris-HCl (pH 8.0), 0.2M NaCl, 0.05 % Tween 20, 1 mM
EDTA] に懸濁し、超音波処理で菌体を破砕する。 4.破砕された細胞懸濁液を遠心分離（20,000 g, 30分
間）し、得られた上清を1.2−μm hydrophilic filter
でろ過する。 5.細胞抽出液をHSA-Sepharoseカラムに供する。 6.目的タンパク質を0.5 M HAc (pH 2.8) 溶液で溶出さ
せる。

【００８１】(５−４) 蛋白質と特定のアミノ酸、DN
A、色素、ビタミン、レクチン等の低分子化合物との結
合性を利用する方法 Ａ．グルタチオン−S−トランスフェラーゼ (GST)とグ
ルタチオン、 GSTとグルタチオンとの相互作用を利用して蛋白質を精
製する方法は、GST pull down methodと呼ばれ、通常行
われている(例えば、羊土社発行、タンパク質実験ノー
ト(上) 162頁以下、第5章 ２．GST融合タンパク質の発
現と精製(末武)、D. B. Smith, Generating Fusions to
Glutathione S-Transferase for ProteinStudies. Met
hods in Enzymology 326:254-270, (2000)参照)。本発
明において、かかる組合せを用いることができる。

【００８２】目的タンパク質とGSTとの融合タンパク質
を製造し、グルタチオン(glutathione-agarose)を吸着
体として用いるタンパク質の精製方法である。溶出剤と
しては還元型グルタチオンが用いられる。GST融合タン
パク質を遺伝子工学的手法で製造する場合、E. coli, S
accharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe
等を宿主細胞として使用する例が知られている。

【００８３】GSTとグルタチオンによる、GST融合タンパ
ク質の製造方法の一例について、その概略を示せば次の
通りである。これ以外にも様々なヴァリエーションが知
られており、適宜選択して使用できる。 １．100 mlの形質転換体終夜培養液を1 lのL培地（100
μg/mlアンピシリンを含む）で希釈し、培養する。 ２．遠心分離（5000 g）により集めた細胞のペレットを
20 mlのice-coldのPBS（還元剤を加えたもの。例えば、
1-5 mM dithiothreitol(DTT)あるいは0.1% 2-mercaptoe
thanol）に懸濁する。 ３．泡立たないように細胞懸濁液を氷上で超音波処理す
る。約5分間で懸濁液がくすんだ灰色になるような強度
に調整する。 ４．終濃度が１％になるようにTriton X-100を加え遠心
分離する（10,000 g、4℃、5分間）。上清を50 mlのチ
ューブに移し、これに予め膨潤させておいた1 mlの50%
グルタチオン−アガロース ビーズを加え、時々反転し
て撹拌しながら、4℃で30分間インキュベートする。 ５．遠心分離（500 g、30分）でビーズを集め、50 mlの
ice-coldのPBSで3回 洗浄する。 ６．等量の新しく調整した50 mMのTris-HCl (10 mM還元
状態のグルタチオン含、pH 8) でビーズを室温で5分間
緩やかに撹拌しながら、融合タンパク質を溶出する。 ７.遠心分離（500 g、30秒）で上清を集め、終濃度が10
%になるようにグリセロールを加え、小分けした後−80
℃で保存する。

【００８４】Ｂ．蛋白質とDye-Ligand Zymononas mobilis由来のnative蛋白質が、特定の色
素、C.I. 17908, Reactive Red 8やC.I. Reactive Blue
187に親和性を有し、その性質を利用して該蛋白質を精
製する方法が報告されている(R. K. Scopes and K. Gri
ffiths-Smith, Use of Differential Dye-Ligand Chrom
atography with Affinity Elution for Enzyme Purific
ation: 6-Phosphogluconate Dehydratase from Zymonon
as mobilis. Analytical Biochemistry 136: 530-534,
1984参照)。従って、該蛋白質の全部又は一部で、目的
タンパク質をラベルし、上記色素をリガンドとしたSeph
aroseカラムに吸着させ、アフィニティー溶出させるこ
とにより目的タンパク質の精製が可能である。

【００８５】下記に、Z. mobilis由来の蛋白質の精製法
を示す。 １．Z. mobilisの培養液から、Extraction Bufer [20 m
M K-Mes (pH 6.5), 30 mM NaCl, 5 mM MnCl₂, 0.5 mM a
mmonium ferrous sulfate, 10 mM β-merca ptoethano
l] を用いて、細胞抽出液を調整する。 ２．細胞抽出液をScarlet MX-G (C.I. 17908, Reactive
Red 8) − Sepharose CL-4Bカラム(ファルマシア社製)
とBlue HE-G (C.I. Reactive Blue 187) − Sepharose
CL-4Bカラムに連続して供する。 ３．100 mlのExtraction Bufferでカラムを洗浄する。 ４．Scarlet MX-Gカラムのみを除いて、Blue HE-Gカラ
ムを20 mM Na₂So₄を含んだ同上Bufferでさらに洗浄す
る。 ５．20 mM DL-α-glycerophosphateでZ. mobilis由来の
目的タンパク質を溶出する。

【００８６】Ｃ．Biotin とAvidinの結合性を利用する
方法 ビオチン(Biotin)とアビジン(Avidin)との特異的結合を
利用して蛋白質を精製する方法は古くから知られてい
る。例えば、J. D. Alche, and H. Dickinson, Affinit
y Chromatographic Purification of Antibodies to a
Biotinylated Fusion Protein Expression in Escheric
hia coli. Protein Expression and Purification 12:1
38-143, 1998参照。宿主細胞(例えば、E.coli)中でビオ
チン化される配列（122アミノ酸）を用いて、ビオチン
と目的タンパク質との融合タンパク質をつくり、これを
アビジンを固定したカラム、例えば、SoftLink soft re
lease avidin resin（Promega社製）で捕捉し、biotin
で競合的に溶出させる。本発明においても、この組合せ
を利用することができる。

【００８７】1.遺伝子の発現を誘導させるため、形質転
換体(ホスト：E. coli、ベクター：PinPoint Xa-2（Pro
mega社製）)の終夜培養液に1 mM IPTG（終濃度）を加
え、さらに5時間培養する。発現したタンパク質が細胞
内に存在する場合、以 下のように処理する。 2.1 gの細胞ペレットに対し、10 mlの緩衝液 [50 mM Tr
in-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0.1 mM PMS
F, 1 mg/ml lysozyme] で細胞を溶解する。 3.遠心分離（18,000 g, 15分間）で目的タンパク質を含
む沈殿物を集め、緩衝液[50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 m
M EDTA, 50 mM NaCl, 0.5 % Triron X-100, 0.1 mM PMS
F] に懸濁し2回洗浄する。 4.遠心分離（18,000 g, 15分間）後、得られたペレット
を可溶化緩衝液 [50 mMTris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA,
50 mM NaCl, 0.5 % Triton X-100, 0.1 mM PMSF, 6 M g
uanidine-HCl] に懸濁する。 5.30 mlの可溶化緩衝液で平衡化した、3 mlのSoftLink
soft release avidin resin（Promega）カラムに、細胞
抽出液を供し、60 mlの可溶化緩衝液で洗浄する。 6.ビオチン化された目的タンパク質を5 mM biotinを含
む可溶化溶液で溶出させる。

【００８８】(５−５) 蛋白質と糖との結合性を利用す
る方法 糖結合性蛋白と糖との相互作用を利用して蛋白質を精製
する方法であり、例えば、マルトース結合タンパク（MB
P）とアミロース(D. Sachdev and J. M. Chirgwin, Fus
ions to Maltose-Binding Protein: Control of Foldin
g and Solubility in Protein Purification. Methods
in Enzymology 326: 312-321(2000).)が知られており、
他にも、ガレクチンの如きβ―ガラクトース結合蛋白質
とβ―ガラクト−スとの相互作用を利用する方法等が考
えられる。本発明において、かかる組合せを用いること
ができる。

