DE60111247T2

DE60111247T2 - Verfahren für die Produktion von Peptiden unter Verwendung eines in vitro-Transkription/Translation-System

Info

Publication number: DE60111247T2
Application number: DE60111247T
Authority: DE
Inventors: Akio Ageo-shi INOUE; Yoshihiro Shimizu; Takuya Chiba-shi UEDA
Original assignee: Post Genome Institute Co Ltd
Current assignee: Biocomber Co Ltd Tokyo Jp
Priority date: 2000-12-28
Filing date: 2001-12-06
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2021-12-07
Also published as: NO20024082L; US7118883B2; EP1319074B1; KR20030001371A; IS6607A; PL366364A1; WO2002053582A2; IL150892A0; CA2400735C; MXPA02008485A; ES2193896T1; DE60111247D1; WO2002053582A3; US20020123101A1; AU2002221071A1; JP2003102495A; HUP0301723A2; DE1319074T1; JP4061043B2; ATE296885T1

Description

Technischer Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats unter Verwendung eines Reaktionssystems zur Transkription einer DNS in eine RNS und anschließenden Translation der hergestellten RNS, oder ein Reaktionssystem zur in vitro-Translation einer RNS (nachfolgend als "in vitro-Transkriptions/Translations-Reaktionssystem" bezeichnet) und ein Kit aus Proteinkomponenten, der Enzyme und Faktoren für den Aufbau dieses Reaktionssystems umfasst.
Hintergrund der Erfindung
Zellfreie Proteinsynthese-Systeme, die von Escherichia coli, Kaninchen-Retikulocyten, oder Weizenkeimen abgeleitet sind, sind bekannt (Current Opinion in Biotechnology 9:534–548 (1998), J. Biotechnology 41:81–90 (1995)). In diesen zellfreien Systemen können Peptide innerhalb mehrerer Stunden synthetisiert werden. Proteine können nämlich, verglichen mit dem Fall, dass fremde Gene in Wirtszellen eingebracht und dann darin exprimiert werden (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412–417 (1997), FEBS Letters 414:268–270 (1997)), innerhalb einer kurzen Zeit synthetisiert werden. Darüber hinaus ist es bekannt oder wird erwartet, dass die Synthese von Proteinen in zellfreien Systemen, zumindest theoretisch, gegenüber dem Fall des Einbringens und Exprimierens fremder Gene in Wirtszellen eine Anzahl technischer Vorteile hat. Die Verwendung dieser zellfreien Proteinsynthese-Systeme ermöglicht es nämlich, Peptide, die durch in Wirtszellen entstehende Proteasen digeriert werden würden, und Peptide, die gegenüber Wirtszellen Toxizität zeigen, herzustellen. Durch die Verwendung dieser Systeme ist es auch möglich, Peptidderivate, die nicht natürlich vorkommen, durch Einfügen nicht natürlicher Aminosäurereste in bestimmte Positionen durch die Verwendung von Aminoacyl-tRNS, die mit den nicht natürlichen Aminosäureresten beladen sind (Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 435–462 (1995)), oder Komplexe (Polysomen-Displays), die aus mRNS, Ribosom und Peptid bestehen, herzustellen. Diese Polysomen-Displays und ihre Verwendung wird von He M. et al., J. Immunological Methods 231 (2000) S. 105–117, Schaffitzel C., J. Immunological Methods 231 (2000) S. 119–135, Roberts RW., Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) S. 268–273 und ibid. 9 (1998) S. 534–548 (insbesondere auf oder nach Seite 543) und außerdem z.B. in FEBS Lett. 450:105–110 (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:14130–14135 (1998), und Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937–4942 (1997) beschrieben.
Obwohl rohe Zellextrakte per se im Frühstadium verwendet wurden, konnten dadurch nur instabile Reaktionen ausgeführt werden, und so wurden Peptide mit nur geringer Ausbeute hergestellt, nämlich von 0,1 bis 0,01 % von Lebendzellen. Spätere Studien haben Komponenten aufgeklärt, die in Extrakten enthalten sind, die für die Genexpression notwendig sind und gleichzeitig gezeigt, dass unnötige Komponenten und Inhibitoren (z.B. endogene Nuklease, die mRNS abbaut (RNA 6:1079–1090 (2000)) darin enthalten sind. Daher wurden Versuche unternommen, diese unnötigen Komponenten zu eliminieren. Die konventionelle Methode, die die Verwendung ei nes zellfreien Extrakts als Grundlage und die Eliminierung unnötiger Komponenten daraus umfasst, leidet jedoch unter dem Problem, dass Reaktionsenergie verbraucht wird und dadurch die Reaktion nach etwa 1 Stunde der Proteinsynthese stoppt, wenn man ein Batchsystem verwendet. Es wird darauf aufmerksam gemacht, dass Faktoren, die für diese Probleme ursächlich sind, den Verbrauch von Nukleotidtriphosphaten (Biochim. Biophys. Acta. 1293:207–212 (1996), J. Biotechnol. 48:1–8 (1996)), das Anreichern von kleinen Nebenprodukten wie Triphosphat-Hydrolysaten, die durch endogene Enzyme gebildet wurden (Biochemistry 22:346–354 (1983), J. Biol. Chem. 260:15585–15591 (1985)), und den Energieverbrauch durch Faktoren, die für die Transkriptions-/Translationsreaktion unnötig sind (J. Ferment. Bioeng. 84:7–13 (1997), J. Biotechnol. 61:199–208 (1998)), einschließen.
Das Problem der Reaktionsbeendigung innerhalb einer kurzen Zeit kann durch fortlaufende Bereitstellung eines Substrats in einem Transkriptions-/Translationsreaktionssystem für die Synthetisierung eines Peptids vermieden werden. Es ergibt sich jedoch auch in diesem Fall ein weiteres Problem schlechter Wiederholbarkeit. Dieses Problem wurde durch die Aufklärung der Präsenz eines Keim-Ribosominaktivators (Tritin) und eines Translationsinitiations-Inhibitors in Studien über ein System gelöst, das Weizenkeim nutzt und ein Mittel zur Eliminierung dieser Substanzen vom Keim verwendet (Bio Industry Vol. 17, No. 5, 20–27 (2000)). Es bleibt jedoch ein weiteres Problem bestehen, dass ein solches System sehr viel Energie verschwenderisch verbraucht, unabhängig von der Translation.
Es wurde erwogen, dass diese in den konventionellen Methoden anzutreffenden Probleme durch die Präsenz von verschiedenen unbekannten Komponenten in den Zellextrakten verur sacht wurden, die in der Transkriptions- oder Translationsreaktion unnötig sind, aber kaum vollständig eliminiert werden können. Unter diesem Gesichtspunkt wurde ein Versuch unternommen, ein Peptid in vitro zu synthetisieren, indem ausschließlich Enzyme und Faktoren benutzt werden, die notwendigerweise in der Translation benötigt werden (The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, Nr. 19, 6889–6894 (1997)). Für die DNS-gerichtete Synthese von β-Galaktosidase wurde in diesem Fall zusätzlich zu E. coli-Ribosomen ausschließlich von den folgenden aus E. coli-Extrakt als Faktoren und Enzyme für die Transkription und Translation gereinigten 33 Komponenten Gebrauch gemacht: RNS-Polymerase, N¹⁰-Fornyltetrahydrofolat Met-tRNS^f Transformylase, 20 Aminoacyl-tRNS Synthetasen, IF-1, IF-2, IF-3, EF-Tu, EF-G, RF-1 und/oder RF-2, CRP, L und L_α. In dieser Studie konnte das Zielprodukt jedoch nur in einer sehr geringen Menge erhalten werden, da zu dieser Zeit nur wenige Information über den Translationsmechanismus und unzureichende Reinigungstechniken verfügbar waren.
Danach erstellten Gonza und seine Mitarbeiter ein in vitro-Peptidsynthesesystem aus vorbeladenen Aminoacyl-tRNS (d.h. mit daran angeknüpften aktivierten Aminosäuren) und gereinigten Translationsfaktoren (Biochem. Biophys. Res. Commun. 126:792–798 (1985)). Auf der anderen Seite rekonstruierten Pavlov und Mitarbeiter ein in vitro-Translationssystem unter Verwendung eines teilweise gereinigten Aminoacyl-tRNS-Synthetase-Gemischs mit gereinigten Translationsfaktoren (Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, Nr. 1, 9–16 (1996)). Sie konstruierten auch ein vollständig gereinigtes in vitro-Translationssystem unter Verwendung von kurzer künstlicher mRNS (J. Mol. Biol. 273:389–401 (1997)). Es wurde jedoch soweit die Erfinder wissen nie berichtet, dass ein Protein erfolgreich aus natürlicher mRNS unter Verwendung eines Translationssystems synthetisiert wurde, das ausschließlich essentielle Enzyme und Faktoren umfasst. In den konventionellen zellfreien Peptidsynthesesystemen und in vitro-Peptidsynthesesystemen unter Verwendung von Zellextrakten werden darüber hinaus mühselige Arbeitsschritte für die Isolierung und Reinigung eines Zielpeptidprodukts aus Proteinkomponenten im Reaktionssystem benötigt und deshalb kann nur eine geringe Ausbeute des Zielpeptids erhalten werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung zielt darauf ab, ein effizientes Proteinsynthesesystem zu gestalten, wodurch das Problem des Energieverbrauchs in Systemen zur Peptidsynthetisierung in vitro gelöst werden kann, und ein in vitro-Peptidsynthesesystem zur Verfügung zu stellen, womit ein Peptidprodukt mit hoher Reinheit aus dem Reaktionssystem effizient isoliert werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats unter Verwendung entweder (a) eines Reaktionssystems zur Transkription einer DNS in eine RNS und anschließenden Translation der hergestellten RNS oder (b) eines Reaktionssystems zur Translation einer RNS in vitro, das dadurch charakterisiert ist, dass sämtliche Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, mit einer Markierung gekennzeichnet sind, die in der Lage ist, selektiv an ein Adsorptionsmittel zu binden und dieses Adsorptionsmittel zum Fangen dieser markierten Proteinkomponenten nach der Translation des Peptids oder Peptidderivats verwendet wird, wodurch ermöglicht wird, das hergestellte Peptid oder Peptidderivat von den das Reaktionssystem ausmachenden markierten Proteinkomponenten zu trennen.
In diesem Verfahren kann eine Vielzahl von Kombinationen der Markierung und des Adsorptionsmittels im Transkriptions-/Translationsreaktionssystem verwendet werden.
Die markierten Proteinkomponenten sind Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- oder Translationsreaktion und andere Enzyme, die für den Aufbau des Reaktionssystems benötigt werden.
Besondere Beispiele dieser Faktoren und Enzyme umfassen Initiationssfaktoren, Elongationsfaktoren, Terminationsfaktoren, Aminoacyl-tRNS-Synthetase, Methionyl-tRNS-Transformylase und RNS-Polymerase.
Beispiele der für den Aufbau des Reaktionssystems benötigten Enzyme, andere als die Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- oder Translationsreaktion, umfassen Enzyme zum Regenerieren von Energie im Reaktionssystem und Enzyme zum Hydrolysieren anorganischer Pyrophosphorsäure, die während der Transkriptions- oder Translationsreaktion gebildet wird.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung können nicht natürliche Peptide, die nicht natürliche Aminosäurereste tragen, die an gewünschten Positionen eingebaut sind, und Peptidderivate, wie z.B. Polysomen-Displays, unter Verwendung des Reaktionssystems zum Transkribieren einer DNS in eine RNS und anschließender Translation der gebildeten RNS oder in vitro-Translation der RNS, die frei von Terminationsfaktoren ist, hergestellt werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die Kombination von Substanzen, die gegenseitig in der Affinitätschromatographie wechselwirken, d.h. Markierung und Adsorptionsmittel, aus einer Kombination eines Proteins oder eines Peptidfragments mit einem Metallion, einer Kombination eines Antigens mit einem Antikörper, einer Kombination eines Proteins mit einem Protein oder einem Peptidfragment, einer Kombination eines Proteins mit einer spezifischen niedrigmolekularen Gewichtskomponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Aminosäuren, DNS, Farbstoffen, Vitaminen und Lektinen besteht, einer Kombination eines Proteins mit einem Saccharid und einer Kombination eines Proteins oder eines Peptidfragments mit einem Ionenaustauscherharz ausgewählt werden. Bei allen ist es günstig, eine Kombination einer Histidin-Markierung (engl.: histidine tag) mit einem Metallchelat, wie z.B. einem Nickelkomplex oder einem Kobaltkomplex, unter Ausnutzung einer Verbindung zwischen einem Protein oder einem Peptidfragment und einem Metallion, zu verwenden.
Die Substanzen, die sich gegenseitig binden und in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, d.h. Markierung und Adsorptionsmittel, sind nicht auf eine Kombination von Substanzen beschränkt, die in der Affinitätschromatographie gegenseitig wechselwirken. Daher kann z.B. auch Verwendung von Substanzen gemacht werden, die sich magnetisch aneinander binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen Satz (engl.: kit) von Proteinkomponenten für ein Reaktionssystem zur Herstellung eines Peptids oder Peptidderivats durch Transkription entweder (a) einer DNS in eine RNS und anschließender Translation der erzeugten RNS oder (b) Translation einer RNS in vitro, die dadurch gekennzeichnet ist, dass der Satz sämtliche Proteinkomponenten umfasst, die das Reaktionssystem ausmachen, und dass alle Proteinkomponenten in dem Satz mit einer Markierung gekennzeichnet sind, die in der Lage ist, selektiv an ein Adsorptionsmittel zu binden.
In diesem Satz sind die markierten Proteinkomponenten Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- oder Translationsreaktion und andere Enzyme, die für den Aufbau des Reaktionssystems benötigt werden. Besondere Beispiele der Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- oder Translationsreaktion umfassen Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Terminationsfaktoren, Aminoacyl-tRNS-Synthetase, Methionyl-tRNS-Transformylase und RNS-Polymerase. Spezielle Beispiele für die für den Aufbau des Reaktionssystems benötigten Enzyme, andere als die Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- und Translationsreaktion, umfassen Enzyme zum Regenerieren von Energie im Reaktionssystem und zum Hydrolysieren anorganischer Pyrophosphorsäure, die während der Transkriptions- oder Translationsreaktion gebildet wird. Der Satz aus Proteinkomponenten gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Adsorptionsmittel zum Einfangen der Proteinkomponenten umfassen, die mit einer Markierung gekennzeichnet sind.
Der Satz aus Proteinkomponenten gemäß der vorliegenden Erfindung kann Kombinationen der Markierung und des Adsorptionsmittels für das Einfangen der markierten Proteinkomponenten umfassen, die jeweils unterschiedlich sind.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
[1]
1 zeigt E. coli-Ribosomfraktionen unter einem Saccharose-Dichtegradienten.
[2]
2 zeigt 12 % SDS-PAGE Muster von His-markierten Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren (gefärbt mit Coomassie-Brilliantblau).
[3]
3A zeigt die relativen DHFR-Aktivitäten von Hismarkierten Initiationsfaktoren und 3B zeigt die optimalen Konzentrationen von His-markierten Initiationsfaktoren, die in den relativen DHFR-Aktivitäten ausgedrückt sind.
[4]
4 zeigt die Aktivitäten von His-markierten Terminationsfaktoren, die als Ausbeuten von fMFL ausgedrückt sind.
[5]
5A zeigt ein Diagramm der UV-Absorption bei 570 nm von Eluat, das His-markierte SerRS enthält. 5B zeigt ein Chromatogramm von His-markiertem SerRS.
[6]
6 zeigt 12 % SDS-PAGE Muster von His-markierten ARSs und MTF.
[7]
7A zeigt die optimalen Konzentrationen von His-markierten Terminationsfaktoren in dem in vitro-poly(Phe)-Synthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung, die als die Phe-Einbaulevel ausgedrückt sind. 7B zeigt den Verlauf der Poly(Phe)-Synthesereaktionen (ausgedrückt in den Phe-Einbaulevel) in dem in vitro-Synthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung und in dem S100-Extraktsystem.
[8]
8A zeigt 12 % SDS-PAGE Muster von [³⁵S] Met-enthaltenden DHFR-Produkten, die jeweils unter Verwendung des in vitro-Synthesesystems gemäß der vorliegenden Erfindung und des S30-Systems synthetisiert wurden. 8B zeigt die DHFR-Aktivitäten dieser Produkte.
[9]
9 zeigt die Zeitverläufe der DHFR-Synthesereaktionen in dem in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung und in dem S30-System.
[10]
10 zeigt den Verbrauch der Energiequelle in dem in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung (rechts) und in dem S30-System (links) mit dem Verlauf der Zeit.
[11]
11 zeigt die Bildung von DHFR, das einen Valinrest trägt, der in die 37-Position eingebaut ist, als ein Modell der Inkorporation von einer nicht natürlichen Aminosäure in dem in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung.
[12]
12A zeigt ein Diagramm der UV-Absorption bei 570 nm von Eluat, das His-markierte T7RNS-Polymerase enthält. 12B zeigt ein Chromatogramm der His-markierten T7RNS-Polymerase.
[13]
13 zeigt SDS-PAGE Muster von verschiedenen Proteinen, die unter Verwendung des in vitro-Synthesesystems der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden.
[14]
14 zeigt die Reinheit von DHFR, das das Translationsprodukt in dem in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung ist, nach Passieren einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Rückhaltevermögen (Cut-off) von 100 kDa und einer Nickelsäule. In dieser Figur zeigt der Pfeil die Position von DHFR.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Das in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung ist ein Reaktionssystem für die Synthetisierung eines Peptids durch Transkription einer DNS in eine RNS und anschließende Translation der gebildeten RNS oder Translation einer RNS ohne die Verwendung von Zellen per se. Der Begriff "Peptid", wie er hier benutzt wird, meint eine Substanz, die aus 2 oder mehr natürlichen oder nicht natürlichen Aminosäuren besteht, die aneinander über eine Peptidbindung gebunden sind, und umfasst in seiner Bedeutung Oligopeptide und Polypeptide. Darüber hinaus fallen Proteine, die eine spezifische dreidimensionale Polypeptidstruktur aufweisen, in diese Kategorie. Der Begriff "RNS", wie er hier benutzt wird, umfasst in seiner Kategorie synthetische RNSs und mRNSs, während der Begriff "DNS", wie er hier verwendet wird, in seiner Kategorie synthetische DNSs und cDNSs umfasst.
Das in vitro-Synthesesystem der vorliegenden Erfindung, wobei eine DNS in eine RNS transkribiert wird und anschließend die gebildete RNS translatiert oder eine RNS translatiert wird, ist ein Reaktionssystem, das in prokaryotischen Zellen oder eukaryotischen Zellen existiert und aus Ribosom, Faktoren und Enzymen für die Transkriptions- oder Translationsreaktion, anderen Enzymen, die für den Aufbau des Reaktionssystems benötigt werden, verschiedenen Substraten, Puffern und Salzen, besteht. Obwohl die ausgezeichneten Wirkungen der vorliegenden Erfindung in einem Reaktionssystem eingesetzt werden können, das komplett künstlich rekonstituiert wurde, ist die vorliegende Erfindung auch auf Reaktionssysteme anwendbar, bei welchen einige dieser Komponenten in Form eines Zellextrakts hinzugefügt werden.
Die Faktoren und Enzyme für die Transkriptions- oder Translationsreaktion sind nicht auf solche beschränkt, die aus prokaryotischen Zellen wie E. coli stammen, sondern man kann solche verwenden, die aus eukaryotischen Zellen stammen. Im Fall (1) der Translation einer RNS umfassen diese Faktoren Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren, Terminationsfaktoren, 20 Aminoacyl-tRNS-Synthetasen und tRNSs, die an natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren angeknüpft sind, und weiterhin ist die Methionyl-tRNS-Transformylase in einem E. coli originären Reaktionssystem enthalten. Im Fall (2) von Transkription einer DNS in eine RNS und anschließender Translation der gebildeten RNS umfassen diese Faktoren und Enzyme, zusätzlich zu den im oberen Fall (1) genannten Faktoren und Enzymen eine RNS-Polymerase, wie beispielsweise T7RNS-Polymerase. Die Translationsreaktion kann durch Eliminieren der Terminationsfaktoren aus dem Reaktionssystem des oben beschriebenen Falles (1) oder (2) reguliert werden, wie hierin später diskutiert werden wird.
Beispiele für die Enzyme außer den Faktoren und Enzymen für die Transkriptions- oder Translationsreaktion umfassen Enzyme zur Regeneration von Energie in dem Reaktionssystem, wie z.B. Kreatinkinase, Myokinase und Nukleosid-Diphosphatkinase (NDK), und Enzyme zum Hydrolysieren anorganischer Pyrophosphorsäure, die während der Transkriptions- oder Translationsreaktion gebildet wird, wie beispielsweise anorganische Pyrophosphatase.
Beispiele der verschiedenen Substrate umfassen natürliche Aminosäuren, nicht natürliche Aminosäuren, Nukleotid-Triphosphate als Energiequelle, Kreatinphosphat und Formylfolsäure. Nukleotidtriphosphate umfassen ATP, GTP, CTP und UTP. ATP und GTP werden im oben beschriebenen Fall (1) be nutzt, während ATP, GTP, CTP und UTP im oben beschriebenen Fall (2) benutzt werden.
Als Puffer wird normalerweise Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3) eingesetzt. Als Salze werden normalerweise z.B. Kaliumglutamat, Ammoniumchlorid, Magnesiumacetat, Kalziumchlorid, Putrezin, Spermidin und Dithiotreitol (DTT) verwendet. Es ist nicht notwendig zu sagen, dass andere als die oben genannten geeignete Komponenten ebenfalls in dem Reaktionssystem eingesetzt werden können.
Das erste Charakteristikum der vorliegenden Erfindung beruht darin, dass in einem System zum Synthetisieren eines Peptids durch Transkription einer DNS in eine RNS und anschließende Translation der gebildeten RNS oder Translation einer RNS in vitro, alle Proteinkomponenten, die das Transkriptions-/Translationsreaktionssystem ausmachen, mit einem Label markiert sind, und die andere Substanz als ein Adsorbtionsmittel für das Einfangen der markierten Proteinkomponenten nach der Translation verwendet wird. Somit kann das Zielpeptid leicht von den Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, abgetrennt und in extrem hoher Reinheit erhalten werden.
Ein Markieren mit Histidin wurde manchmal beim Herstellen und Reinigen individueller Proteinkomponenten eingesetzt, die ein Reaktionssystem bilden, insbesondere Faktoren und Enzyme für eine Transkriptions-/Translationsreaktion. Beispielsweise ist beschrieben, eine Histidin-Markierung beispielsweise bei der Herstellung und Reinigung von Elongationsfaktoren EF-Tu (Eur. J. Biochem. 210:177–183 (1992)), EF-G (Cell 92:131–139 (1998)) und EF-Ts (Archives of Biochemistry and Biophysics 348:157–162 (1997)), bei der Herstellung und Reinigung eines Terminationsfaktors RF2 (Prod. Natl. Acad. Sci. USA 95:8165–8169 (1998)), und bei der Her stellung und Reinigung von Phenalalanyl-tRNS-Synthetase (Protein Expression and Purification 8:347–357 (1996)) zu verwenden. In diesen Fällen wurde die Herstellung und Reinigung jedoch nicht durchgeführt, um ein in vitro-Peptidsynthese-System zu konstruieren, sondern lediglich um die Funktionen oder Eigenschaften von individuellen Proteinen zu untersuchen.
Um ein Protein oder ein Proteinderivat abzutrennen, welches durch Expression eines Gens in einem Transformanten, beispielsweise E. coli, gebildet wurde, wurde Affinitätschromatographie mit Verwendung einer Kombination einer Histidin-Markierung mit einer Nickelsäule, einer Kombination einer Glutathion-S-Transferase mit einer Glutathion-Sepharoseharzsäule oder einer Kombination einer Epitop-Markierung mit einem Antikörper verwendet. In einem solchen Fall war es die Praxis, in das Zielpeptid einen Rest einzubauen, der in der Lage ist, selektiv an die Adsorptionssäule zu binden. In zellfreien Systemen mit der Verwendung von vermarkteten Zellextrakten wird von einem Vektor Gebrauch gemacht, um eine Histidin-Markierung in ein Zielpeptid einzubauen. In einem solchen Fall wird daher das Produkt in der Form eines fusioniarten Proteins aus dem Zielpeptid mit der Histidin-Markierung erhalten, welches enzymatisch von dem Peptid nach dem Synthetisieren abgespalten werden sollte.
Im Gegensatz zu diesen herkömmlichen Methoden haben die vorliegenden Erfinder nicht in das Zielpeptid, sondern in Proteinkomponenten, die das in vitro-Peptidsynthesesystem ausmachen, ein Paar von Substanzen eingeführt, die aneinander binden, basierend auf einem neuen Ergebnis, dass die Transkriptions- oder Translationsreaktion sogar dann stattfinden kann, wenn die Faktoren und Enzyme für die Transkription oder Translation und andere Enzyme mit einer eines Paares von Substanzen markiert sind, die aneinander binden.
Die Kombination eines Paares von Substanzen, die aneinander binden, die in der vorliegenden Erfindung Anwendung findet, kann eine beliebige sein, solange die Transkriptions- oder Translationsreaktion dadurch nicht gestört wird. Obwohl die Bindung dieser Substanzen aneinander entweder reversibel oder irreversibel sein kann, ist es bevorzugt, ein Paar von Substanzen zu verwenden, welche reversibel aneinander binden. Dies liegt daran, dass die Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, in einem solchen Fall wiederholt verwendet werden können.
Als ein Beispiel für die Kombination der Substanzen, die aneinander binden, kann die Kombination einer Adsorptionssäule mit einer Substanz genannt werden, die in der Lage ist, selektiv an die Adsorptionssäule zu binden. Typische Beispiele hierfür umfassen Substanzen, die sich in der Affinitätschromatographie gegenseitig beeinflussen. Beispielsweise dient ein Metallkomplex, wie z.B. ein Nickel- oder Kobaltkomplex, als ein Ligand einer Adsorptionssäule, während eine Histidin-Markierung als Substanz dient, die selektiv an die Adsorptionssäule binden kann. Darüber hinaus können Kombinationen von verschiedenen Liganden mit Substanzen, die selektiv daran binden können, verwendet werden, wie später diskutiert werden wird, solange die Reaktion dadurch nicht gestört wird. D.h., dass die in der vorliegenden Erfindung verwendbare Kombination der Substanzen, die sich in der Affinitätschromatographie gegenseitig beeinflussen, unter z.B. einer Kombination eines Proteins oder eines Peptidfragments mit einem Metallion, einer Kombination eines Antigens mit einem Antikörper, einer Kombination eines Proteins mit einem Protein oder einem Peptidfragment, einer Kombination eines Proteins mit einer spezifischen niedermolekularen Gewichtskomponente, die aus einer Gruppe ausgewählt sein kann, die aus Aminosäuren, DNSs, Farbstoffen, Vitaminen und Lektinen besteht, einer Kombination eines Proteins mit einem Saccharid und einer Kombination eines Proteins oder eines Peptidfragments mit einem Ionenaustauscher-Harz ausgewählt sein kann.
Die Substanzen, die aneinander binden und in der vorliegenden Erfindung einsetzbar sind, sind nicht auf eine Kombination von Substanzen beschränkt, die sich in der Affinitätschromatographie gegenseitig beeinflussen, sondern können abhängig von dem Zweck beliebig ausgewählt werden. Z.B. können dafür Substanzen verwendet werden, die magnetisch aneinander binden. Als ein Beispiel hierfür kann eine Kombination eines mit magnetischen Kügelchen markierten Proteins mit einem Magnet zitiert werden. In diesem Fall können Proteinkomponenten, die das Peptidsynthesesystem ausmachen und die individuell mit den magnetischen Kügelchen markiert sind, von dem Magneten adsorbiert und so eingefangen werden.
In der vorliegenden Erfindung wird das Adsorptionsmittel beispielsweise in der Form einer Säule, einer Matrix, eines Filters, oder eines Kügelchens eingesetzt. Alternativ dazu kann es, wenn gewünscht, an einen Träger (Support) fixiert sein. Um das Adsorptionsmittel an den Träger zu fixieren, kann abhängig von den Eigenschaften des Adsorptionsmittels ein geeignetes Mittel aus bekannten Techniken ausgewählt werden.