【００８９】Ａ．Maltose-Binding Proteinとアミロー
ス Maltose-Binding Protein融合タンパク質を固定化した
アミロース樹脂に吸着させる方法においては、溶出剤と
してMaltoseが用いられる。Maltose-Binding Protein融
合タンパク質の製法の一例を示せば次の通りである。こ
れ以外にも様々なヴァリエーションが知られており、適
宜選択して使用できる。 １．2 mlの形質転換体(E. coli／ベクターはpMAL-c2 (N
ew England Biolabs製))の終夜培養液を225 mlの100 μ
g/mlのアンピシリンを含むLBD培地(0.2 % glucoseを含
むLB培地)に加え、OD₆₀₀=0.5になるまで37℃で振とう培
養する。 ２．遺伝子の発現を誘導するために、0.3 mM isopropyl
-β-thiogalacto−pyranoside (IPTG)を加え、30℃でさ
らに2〜3時間培養する。 ３．遠心分離（6,800 g、5分間）で菌体を集め、細胞の
ペレットを10 mlのカラム緩衝液 [20 mM Tris (pH 7.
4), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.02 % Tween 80] に懸
濁後、−20℃で一晩凍結させる。 ４．凍結した細胞懸濁液を氷の入った水中で融解させ、
10 mlのカラム緩衝液で希釈する。超音波処理（最大値
の75%強度）をして、細胞を破砕する。 ５．遠心分離（20,000 g、4℃で15分間）後、上清にさ
らに10 mlのカラム緩衝液を加え希釈する（粗抽出
液）。 ６．10 mlのアミロース樹脂カラムに粗抽出液を供す
る。 ７．カラムを20〜30 mlのカラム緩衝液で数回洗浄後、1
0 mM maltoseを含むカラム緩衝液で目的タンパク質を溶
出させる。

【００９０】Ｂ． Chitin とChitin Binding Domain (C
BD) ChitinとChitin Binding Domain (CBD)との結合性を利
用するタンパク質の精製方法であり、Intein (inducibl
e self-cleavage activity of engineered protein spl
icing elements) を介してChitin Binding Domain (CB
D)を目的タンパク質に結合させた融合タンパク質を発現
させ、これをchitin affinity column (New England Bi
olabs社)に吸着させる。溶出に際しては、DTT、β-merc
aptoethanol、cysteinなどの還元剤で、Inteinと目的タ
ンパク質の連結部分を切断する。例えば、Chung-Mo Par
k, Jae-Yoon Shim, Song-Sook Yang, Jeong-GuKang, Je
ong-Il Kim, Z. Luka, and Pill-Soon Song, Chromopho
re − Apoprotein Interactions in Synechocystis sp.
PCC6803 Phytochrome Cph1. Biochemistry 39: 6349-6
356, 2000参照。本発明の蛋白質成分にこの方法を利用
する場合は、CBD−Intein以外の付着性物質でもラベル
しておき、該付着性物質のラベルをin vitro合成系で生
成した目的蛋白質との分離のために使用する。

【００９１】この方法による蛋白質の精製方法の一例を
示せば次の通りである。これ以外にも様々なヴァリエー
ションが知られており、適宜選択して使用できる。 １．形質転換体(ホスト：E. coli、ベクター：pTYB2 (N
ew England Biolabs社))の終夜培養液3 mlを250 mlのRB
培地 [0.5 % yeast extract, 1% tryptone, 0.5 % NaC
l, 0.2 % glucose (pH 7.5) ] に加え、OD₆₀₀=0.6にな
るまで30℃ で培養する。 ２．融合タンパク質の発現を誘導するために、1 mM IPT
G（終濃度）を加え、さらに20℃で14から16時間培養す
る。 3. 遠心分離（5,000 g, 5分間）で菌体を集め、菌体ペ
レットを氷冷下でLysisBuffer [Tris-HCl (pH 8.0), 50
0 mM NaCl, 0.1 % Triton X-100, 1 mM EDTA]に懸濁
し、超音波処理により、細胞を破砕する。 ４．遠心分離（100,000 g, 30分間）で上清を集め、0.2
mmの膜を用いてフィルターろ過する。 ５．細胞抽出液1.5 mlに 2 mM DMSOを20 μl加え、氷上
で1時間インキュベートし、Chitin Affinity Columnに
供する。 ６．カラムを緩衝液 [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 m
M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100] で洗浄し、In
teinのself-cleavageを誘導させるために、1 mM DTT
（終濃度）を加えた緩衝液中で、一晩（4℃）インキュ
ベートする。次いで、遊離した目的タンパク質を採取す
る。

【００９２】(５−６) 蛋白質又はペプチド断片とイオ
ン交換樹脂との結合性を利用する方法Ａ．Poly Arg と
イオン交換樹脂 目的タンパク質をPoly Argタグでラベルするにより、目
的タンパク質がプラスに帯電し、陽イオン交換体（例え
ば、SP-TSK HPLCカラム）に吸着することを利用いたタ
ンパク質の精製方法であり、溶出はイオン強度を調整す
ることにより行われる(J. C. Smith, R. B. Derbyshir
e, E. Cook, L. Dunthorne, J. Viney, S. J. Brewer,
H. M. Sassenfeld, and L. D. Bell, Chemical Synthes
is and Cloning of a Poly (Arginine) − Coding Gene
Fragment Designed to Aid Polypeptide Purificatio
n. Gene 32: 321-327, 1984参照)。

【００９３】上記方法の一例を示せば次の通りである。
これ以外にも様々なヴァリエーションが知られており、
適宜選択して使用できる。 1．形質転換体(ホスト：E. coli、ベクター：pWT221)の
終夜培養液6 mlを30 0mlのM9培地（100 μg/mlアンピ
シリンを含む）に加え、A₆₀₀=0.4になるま で37℃で振
とう培養する。 ２．終濃度が20 μg/mlになるように、IAA溶液（20 mg/
ml in ethanol）を加える。 ３．0.1 % Polymin P（終濃度）を加え、遠心分離で菌
体を集める。 ４．菌体ペレットを緩衝液 [40 mM Tris-acetate (pH
5.5), 5 M usea] で溶解し、同緩衝液で透析する。 ５．0.1 mlの細胞抽出液をSP-TSK HPLCカラムに供し、
同緩衝液でカラムを洗浄する。 ６．NaClの濃度勾配（100 mM − 350 mM）により、緩衝
液 [40 mM PIPES (pH 6.0), 5 M urea] 中に目的タンパ
ク質を溶出させる。

【００９４】(５−７) 磁気ビーズを使用する方法 可磁化物質(例えば、γFe₂O₃とFe₃O₄)を均一に分布させ
た高分子ポリマーのコアを親水性ポリマーで覆った、粒
子径が均一な磁気ビーズ(magnetic beads)が市販されて
おり(DYNAL社、ノルウエー／商品名 Dynabeads)、この
表面に種々の抗体を結合させることにより、磁気ビーズ
を細胞やタンパク質に結合させることができる。磁気ビ
ーズは強力磁石(MPC)を近づけると磁化されて磁力に引
き寄せられ、磁石を離すと磁性を失って元通り分散する
という性質を有しており、それを利用して細胞やタンパ
ク質の精製等に利用されている。例えば、Kanegasaki,
S.et al, J.Biochem. 117:758-765(1995) においては、
CD19抗体でコートされた磁気ポリスチレンビーズ(DYNAL
社)を用いて末梢血Bリンパ球を単離している。本発明に
おいても、反応系を構成する蛋白質成分を磁気ビーズで
ラベルし、磁石により反応系から除去することが可能で
ある。本発明の、相互に吸着し得る関係にある物質は、
かかる磁気ビーズと磁石の如き関係にある物質も包含す
る。

【００９５】以下に、実施例により本発明を更に詳細に
説明するが、もとよりこれらは例示であり、本発明はこ
れらに限定されるものではない。

【実施例１】大腸菌のリボソーム調製とＳ１００の抽出 増殖期中間のE. coli A19株の細胞300 gをアルミナ摩砕
した。摩砕した細胞を緩衝液Ａ（pH 7.6の10mM HEPES-K
OH(ヘペス-水酸化カリウム)、10 mM MgCl₂(塩化マグネ
シウム)、50 mM KCl(塩化カリウム)、1 mM DTT(ジチオ
トレイトール)）に懸濁し、アルミナと細胞破砕物を遠
心分離（30,000 g、４℃で１時間）して除いた。得られ
た上清画分に終濃度が1 μg/mlになるようにDNase(デオ
キシリボンクレアーゼ)を加えた後、４℃で４時間遠心
（100,000 g）した。得られた上清画分をS100とした。
また、ペレットは緩衝液Ａに懸濁しリボソームの粗抽出
液とした。このリボソーム粗抽出液を６から３６％のシ
ョ糖密度勾配にかけ強く結合した(tight-coupled)リボ
ソーム画分を得た。このtight-coupledリボソーム画分
を100,000 g回転で遠心分離し、そのペレットをリボソ
ーム緩衝液(pH 7.6の20 mMHEPES-KOH、6 mM MgOAc、30
mM NH₄Cl、7 mM β-mercaptoethanol(メルカプトエタノ
ール))に懸濁しtight-coupledリボソームを調製した。
図１にショ糖密度勾配におけるリボソーム画分を示す。

【００９６】

【実施例２】開始因子、延長因子、終結因子の高発現用
プラスミドの構築 大腸菌A19より抽出したゲノムを鋳型としてEF-Tuの遺伝
子をコードする遺伝子配列をPCR法により増幅し、５′
端にEcoRI、３′端にBglIIが認識する配列をもったDNA
断片を得た。得られたDNA断片をあらかじめEcoRI及びBg
lIIで切断したプラスミドpQE60（QIAGEN社製）に挿入
し、C末端にHis tag（ヒスタグ）が融合したEF-Tuを高
発現させるためのベクターを得た。得られたベクターで
E.coli BL21/ｐREP4を形質転換した。その他延長因子
及び開始因子、終結因子を高発現するベクターも同様の
手法で構築した。表１に使用したベクター、制限酵素、
his tag の位置を示す。

【００９７】

【実施例３】アミノアシルｔRNAシンテターゼ(ARS)、メ
チオニンｔRNAフォルミラーゼ(MTF)の高発現用プラスミ
ドの構築 大腸菌A19より抽出したゲノムを鋳型としてアラニルｔR
NAシンテターゼの遺伝子をコードする遺伝子配列をPCR
法により増幅し、５′端にSphI、３′端にHindIIIが認
識する配列をもったDNA断片を得た。得られたDNA断片を
あらかじめSphI及びHindIIIで切断したプラスミドpQE30
（QIAGEN社製）に挿入し、N末端にHis tag（ヒスタグ）
が融合したアラニルｔRNAシンセターゼを高発現させる
ためのベクターを得た。得られたベクターでE.coli BL
21/ｐREP4を形質転換した。その他のARS及びMTFを高発
現するベクターも同様の手法で構築した。表１に使用し
たベクター、制限酵素、his tag の位置を示す。なお、
表１におけるプラスミドのｐQEシリーズはE.coli BL21
／ｐREP４の、pETシリーズはE.coli BL21／DE3の形質転
換に用いられた。

【００９８】

【実施例４】T7ＲＮＡポリメラーゼの高発現用プラスミ
ドの構築 T7ファージより抽出したゲノムを鋳型としてT7RNAポリ
メラーゼの遺伝子をコードする遺伝子配列をPCR法によ
り増幅し、５′端にBamHI、３′端にPstIが認識する配
列をもったDNA断片を得た。得られたDNA断片をあらかじ
めBamHI及びPstIで切断したプラスミドpQE30（QIAGEN社
製）に挿入し、N末端にHis tag（ヒスタグ）が融合した
T7RNAポリメラーゼを高発現させるためのベクターを得
た。得られたベクターでE.coli BL21/ｐREP4を形質転
換した。

【００９９】

【実施例５】ヌクレオシドジフォスフェートキナーゼ(N
DK) 及び他の酵素類の高発現用プラスミドの構築 大腸菌A19より抽出したゲノムを鋳型としてNDKの遺伝子
をコードする遺伝子配列をPCR法により増幅し、５′端
にBamHI、３′端にHindIIIが認識する配列をもったDNA
断片を得た。得られたDNA断片をあらかじめBamHI及びHi
ndIIIで切断したプラスミドpQE30（QIAGEN）に挿入し、
N末端にHis tag（ヒスタグ）が融合したNDKを高発現さ
せるためのベクターを得た。得られたベクターでE.coli
BL21/ｐREP4を形質転換した。なお、21頁の(4−1)及
び(4−2)で例示した、NDK以外のの酵素類に対するプラ
スミドも、所望により、同様にして構築することができ
る。

【０１００】

【実施例６】開始因子、延長因子、終結因子の高発現と
精製 His tagが付されたEF-Tu(EF-Tu^*)を高発現させるため
に、実施例2で得られた形質転換体BL21/pREP4細胞を６
リットルのLB培地で細胞懸濁度OD₆₆₀が0.7になるまで培
養した。この培養液に終濃度が0.1 mMになるようにIPTG
（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド; is
opropyl-1-thio-β-D-galactoside）を添加し、さらに
３７℃で４時間培養した。この培養液を遠心分離し、得
られた細胞を懸濁緩衝液（pH 7.6の50 mM HEPES-KOH、1
M NH₄Cl、10 mM MgCl₂、0.3 mg/mlリゾチーム、0.1 %
Triton X-100、0.2 mM PMSF (フェニルメタンスルホニ
ルフルオリド; phenylmethanesulfonyl)、6 mM β-merc
aptoethanol）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理
し、細胞を破壊した。超音波処理した懸濁液を４℃で１
時間遠心分離（100,000 g）し、細胞破砕物を除いた。
得られた上清画分をNi²⁺でプレチャージされた10 mlのH
i-Trap chelatingカラム（ファルマシア社製）に供し、
10 mMのimidazole（イミダゾール）を含む100 mlのHT緩
衝液（pH 7.6の50mM HEPES-KOH、1 M NH₄Cl、10 mM MgC
l₂）で洗浄した。HT緩衝液に含まれるimidazole濃度を1
0から400 mMまで直線的に勾配をつけて、EF-Tu^*をカラ
ムから溶出した。精製されたEF-Tu^*を含む画分を合わせ
て、Stock緩衝液（pH 7.6の50 mM HEPES-KOH、100 mM K
Cl、10 mM MgCl₂、30 % glycerol（グリセロール））で
透析した。精製したEF-Tu^*の濃度はBio-Rad社のProtein
Assay Kitを用いてBSA（ウシ血清アルブミン）を基準
に作成した標準曲線から算出した。精製したEF-Tu^*は1m
lずつ小分けして液体窒素で急冷凍した後−８０℃で保
存した。その他のHis tagが付された延長因子及び開始
因子、終結因子も同様の手法で精製を行った。His tag
が付された各因子の12％SDS-PAGEによる分離(クマシー
ブリリアントブルーで染色)を図２に示す。

【０１０１】得られた、His tagが付された開始因子IF
1、IF2及びIF3(His tagが付されていることを「^*」で示
す)の活性と至適濃度をDHFR ｍRNA in vitro翻訳系(後
記実施例１７)を用いて測定した。即ち、His tagが付さ
れた開始因子の活性は、IF1^*、IF2^*及びIF3^*が共に存在
する系をポジティブコントロールとし、各開始因子を欠
如させた系で30分間の培養を行い、生成したDHFRの相対
的活性で比較した(図３A参照)。ポジティブコントロー
ルを100とした時、何れの因子が欠如してもDHFRの生成
は2分の1以下であり、IF1^*、IF2^*及びIF3^*が何れも活性
を有することが確認された。また、His tagが付された
開始因子の至適濃度は、他の条件を一定にしたin vitro
の系で、各開始因子の濃度を変えて翻訳を行い、生成
したDHFRの相対活性で測定した(図3B参照)。図3Bにおい
て、●はIF1^*を、黒い三角印はIF2^*を、■はIF3^*を意味
する。