Es gibt eine Mehrzahl von Kombinationen der Substanz zum Markieren eines Teils oder aller Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, mit der Substanz, die als das Adsorptionsmittel zum Einfangen der so markierten Proteinkomponenten verwendet wird. Es ist möglich, solche Kombinationen zu verwenden, die voneinander in einem einzigen Reaktionssystem abweichen. Es kann vielmehr als bevorzugt angesehen werden, die am meisten geeigneten Markierungen für die jeweiligen Proteinkomponenten auszuwählen und dann Adsorptionsmittel auszuwählen, die für diese Markierungen geeignet sind.
Da die Faktoren und Enzyme für das Transkriptions-/Translationsreaktionssystem und andere Enzyme in der vorliegenden Erfindung mit einer eines Paares der Substanzen markiert sind, die aneinander binden, können die Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, jeweils in einem sehr sauberen Zustand erhalten werden, und das Reaktionssystem ist nicht mit irgendwelchen unbekannten und unnötigen oder inhibitorischen Komponenten verunreinigt. Somit kann das Reaktionssystem etabliert werden und folglich kann die Reaktionseffizienz in hohem Maße erhöht werden. Zusätzlich wird es möglich, das Zielpeptid von den Reaktionskonstituenten nach der Synthese des Peptids schnell abzutrennen. In den herkömmlichen zellfreien Systemen wird ein Peptid, das durch die Reaktion gebildet wurde, durch Extraktion gereinigt. Es ist daher in jedem Fall notwendig, eine geeignete Reinigungsprozedur auszuwählen, abhängig von den physikalischen und chemischen Eigenschaften des Reaktionsprodukts. In der vorliegenden Erfindung werden im Gegensatz dazu die Komponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, durch Verwendung des Adsorptionsmittels eliminiert und das Reaktionsprodukt wird so gereinigt. Demgemäß ist es theoretisch möglich, die gleiche Reinigungsprozedur auf jegliche Reaktionsprodukte, unabhängig von deren physikalischen und chemischen Eigenschaften anzuwenden. Zusätzlich hat das auf diese Weise erhaltene Zielpeptid eine sehr hohe Reinheit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können weiterhin die Komponenten des Reaktionssystems sicher kontrolliert werden, wodurch es ermöglicht wird, ein Reaktionssystem frei von Terminationsfaktoren zu etablieren. Auf Grund dieses Merk mals ermöglicht die vorliegende Erfindung die Konstruktion von Polysomen-Displays verschiedener Typen, wodurch der Anwendungsbereich des in vitro-Peptidsynthesesystems erweitert wird. Genauer gesagt können ternäre Komplexe (Polysomen-Displays), die aus Peptid, RNS und Ribosom gebildet sind, durch Exprimieren verschiedener DNS oder RNS in dem Terminationsfaktor-freien in vitro-Peptidsynthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Durch Abtrennen eines solchen Polysomen-Displays von anderen Komplexen mit der Verwendung des Peptids als Ziel können das Zielpeptid und RNS zur gleichen Zeit erhalten werden. Durch Behandlung des Produkts mit Terminationsfaktoren kann die korrespondierende RNS erhalten werden. In diesem Fall kann das Peptid, das von dem Ribosom abgetrennt wurde, und die dazu korrespondierende RNS einfach durch Behandlung mit Terminationsfaktoren isoliert werden, die mit einer eines Paares der Substanzen markiert sind, die aneinander binden. Z.B. kann eine korrespondierende DNS aus einem isolierten Polysomen-Display unter Verwendung der RT-PCR-Methode erhalten werden, wie in Current Opinion in Biotechnology 9:534–548 (1998) beschrieben ist. Durch Abbauen dieses Polysomen-Displays mit EDTA kann eine RNS erhalten werden. Es ist insbesondere technisch vorteilhaft, dass eine RNS oder eine DNS, die zu einem gewählten Zielpeptid korrespondiert, leicht durch zufällige (random) Expression erhalten werden kann. Obwohl halb zufällige Expression von DNS und RNS in einem zellfreien System unter der Verwendung eines Kaninchen-Retikulozytenkits bereits bekannt ist, werden in diesem Fall komplizierte Prozeduren benötigt (WO 91/05058).
Durch das sichere Kontrollieren der Komponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, wird es durch das in vitro-Peptidsynthesesystem möglich, ein Peptid zu synthetisieren, das einen nicht natürlichen Aminosäurerest hat. Und zwar kann ein Peptid, das einen nicht natürlichen Aminosäurerest hat, unter Verwendung des Herstellungsverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung folgendermaßen synthetisiert werden. Eine Suppressor-tRNS, die mit einem nicht natürlichen Aminosäurerest beladen ist, und die einem Terminationskodon entspricht, das von dem C-terminalen Terminationskodon abweicht, wird zu dem Reaktionssystem zugegeben. Dann wird eine DNS oder eine RNS, die durch Einfügung eines mit der Suppressor-tRNS korrespondierenden Terminationskodons in eine Position für die Einfügung eines nicht natürlichen Aminosäurerestes modifiziert wurde, transkribiert oder translatiert, um so ein Peptid zu ergeben, das den nicht natürlichen Aminosäurerest darin eingebaut hat. Detaillierter ausgedrückt kann die Synthese folgendermaßen ausgeführt werden. Um den nicht natürlichen Aminosäurerest einzufügen, wird einer der Terminationskodone (UAA, UAG und UGA) wie z.B. UGA oder UAG, in eine gewünschte Position innerhalb des Offenen Leserahmens (engl.: Open Reading Frame) (ORF) eingefügt, und UAA wird zum Beenden der Translation eingesetzt. Anschließend wird durch in vitro-Transkription eine Suppressor-tRNS gebildet, die ein Antikodon zu UGA und/oder UAG trägt, und mit der nicht natürlichen Aminosäure beladen. Dann wird das Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung dieser RNS und der Suppressor-tRNS wie oben beschrieben durchgeführt, um die RNS zu translatieren. So kann ein Peptid synthetisiert werden, in welches der nicht natürliche Aminosäurerest stellenspezifisch eingefügt ist. Alternativ dazu kann das Peptid durch separates Synthetisieren der entsprechenden DNS mit anschließender Transkription und Translation synthetisiert werden.
Die Verwendung eines Reaktionssystems, das durch Eliminierung von Terminationsfaktoren aus dem oben beschriebenen Reaktionssystem erhalten wird, ermöglicht es, ein Polysomen-Display aus Peptid, mRNS und Ribosom, das eine oder mehrere nicht natürliche Aminosäurereste an der oder den gewünschten Positionen trägt, zu erhalten. Durch Behandlung dieses Polysomen-Displays mit Terminationsfaktoren, die mit einer eines Paares von Substanzen, die aneinander binden, markiert sind, wie in dem obigen Fall, kann das Peptid, das von dem Ribosom abgetrennt wurde, und die damit korrespondierende RNS leicht isoliert werden. Z.B. kann eine korrespondierende DNS von einem Polysomen-Display unter Verwendung der RT-PCR-Methode, wie in Current Opinion in Biotechnology 9:534–548 (1998) beschrieben, erhalten werden. Durch Abbau dieses Polysomen-Displays mit EDTA ist es ebenfalls möglich, die RNS zu erhalten.
Demgemäß umfassen die Peptidderivate, die durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt sind, Polysomen-Displays und nicht natürliche Peptide, die nicht natürliche Aminosäurereste an gewünschten Positionen haben.
Das Verfahren zum Herstellen eines Peptids oder eines Peptidderivates gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung eines Batchsystems in herkömmlicher Art durchgeführt werden. Alternativ dazu kann es unter Verwendung verschiedener bereits bekannter oder herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden, wie z.B. einer Durchströmungsmethode, wobei Materialien einschließlich der Substrate kontinuierlich zugeführt oder das Reaktionsprodukt gelegentlich verworfen wird, oder einer Dialysemethode (siehe z.B. die japanische Patentveröffentlichung 110236/1995, Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic acids and Enzymes) Vol. 44, Nr. 4, 598–605 (1999), Current Opinion in Biotechnology 9:534–548 (1998)).
Als Nächstes wird die vorliegende Erfindung durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele detaillierter ausgeführt werden. Es sollte jedoch verstanden sein, dass die Erfindung nicht als darauf beschränkt auszulegen ist.
(1) Peptide und Peptidderivate, die durch die Erfindung hergestellt werden können
Gemäß dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung können natürliche Peptide und nicht natürliche Peptide jeden Typs hergestellt werden. D.h., die Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, Peptide herzustellen, die durch in Wirtszellen entstehende Proteasen digeriert werden würden, wie beispielsweise Dihydrofolatreduktase (DHFR), Lysozym (in λ-Phage entstehend) und grün fluoreszierende Proteine (GFPs), sowie Peptide, die bei Wirtszellen Toxizität zeigen. Der Ausdruck "natürliche Peptide", wie er hier benutzt wird, meint Peptide, die von 20 natürlichen Aminosäuren gebildet sind, die in genetischen Codes benutzt werden, während Peptide, die andere als α-Aminosäuren enthalten, als "nicht natürliche Peptide" bezeichnet werden.
Darüber hinaus können ternäre Komplexe (Polysomen-Displays), die aus Peptid, RNS und Ribosom gebildet sind, leicht unter Verwendung eines Terminationsfaktor-freien Reaktionssystems im Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden.
Beispiele von nicht natürlichen Peptiden, die durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, umfassen Peptide, die modifizierte natürliche Aminosäuren, modifizierte nicht-geladene Aminosäuren, modifizierte saure Aminosäuren, modifizierte basische Aminosäuren, nicht- α-Aminosäuren, Aminosäuren mit Φ, Φ-Winkelabstand, und Aminosäuren mit funktionellen Gruppen, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Nitrogruppe, Amidin, Hydroxylamin, Chinon, aliphatischen Verbindungen und zyklischen und nicht gesättigten Hydrocarbylgruppen besteht, haben. Es gibt bereits bekannte Verfahren zum Synthetisieren dieser Peptide in zellfreien
Proteinsynthesesystemen unter der Verwendung von Zellextrakten (siehe z.B. JP-W-Hei-4-504651/WO90/05785). Als ein bestimmtes Beispiel dieser nicht natürlichen Peptide kann DHFR, das einen an einer geeigneten Position eingefügten geschützten Cysteinrest hat, und das nicht in der Natur vorkommen würde, zitiert werden. Weiterhin können Peptide aufgeführt werden, die einen nicht natürlichen Aminosäurerest wie beispielsweise p-Fluorophenylalanin, p-Nitrophenylalanin oder Homophenylalanin aufweisen, der an einer gewünschten Position eingebaut ist. Es ist bereits bekannt, dass Varianten der β-Laktamase, die diese 3 nicht natürlichen Aminosäurereste als ein Ersatz für Phenylalanin an der Position 66 eingebaut haben, ausreichende Enzymaktivität zeigen (Bio Industry 8:749–759 (991) [Anmerkung des Übersetzers: 1991]). Diese nicht natürlichen Peptide können ebenfalls leicht durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
(2) Ribosom
Ribosom ist ein Partikel, wo Peptide synthetisiert werden. Es bindet an mRNS und koordiniert Aminoacyl-tRNS an die A-Position und Formylmethionyl-tRNS oder Peptidyl-tRNS an die P-Position, wobei eine Peptidbindung gebildet wird (Science 289:920–930 (2000)). In der vorliegenden Erfindung kann jedes Ribosom, unabhängig von dessen Ursprung, verwendet werden, solange es die Funktion wie oben beschrieben hat. Obwohl normalerweise ein E. coli Ribosom eingesetzt wird, können auch eukaryotische Ribosomen eingesetzt werden. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, ein E. coli Ribosom zu verwenden, z.B. solche, die aus den E. coli-Stämmen A19 oder MRE 600 erhalten werden.
(3) Faktoren und Enzyme für die Transkription oder Translation, die in dem in vitro Peptidsynthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden
(3-1) Initiationsfaktoren
Initiationsfaktoren bedeutet Faktoren, die notwendigerweise bei der Bildung eines Initiationskomplexes in dem Prozess der Peptidsynthese benötigt werden oder diesen deutlich fördern. IF1, IF2 und IF3 sind als Initiationsfaktoren aus E. coli bekannt (Biochmistry 29:5881–5889 (1990)). IF3 fördert die Dissoziation des Ribosoms in 30S- und 50S-Untereinheiten (d.h., der Schritt, der zum Initiieren der Translation benötigt wird) und behindert die Einführung von tRNS außer der Formylmethionyl-tRNS in die P-Position im Schritt der Bildung des Initiationskomplexes. IF2 bindet an Formylmethionyl-tRNS und transferiert die Formylmethionyl-tRNS zu der P-Position der 30S-Untereinheit, wobei der Initiationskomplex gebildet wird. IF1 potenziert die Funktionen von IF2 und IF3. In der vorliegenden Erfin dung ist es bevorzugt, Initiationsfaktoren aus E. coli zu verwenden, beispielsweise solche, die von dem E. coli-Stamm K12 erhalten werden. Es ist jedoch auch möglich, eukaryotische Initiationsfaktoren zu verwenden.
(3-2) Elongationsfaktoren
Ein Elongationsfaktor EF-Tu wird in zwei Typen klassifiziert, d.h. GTP- und GDP-Typen. EF-Tu des GTP-Typs bindet an Aminoacyl-tRNS und transferiert sie zu der A-Position des Ribosoms. Wenn EF-Tu vom Ribosom freigesetzt wird, wird GTP zu GDP hydrolysiert (EMBO J. 17:7490–7497 (1998)). Ein weiterer Elongationsfaktor EF-Ts bindet an EF-Tu des GDP-Typs und fördert dessen Konversion in den GTP-Typ (Archives of Biochemistry and Biophysics 348:157–162 (1997)). Ein weiterer Elongationsfaktor EF-G fördert die Translokation, die der Bildung der Peptidbindung in dem Prozess der Peptidkettenelongation folgt (Nature Structural Biology 6:643–647 (1999), FEMS Microbiology Reviews 23:317–333 (1999)). In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, Elongationsfaktoren aus E. coli zu verwenden, die von dem E. coli-Stamm K12 erhalten werden. Es ist jedoch auch möglich, eukaryotische Elongationsfaktoren zu verwenden.
(3-3) Terminationsfaktoren
Terminationsfaktoren werden notwendigerweise bei Beenden der Proteinsynthese, bei Freisetzen der translatierten Peptidkette und beim Recyclen des Ribosoms für die Initiation der anschließenden mRNS-Translation benötigt. Wenn ein Protein in ei nem terminationsfaktorfreien Translationssystem synthetisiert wird, stoppt die Reaktion vor dem Terminationskodon und so kann ein stabiler ternärer Komplex (Polysomen Display), der aus Ribosom, Peptid und mRNS besteht, leicht gebildet werden. Eine nicht natürliche Aminosäure wird in eine Peptidkette durch Eliminierung von entweder RF1 oder RF2 aus dem Reaktionssystem eingefügt. D.h., eine nicht natürliche Aminosäure wird mit hoher Effizienz in das UAG-Kodon, im Fall der Eliminierung von RF1, oder in das UGA-Kodon, im Fall der Eliminierung von RF2, eingefügt.
Wenn sich ein Terminationskodon (UAA, UAG oder UGA) an der A-Position des Ribosoms befindet, treten die Terminationsfaktoren RF1 und RF2 in die A-Position ein und fördern die Dissoziation der Peptidkette von der Peptidyl-tRNS an der P-Position. RF1 erkennt UAA und UAG unter den Terminationskodonen, während RF2 UAA und UGA erkennt. Ein weiterer Terminationsfaktor RF3 fördert die Dissoziation von RF1 und RF2 vom Ribosom nach der Dissoziation der Peptidkette durch RF1 und RF2. Der Ribosomrecyclingfaktor (RRF) fördert die Dissoziation von tRNS, die nach der Proteinsynthese an der P-Position verbleibt, und das Recycling des Ribosoms für die anschließende Proteinsynthese. In der vorliegenden Erfindung wird auf RRF als einen der Terminationsfaktoren Bezug genommen. Die Funktionen der Terminationsfaktoren RF1, RF2, RF3 und RRF sind in EMBO J. 16:4126–4133 (1997) und EMBO J. 16:4134–4141 (1997) beschrieben. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, aus E. coli stammende Terminationsfaktoren zu verwenden, z.B. solche, die aus dem E. coli-Stamm K12 erhalten werden. Es ist je doch auch möglich, eukaryotische Terminationsfaktoren zu verwenden.
(3-4) Aminoacyl-tRNS-Synthetase
Aminoacyl-tRNS-Synthetase ist ein Enzym, durch das eine Aminosäure in der Anwesenheit von ATP kovalent an tRNS gebunden wird, wodurch eine Aminoacyl-tRNS synthetisiert wird (RNA 3:954–960 (1997), Tanpakushitsu, Kakusan, Koso (Proteins, Nucleic Acids and Enzymes) 39:1215–1225 (1994)). In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, eine aus E. coli stammende Aminoacyl-tRNS-Synthetase zu verwenden, z.B. eine, die aus einem E. coli-Stamm K12 erhalten wurde. Es ist jedoch auch möglich, eine eukaryotische Aminoacyl-tRNS-Synthetase zu verwenden.
(3-5) Methionyl-tRNS-Transformylase
N-Formylmethionin (fMet), das eine an die Aminogruppe am Ende des Methionins gebundene Formylgruppe trägt, dient als Initiationsaminosäure in einem prokaryotischen Proteinsynthesesystem. Diese Formylgruppe wird an das Methionin in der Methionyl-tRNS durch Methionyl-tRNS-Transformylase (MTF) angefügt. Die Methionyl-tRNS-Transformylase transferiert nämlich die Formylgruppe in N¹⁰-Formyltetrahydrofolat zu dem N-Endpunkt der Methionyl-tRNS, die mit dem Initiationskodon korrespondiert, wodurch sich die Formylmethionyl-tRNS ergibt (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:875–880 (1999)). Die so angehängte Formylgruppe wird durch IF2 erkannt und dient somit als ein Initiationssignal für die Proteinsynthese. Obwohl MTF nicht in dem Synthesesystem in eukaryotischem Zytoplasma auftritt, ist es in den Synthesesystemen in eukaryotischen Mitochondrien oder Chloroplasten vorhanden. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, aus E. coli stammende Methionyl-tRNS-Transformylase zu verwenden, z.B. eine, die aus E. coli-Stamm K12 erhalten wurde.
(3-6) RNS-Polymerase
Es ist bekannt, dass die RNS-Polymerase, die ein Enzym ist, das eine DNS-Sequenz in eine RNS transkribiert, in verschiedenen Organismen vorkommt. Als ein Beispiel hierfür kann die T7RNS-Polymerase, die in T7 Phagen entsteht, genannt werden, die ein Enzym ist, das an eine bestimmte DNS-Sequenz bindet, die T7-Promoter genannt wird, und welche dann die stromabwärts gelegene DNS-Sequenz in eine RNS transkribiert. Die Erfinder fügten eine His-Markierung an den N-Endpunkt dieser T7RNS-Polymerase an und exprimierten diese als ein fusioniertes Protein in großer Menge in E. coli-Stamm BL21. Dann reinigten sie das Expressionsprodukt durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Nickelsäule. Die so erhaltene His-markierte T7RNS-Polymerase ist eine Neue. Zusätzlich zur T7RNS-Polymerase können verschiedene RNS-Polymerasen in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Z.B. können die handelsübliche T3RNS-Polymerase und die SP6RNS-Polymerase verwendet werden.
(3-7) Aminoacyl-tRNS, die an eine nicht natürliche Aminosäure angehängt ist
Durch das Einfügen von anderen Aminosäureresten in Proteine als den 20 Aminosäuren, die die natürli chen Proteine bilden, ist es möglich, die inhärenten Funktionen der Proteine zu verbessern, oder den Proteinen neue nützliche Funktionen oder Merkmale zu verleihen. Eine Aminoacyl-tRNS, die an eine nicht natürliche Aminosäure angehängt ist, kann hergestellt werden, indem eine 3'-terminale CA-arme Suppressor-tRNS durch in vitro-Transkription synthetisiert und an chemisch synthetisiertes Aminoacyl-pCpA, das die nicht natürliche Aminosäure trägt, unter Verwendung von RNS-Ligase gebunden wird (Baiosaiensu to Indasutori (Bioscience and Industry) 47:16–24 (1989)).
(4) Enzyme, die für den Aufbau des Reaktionssystems benötig werden, außer den Faktoren und Enzymen für die Transkription und Translation, die in dem in vitro-Peptidsynthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind
(4-1) Enzyme zum Regenerieren von Energie im Reaktionssystem
Beispiele für die Enzyme dieses Typs schließen Kreatinkinase, Myokinase und Nukleosiddiphosphatkinase (NDK) ein. Die Kreatinkinase, die auch Kreatinphosphokinase (CPK) genannt wird, katalysiert den Transfer der Phosphatgruppe von ATP auf Kreatin. Die Myokinase, die auch Adenylatkinase genannt wird, ist an der Regeneration von ATP aus ADP und der gleichzeitigen Bildung von AMP beteiligt. NDK katalysiert den γ-Phosphatgruppentransfer zwischen Nukleosiddiphosphat und Nukleosidtriphosphat. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, solche Enzyme zu verwenden, die aus E. coli stammen, z.B. solche, die aus dem E. coli-Stamm K12 erhalten wer den. Es ist jedoch auch möglich, eukaryotische Enzyme zu verwenden.
(4-2) Enzyme für das Hydrolysieren anorganischer Pyrophosphorsäure, die während der Transkriptions- oder Translationsreaktion gebildet wird
Als ein Beispiel für Enzyme dieses Typs kann anorganische Pyrophosphatase zitiert werden. In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, aus E. coli stammende Enzyme zu verwenden, z.B. solche, die aus dem E. coli-Stamm K12 erhalten werden. Es ist jedoch auch möglich, eukaryotische Enzyme zu verwenden.
Unter den Komponenten des Reaktionssystems wie oben in (3) oder (4) beschrieben, werden Proteinkomponenten in einer großen Menge in E. coli (z.B. marktüblicher E. coli-Stamm BL21) in der Form von fusionierten Proteinen (z.B. His-markierte Proteine) exprimiert, die am N- oder C-Endpunkt mit einer eines Paares von Substanzen markiert sind, die aneinander binden, wie es nachfolgend detaillierter beschrieben wird. Dann werden diese so exprimierten Proteine unter Verwendung einer Nickelsäule gereinigt, die mit einem Adsorptionsmittel verbunden ist, das die andere Substanz enthält, wie z.B. durch schnelle Proteinflüssigkeitschromatographie (FPLC), und dann dem Reaktionssystem bereitgestellt. Neben E. coli ist es auch möglich, diese Proteine in tierischen Zellen, Hefen, Bacillus subtilis oder ähnlichem zu exprimieren. Alternativ dazu ist es möglich, diese Proteine unter Verwendung eines in vitro-Peptidsynthesesystems herzustellen.
(5) Label und Adsorptionsmittel, d.h., ein Paar von Substanzen, die aneinander binden
In der vorliegenden Erfindung sind sämtliche der Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem, wie unter (3) und (4) beschrieben, ausmachen, mit einer eines Paares von Substanzen markiert, die aneinander binden, und die so markierten Proteinkomponenten werden durch die Verwendung der anderen Substanz als Adsorptionsmittel eingefangen, um dadurch das in dem Reaktionssystem gebildete Zielpeptid zu isolieren. Als typische Beispiele eines Paars der Substanzen, die aneinander binden, können Substanzen, die sich in der Affinitätschromatographie gegenseitig beeinflussen, zitiert werden. Es kann jedoch jedes Paar von Substanzen, die aneinander binden, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ohne Beschränkung auf Substanzen, die sich in der Affinitätschromatographie gegenseitig beeinflussen, solange diese Substanzen beim Einfangen der Proteinkomponenten genutzt werden können.
Proteine üben physiologische Effekte durch spezifische gegenseitige Wechselwirkungen mit bestimmten Substanzen aus. Die Adsorptionschromatographie, die unter Ausnutzung einer solchen spezifischen Wechselwirkung (Affinität) zwischen einem Protein und einer bestimmten Substanz (Ligand) ausgeführt wird, wird Affinitätschromatographie genannt. Beispiele für eine Kombination von Substanzen, die spezifisch aneinander binden, umfassen ein Protein- oder Peptidfragment mit einem Metallion oder einer Chelatverbindung, ein Antigen mit einem Antikörper, ein Cytokin oder ein Hormon mit einem Rezeptor und ein Enzym mit einem Substrat oder einem Inhibitor. Dar über hinaus binden bestimmte Aminosäuren, DNS, Farbstoffe, Vitamine, Lektine und ähnliches gegenseitig an Proteine, die jeweilige Affinitäten dafür aufweisen.
Eine der Substanzen einer solchen Kombination ist, um ein Adsorptionsmittel zu bilden, als ein Ligand an einen Träger oder einen Support fixiert. Dann werden Materialien, die mit der anderen Substanz markiert sind (die Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem im Fall der vorliegenden Erfindung ausmachen), da hindurch geführt. Die Markierung (Label) bindet somit spezifisch an den Liganden. Affinitätschromatographie, die auf dieser spezifischen Bindung basiert, wurde allgemein als ein Mittel zur Reinigung von Proteinen eingesetzt. Verschiedene Träger werden durch eine Reihe von Herstellern vertrieben, was dieses Mittel sehr gut verfügbar macht. Bei der Reinigung eines Proteins unter Verwendung einer Antigen-Antikörperreaktion wird z.B. eine Kombination eines Antigendeterminanten (ein Epitop) mit einer bekannten Struktur mit einem für das Epitop spezifischen Antikörper verwendet. Es werden verschiedene Kombinationen von Vektoren und Adsorptionsmitteln für die Ausführung dieses Mittels vertrieben. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird von der Kombination von solchen Substanzen Gebrauch gemacht, die aneinander binden und die in Affinitätschromatographie eingesetzt werden. Bei der Herstellung der markierten Proteinkomponenten, die in der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, ist die Markierung bei der Reinigung sinnvoll. Es ist auch möglich, die Proteinkomponenten zur gleichen Zeit mit einer Vielzahl von Labeln zu markieren. In diesem Fall ist es möglich, dass das Label, das für die Reinigung im Herstellungsverfahren verwendbar ist, abgetrennt wird, während andere Label für die Separation des Zielprodukts verwendet werden, welches im in vitro-Peptidsynthesesystem gebildet wurde.
Nun werden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch Anführung einiger Beispiele der Kombination der Substanzen, die aneinander binden, dargestellt. Es ist jedoch zu verstehen, dass die vorliegende Erfindung nicht auszulegen ist als auf diese Beispiele beschränkt zu sein.
(5-1) Verfahren unter Verwendung der Bindung eines Proteins oder eines Peptidfragments an ein Metallion oder eine Chelatverbindung
A. His-Markierung mit Metallkomplex wie beispielsweise Nickelkomplex oder Kobaltkomplex
Es war ein Praxis, ein Protein durch Verwendung der Bindung einer His-Markierung an einen Metallkomplex, wie z.B. einen Nickelkomplex oder einen Kobaltkomplex, zu reinigen. Die His-Markierung wird nämlich an eine zu exprimierende DNS angefügt, sodass sich ein fusioniertes Protein mit einer His-Markierung ergibt. Dann wird dieses fusionierte Protein gefangen und unter Verwendung einer Säule gereinigt, die z.B. einen Nickelkomplex, einen Kobaltkomplex, einen Kupferkomplex oder einen Zinkkomplex aufweist. Dann kann das Protein von der Säule mit einem Elutionsmittel eluiert werden, das Imidazol enthält (siehe z.B. Tanpakushitsu Jikken Noto (Protein Experiment Note) (I), auf und nach S. 139, Kap. 5: 1. His-Tag Tanpakushitu no Hatugen to Seisei (Expression and Purification of His-Tag Protein), Yasumitsu and Wakui, veröffentlicht von Yodosha; J. A. Bornhorst und J. J. Falke, Purification of Proteins Using Polyhistidine Affinity Tags. Methods in Enzymology 326:245–254 (2000); Proteins 41:144–53 (2000), FEMS Microbiol. Lett. 188:147–51 (2000); und J. Bacteriol. 182:4304–9 (2000)). Diese Kombinationen sind in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Um Gene zu exprimieren, die His-markierte Proteinkomponenten kodieren, ist es bekannt, z.B. E. coli (M.W. Van Dyke, M.Sirito, and M.Sawadogo, Gene 111:95, 1992), Saccharomyces cerevisiae (D.C. Kaslow and J.Shiloach, Bio/Technology 12:494, 1994), Säugetierzellen (R.Janknecht and A.Nordheim, Gene 121: 321, 1992) und Baculovirus-infizierte Insektenzellen (A.Kuusinen, M.Arvola, C.Oker-Blom, and K.Keinanen, Eur. J. Biochem. 233:720, 1995) zu verwenden. Diese Zellen können wahlweise in der vorliegenden Erfindung benutzt werden.
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel des Verfahrens der Reinigung einer His-markierten Proteinkomponente unter Verwendung einer His-Markierung und einer Nickelsäule. Eine Anzahl von Variationen dieses Verfahrens ist bekannt und eine geeignete Variation kann daraus ausgewählt werden.

1. Füge eine His-Markierung, die aus 6 His-Resten besteht, an den N-Endpunkt eines Zielproteins durch ein gentechnisches Verfahren an, um so ein fusioniertes Protein zu erhalten.
2. Schließe Zellen, die das markierte Protein exprimieren, durch Ultraschallbehandlung auf Eis auf und suspendiere die aufgeschlossenen Zellen in Beladungspuffer (300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, pH 8,0).
3. Zentrifugiere das Zelllysat (30.000 g, 4°C, 30 min).
4. Gebe eine 50% Ni²⁺-NTA-Aufschlämmung (Qiagen) zu dem Überstand, die in eiskaltem Beladungspuffer vorequilibriert ist. Rühre bei 4 °C für eine Stunde.
5. Lade das Harz in eine Säule. Wasche die Säule mit 20 Säulenvolumen Beladungspuffer bei 4 °C.
6. Wasche die Säule mit 20 Säulenvolumen Beladungspuffer (der 10 mM Imidazol enthält, pH 8,0) bei 4 °C.
7. Eluiere das Zielprotein mit 20 Säulenvolumen Beladungspuffer mit einem Imidazolkonzentrationsgradienten von 10 bis 250 mM im Beladungspuffer. Sammle 1ml Fraktionen und identifiziere das Zielprotein durch SDS-PAGE.