【０１０２】

【実施例７】His tagが付されたARS及びMTFの高発現と
精製 His tagが付されたSer tRNAシンテターゼ(以下におい
て、His tagが付されていることを、「^*」で示す)を高
発現させるための形質転換体BL21/DE3細胞を2リットル
のLB培地で細胞懸濁度OD₆₆₀が0.7になるまで培養した。
この培養液に終濃度が0.1 mMになるようにIPTG（イソプ
ロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド; isopropyl-
1-thio-β-D-galactoside）を添加し、さらに３７℃で
４時間培養した。この培養液を遠心分離し、得られた細
胞を懸濁緩衝液（pH 7.6の50 mM HEPES-KOH、1 M NH₄C
l、10 mM MgCl₂、0.3 mg/ml リゾチーム、0.1 % Triton
X-100、0.2 mM PMSF (フェニルメタンスルホニルフル
オリド; phenylmethanesulfonyl)、6 mM β-mercaptoet
hanol）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、細胞
を破壊した。超音波処理した懸濁液を４℃で１時間遠心
分離（100,000 g）し、細胞破砕物を除いた。得られた
上清画分をNi²⁺でプレチャージされた10 mlのHi-Trap c
helatingカラム（ファルマシア社製）に供し、10 mMのi
midazole（イミダゾール）を含む100 mlのHT緩衝液（pH
7.6の50 mM HEPES-KOH、1 M NH₄Cl、10 mM MgCl₂）で
洗浄した。HT緩衝液に含まれるimidazole濃度を10から4
00 mMまで直線的に勾配をつけて、Ser tRNAシンセター
ゼ^*をカラムから溶出した。精製されたSer tRNAシンセ
ターゼ^*を含む画分を合わせて、Stock緩衝液（pH 7.6の
50 mMHEPES-KOH、100 mM KCl、10 mM MgCl₂、30 % glyc
erol（グリセロール））で透析した。精製したSer tRNA
シンセターゼ^*の濃度はBio-Rad社のProtein Assay Kit
を用いてBSA（ウシ血清アルブミン）を基準に作成した
標準曲線から算出した。精製したSer tRNAシンセターゼ
^*は1mlずつ小分けして液体窒素で急冷凍した後−８０℃
で保存した。得られたSer tRNAシンセターゼ^*のクロマ
トグラムを図５に示す。

【０１０３】その他のARS^*、MTF^*も同様の手法で高発現
させ、精製を行った。12％ SDS-PAGE により分離されク
マシーブリリアントブルーで染色された、His−tagが付
された各因子及び酵素 を図6に示す。図6において、Gly
RS^*及びPhe RS^*の2本のバンドは、これ等の酵素にα₂
β₂のタイプがあることに因る。図6から、His−tagが付
された各因子及び酵素が高純度で得られたことがわか
る。

【０１０４】

【実施例８】His−tagが付されたT7 RNAポリメラーゼの
高発現と精製 His−tagが付されたT7ＲＮＡポリメラーゼ(以下におい
て、His tagが付されていることを、「^*」で示す)を高
発現させるための形質転換体BL21/pREP4細胞を６リット
ルのLB培地で細胞懸濁度OD₆₆₀が0.7になるまで培養し
た。この培養液に終濃度が0.1 mMになるようにIPTG（イ
ソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド; isopro
pyl-1-thio-β-D-galactoside）を添加し、さらに３７
℃で４時間培養した。この培養液を遠心分離し、得られ
た細胞を懸濁緩衝液（pH 7.6の50 mMHEPES-KOH、1 M NH
₄Cl、10 mM MgCl₂、0.3 mg/ml リゾチーム、0.1 % Trit
on X-100、0.2 mM PMSF (フェニルメタンスルホニルフ
ルオリド; phenylmethanesulfonyl)、6 mM β-mercapto
ethanol）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理し、細
胞を破壊した。超音波処理した懸濁液を４℃で１時間遠
心分離（100,000 g）し、細胞破砕物を除いた。得られ
た上清画分をNi²⁺でプレチャージされた10 mlのHi-Trap
chelatingカラム（ファルマシア社製）に供し、10 mM
のimidazole（イミダゾール）を含む100 mlのHT緩衝液
（pH 7.6の50 mM HEPES-KOH、1 M NH₄Cl、10mM MgCl₂）
で洗浄した。HT緩衝液に含まれるimidazole濃度を10か
ら400 mMまで直線的に勾配をつけて、T7ＲＮＡポリメラ
ーゼ^*をカラムから溶出した。精製されたT7ＲＮＡポリ
メラーゼ^*を含む画分を合わせて、Stock緩衝液（pH 7.6
の50 mM HEPES-KOH、100 mM KCl、10 mM MgCl₂、30 % g
lycerol（グリセロール））で透析した。精製したT7Ｒ
ＮＡポリメラーゼ^*の濃度はBio-Rad社のProtein AssayK
itを用いてBSA（ウシ血清アルブミン）を基準に作成し
た標準曲線から算出した。精製したT7ＲＮＡポリメラー
ゼ^*は1mlずつ小分けして液体窒素で急冷凍した後−８０
℃で保存した。得られたT7ＲＮＡポリメラーゼ^*のクロ
マトグラムを図12Ａ及びＢに示す。

【０１０５】

【実施例９】His tagが付されたNDK、その他酵素類の高
発現と精製 His tagが付されたNDK(以下において、His tagが付され
ていることを、「^*」で示す)を高発現させるための形質
転換体BL21/pREP4細胞を2リットルのLB培地で細胞懸濁
度OD₆₆₀が0.7になるまで培養した。この培養液に終濃度
が0.1 mMになるようにIPTG（イソプロピル−１−チオ−
β−Ｄ−ガラクトシド; isopropyl-1-thio-β-D-galact
oside）を添加し、さらに３７℃で４時間培養した。こ
の培養液を遠心分離し、得られた細胞を懸濁緩衝液（pH
7.6の50 mM HEPES-KOH、1 M NH₄Cl、10 mM MgCl₂、0.3
mg/ml リゾチーム、0.1 % Triton X-100、0.2 mM PMSF
(フェニルメタンスルホニルフルオリド; phenylmethan
esulfonyl)、6 mM β-mercaptoethanol）に懸濁した。
この懸濁液を超音波処理し、細胞を破壊した。超音波処
理した懸濁液を４℃で１時間遠心分離（100,000 g）
し、細胞破砕物を除いた。得られた上清画分をNi²⁺でプ
レチャージされた10 mlのHi-Trapchelatingカラム（フ
ァルマシア社製）に供し、10 mMのimidazole（イミダゾ
ール）を含む100 mlのHT緩衝液（pH 7.6の50 mM HEPES-
KOH、1 M NH₄Cl、10 mM MgCl₂）で洗浄した。HT緩衝液
に含まれるimidazole濃度を10から400 mMまで直線的に
勾配をつけて、NDK^*をカラムから溶出した。精製された
NDK^*を含む画分を合わせて、Stock緩衝液（pH 7.6の50
mM HEPES-KOH、100 mM KCl、10 mM MgCl₂、30% glycero
l（グリセロール））で透析した。精製したNDK^*の濃度
はBio-Rad社のProtein Assay Kitを用いてBSA（ウシ血
清アルブミン）を基準に作成した標準曲線から算出し
た。精製したNDK^*は1mlずつ小分けして液体窒素で急冷
凍した後−８０℃で保存した。21頁(4−1)及び(4−2)に
例示した、その他の酵素類についても、所望により、Hi
s tagが付された形の酵素類として同様にして得られ
る。