B. Thioredoxin mit Phenylarsenoxid (PAO)
In diesem Verfahren wird ein fusioniertes Protein gebildet, das aus einem Zielprotein mit Thioredoxin besteht, und von einem Agarosegel mit fixiertem PAO (ThioBond^TM Harz, Invitrogen) unter Ausnutzung der Bindung von Thioredoxin an PAO adsorbiert wird, gefolgt von einer Elution mit β-Mercaptoethanol (β-ME) (A.Alejo, R. J. Yanez, J. M. Rodriguez, E. Vinuela, and M. L. Salas, African Swine Fever Virus trans-Prenyltransferase, The Journal of Biological Chemistry 272:9417–9423, 1997). Dieses Verfahren ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung anwendbar.
Das folgende Protokoll zeigt in etwa ein Beispiel des Verfahrens der Reinigung eines Proteins unter Verwendung dieses Verfahrens.

1. Verdünne eine Übernachtkultur von transformierten Zellen (E. coli/Vektor pTrxFus, Invitrogen) 20-fach in RM-Medium (0,6 % Na₂HPO₄, 0,3 % KH₂PO₄, 0,05 NaCl, 0,1 % NH₄Cl, 2 % Caseinhydrolysate, 0,0095 MgCl₂), welches 100 μg/ml Ampicillin enthält (finale Konzentration) und inkubiere bei 30 °C.
2. Nach Inkubation bis zu A₅₅₀ = 0,5 gebe 100 μg/ml Tryptophan (finale Konzentration) hinzu, um die Expression des fusioniertes Proteins zu induzieren. Führe dann die Inkubation bei 34 °C für weitere 2 Stunden weiter.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren. Suspendiere das Zellpellet in 5 ml Laufpuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM β-Mercaptoethanol]. Schließe dann die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf.
4. Zentrifugiere die Zellsuspension (10.000 g, 15 min) und sammle den Überstand.
5. Inkubiere den Überstand mit 2 ml ThioBond^TM Harz bei 4 °C für 60 min, um das im Überstand enthaltene fusionierte Protein an den Harz zu binden.
6. Fülle eine Säule mit der Aufschlämmung und wasche mit 30 Säulenvolumen Laufpuffer [100 mM Tris-HCl (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM β-Mercaptoethanol].
7. Eluiere das Zielprotein mit dem Laufpuffer mit einem β-Mercaptoethanol-Gradienten.

(5-2) Verfahren unter der Verwendung der Bindung eines Antigens oder Antigenfragments (Epitop-Markierung) an einen Antikörper
A. T7-Markierung und monoklonaler Antikörper, der spezifisch für die T7-Markierung ist
T7-Markierung bedeutet eine Sequenz, die aus 11 Aminosäuren des Gens 10 besteht, das aus dem Phagen T7 stammt. Eine Kombination der T7-Markierung mit einem Antikörper dagegen wird in einem Mittel zur Reinigung von Protein eingesetzt. Und zwar umfasst dieses Verfahren das Anfügen einer DNS-Sequenz, die die T7-Markierung kodiert, an ein Gen, anschließendes Exprimieren des Zielproteins, und Fangen und Reinigen des T7-markierten fusionierten Proteins, das so unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch für die T7-Markierung ist, als Adsorptionsmittel erhalten wird. Als ein Beispiel für das Adsorptionsmittel wird T7-Markierung Antikörperagarose vermarktet (Novagen). Zitronensäure wird als Elutionsmittel verwendet. Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar. Siehe R. Deora, T. Tseng, and T. K. Misra, Alternative Transcription Factor σ^SB of Staphylococcus aureus: Characterization and Role in Tran scription of the Global Regulatory Locus sar. Journal of Bacteriology 179:6355–6359, 1997.
Das folgende Protokoll zeigt in etwa ein Beispiel des Verfahrens für die Reinigung einer T7-markierten Proteinkomponente. Eine Anzahl von Variationen dieses Verfahrens ist bekannt und daraus kann eine geeignete Variation ausgewählt werden.

1. Kultiviere transformierte Zellen E. coli/Vektor pET (Novagen) in 2xYT-Medium (1,6 % Bacto-Trypton, 1 Hefeextrakt, 0,5 % NaCl, 0,4 % Glukose), welches 20 μg/ml Chloramphenicol und 30 μg/ml Kanamycin enthält.
2. Nach Inkubation bis zu A₆₀₀ = 0,6 gebe IPTG hinzu, um die Expression des Zielproteins zu induzieren. Setze dann die Inkubation für weitere 2 Stunden fort.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren. Suspendiere das Zellpellet in 10 ml eiskaltem T7-Markierung Binde-/Waschpuffer (4,29 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM KH₂PO₄, 2,7 mM KCl, 137 mM NaCl, 1 % Tween-20, 0,02 Natriumazid (pH 7,3)).
4. Schließe die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf Eis auf, bis die Suspension keine Viskosität mehr zeigt.
5. Zentrifugiere (39.000 g, 20 min), um Zelltrümmer zu eliminieren. Filtriere den Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran.
6. Führe den Zellextrakt einer T7-Markierung-Antikörperagarosesäule (Novagen) zu, die mit T7-Markie rung-Binde-/Waschpuffer voräquilibriert ist. Wasche die Säule mit dem gleichen Puffer, um nichtspezifisch gebundene Proteine zu eliminieren.
7. Eluiere das Zielprotein mit Elutionspuffer (0,1 M Zitronensäure (pH 2,2)).

B. Verfahren unter Verwendung der Bindung des FLAG peptide tag^TM (Sigma) an anti-FLAG antibody^TM (Sigma)
FLAG peptide tag^TM (Sigma und so weiter), das ein aus 8 Aminosäuren bestehendes Peptid ist, wird zur Reinigung von Proteinen als eine so genannte Epitop-Markierung zusammen mit einem Antikörper dagegen verwendet. Und zwar wird ein Protein, das die FLAG-Peptid-Markierung am N-Endpunkt trägt, konstruiert und durch eine FLRG-Antikörpersäule gefangen. FLAG-Peptid wird in der Elution verwendet. Siehe P. J. Woodring and J. C. Garrison, Expression, Purification, and Regulation of Two Isoforms of the Inositol 1,4,5-Triphosphate 3-Kinase. The Journal of Biological Chemistry 272:30447–30454, 1997.
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel dieses Verfahrens, das entsprechend abgewandelt werden kann.

1. Sammle die Zellen (Wirt: B31-Zellen (Ratten-1 Fibroblastenzelllinie), Vektor: pDouble-Trouble (pDT) Säugetierexpressionsvektor), die die Expression des Zielproteins zeigen, durch Zentrifugieren und homogenisiere in 8 ml hypotonischem Lysepuffer, der Proteaseinhibitoren enthält (10 μg/ml Calpain- Inhibitoren I und II, 100 μg/ml Pefablock, 2,5 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Aprotinin, 2 μg/ml Bacitracin, 20 μg/ml Benzamidin).
2. Zentrifugiere (2.000 g), um Zelltrümmer und Nukleinsäuren zu eliminieren und sammle den Überstand.
3. Zentrifugiere weiter und trage den so erhaltenen Zellextrakt auf 1 ml einer FLAG-Antikörpersäule auf. Wasche die Säule mit 35 ml TBSC (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,1 % (v/v) CHAPS).
4. Eluiere das Zielprotein mit 5 ml TBSC, welcher 200 μg/ml des FLAG-Peptids enthält.

C. Protein A und IgG
In diesem Verfahren wird die Bindung von Staphylokokken-Protein A (SPA) an Antikörper IgG davon verwendet. Ein fusioniertes Protein, das aus einem Zielprotein mit SPA gebildet ist, wird unter Verwendung einer IgG-Sepharosesäule gefangen. Ein Puffer mit einem niedrigen pH-Wert wird in der Elution verwendet. Siehe B. Nilsson and L. Abrahmsen, Fusion to Staphylococcal Protein A. Methods in Enzymology 185:144–161, 1990.
Das folgende Protokoll zeigt in etwa ein Beispiel dieses Verfahrens, das entsprechend angepasst werden kann.

1. Gebe eine Übernachtkultur von transformierten Zellen (Wirt: E. coli oder S. aureus, Vektor: pRIT 20- oder pRIT 30-Serien) zu 25 ml LB-Medium (LB-Medium + 0,1 % (w/v) Glukose, 250 mg/l Ampicillin) und inkubiere bei 37 °C für 4 Stunden.
2. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren (10.000 g, 5 °C, 20 min) und filtriere den Überstand durch eine 0,45 μm Filtermembran.
3. Trage das Filtrat auf 5 ml einer IgG-Sepharosesäule auf, die mit TST (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,05 % (v/v) Tween-20) voräquilibriert ist.
4. Wasche die Säule sukzessiv zweimal mit Aliquots von 15 ml TST und 5 ml 1 mM Ammoniumacetat.
5. Eluiere das Protein mit 1 ml 0,5 M Ammoniumacetat (pH 3,3).

D. Protein und monoklonaler Antikörper
Ein Verfahren zur Reinigung eines zyklischen Nukleotid-gesperrten Kanals (CNG), welcher ein aus boviner Retina stammendes Protein ist, unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers PMc 6E7 ist bekannt (N-terminale Domäne der α-Untereinheit: 63-kDa Polypeptid) (R. S. Molday and L. L. Molday, Purification, Characterization, and Reconstitution of Cyclic Nucleotide-Gated Channels. Methods in Enzymology 294:246–260, 1999). Als ein Adsorptionsmittel wird Sepharose 2B (Pharmacia) verwendet, die den monoklonalen Antikörper trägt, der darauf fixiert ist. Um das Zielprotein zu eluieren wird 6E7 konkurrierendes Peptid verwendet, welches ein Peptid ist, das konkurrierend an den monoklonalen Antikörper bindet und eine Aminosäuresequenz Ser-Asn-Lys-Glu-Gln-Glu-Pro-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (SEQ ID NO:1) hat. Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel für das Verfahren zum Reinigen des aus boviner Retina stammdenden Proteins unter der Verwendung des monoklonalen Antikörpers.

1. Sammle Fraktionen des äußeren Segments von Stäbchenzellen (ROS) von einem Homogenat aus boviner Retina durch Zentrifugieren unter einem 30 bis 50 Saccharose-Dichtegradienten (20 mM Tris-Acetat (pH 7,4), 10 mM Glukose, 1 mM MgCl₂; 82.500 g bei 4 °C für 45 min).
2. Verdünne die ROS-Fraktion in 5 Volumen Homogenisierungspuffer (20 % (w/v) Saccharose, 20 mM Tris-Acetat (pH 7,4), 10 mM Glukose, 1 mM MgCl₂) und zentrifugiere (20.000 g, 4 °C, 20 min).
3. Resuspendiere das ROS-Pellet in 8 ml Homogenisierungspuffer, so dass sich ein roher ROS-Extrakt ergibt.
4. Suspendiere ROS in 10 Volumen hypotonischem Lysepuffer (10 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 1 mM EDTA, 1 mM DTT) und zentrifugiere (20.000 g, 10 min).
5. Suspendiere das Membranpellet in dem gleichen Puffer und wasche wiederholt zweimal.
6. Suspendiere das Pellet in 10 mM HEPES-KOH (pH 7,4).
7. Gebe die ROS-Membranen zu CHAPS-(3-[3-(Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-Propansulfonat) Solubili sierungspuffer [10 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 10 mM CaCl₂, 0,15 M KCl, 18 mM CHAPS, 2 mg/ml Asolektin (Phosphatidylcholin aus Sojabohne, Typ IV-S; Sigma) Proteaseinhibitor (0,1 mM Diisopropylfluorophosphat, 5 μg/ml Aproteinin, 1 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Pepstatin oder 20 μg Pefablock SC)] und rühre langsam.
8. Zentrifugiere (27.000 g, 4 °C, 30 min), um Zelltrümmer zu eliminieren.
9. Trage 20 ml der solubilisierten ROS-Membran auf eine Sepharose-2B-Säule auf, die darauf fixiert PMc 6E7 (Antikörper) hat. Wasche mit 10 Volumen CHAPS-Säulenpuffer (10 mM HEPES-KOH (pH 7,4), 1 mM CaCl₂, 0,15 M KCl, 12 mM CHAPS, 2 mg/ml Asolectin).
10. Eluiere das Zielprotein mit CHAPS-Säulenpuffer, der 0,1 mg/ml des konkurrierenden Peptids 6E7 enthält.

(5-3) Verfahren unter der Verwendung einer Bindung eines Proteins an ein Protein oder ein Peptidfragment
A. Strep-Markierung (engl: Strep-tag) und Streptavidin
Es ist ein Verfahren zur Affinitätsreinigung eines Proteins bekannt, das eine Strep-Markierung besitzt, welches ein Oligopeptid mit einer Affinität für Streptavidin ist (siehe z.B. A. Skerra und T. G. Schmidt, Use of the Strep-Tag and Streptavidin for Detection and Purification of Recombinant Proteins. Methods in Enzymology 326: 271–311 (2000), BioTechniques 28: 338–344 (2000)). Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
In diesem Verfahren mit der Benutzung der Bindung von einer Strep-Markierung (Strep-Tag) an Streptavidin wird beispielsweise das Strep-Tag Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO:2) oder Asn-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO:3) (Strep-Tag II) verwendet. Ein Strep-markiertes Protein wie z.B. DHFR (Dihydrofolatreduktase) wird in einem zellfreien System synthetisiert. Dann wird es durch Adsorbieren an fixiertes Streptavidin oder StrepTactin gereinigt. Als ein Elutionsmittel wird Desthiobiotin eingesetzt.
Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel des Verfahrens für die Herstellung einer Strep-markierten Proteinkomponente unter der Verwendung von Strep-Markierung und Streptavidin. Es ist eine Anzahl von Variationen dieses Verfahrens bekannt und eine geeignete Variation davon kann ausgewählt werden.

1. Gebe eine Übernachtkultur von transformierten E. coli-Zellen (unter Verwendung des pASK-IBA-Vektors) zu 2 l frischem LB-Medium (das Ampicillin in einer finalen Konzentration von 100 μg/ml enthält) und inkubiere bis zu OD₅₅₀= 0,5 unter Schütteln (200 rpm) bei 22 °C.
2. Um die Genexpression zu induzieren gebe 200 μl von einer 2 mg/ml Anhydrotetracyclin-Dimethylformamid(DMF) Lösung hinzu. Setze dann die Inkubation für weitere 3 Stunden fort.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren (4.200 g, 4 °C, 12 min). Suspendiere die Zellen in 20 ml Puf fer P (100 mM Tris-Cl (pH 8,0), 500 mM Saccharose, 1 mM Na₂EDTA) und inkubiere auf Eis für 30 min.
4. Eliminiere Spheroplast durch Zentrifugieren (27.000 g, 4 °C, 15 min).
5. Dialysiere die so erhaltene Periplasmafraktion gegen 2 l Puffer (100 mM Tris-Cl (pH 8,0), 1 mM Na₂EDTA) über Nacht.
6. Äquilibriere eine StrepTactin-Sepharosesäule mit Puffer W. Appliziere die Proteinlösung unter Verwendung eines Systems auf die Säule, das eine peristaltische Pumpe, einen UV-Detektor (A₂₈₀) und einen Fraktionssammler bereitstellt.
7. Wasche die Säule mit Puffer W bis A₂₈₀ die Basislinie erreicht.
8. Eluiere das Zielprotein mit Puffer W, der 2,5 mM Desthiobiotin enthält.

B. S-Peptid und S-Protein
Es ist bekannt, dass das Proteinfragment der Ribonuklease S (S-Protein) reversibel fest an sein S-Peptidfragment (S-Peptid) fest bindet. Ein Protein kann unter Verwendung dieser Bindung gereinigt werden. Und zwar kann ein S-markiertes Protein (d.h., eines mit einem daran angefügten S-Peptid) durch Agarose gefangen werden, welche daran fixiertes S-Protein aufweist. Die Elution wird durch Spaltung der Bindung zwischen S-Markierung und S-Protein mit z.B. 3 M Guanidiniumthiocyanat; 0,2 M Kaliumzitronenpuffer, pH 2; 3 M MgCl₂ durchgeführt (R. T. Rai nes, M. McCormick, T. R. V. Oosbree, R. C. Mierendorf, The S·Tag Fusion System for Protein Purification. Methods in Enzymology 326:362–376, 2000).
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel dieses Verfahrens, welches optional abgewandelt werden kann.

1. Gebe 2 ml einer S-Protein-Agaroseaufschlämmung (Novagen) zu einem Extrakt von Zellen, die das Zielprotein exprimieren (Wirt: Bakterien, Insekt, Säugetier, Vektor: pET, pBAC (Novagen)), und rühre gründlich bei Raumtemperatur für 30 min.
2. Zentrifugiere (500 g, 10 min) und eliminiere den Überstand.
3. Suspendiere die S-Protein-Agarose, die das Zielprotein daran gebunden hat, in Binde-/Waschpuffer (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl, 0,1 % (v/v) Triton X-100).
4. Nach Zentrifugieren (500 g, 10 min) verwerfe den Überstand, um dadurch Proteine zu eliminieren, die unspezifisch gebunden waren.
5. Suspendiere die S-Protein-Agaroseaufschlämmung in 1,5 Volumen Elutionspuffer (Binde-/Waschpuffer + 3 M Guanidiniumthiocyanat, 0,2 M Kaliumcitrat (pH 2) oder 3 M MgCl₂).
6. Inkubiere bei Raumtemperatur für 10 min mit gelegentlichem Rühren, um den suspendierten Status aufrechtzuerhalten.
7. Ernte nach Zentrifugieren das Zielprotein, das so eluiert wurde.