【０１０６】

【実施例10】DHFRの遺伝子構築とmRNAの調製 E.coli由来のDHFR（dihydrofolate reductase；ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ）遺伝子の5'末端にHindIII、3'末
端にBam HI配列を加えPCRで増幅した。この増幅された
遺伝子は、リボソーム結合部の上流に、バクテリオファ
ージT7 gene 10由来のエプシロン配列(epsilon sequenc
e)及びそれに引き続くSD（Shine-Dalgarno；シャイン−
ダルガノ）配列を有するT7 プロモーターを含んでい
た。このDNA断片をプラスミドベクターpUC18（宝酒造）
に組み込んだ。このプラスミドをSma Iで処理した後、H
is tagが付されたT7 RNAポリメラーゼを用いたランオフ
転写(run-off transcription)や転写・翻訳型（transcr
iption/translation）in vitro翻訳反応に鋳型として用
いた。In vitroの転写反応4２℃で３時間行った。この
反応液1 ml中の組成はpH 7.8のHEPES-KOH 40M、20 mM M
gCl₂、1 mM spermidine（スペリミジン）、5 mM DTT、
各2 mM のATP、UTP、CTP及びGTP、20 μgのSma Iで処理
された鋳型プラスミド、50 μg BSA、1.78 units PPias
e（pyrophosphatase；ピロホスファターゼ）、10 μgの
精製され、His tagが付されたT7 RNAポリメラーゼであ
る。この反応を終了させるために終濃度が50 mMになる
ようにEDTA（ethylenedinitro‐lotetraacetic acid；
エチレンジニトロロ四酢酸）を加えた。得られたmRNAは
フェノール/クロロホルム抽出を行った後、エタノール
で沈殿させ、RNA精製キット（QIAGEN社製）を用いてメ
ーカーの推奨する方法に従って精製を行った。

【０１０７】

【実施例11】MFL mRNAの構築 DNA配列AUGUUCUUGUAA（翻訳するとfMet-Phe-Leu-Stop；
ホルミルメチオニン−フェニルアラニン−ロイシン−停
止コドンになる。以下、MFLと略記する）を、MFL mRNA
の鋳型とするために以下に示すような方法で構築した。
オリゴヌクレオチドＡ；5'-TAtgttcttgtaacとオリゴヌ
クレオチドＢ；5'-TCGAgttacaagaacaをアニールさせNde
I配列とXho I配列を含む二本鎖DNAを構築し、T7ターミ
ネーターを含むプラスミドベクターpET29a（Novagen）
のNde IとXho I部位へ連結した。得られたプラスミドは
上述のDHFR遺伝子を同様に転写させた。

【０１０８】

【実施例12】His tagが付されたアミノアシルtRNAシン
テターゼ活性 His tagが付されたARS（アミノアシルtRNAシンテター
ゼ）活性測定は以下に示す通りに行った。反応溶液50
μlはpolymix緩衝液（翻訳実験の項を参照のこと）に1
mM ATP、2.8 A₂₆₀ unit tRNAmix（Boehringer社製）、
各50 μMのラベルされたアミノ酸、そして精製された各
His tagが付されたARSを含んだものを用いた。反応は３
７℃で行い、放射性アミノアシルtRNAを3MMろ紙に沈殿
させ5%のトリクロロ酢酸で洗浄した後、放射能を測定し
た。活性1 unitは、37℃で1分間に1pmolのアミノアシル
tRNAの形成を触媒した酵素量で表した。結果を表２に示
す。

【０１０９】

【実施例13】His tagが付されたメチオニルtRNAトラン
スホルミラーゼ活性 His tagが付されたMTF（メチオニルtRNAトランスホルミ
ラーゼ／以下において、His tagが付されていること
を、「^*」で示す）活性は以下に示す通りに行った。反
応溶液50 μlはpolymix緩衝液（翻訳実験の項を参照の
こと）に1 mM ATP、2.8 A₂₆₀ unit tRNAmix（Boehringe
r）、各50 μMの[³H]ラベルされたメチオニン、0.5 μg
10-formyl-5,6,7,8,-tetrahydroforic acid（テトラヒ
ドロ葉酸）、3000 units MetRS（メチオニルtRNAシンテ
ターゼ）、そしてMTF^*を含んだものを用いた。反応は３
７℃で行い、ホルミル化されていないメチオニルtRNAは
緩衝液（0.175 M CuSO₄、pH 7.5の0.5 M Tris-HCl）中
で３０℃、8分間脱アシル化させた。放射性ホルミルメ
チオニルtRNAを3MMろ紙に沈殿させ5%のトリクロロ酢酸
で洗浄した後、放射能を測定した。活性1 unitは1分間
に1 pmolのホルミルメチオニルtRNAの形成を触媒した酵
素量で表した。結果を表２(末行)に示す。

【０１１０】

【実施例14】翻訳実験（一般的方法） 翻訳用の混合液（50 μl）はJelencら（1979）やWagner
ら（1982）の用いたPolymix緩衝液を改良したもので調
製する。Polymix緩衝液の組成は5 mM magnesiumacetate
（酢酸マグネシウム）、pH 7.3の5 mM potassium phosp
hate（リン酸カリウム）、95 mM potassium glutamate
（グルタミン酸カリウム）、5 mM ammonium chloride
（塩化アンモニウム）、0.5 mM calcium chloride（塩
化カルシウム）、1 mM spermidine、8 mM putrescine
（プトレッシン）、1 mM DTTである。反応液の組成は1
mM ATP、1 mM GTP、10 mM creatine phosphate（クレア
チンリン酸）、2.8 A₂₆₀ unit tRNA mix、0.5 μg 10-f
ormyl-5,6,7,8,-tetrahydrophilic acid、0.1 mM各アミ
ノ酸、因子混合物（後述）である。転写・翻訳型で反応
を行わせる場合には、上記の反応液に1 mM NTPと4 mM m
agnesium acetateを添加する。因子・酵素混合物の組成
は12 pmolリボソーム、1 μg IF1^*、2 μg IF2^*、0.75
μg IF3^*、1 μg EF-G^*、2 μg EF-T^*u、1 μg EF-T
s^*、0.5 μg RF1^*、0.5μg RF3^*、0.5 μg RRF^*、30-30
0 units各ARS^*あるいはMTF^*、0.2 μg creatine kinase
(CK；クレアチンキナーゼ)、0.15 μg myokinase（M
K；ミオキナーゼ）、0.054μg nucleoside diphosphate
kinase^*（NDK；ヌクレオシド二リン酸キナーゼ）であ
る。転写・翻訳型で反応を行う場合には、上記の反応液
に1.78 units PPiaseと0.5 μg T7 RNAポリメラーゼ^*を
添加する。以上の因子、酵素の表示において「^*」は、
それ等がHis-tagが付されたものであることを示す。反
応液を３７℃で５分間インキュベートし、その後、DNA
やRNAなどの鋳型を加え、反応を開始する。翻訳の反応
は３７℃で行なわれる。反応後、リボソームは高分子量
であるのでそれをまず100kDa以下の物質を通す限外ろ過
膜に通し、除去する。その後限外ろ過膜を通った成分を
Niカラムに通し、ヒスタグヒュ-ジョンタンパク質の除
去を行う。Niカラムを素通りする成分は高純度の翻訳産
物であり、SDS-PAGEで1本のバンドを示す。なお、以下
の実施例において、比較のために使用するS30システム
はPromega社から購入したものを使用し、メーカーの推
奨する方法に従って翻訳を行った。

【０１１１】

【実施例15】種々の蛋白質の発現 His−tagが付された各反応系構成成分の活性を確認した
後、これ等酵素及びHis−tagが付されたT7 RNAポリメレ
ースを用いて、実施例14記載の通りにin vitro 蛋白
合成系を構築した。この合成系により、大腸菌のDHFR、
λリゾチーム(λlysozyme)、グリーン蛍光蛋白(GFP)、
グルタチオントランスフェラーゼ(GST)及びT7 gene10蛋
白の全長ポリペプチドを合成し、夫々の生成量を測定し
た。結果を図13に示す。本発明の合成系が翻訳に必要な
総ての成分を含んでいることが明らかである。