C. Calmodulin-bindendes Protein (CBP) und Calmodulin (CaM)
In diesem Verfahren wird Protein unter Verwendung einer Wechselwirkung zwischen Calmodulin-bindendem Protein (CBP) und Calmodulin gereinigt (P. Vaillancourt, Chao-Feng Zheng, D. Q. Hoang, and L. Breister, Affinity Purification of Recombinant Proteins Fused to Calmodulin or to Calmodulin-Binding Peptides. Methods in Enzymology 326: 340–362 (2000)). Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Es wird ein CBP-fusioniertes Protein, das aus einer Proteinkomponente und daran gebundenem CBP besteht, hergestellt. Dann wird es durch Adsorbieren an ein auf Sepharose 4B-basierende CaM-Affinitätsharz oder andere kommerziell erhältliche CaM-Harze gereinigt. Bei der Elution wird EGTA verwendet, welches ein Chelat mit Ca²⁺ bilden kann.
Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel des Verfahrens für die Herstellung eines CBP-fusionierten Proteins unter Verwendung von CBP und CaM. Es ist eine Anzahl von Variationen dieses Verfahrens bekannt und eine geeignete Variation kann daraus ausgewählt werden.

1. Gebe 20 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (pCA-Serien, die auf der Basis von pET-11 als Vektor konstruiert sind) über Nacht zu 1 l LB-Medium, das 50 μg/ml Ampicillin oder Carbenicil lin enthält. Inkubiere bis zu einer OD₆₀₀ = 0,6 ~ 10. Nach Zugabe von IPTG bis zu einer finalen Konzentration von 1 mM, setze die Inkubation für weitere 3 bis 5 Stunden unter Schütteln fort.
2. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren. Suspendiere das Zellpellet in Puffer A (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Magnesiumacetat, 1 mM Imidazol, 2 mM CaCl₂), welcher 0,2 mg/ml Lysozym enthält. Schließe die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf.
3. Zentrifugiere das Zelllysat (25.000 g, 15 min) und sammle den Überstand.
4. Äquilibriere 10 ml eines CaM-Sepharoseharzes mit Puffer A.
5. Mische das CaM-Sepharoseharz mit dem Zelllysat und rühre vorsichtig für 1 Stunde. Zentrifugiere bei niedriger Geschwindigkeit und eliminiere die Aufschlämmung, um so unspezifisch gebundene Substanzen zu eliminieren.
6. Wasche mit 40 ml Puffer A. Resuspendiere in 20 bis 30 ml Puffer A und belade dann eine Säule damit. Wasche sukzessiv mit 5 Säulenbettvolumen Puffer A und Puffer B (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Magnesiumacetat, 1 mM Imidazol, 0,1 mM CaCl₂) bis A₂₈₀ des UV-Detektors die Basislinie erreicht.
7. Eluiere das Zielprotein mit Puffer B, der 2 mM EGTA enthält.

D. HSA und ABP
Es wurde ein Verfahren zur Proteinreinigung unter Verwendung der Bindung von humanem Serumalbumin (HSA) an ein Serumalbumin-Bindungsaffinitätsmittel (ABP) beschrieben (T. Graslund, J. Nilsson, A. M. Lindberg, M. Uhlen, and Per-Ake Nygren, Production of a Thermostable DNA Polymerase by Site-Specific Cleavage of A Heat-Eluted Affinity Fusion Protein. Protein Expression and Purification 9: 125–132, 1997). Dieses Verfahren umfasst das Exprimieren eines Zielproteins als ein fusioniertes Protein mit einem Serumalbumin-Bindungsaffinitätsmittel (ABP), das Einfangen davon durch eine HSA-Sepharosesäule und das Eluieren mit Puffer, der einen niedrigen pH-Wert hat. Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Das folgende Protokoll zeigt grob dieses Verfahren zur Proteinreinigung.

1. Gebe 5 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (Wirt: E. coli, Vektor: pET-21a (Novagen)) zu 500 ml TSB + YE-Medium (30 g/l tryptische Sojabrühe, 5 g/l Hefeextrakt, 100 mg/l Ampicillin, 34 mg/l Chloramphenicol), gefolgt von einer Inkubation unter Schütteln bis zu OD₆₀₀ = 0,8 bis 1,5.
2. Um die Expression des fusionierten Proteins zu induzieren, gebe 1 mM (finale Konzentration) Isopropyl β-D-Thiogalaktosid hinzu und setze die Inkubation für weitere 3 bis 5 Stunden fort.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren. Suspendiere das Zellpellet in TST (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 M NaCl, 0,05 % Tween-20, 1 mM EDTA) und schließe die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf.
4. Zentrifugiere die aufgeschlossene Zellsuspension (20.000 g, 30 min). Filtriere den so erhaltenen Überstand durch einen hydrophilen 1,2 μm Filter.
5. Trage den Zellextrakt auf eine HSA-Sepharosesäule auf.
6. Eluiere das Zielprotein mit einer 0,5 M Hac-Lösung (pH 2,8).

(5-4) Verfahren unter der Verwendung der Bindung von Protein an spezifische niedermolekulare Gewichtskomponenten wie beispielsweise eine Aminosäure, DNS, ein Farbstoff, ein Vitamin oder Lektin
A. Glutathion-S-Transferase (GST) und Glutathion
Üblicherweise wird ein Verfahren zur Proteinreinigung unter Verwendung der Wechselwirkung zwischen GST und Glutathion eingesetzt, das als das GST-Pulldown-Verfahren bezeichnet wird. (siehe z.B. Tanpakushitsu Jikken Noto (Protein Experiment Note) (I), auf und nach S. 162, Chap. 5: 1. GST-Yugo Tanpakushitu no Hatugen to Seisei (Expression and Purification of GST-fused Protein), Suetake, D. B. Smith, Generating Fusions to Glutathione S-Transferase for Protein Studies. Methods in Enzymology 326:254–270, (2000)). Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
Dieses Verfahren umfasst Herstellen eines fusionierten Proteins, das aus einem Zielprotein mit GST gebildet ist, und Adsorbieren an Glutathion-Agarose, die als Adsorptionsmittel eingesetzt wird. Als Elutionsmittel wird reduziertes Glutathion verwendet. In dem Fall, dass das GST-fusionierte Protein durch gentechnische Methoden hergestellt wird, ist es bekannt, z.B. E. coli, Saccharomyces cerevisiae oder Schizosaccharomyces pombe als Wirt zu verwenden.
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel des Verfahrens für die Herstellung von GST-fusioniertem Protein unter Verwendung von GST und Glutathion. Es ist eine Anzahl von Variationen dieses Verfahrens bekannt, wovon eine geeignete Variation ausgewählt werden kann.

1. Verdünne 100 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen in 1 l L-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, gefolgt von einer Inkubation.
2. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren (5.000 g). Suspendiere das Zellpellet in 20 ml eiskaltem PBS, der ein reduzierendes Mittel enthält, wie beispielsweise 1 bis 5 mM Dithiothreitol (DTT) oder 0,1 % 2-Mercaptoethanol.
3. Behandle die suspendierten Zellen vorsichtig auf Eis mit Ultraschall, so dass die Suspension nicht fortschreitet. Kontrolliere die Ultraschallbehandlung bis zu einem solchen Grad, dass die Lösung sich in ein trübes Grau innerhalb von etwa 5 min verwandelt.
4. Gebe Triton X-100 bis zu einer finalen Konzentration von 1 % hinzu und zentrifugiere (10.000 g, 4 °C, 5 min). Gebe den Überstand in ein 50 ml Röhrchen. Gebe 1 ml vorgequollener 50 % Glutathion-Agarosekügelchen dazu und inkubiere bei 4 °C für 30 min mit gelegentlichem Umdrehen.
5. Sammle die Kügelchen durch Zentrifugieren (500 g, 30 min) und wasche dreimal mit Aliquots von 50 ml eiskaltem PBS.
6. Eluiere das fusionierte Protein durch vorsichtiges Rühren der Kügelchen mit einem entsprechenden Volumen von frisch hergestelltem 50 mM Tris-HCl (pH 8) bei Raumtemperatur für 5 min.
7. Eliminiere den Überstand durch Zentrifugieren (500 g, 30 sec), gebe Glyzerin bis zu einer finalen Konzentration von 10 % hinzu und lagere in Aliquots bei –80 °C.

B. Protein und Farbstoff-Ligand
Es ist beschrieben, dass ein natives Protein aus Zymomonas mobilis eine Affinität für spezifische Farbstoffe, wie z.B. C.I. 17908, Reactive Red 8 und C.I. Reactive Blue 187 zeigt, und dass dieses Protein unter Verendung dieses Merkmals gereinigt werden kann (R. K. Scopes and K. Griffiths-Smith, Use of Differential and Dye-Ligand Chromatography with Affinity Elution for Enzyme Purification: 6-Phosphogluconate Dehydratase from Zymomonas mobilis. Analytical Biochemistry 136: 530–534, 1984). Und zwar kann ein Zielprotein gereinigt werden, indem das Zielprotein mit dem gesamten oder einem Teil dieses Proteins markiert wird, indem es durch eine Sepharoseaffinitätssäule adsorbiert wird, wo bei der obige Farbstoff als Ligand verwendet wird, und dann eluiert wird. Das folgende Protokoll zeigt das Verfahren zur Reinigung des aus Z. mobilis stammenden Proteins.

1. Stelle ausgehend von einer flüssigen Kultur von Z. mobilis einen Zellextrakt unter der Verwendung von Extraktionspuffer her (20 mM K-Mes (pH 6,5), 30 mM NaCl, 5 mM MnCl₂, 0,5 mM Ammoniumeisensulfat, 10 mM β-Mercaptoethanol).
2. Trage den Zellextrakt sukzessiv auf eine Scarlet MX-G (C.I. 17908, Reactive Red 8)-Sepharose CL-4B Säule (Pharmacia) und eine Blue HE-G (C.I. Reactive Blue 187)-Sepharose CL-4B Säule auf.
3. Wasche die Säule mit 100 ml Extraktionspuffer.
4. Wasche nicht die Scarlet MX-G Säule, sondern ausschließlich die Blue-HE-G-Säule mit dem Extraktionspuffer, der 20 mM Na₂SO₄ enthält.
5. Eluiere das Zielprotein aus Z. mobilis mit 20 mM DL-α-Glycerophosphat.

C. Verfahren unter der Verwendung der Bindung von Biotin an Avidin
Ein Verfahren zur Reinigung eines Proteins unter Verwendung der spezifischen Bindung von Biotin an Avidin ist seit langer Zeit bekannt (siehe z.B. J. D. Alche, and H. Dickinson, Affinity Chromatography Purification of Antibodies to a Biotinylated Fusion Protein Expression in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 12:138–143, 1998). Dieses Verfahren umfasst das Herstellen eines fusionierten Proteins, das aus Biotin und einem Zielprotein besteht, unter Verwendung einer Sequenz (122 Aminosäuren), die in einem Wirt (z.B. E. coli) biotiniliert wird, das Einfangen dieses fusionierten Proteins mit einer Säule, die daran fixiertes Avidin trägt (z.B. SoftLink soft release avidin resin (Promega)), und dann ein konkurrierendes Eluieren mit Biotip. Diese Kombination ist ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.

1. Um eine Genexpression zu induzieren, gebe 1 mM IPTG (finale Konzentration) zu einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (Wirt: E.coli, Vektor: Pin-Point Xa-2 (Promega)) und inkubiere für weitere 5 Stunden. In dem Fall, wo das so exprimierte Protein in den Zellen vorhanden ist, behandle wie folgt.
2. Lysiere die Zellen durch Zugabe von 10 ml Puffer pro Gramm des Zellpellets (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,1 mM PMSF, 1 mg/ml Lysozym).
3. Sammle das Präzipitat, das das Zielprotein enthält, durch Zentrifugieren (18.000 g, 15 min) und suspendiere in Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl 0,5 % Triton X-100, 0,1 mM PMSF), gefolgt von zweimaligem Waschen.
4. Suspendiere nach Zentrifugieren (18.000 g, 15 min) das so erhaltene Pellet in Solubilisierungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8), 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5 Triton X-100, 0,1 mM PMSF, 6 M Guanidin-HCl).
5. Trage den Zellextrakt auf 3 ml einer SoftLink soft release avidin resin (Promega)-Säule auf, die mit 30 ml des Solubilisierungspuffers voräquilibriert ist. Wasche mit 60 ml Solubilisierungspuffer.
6. Eluiere das biotinilierte Zielprotein mit Solubilisierungselutionsmittel, das 5 mM Biotin enthält.

(5-5) Verfahren unter der Verwendung der Bindung von Protein an Saccharid
In diesem Verfahren wird ein Protein unter Verwendung einer Wechselwirkung zwischen einem Saccharidbindenden Protein mit einem Saccharid gereinigt. Es ist z.B. bekannt, Maltose-bindendes Protein (MBP) zusammen mit Amylose zu verwenden (D. Sachdev and J. M. Chirgwin, Fusions to Maltose-Binding Protein: Control of Folding and Solubility in Protein Purification. Methods in Enzymology 326: 312–321 (2000)). Weiterhin wird erwartet, dass die Wechselwirkung zwischen β-Galaktose-bindenden Proteinen, wie z.B. Galektin und β-Galaktose, verwendet werden kann. Diese Kombinationen sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung verwendbar.
A. Maltose-bindendes Protein und Amylose
In dem Verfahren, in dem ein fusioniertes Protein eines Maltose-bindenden Proteins an einem Harz mit daran fixierter Amylose adsorbiert wird, wird Maltose als ein Elutionsmittel verwendet. Das folgende Protokoll zeigt ein Beispiel des Herstellungsverfahrens eines fusionierten Proteins eines Maltosebindenden Proteins. Es ist eine Anzahl von Variati onen dieses Verfahrens bekannt, wovon eine geeignete Variation ausgewählt werden kann.

1. Gebe 2 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (E. coli/Vektor pMRL-c2 (New England Biolabs)) zu 225 ml LBD-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält (LB-Medium, das 0,2 % Glukose enthält), und inkubiere unter Schütteln bis zu OD₆₀₀ = 0,5 bei 37 °C.
2. Um eine Genexpression zu induzieren gebe 0,3 mM Isopropyl-β-Thiogalaktopyranosid (IPTG) hinzu und setze die Inkubatin für weitere 2 bis 3 Stunden bei 30 °C fort.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren (6.800 g, 5 min). Suspendiere das Zellpellet in 10 ml Säulenpuffer (20 mM Tris (pH 7,4), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,02 % Tween 80) und friere bei –20 °C über Nacht ein.
4. Taue die gefrorene Zellsuspension in Eiswasser auf und verdünne in 10 ml Säulenpuffer. Schließe die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf (Intensität: 75 % des maximalen Levels).
5. Verdünne nach Zentrifugieren (20.000 g, 4 °C, 15 min) den Überstand mit 10 ml Säulenpuffer (roher Extrakt).
6. Trage den rohen Extrakt auf 10 ml einer Amylose-Harz-Säule auf.
7. Wasche die Säule mehrere Male mit Aliquots von 20 bis 30 ml des Säulenpuffers. Eluiere dann das Ziel protein mit dem Säulenpuffer, der 10 mM Maltose enthält.
8. Chitin und Chitin-bindende Domäne (CBD)

In diesem Verfahren wird die Bindung von Chitin an eine Chitin-bindende Domäne (CBD) für die Reinigung eines Proteins verwendet. Und zwar wird ein fusioniertes Protein, das aus Chitin-bindendem Protein (CBD) besteht, das an ein Zielprotein über Intein (induzierbare selbstspaltende Aktivität von technischen Proteinspleißelementen) gebunden ist, exprimiert, und dann an eine Chitinaffinitätssäule (New England Biolabs) adsorbiert. In der Elution wird die Bindung zwischen Intein und dem Zielprotein mit einem reduzierenden Mittel wie beispielsweise DTT, β-Mercaptoethanol Orcystein gespalten (siehe z.B. Chung-Mo Park, Jae-Yoon Shim, Song-Sook Yang, Jeong-GuKang, Jeong-Il Kim, Z. Luka, and Pill-Soon Song, Chromophore – Apoprotein Interactions in Synechocystis sp. PCC6803 Phytochrome Cph1. Biochemistry 39: 6349–6356, 2000). In dem Fall, dass dieses Verfahren auf die Proteinkomponenten der vorliegenden Erfindung angewendet wird, werden die Proteinkomponenten neben CBD-Intein zusätzlich mit einer anderen adhäsiven Substanz markiert, und diese adhäsive Markierung wird in der Trennung der Proteinkomponenten von dem Zielprotein, das in dem in vitro-Synthesesystem gebildet wird, verwendet.
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel dieses Verfahrens zur Reinigung eines Proteins. Es ist eine Anzahl von Variationen hierfür bekannt und eine geeignete Variation davon kann ausgewählt werden.

1. Gebe 3 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (Wirt: E. coli, Vektor: pTYB2 (New England Biolabs)) zu 250 ml RB-Medium hinzu (0,5 % Hefeextrakt, 1 % Trypton, 0,5 % NaCl, 0,2 % Glukose (pH 7,5) und inkubiere bis zu OD₆₀₀ = 0,6 bei 30 °C.
2. Um die Expression des fusionierten Proteins zu induzieren, gebe 1 mM IPTG (finale Konzentration) hinzu und setze die Inkubation für weitere 14 bis 16 Stunden bei 20 °C fort.
3. Ernte die Zellen durch Zentrifugieren (5.000 g, 5 min). Suspendiere das Zellpellet in Lysepuffer (Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 1 mM EDTA) bei Eiskühlung. Schließe die Zellen durch Ultraschallbehandlung auf.
4. Sammle den Überstand durch Zentrifugieren (100.000 g, 30 min) und filtriere durch eine 0,2 mm Filtermembran.
5. Gebe 20 μl 2 mM DMSO zu 1,5 ml des Zellextrakts hinzu. Inkubiere auf Eis für 1 Stunde und appliziere dann auf eine Chitinaffinitätssäule.
6. Wasche die Säule mit Puffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 % Triton X-100). Inkubiere in Puffer, der 1 mM DTT (finale Konzentration) enthält, über Nacht bei 4 °C, um die Selbstspaltung des Inteins zu induzieren. Sammle dann das so freigesetzte Zielprotein.

(5-6) Verfahren unter der Verwendung der Bindung eines Proteins oder eines Peptidfragments an ein Ionenaustauscher-Harz
A. Poly-Arg und Ionenaustauscher-Harz
In diesem Verfahren wird ein Protein unter Ausnutzung des Phänomens gereinigt, dass ein Poly-Argmarkiertes Zielprotein, das positiv geladen ist, an ein Kationenaustauscher-Harz adsorbiert wird (z.B. eine SP-TSK HPLC-Säule). Die Elution wird durch Kontrollieren der Ionenstärke durchgeführt (J. C. Smith, R. B. Derbyshire, E. Cook, L. Dunthorne. J. Viney. S. J. Brewer, H. M. Sassenfeld, and L. D. Bell, Chemical Synthesis and Cloning of a Poly (Arginin) – Coding Gene Fragment Designed to Aid Polypeptide Purification. Gene 32: 321–327, 1984).
Das folgende Protokoll zeigt grob ein Beispiel des oben beschriebenen Verfahrens. Es ist eine Anzahl von Variationen hierfür bekannt und eine geeignete Variation davon kann ausgewählt werden.

1. Gebe 6 ml einer Übernachtkultur von transformierten Zellen (Wirt. E. coli, Vektor: pWT221) zu 300 ml M9-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthält, hinzu und inkubiere bis zu A₆₀₀ = 0,4 unter Schütteln bei 37 °C.
2. Gebe eine IAA-Lösung (20 mg/ml in Ethanol) hinzu, so dass sich eine finale Konzentration von 20 μg/ml ergibt.
3. Gebe 0,1 % Polymin P (finale Konzentration) hinzu und ernte die Zellen durch Zentrifugieren.
4. Lysiere das Zellpellet in Puffer (40 mM Tris-Acetat (pH 5,5), 5 M Harnstoff (Urea)) und dialysiere gegen den gleichen Puffer.
5. Trage 0,1 ml des Zellextrakts auf eine SP-TSK HPLC-Säule auf und wasche die Säule mit dem gleichen Puffer.
6. Eluiere das Zielprotein in Puffer (40 mM PIPES (pH 6,0), 5 M Harnstoff) mit einem NaCl-Konzentrationsgradienten (100 mM bis 350 mM).

(5-7) Verfahren unter der Verwendung von Kügelchen
Es werden magnetische Kügelchen (Dynabeads^TM, DYNAL, Norwegen) mit einer gleichmäßigen Partikelgröße, die aus einem Polymerkern mit magnetisierbaren Substanzen (z.B. γFe₂O₃ und Fe₃O₄), die gleichmäßig darin verteilt sind, und einer hydrophilen Polymerbeschichtung bestehen, vermarktet. Durch Bindung verschiedener Antikörper an die Oberfläche können diese Kügelchen an Zellen und Proteine gebunden werden. Wenn sie in die Nähe eines starken Magneten (MPC) gebracht werden, werden die magnetischen Kügelchen magnetisiert und so magnetisch angezogen. Wenn der Magnet entfernt wird, werden die Kügelchen entmagnetisiert und verteilen sich wieder. Aufgrund dieser Merkmale wurden magnetische Kügelchen z.B. bei der Reinigung von Zellen und Proteinen eingesetzt. Z.B. ist beschrieben, dass periphere Blut-B-Lymphozyten unter Verwendung von magnetischen Polystyrenkügelchen (DYNAL), die mit CD19-Antikörper (Kanegasaki, S. et al, J. Biochem. 117:758–765 (1995)) beschichtet waren, isoliert wurden. In der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls möglich, die Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, mit magnetischen Kügelchen zu markieren, und so aus dem Reaktionssystem magnetisch zu eliminieren. D.h., dass eine solche Kombination von magnetischen Kügelchen mit einem Magneten ebenfalls in die Kategorie der Substanzen fällt, die sich gemäß der vorliegenden Erfindung gegenseitig beeinflussen.
Nun wir die vorliegende Erfindung detaillierter in Bezug auf die folgenden Beispiele erläutert. Dennoch ist es so zu verstehen, dass die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt ist.
[Beispiel 1]
Präparationen von E. coli Ribosom und Extraktion von 5100 300 g E. coli A19-Zellen (geerntet in der mittleren Log-Phase) wurden mit Tonerde (Al₂O₃) gemahlen. Die gemahlenen Zellen wurden in Puffer A suspendiert (10 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 1 mM DTT) und Tonerde und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 30.000 g für 1 Stunde bei 4 °C eliminiert. DNase (Deoxyribonuklease) wurde zu der resultierenden Überstandsfraktion zugegeben, um eine finale Konzentration von 1 μg/ml zu ergeben, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100.000 g für 4 Stunden bei 4 °C. Die so erhaltene Überstandsfraktion wurde als S100 bezeichnet. Das Pellet wurde in Puffer A resuspendiert und die resultierende Suspension wurde als roher Ribosomenextrakt bezeichnet. Von diesem rohen Ribosomenextrakt wurde eine festgekoppelte Ribosomenfraktion mit einem Saccharosedichtegradienten von 6 bis 36 % erhalten. Diese festgekoppelte Ribosomenfraktion wurde bei 100.000 g zentrifugiert und das Pellet wurde in Ribosomenpuffer suspendiert (20 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 6 mM MgOAc, 30 mM NH₄Cl, 7 mM β-Mercaptoethanol), um so festgekoppelte Ribosomen herzustellen. 1 zeigt die Ribosomenfraktionen gemäß dem Saccharosedichtegradienten.
[Beispiel 2]
Konstruktion von Plasmiden für die Überexpression von Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren
Unter Verwendung des E. coli A19-Genoms als Matrize (engl.: template) wurde eine Gensequenz, die das EF-Tu-Gen kodiert, durch PCR erweitert, um ein DNS-Fragment zu ergeben, das am 5'-Endpunkt eine EcoRI-Erkennungssequenz und am 3'-Endpunkt eine BglII-Erkennungssequenz hat. Das so erhaltene DNS-Fragment wurde in das Plasmid pQE60 (QIAGEN) eingefügt, das mit EcoRI und BglII gespalten worden war. So wurde ein Vektor für die Überexpression von EF-Tu konstruiert, welches am C-Endpunkt mit einer His-Markierung fusioniert ist. Als nächstes wurde E. coli BL21/pREP4 mit dem oben erhaltenen Vektor transformiert. Vektoren für eine Überexpression anderer Elongationsfaktoren, Initiationsfaktoren und Terminationsfaktoren wurden in der gleichen Weise konstruiert. Tabelle 1 fasst die verwendeten Vektoren und Restriktionsenzyme und die Positionen der His-Markierung zusammen.
[Beispiel 3]
Konstruktion von Plasmiden für eine Überexpression der Aminoacyl-tRNS-Synthetase (ARS) und Methionin-tRNS-Formylase (MTF)
Unter Verwendung des E. coli A19-Genoms als Matrize bzw. Templat (engl.: template) wurde eine Gensequenz, die das Alanyl-tRNS-Synthetasegen kodiert, durch PCR erweitert, um ein DNS-Fragment zu ergeben, das am 5'-Endpunkt eine SphI-Erkennungssequenz und am 3'-Endpunkt eine HindIII-Erkennungssequenz hat. Das so erhaltene DNS-Fragment wurde in ein Plasmid pQE30 (QIAGEN) eingefügt, das mit SphI und HindIII gespalten worden war. So wurde ein Vektor für die Überexpression der Alanyl-tRNS-Synthetase konstruiert, die am N-Endpunkt mit einer His-Markierung fusioniert ist. Als nächstes wurde E. coli BL21/pREP4 mit dem oben erhaltenen Vektor transformiert. Vektoren für eine Überexpression von anderen als ARS und MTF wurden in der gleichen Weise konstruiert. Tabelle 1 fasst die verwendeten Vektoren und Restriktionsenzyme und die Positionen der His-Markierung zusammen, wobei die erhaltenen Plasmide in E. coli-Stamm BL21/pREP4 (pQE-Serien) oder BL21/DE3 (pET-Serien) transformiert wurden.
Tabelle 1

Bemerkung: RE bedeutet Restriktionsenzym.