【０１１２】

【実施例16】Poly (U) − poly (Phe)合成 Poly (U) − poly (Phe)のin vitro反応系における合成
は以下に示した通りに行った。反応液は1 mM ATP、1mM
GTP、10 mM creatine phosphate、2.8 A₂₆₀ units tRNA
mix、1 mM [¹⁴C]でラベルされたフェニルアラニン、因
子混合物を含むpolymix緩衝液を用いた。因子混合物の
組成は12 pmolリボソーム、1 μg EF-G^*、2μg EF-T
u^*、1μg EF-Ts^*、60 units PheRS^*、0.2μg creatine
kinase (CK)、0.15μg myokinase (MK)、0.054μg nucl
eoside diphosphate kinase^* (NDK) である。なお、因
子、酵素の表示において「^*」は、それ等がHis-tagの付
されたものであることを示す。反応液を３７℃で５分間
インキュベートした後、5μgのpoly (U) を加え、反応
を開始した。Poly (Phe)を経時的に8 μlずつサンプリ
ングし、10 %のトリクロロ酢酸で3MMろ紙上に沈殿させ
た。アミノアシルtRNAを８５℃で脱アシル化させ10 %ト
リクロロ酢酸で洗浄し、放射能を測定し、目的物の生成
を確認した。

【０１１３】上記翻訳反応を行う中で、EF-G^*、EF-Tu^*
及びEF-Ts^*の至適濃度を調べるために、他の条件を一定
にしたin vitro 反応系において、各延長因子の濃度を
変えてpoly (Phe)の生成量を調べ、図７(A)に示す結果
を得た。図７(A)において、●はEF-G^*、黒い三角印はEF
-Tu^*、■はEF-Ts^*のデーターを夫々示す。

【０１１４】更に、本発明の上記反応系によるpoly (Ph
e)の生成を、S100抽出物を用いた翻訳系によるpoly (Ph
e)の生成と比較して、図7(B)の結果を得た。後者の系
(○)では反応が20分後に停止したが、本発明の系(●)で
は40分経過後においてなお反応が進行した。

【０１１５】

【実施例17】終結因子とリボソーム再生因子の活性 終結因子（RF1^*、RF3^*とRRF^*／「^*」は、His tagが付さ
れていることを示す）の活性は、改良を加えたPavlovら
（1997）の方法に基づき測定した。翻訳反応液(50μl)
は翻訳実験に用いたpolymix緩衝液を元に調製した。反
応液の組成は1 mMATP、1 mM GTP、2.8 A₂₆₀ unit tRNA
mix、1 mM フェニルアラニン及びロイシン、[³⁵S]放射
性メチオニンを用いて調製した50pmolのformyl methion
yl-tRNA、His tagが付された因子・酵素混合物（後述）
である。因子・酵素混合物の組成は12 pmol リボソー
ム、1 μg IF1^*、2 μg IF2^*、0.75 μg IF3^*、1 μg E
F-G^*、2 μg EF-Tu^*、1 μg EF-Ts^*、0.5 μg RF1^*、0.
5 μg RF3^*、0.5 μg RRF^*、50 unitのPheRS^*と300 uni
tのLeuRS^*である。この因子・酵素混合物からRF1^*、RF3
^*、RRF^*を目的に応じてそれぞれ除いた反応液を用意し
反応を行った。反応液を３７℃でプレインキュベーショ
ンした後に1 μgのMFL mRNAを加えて翻訳反応をスター
トさせた後、この反応液から経時的に5 μlずつサンプ
リングし、等量の1 N HClに加えて反応を止めた。さら
にこれに200 μlの酢酸エチルを加えてトリペプチド（f
MFL）を溶出させ、液体シンチレーションカウンターを
用いて放射能を測定した。

【０１１６】得られた、終結因子RF1^*、RF3^*及びRRF^*の
活性を、fMet-Phe-Leu-Stop (fMFL)をコードする合成ｍ
RNAのin vitro翻訳系を用いて測定した。即ち、終結因
子として、RF1^*、RF3^*及び RRF^* を含む系(●)、RF1^*及
びRRF^*を含む系 (×)、RF1^*,及びRF3^*を含む系 (黒い三
角印)、RF1^*のみを含む系 (■)、 RF3^*及びRRF^*を含む
系 (○)、何れの終結因子^*も(RRF^*も)含まない系(◆)の
夫々においてfMFL mRNAを翻訳させ、生成量を測定し
た。結果を図４に示す。図４において、最初のサイクル
により生成したペプチドは、ｙ軸上で約1000cpmに相当
する。RF1^*、RF3^*及び RRF ^*を含む系(●)が時間の経過
と共に直線的に生成量が増し、他の系との比較から、RF
1^*、RF3^*及び RRF^* が活性を有することが確認された。
なお、RF1^*を欠如する系(○)ではペプチドの生成は見ら
れず、また、RRF^*を欠如する系(黒い三角印、■、◆)で
はリボソームの再循環(recycling)が起こらないことを
示している。

【０１１７】

【実施例18】DHFRの合成 本発明のin vitro 翻訳系及びS−30抽出物を用いた翻訳
系の夫々により、[³⁵S]でラベルされたメチオニンを含
むDHFRを合成した。生成物を12 %のSDS-PAGE(sodium do
decyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis；
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分離させ、BAS-
1000 system（Fuji film）で検出し、放射能を測定し
た。SDS-PAGEによる分離の結果を、図８(A)に示す。一
方、DHFRの活性は以下に示した方法で測定した。pH 7.0
の50 mM potassiumphosphate緩衝液、50 μM DHF（dihy
drofolic acid；ジヒドロ葉酸）、60 μM NADPH（reduc
ed nicotinamide adnine dinucleotide phosphate；還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を
含む反応液中、３０℃で反応させ、A_{3 40}減少値を１分ご
とに測定した。結果を図８(B)に示す。

【０１１８】本発明のin vitro 翻訳系及びS−30抽出物
を用いた翻訳系の夫々における反応の経過を図９に示
す。本発明のin vitro 翻訳系(■)においては、反応が1
20分経過後においても進行しているのに対し、S−30抽
出物をっ用いた翻訳系（●）においては20分でDHFRの生
成量がピークに達している。

【０１１９】反応系におけるエネルギー消費を調べるた
めに、本発明のin vitro 翻訳系と、S-30抽出物を用い
た翻訳系とを対比しながら、ヌクレオシド三リン酸の加
水分解の測定を以下に示す通りに行った。DHFRを鋳型と
し、[α-³²P]ATPあるいはGTPを含む反応液を用い、３７
℃で翻訳実験を行った。この反応液から経時的に2 μl
ずつサンプリングし150 μlの10 % ギ酸に加えた。Poly
ethyleneimine TLC plateに反応液をスポットし、pH 3.
75のpotassium phosphate緩衝液 0.75Mを用いて反応生
成物を展開した。このTLC plateを風乾した後ラップで
覆い、オートラジオグラフをとった。結果を図10に示
す。図中、左側がS-30の系であり、右側が本発明の系で
ある。S-30の系では、ATPの量が時間の経過と共に減少
するのに対し、本発明の系では、ほぼ一定の水準を保っ
ている。

【０１２０】生成したDHFRを精製するために、100ｋDa
以下の物質を通す限外ろ過膜を用いてリボソームを除去
した。次いで、総てのHis−tagが付された反応系構成成
分をニッケルカラムを通して除去した。ニッケルカラム
を通す前の反応混合物と、ニッケルカラムを通して得ら
れる生成物を、12%SDS-PAGEゲル上に展開し、クマシー
ブルーで染色した。結果を図14に示す。図において、レ
ーン１はマーカー、レーン２は反応混合物、レーン3は
生成物(DHFR)であり、DHFRがシングルバンドで得られて
いることを示している。

【０１２１】

【実施例19】バリルサプレッサーtRNAによるバリン残基
の導入（非天然アミノ酸導入のモデル） His tagが付されたRF1(以下、His tagが付されているこ
とを、「^*」で示す)の代わりにRF2^*を終結因子として用
いた本発明のin vitro翻訳系において、化学的に合成し
たバリルサプレッサーtRNAを用いて37番残基のアスパラ
ギン(ATAコドン)をUAGコドンに置換したDHFRの鋳型を翻
訳させた。その結果RF1^*を含むサンプルでは37番目の残
基で終結反応が行われ途中で止まったタンパク質ができ
たのに対し(図11のレーン2)、RF1^*を除くと(RF2は含ま
ない)途中で切れたタンパク質のバンドが薄くなった(図
11のレーン3)。さらにここにRF2^*を導入すると通常のDH
FR(図11のレーン1)と同様の位置にタンパク質が生産さ
れるようになった(図11のレーン4)。このことからサプ
レッサーtRNAに結合したバリン残基がDHFRの37番目に導
入されたことが確かめられた。

【０１２２】

【発明の効果】反応系を構成する蛋白質成分をラベルす
ることにより、反応系を構成するの各蛋白質成分の精製
が確実に行われ、未知の成分が入り込まない反応系が確
立でき、且つ、生成した目的タンパク質が容易に、しか
も極めて高純度で単離出来るすることが可能となった。

【０１２３】細胞や細胞抽出液に含まれているリポポリ
サッカライド(LPS)は、内毒素として、生体に対し種々
の好ましくない作用をすることが指摘されてきたが、目
的生成物であるペプチドと分離することが難しいという
技術的な問題があった。しかし、本発明のin vitroペプ
チド合成系によれば、かかる問題が払拭される。

【０１２４】未知の成分が入り込まない反応系が確立で
きることにより、長時間の反応継続が可能となり、バッ
チ式で２時間或いはそれ以上反応が継続する。又、反応
液のボリュームを増すことも理論上期待できる。

【０１２５】flow式によれば更に長時間の反応継続が可
能となり、in vitro 反応系による蛋白質の生産・精製
が実用化され得る。このことは、今までコストが高いが
故に治療に供することが躊躇されがちであったある種の
酵素類が安価に供給される道を拓くことを意味し、デリ
バリーについて技術的問題を抱えている遺伝子治療の少
なくとも一部に代えて、酵素類の投与による治療領域を
広げるものと期待される。

【０１２６】本発明により、終結因子のある系とない系
が明確に樹立でき、リボソームディスプレーの選択的製
造が容易となり、又、非天然型アミノ酸残基を所望の位
置に導入することがより正確に行えるようになった。

【０１２７】従来の、原核細胞抽出液を用いる無細胞蛋
白合成系では、転写と翻訳を同時に行わせない場合は、
ｍRNAの安定性が大きく下がるという問題があるが、本
発明の反応系においては、ｍRNAを翻訳させる場合にお
いても安定した反応が進行する。

【０１２８】ゲノム解析が終了し、遺伝子解析に研究の
中心が移ろうとしている時、本発明の反応系により、遺
伝子の発現と生成蛋白の確認が迅速に行われ得ること
は、遺伝子の機能を調べることが容易となる等、科学技
術の進歩に与えるメリットが極めて高い。

【０１２９】

【表１】

【０１３０】

【表２】

【０１３１】［Reference］ ADDIN ENBbu Crowe, J., Dobeli, H., Gentz, R., Hoch
uli, E., Stuber, D.,and Henco, K. (1994). 6xHis-Ni
-NTA chromatography as a superior technique in rec
ombinant protein expression/purification. Methods
Mol Biol 31, 371-87. Hochuli, E., Dobeli, H., and Schacher, A. (1987).
New metal chelate adsorbent selective for proteins
and peptides containing neighbouring histidine re
sidues. J Chromatogr 411, 177-84. Smith, D. B., and Johnson, K. S. (1988). Single-st
ep purification of polypeptides expressed in Esche
richia coli as fusions with glutathione S-transfer
ase. Gene 67, 31-40.

【図面の簡単な説明】

【図１】 大腸菌リボソームのショ糖密度勾配における
画分を示す。

【図２】 His tag が付された開始因子、延長因子及び
終結因子の12％SDS-PAGEにおける分離（クマシーブリリ
アントブルーで染色）を示す。

【図３】 Aには、His tagが付された開始因子の活性を
DHFRの相対的活性で示し、Bには、His tagが付された開
始因子の至適濃度をDHFRの相対的活性で示す。

【図４】 His tagが付された終結因子の活性をfMFLの
生成量で示す。

【図５】 His tagが付されたSerRS のクロマトグラム
を示す。

【図６】 His tagが付された各ARS及びMTFの12％SDS-P
AGEにおける分離を示す。

【図７】 Aには、本発明のin vitro poly(Phe)合成系
における、His tagが付された延長因子の至適濃度をPhe
の取込量で示し、Bには、本発明のin vitro合成系とS10
0抽出物を用いた系におけるpoly(Phe)合成反応の進行経
過をPheの取込量で示す。

【図８】 Aには、本発明のin vitro合成系とS30系によ
り合成された、[³⁵S]Met含有DHFRの12％SDS-PAGEにおけ
る分離を示し、Bには、同DHFRの活性を示す。

【図９】 本発明のin vitro合成系とS30系におけるDHF
R合成反応の時間経過を示す。

【図10】 本発明のin vitro合成系(右)とS30系(左)に
おける、エネルギー源の消費を時間経過と共に示す。

【図11】 本発明のin vitro合成系における非天然型ア
ミノ酸導入のモデルとして、37番目にバリン残基が導入
されたDHFRの生成を示す。

【図12】 His tagが付されたT7RNAポリメラーゼ のク
ロマトグラムを示す。

【図13】本発明のin vitro合成系により合成された種々
の蛋白のSDS−PAGEゲルパターンを示す。

【図14】本発明のin vitro合成系による翻訳生成物であ
るDHFRの、限外ろ過膜(100kDa cut−off)処理及びニッ
ケルカラムを通した後の純度を示す。矢印はDHFRの位置
を示す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１１月２日（２００１．１１．
２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１２】 ─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１４年３月５日（２００２．３．５）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０６

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０６】

【実施例10】DHFRの遺伝子構築とmRNAの調製 E.coli由来のDHFR（dihydrofolate reductase；ジヒド
ロ葉酸レダクターゼ）遺伝子の5'末端にHindIII、3'末
端にBam HI配列を加えPCRで増幅した。この増幅された
遺伝子は、リボソーム結合部の上流に、バクテリオファ
ージT7 gene 10由来のエプシロン配列(epsilon sequenc
e)及びそれに引き続くSD（Shine-Dalgarno；シャイン−
ダルガノ）配列を有するT7 プロモーターを含んでい
た。このDNA断片をプラスミドベクターpUC18（宝酒造）
に組み込んだ。このプラスミドをSma Iで処理した後、H
is tagが付されたT7 RNAポリメラーゼを用いたランオフ
転写(run-off transcription)や転写・翻訳型（transcr
iption/translation）in vitro翻訳反応に鋳型として用
いた。In vitroの転写反応4２℃で３時間行った。この
反応液1 ml中の組成はpH 7.8のHEPES-KOH 40ｍM、20 mM
MgCl₂、1 mM spermidine（スペリミジン）、5 mM DT
T、各2 mM のATP、UTP、CTP及びGTP、20 μgのSmaIで処
理された鋳型プラスミド、50 μg BSA、1.78 units PPi
ase（pyrophosphatase；ピロホスファターゼ）、10 μg
の精製され、His tagが付されたT7 RNAポリメラーゼで
ある。この反応を終了させるために終濃度が50 mMにな
るようにEDTA（ethylenediaminetetraacetic acid；エ
チレンジアミン四酢酸）を加えた。得られたmRNAはフェ
ノール/クロロホルム抽出を行った後、エタノールで沈
殿させ、RNA精製キット（QIAGEN社製）を用いてメーカ
ーの推奨する方法に従って精製を行った。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１０７】

【実施例11】MFL mRNAの構築 fMet-Phe-Leu-Stop(ホルミルメチオニン−フェニルアラ
ニン−ロイシン−停止コドン／以下、MFLと略記する)を
コードするｍRNAであるAUGUUCUUGUAAの鋳型となるDNA配
列を 以下に示すような方法で構築した。オリゴヌクレオ
チドＡ；5'-TAtgttcttgtaacとオリゴヌクレオチドＢ；
5'-TCGAgttacaagaacaをアニールさせNdeI配列とXho I配
列を含む二本鎖DNAを構築し、T7ターミネーターを含む
プラスミドベクターpET29a（Novagen）のNde IとXho I
部位へ連結した。得られたプラスミドは上述のDHFR遺伝
子を同様に転写させた。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１７

【補正方法】変更

【補正内容】

【０１１７】

【実施例18】DHFRの合成 本発明のin vitro 翻訳系及びS−30抽出物を用いた翻訳
系(Promega社製)の夫々により、[³⁵S]でラベルされたメ
チオニンを含むDHFRを合成した。生成物を12%のSDS-PAG
E(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electr
ophoresis；SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分
離させ、BAS-1000 system（Fuji film）で検出し、放射
能を測定した。SDS-PAGEによる分離の結果を、図８(A)
に示す。一方、DHFRの活性は以下に示した方法で測定し
た。pH 7.0の50 mM potassiumphosphate緩衝液、50 μM
DHF（dihydrofolic acid；ジヒドロ葉酸）、60 μM NA
DPH（reduced nicotinamide adnine dinucleotide phos
phate；還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
リン酸）を含む反応液中、３０℃で反応させ、A_{3 40}減少
値を１分ごとに測定した。結果を図８(B)に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上田 卓也 千葉県千葉市稲毛区弥生町１−170、東大 宿舎４−204 Ｆターム(参考） 4B050 CC01 DD02 FF14E LL05 4B064 AG01 CA21 DA01

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 in vitroで、DNAを転写し次いで翻訳す
   る系又はRNAを翻訳する系において、反応系を構成する
   蛋白質成分の一部又は全部が相互に付着し合う関係にあ
   る物質の一方でラベルされており、他方の物質が吸着体
   として翻訳終了後に該ラベルされた蛋白質成分を捕捉す
   るために使用されることを特徴とするinvitro転写／翻
   訳系によるペプチド又はペプチド誘導体の製造方法。
2. 【請求項２】 反応系を構成する蛋白質成分の一部又は
   全部をラベルする物質とラベルされた蛋白質成分を捕捉
   するための吸着体として用いられる物質との組合せが、
   当該製法において、互いに異なる複数の組合せで用いら
   れることを特徴とする請求項1記載のペプチド又はペプ
   チド誘導体の製造方法。
3. 【請求項３】 相互に付着し合う関係にある物質の一方
   でラベルされている蛋白質成分が、転写／翻訳のための
   因子及び酵素の一部又は全部であることを特徴とする請
   求項１乃至２記載のペプチド又はペプチド誘導体の製造
   方法。
4. 【請求項４】 転写／翻訳のための因子・酵素が、開始
   因子、延長因子、終結因子、アミノアシルｔRNAシンテ
   ターゼ、メチオニルｔRNAトランスフォルミラーゼ及びR
   NAポリメラーゼよりなる群から選ばれることを特徴とす
   る請求項３記載のペプチド又はペプチド誘導体の製造方
   法。
5. 【請求項５】 相互に付着し合う関係にある物質の一方
   でラベルされている蛋白質成分が、転写／翻訳のための
   因子・酵素及びそれ等以外の反応系の構成に必要とされ
   る酵素類であることを特徴とする請求項１乃至２記載の
   ペプチド又はペプチド誘導体の製造方法。
6. 【請求項６】 転写／翻訳のための因子・酵素以外の酵
   素類であって反応系の構成に必要とされる酵素類が、反
   応系においてエネルギーを再生するための酵素及び転写
   ・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素より
   なる群から選ばれることを特徴とする請求項５記載のペ
   プチド又はペプチド誘導体の製造方法。
7. 【請求項７】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
   訳系が、終結因子を含まないことを特徴とする請求項１
   乃至６記載のペプチド誘導体の製造方法。
8. 【請求項８】 相互に付着し合う関係にある物質が、ア
   フィニティークロマトグラフィーにおける相互作用物質
   の関係にある物質であることを特徴とする請求項１乃至
   ７記載のペプチド又はペプチド誘導体の製造方法。
9. 【請求項９】 アフィニティークロマトグラフィーにお
   ける相互作用物質の関係にある物質の組合せが、蛋白質
   又はペプチド断片と金属イオンとの組合せ、抗原と抗体
   との組合せ、蛋白質と蛋白質又はペプチド断片との組合
   せ、蛋白質と特定のアミノ酸、ＤＮＡ、色素、ビタミ
   ン、レクチン等の低分子化合物との組合せ、蛋白質と糖
   との組合せ、蛋白質又はペプチド断片とイオン交換樹脂
   との組合せから選ばれることを特徴とする請求項８記載
   のペプチド又はペプチド誘導体の製造方法。
10. 【請求項10】 蛋白質又はペプチド断片と金属イオンと
    の組合せが、ヒスチジンタグとニッケル錯体又はコバル
    ト錯体であることを特徴とする請求項９記載のペプチド
    又はペプチド誘導体の製造方法。
11. 【請求項11】 相互に付着し合う関係にある物質が、磁
    力により付着し合う関係にある物質であることを特徴と
    する請求項１乃至７記載のペプチド又はペプチド誘導体
    の製造方法。
12. 【請求項12】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成する蛋白質成分の一部又は全部であって、相
    互に付着し合う関係にある物質の一方でラベルされてい
    る蛋白質成分を含むことを特徴とするin vitro転写／翻
    訳系によりペプチド又はペプチド誘導体を製造するため
    の酵素・因子キット。
13. 【請求項13】 反応系を構成する蛋白質成分が、転写／
    翻訳のための因子・酵素及び／又はそれ等以外の反応系
    の構成に必要とされる酵素類であることを特徴とする請
    求項12記載の酵素・因子キット。
14. 【請求項14】 転写／翻訳のための因子・酵素が、開始
    因子、延長因子、終結因子、アミノアシルｔRNAシンテ
    ターゼ、メチオニルｔRNAトランスフォルミラーゼ及びR
    NAポリメラーゼよりなる群から選ばれることを特徴とす
    る請求項13記載の酵素・因子キット。
15. 【請求項15】 転写／翻訳のための因子・酵素以外の酵
    素類であって反応系の構成に必要とされる酵素類が、反
    応系においてエネルギーを再生するための酵素及び転写
    ・翻訳で生じる無機ピロリン酸の分解のための酵素より
    なる群から選ばれることを特徴とする請求項13記載の酵
    素・因子キット。
16. 【請求項16】 相互に付着し合う関係にある物質の一方
    でラベルされている蛋白性成分を捕捉するための吸着体
    を含むことを特徴とする請求項12乃至15記載の酵素・因
    子キット。
17. 【請求項17】 反応系を構成する蛋白質成分の一部又は
    全部をラベルする物質とラベルされた蛋白質成分を捕捉
    するための吸着体として用いられる物質との組合せにお
    いて、異なる組合せを含むことを特徴とする請求項12乃
    至16記載の酵素・因子キット。
18. 【請求項18】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされている開始因子。
19. 【請求項19】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされている延長因子。
20. 【請求項20】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされている終結因子。
21. 【請求項21】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされているアミノアシルｔRNAシンテ
    ターゼ。
22. 【請求項22】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされているメチオニルｔRNAトランス
    フォルミラーゼ。
23. 【請求項23】 in vitroでのDNA転写・翻訳系を構成す
    るための、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラ
    ベルされているRNAポリメラーゼ。
24. 【請求項24】 in vitroでのDNA転写・翻訳系を構成す
    るための、相互に付着し合う関係にある物質の一方でラ
    ベルされているT7RNAポリメラーゼ。
25. 【請求項25】 in vitroでのDNA転写・翻訳系を構成す
    るための、ヒスチジンタグでラベルされているT7RNAポ
    リメラーゼ。
26. 【請求項26】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされている反応系においてエネルギー
    を再生するための酵素。
27. 【請求項27】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系を構成するための、相互に付着し合う関係にある物
    質の一方でラベルされている転写・翻訳で生じる無機ピ
    ロリン酸の分解のための酵素。
28. 【請求項28】 in vitroでのDNA転写・翻訳系又はRNA翻
    訳系により製造されたペプチド又はペプチド誘導体を単
    離するに当たり、相互に付着し合う関係にある物質の一
    方でラベルされている反応系を構成する蛋白質成分を捕
    捉するための吸着体。