[Beispiel 4]
Konstruktion von Plasmiden für eine Überexpression der T7RNS-Polymerase
Unter Verwendung des T7-Phagengenoms als Matrize bzw. Templat (engl.: template) wurde eine Gensequenz, die das T7RNS-Polymerasegen kodiert, durch PCR erweitert, um ein DNS-Fragment zu ergeben, das am 5'-Endpunkt eine BamHI-Erkennungssequenz und am 3'-Endpunkt eine PstI-Erkennungssequenz hat. Das so erhaltene DNS-Fragment wurde in das Plasmid pQE30 (QIAGEN) eingefügt, das mit BamHI und PstI gespalten worden war. So wurde ein Vektor für die Überexpression der T7RNS-Polymerase konstruiert, die am N-Endpunkt mit einer His-Markierung fusioniert ist. Als nächstes wurde E. coli BL21/pREP4 mit dem oben erhaltenen Vektor transformiert.
[Beispiel 5]
Konstruktion von Plasmiden für eine Überexpression der Nukleosid-Diphosphatkinase (NDK) und anderer Enzyme
Unter Verwendung des E. coli A19-Genoms als Matrize bzw. Templat (engl.: template) wurde eine Gensequenz, die das NDK-Gen kodiert, durch PCR erweitert, um ein DNS-Fragment zu ergeben, das am 5'-Endpunkt eine BamHI-Erkennungssequenz und am 3'-Endpunkt eine HindIII-Erkennungssequenz hat. Das so erhaltene DNS-Fragment wurde in das Plasmid pQE30 (QIAGEN) eingefügt, das mit BamHI und HindIII gespalten worden war. So wurde ein Vektor für die Überexpression der NDK konstruiert, die am N-Endpunkt mit einer His-Markierung fusioniert ist. Als nächstes wurde E. coli BL21/pREP4 mit dem oben erhaltenen Vektor transformiert. Plasmide für andere Enzyme, die in (4-1) und (4-2) beispielhaft erläutert sind (auf Seite 18–19), können, wenn gewünscht, in der gleichen Weise konstruiert werden.
[Beispiel 6]
Überexpression und Reinigung von Initiationsfaktoren, Elongationsfaktoren und Terminationsfaktoren
Um His-markierte EF-Tu (EF-Tu*) zu überexprimieren, wurden die in Beispiel 2 erhaltenen Transformanten BL21/pREP4 Zellen in 6 l LB-Medium kultiviert, bis die optische Dichte (OD₆₆₀) 0,7 erreicht hatte. Zu der Kultur wurde IPTG (Isopropyl-1-Thio-β-D-Galaktosid) bis zu einer finalen Konzentration von 0,1 mM zugegeben, und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden bei 37 °C fortgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Suspensionspuffer resuspendiert (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂, 0,3 mg/ml Lysozym, 0,1 % Triton X-100, 0,2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), 6 mM β-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 100.000 g für 1 Stunde bei 4 °C eliminiert. Der erhaltene Überstand wurde auf eine mit Ni²⁺ vorbeladene 10 ml Hi-Trap chelatbildende Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit 100 ml HT-Puffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NagCl, 10 mM MgCl₂), der 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Dann wurde EF-Tu* von der Säule unter einem in dem HT-Puffer enthaltenen linearen Gradienten der Imidazolkonzentration (10 bis 400 mM) eluiert. Die so gereinigten EF-Tu*-Fraktionen wurden gesammelt und gegenüber Stockpuffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 30 % Glycerin) dialysiert. Die Konzentration des gereinigten EF-Tu* wurde basierend auf einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung des Bio-Rad Proteintestkits unter Verwendung von BSA (bovines Serumalbumin) als Standard aufgenommen wurde. Das erhaltene EF-Tu* wurde schnell in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. Andere His-markierte Elongationsfaktoren, Initiationsfaktoren und Terminationsfaktoren wurden in der gleichen Weise gereinigt. 2 zeigt 12 SDS-PAGE Muster von His-markierten Faktoren (gefärbt mit Coomassie-Brilliantblau).
Die Aktivitäten und optimalen Konzentrationen der His-markierten Initiationsfaktoren (IF1, IF2 und IF3: "*" bedeutet "His-markiert") wurden unter der Verwendung eines DHFR mRNS in vitro-Translationssystems gemessen (Beispiel 17 wie nachstehend ausgeführt). Unter Verwendung eines Systems, das IF1*, IF2* und IF3* als eine positive Kontrolle enthielt, wurde die Inkubation für 30 min in Systemen durchgeführt, denen entsprechende Initiationsfaktoren fehlten, und dann wurden die so gebildeten relativen Aktivitäten von DHFR verglichen (3A). Und zwar wurden die Aktivitäten der His-markierten Initiationsfaktoren bestimmt, indem die Aktivität der positiven Kontrolle auf 100 bezogen wurde. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass die Ausbeute an DHFR in jedem der Systeme, denen IF* fehlte, zu 1/2 oder weniger der positiven Kontrolle korrespondierte, was anzeigt, dass jeweils IF1*, IF2* und IF3* die Aktivität hat. Die optimalen Konzentrationen der His-markierten Initiationsfaktoren wurden durch Translatieren in einem in vitro-System unter konstanten Bedingungen, jedoch unter Variation der Konzentration von jedem Initiationsfaktor, und durch Messen der relativen Aktivität des so gebildeten DHFR (3B) bestimmt. In 3B zeigen jeweils ⦁,
bzw. ∎ die Daten von IF1*, IF2* bzw. IF3*.
[Beispiel 7]
Überexpression und Reinigung von His-markierten ARSs und MTF
Die Transformanten BL21/DE3 Zellen für die Überexpression von His-markierter Ser tRNS-Synthetase ("*" bedeutet "Hismarkiert") wurden in 2 l LB-Medium kultiviert, bis die optische Dichte (OD₆₆₀) 0,7 erreicht hatte. Zu der Kultur wurde IPTG (Isopropyl-1-Thio-β-Galaktosid) bis zu einer finalen Konzentration von 0,1 mM gegeben, und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden bei 37 °C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Suspensionspuffer resuspendiert (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂, 0,3 mg/ml Lysozym, 0,1 % Triton X-100, 0,2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), 6 mM β-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurde durch Zentrifugation bei 100.000 für 1 Stunde bei 4 °C eliminiert. Der erhaltene Überstand wurde auf eine mit Ni²⁺ vorbeladene 10 ml Hi-Trap chelatbildende Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit 100 ml HT-Puffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂), der 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Dann wurde die Ser tRNS-Synthetase* von der Säule unter einem in dem HT-Puffer enthaltenen linearen Gradienten der Imidazolkonzentration (10 bis 400 mM) eluiert. Die so gereinigten Ser tRNS-Synthetase*-Fraktion wurden gesammelt und gegenüber Stockpuffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 30 % Glycerin) dialysiert. Die Konzentration der gereinigten Ser tRNS-Synthetase* wurde basierend auf einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung des Bio-Rad Protein-Testkits unter Verwendung von BSA (bovines Serumalbumin) als Standard aufgenommen wurde. Die so erhaltene Ser tRNS-Synthetase* wurde in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. 5 zeigt ein so erhaltenes Chromatogramm der Ser tRNS-Synthetase*.
Andere ARS* und MTF wurden in der gleichen Weise überexprimiert und gereinigt. 6 zeigt 12 % SDS-PAGE Muster der His-markieten Faktoren und Enzyme (gefärbt mit Coomassie-Brilliantblau). Zwei Banden von Gly RS* und Phe RS*, die in 6 zu beobachten sind, sind der Tatsache zuzuschreiben, dass diese Enzyme α2- und β2-Typen haben. 6 zeigt, dass diese His-markierten Faktoren und Enzyme jeweils in hoher Reinheit erhalten wurden.
[Beispiel 8]
Überexpression und Reinigung von His-markierter T7RNS-Polymerase
Die Transformanten BL21/pREP4 Zellen für die Überexpression von His-markierter T7RNS-Polymerase ("*" bedeutet "His-markiert") wurden in 6 l LB-Medium kultiviert, bis die optische Dichte (OD₆₆₀) 0,7 erreicht hatte. Zu der Kultur wurde IPTG (Isopropyl-1-Thio-β-Galaktosid) bis zu einer finalen Konzentration von 0,1 mM gegeben, und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden bei 37 °C fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Suspensionspuffer resuspendiert (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂, 0,3 mg/ml Lysozym, 0,1 % Triton X-100, 0, 2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), 6 mM β-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation der aufgeschlossenen Zellsuspension bei 100.000 für 1 Stunde bei 4 °C eliminiert. Die erhaltene Überstandsfraktion wurde auf eine mit Ni²⁺ vorbeladene 10 ml Hi-Trap chelatbildende Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit 100 ml HT-Puffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂), der 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Dann wurde die T7RNS-Polymerase* von der Säule unter einem in dem HT-Puffer enthaltenen linearen Gradienten der Imidazolkonzentration (10 bis 400 mM) eluiert. Die so gereinigten T7RNS-Polymerase*-Fraktionen wurden gesammelt und gegenüber Stockpuffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 30 % Glycerin) dialysiert. Die Konzentration der gereinigten T7RNS-Polymerase* wurde basierend auf einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung des Bio-Rad Protein-Testkits unter Verwendung von BSA (bovines Serumalbumin) als Standard aufgenommen wurde. Die erhaltene T7RNS-Polymerase* wurde in 1 ml Ali quots in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. 12A und B zeigen so erhaltene Chromatogramme der T7RNS-Polymerase*.
[Beispiel 9]
Überexpression und Reinigung von His-markierter NDK und anderen Enzymen
Die Transformanten BL21/pREP4 Zellen für die Überexpression von His-markierter NDK ("*" bedeutet "His-markiert") wurden in 2 l LB-Medium kultiviert, bis die optische Dichte (OD₆₆₀) 0,7 erreicht hatte. Zu der Kultur wurde IPTG (Isopropyl-1-Thio-β-Galaktosid) bis zu einer finalen Konzentration von 0,1 mM gegeben und die Inkubation wurde für weitere 4 Stunden bei 37 °C fortgesetzt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in Suspensionspuffer resuspendiert (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂, 0,3 mg/ml Lysozym, 0,1 % Triton X-100, 0,2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), 6 mM β-Mercaptoethanol) und durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 100.000 für 1 Stunde bei 4 °C eliminiert. Die erhaltene Überstandsfraktion wurde auf eine mit Ni²⁺ vorbeladene 10 ml Hi-Trap chelatbildende Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit 100 ml HT-Puffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 1 M NH₄Cl, 10 mM MgCl₂), der 10 mM Imidazol enthielt, gewaschen. Dann wurde die NDK* von der Säule mit einem in dem HT-Puffer enthaltenen linearen Gradienten der Imidazolkonzentration (10 bis 400 mM) eluiert. Die so gereinigten NDK*-Fraktionen wurden gesammelt und gegenüber Stockpuffer (50 mM Hepes-KOH (pH 7,6), 100 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 30 % Glycerin) dialysiert. Die Konzentration der gereinigten NDK* wurde basierend auf einer Standardkurve bestimmt, die unter Verwendung des Bio- Rad Protein-Testkits unter Verwendung von BSA (bovines Serumalbumin) als Standard aufgenommen wurde. Die so erhaltene NDK* wurde in 1 ml Aliquots in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren und dann bei –80 °C gelagert. Andere His-markierte Enzyme, die in (4-1) und (4-2) beispielhaft erläutert sind (auf Seite 18–19), können, wenn gewünscht, in der gleichen Weise erhalten werden.
[Beispiel 10]
Konstruktion des DHFR-Gens und Präparation von mRNS
Durch Hinzufügen einer HindIII-Sequenz bzw. einer BamHI-Sequenz an die 5'- und 3'-Endpunkte wurde das DHFR-Gen (Dihydrofolatreduktase) aus E. coli durch PCR erweitert. Das Gen enthielt einen T7-Promoter stromaufwärts einer Ribosomenbindungsstelle mit der "Epsilon Sequenz" aus dem Bakteriophagen-T7-Gen 10, gefolgt von einer Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz. Dieses DNS-Fragment wurde in den Plasmidvektor pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Nach Behandlung mit SmaI wurde dieses Plasmid als eine Matrize bzw. ein Templat (engl.: template) in einer run-off Transkription oder in einer mit einer in vitro-Transkription gekoppelten Translation unter Verwendung der T7RNS-Polymerase verwendet. Die in vitro-Transkriptionsreaktion wurde bei 42 °C für 3 Stunden durchgeführt. Das Reaktionsgemisch (1 ml) umfasste 40 mM Hepes-KOH (pH 7,8), 20 mM MgCl₂, 1 mM Spermidin, 5 mM DTT, jeweils 2 mM ATP, UTP, CTP und GTP, 20 μg des mit SmaI behandelten Matrizen- bzw. Templat-Plasmids, 50 μg BSA, 1,78 Einheiten PPiase (Pyrophosphatase) und 10 μg der so gereinigten His-markierten T7RNS-Polymerase. Um die Reaktion zu beenden wurde EDTA (Ethylendinitrotetra-Essigsäure) bis zu einer finalen Konzentration von 50 mM hinzugefügt. Die so erhaltene mRNS wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol ausgefällt. Danach wurde sie un ter Verwendung eines RNS-Reinigungskits (QIAGEN) entsprechend dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll gereinigt.
[Beispiel 11]
Konstruktion von MFL-mRNS
Um eine Matrize bzw. ein Templat (engl.: template) für MFL-mRNS zu erhalten, wurde die DNS-Sequenz AUGUUCUUGUAA (SEQ ID NO:4) (translatiert in fMet-Phe-Leu-Stop; Formylmethionin-Phenylalanin-Leucin-Stopcodon; nachfolgend nur als MFL bezeichnet) wie folgt konstruiert. Ein Oligonukleotid A:5'-TAtgttcttgtaac (SEQ ID NO:5) wurde mit einem weiteren Oligonukleotid B: 5'-TCGAgttacaagaaca (SEQ ID NO:6) zusammen abgekühlt (annealed), um eine Doppelstrang-DNS zu ergeben, die NdeI- und XhoI-Sequenzen enthält. Dann wurde diese DNS in die NdeI- und XhoI-Stellen des Plasmidvektors pET29a (Novagen) kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde wie im obigen Fall des DHFR-Gens transkribiert.
[Beispiel 12)
Aktivitäten der His-markierten Aminoacyl-tRNS-Synthetase
Die Aktivitäten der His-markierten ARSs (Aminoacyl-tRNS-Synthetase) wurden wie folgt gemessen. Jedes Reaktionsgemisch (50 μl) enthielt Polymixpuffer (siehe Translationsexperimente) mit 1 mM ATP, 2,8 A₂₆₀-Einheiten von tRNSmix (Boehringer), 50 μM von jeder markierten Aminosäure und jede gereinigte His-markierte ARS. Die Reaktionen wurden bei 37 °C durchgeführt und radioaktive Aminoacyl-tRNS wurden auf 3MM-Filtern zu verschiedenen Inkubationszeiten ausgefällt und mit kalter 5 % Trichloroessigsäure gewaschen und dann die Radioaktivität gemessen. Eine Einheit der Aktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, die 1 pmol Aminoacyl-tRNS pro Minute synthetisieren kann. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.
Tabelle 2
[Beispiel 13]
Aktivitäten der His-markierten Methionyl-tRNS-Transformylase
Aktivitäten von His-markierten MTFs wurden wie folgt gemessen ("*" bedeutet "His-markiert"). Jedes Reaktionsgemisch (50 μl) enthielt Polymixpuffer (siehe Translationsexperimente) mit 1 mM ATP, 2,8 A₂₆₀-Einheiten tRNSmix (Boehringer), 50 μM [³H] markiertes Methionyn, 0,5 μg 10-Formyl-5,6,7,8,-Tetrahydrofolsäure, 3000 Einheiten MetRS und MTF*. Die Reaktionen wurden bei 37 °C durchgeführt und nicht formylierte Methionyl-tRNS wurde in Puffer mit 0,175 M CuSO₄ und 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) für 8 min bei 30 °C deacyliert. Radioaktive Formyl-Methionyl-tRNS wurden auf 3MM-Filtern ausgefällt und mit kalter 5 % Trichloressigsäure gewaschen, gefolgt von der Messung der Radioaktivität. Eine Einheit der Aktivität wurde als die Menge des Enzyms definiert, die 1 pmol Formyl-Methionyl-tRNS pro Minute synthetisieren kann. Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse (letzte Spalte).
[Beispiel 14]
Translationsexperimente (allgemeines Verfahren)
Translationsgemische (50 μl) wurden durch leichtes Modifizieren des Polymixpuffers hergestellt, der von Jelenc et al. (1979) und Wagner et al. (1982) eingesetzt wurde. Der Polymixpuffer enthielt 5 mM Magnesiumacetat, 5 mM Kaliumphosphat (pH 7,3), 95 mM Kaliumglutamat, 5 mM Ammoniumchlorid, 0,5 mM Calciumchlorid, 1 mM Spermidin, 8 mM Putrescin und 1 mM DTT. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 1 mM ATP, 1 mM GTP, 10 mM Kreatinphospat, 2,8 A₂₆₀-Einheiten tRNSmix, 0,5 μg 10-formyl-5,6,7,8,-tetrahydrophile Säure, 1 mM jeder Aminosäure und den Faktorgemisch wie hierin später beschrieben wird. Im Falle einer an eine Translationsreaktion gekoppelten Transkription wurden weiterhin jeweils 1 mM jedes NTP und 4 mM Magnesiumacetat zum oben genannten Reaktionsgemisch hinzugefügt. Das Faktor- und Enzymgemisch umfasste 12 pmol Ribosom, 1 μg IF1*, 2 μg IF2*, 0,75 μg IF3*, 1 μg EF-G*, 2 μg EF-Tu*, 1 μg EF-Ts*, 0,5 μg RF1*, 0, 5 μg RF3*, 0,5 μg RRF*, jeweils 30 bis 300 Einheiten jeder ARS* oder MTF, 0,2 μg Kreatinkinase (CK), 0,15 μg Myokinase (MK) und 0,054 μg Nukleosid-Diphosphatkinase* (NDK). Im Falle einer an eine Translationsreaktion gekoppelten Transkription wurden weiterhin 1,78 Einheiten PPiase und 0,5 μg T7RNS-Polymerase* zugefügt. Bei den Faktoren und Enzymen bedeuten jene mit "*" markiert His-Markierte. Die Reaktionsgemische wurden bei 37 °C für 5 min inkubiert, dann wurde Matrizen- bzw. Templat-DNS oder -RNS hinzugegeben und die Reaktion gestartet. Die Translation wurde bei 37 °C durchgeführt. Nach Vollendung der Reaktion wurden zunächst Ribosom mit hohem Molekulargewicht durch Durchlaufen durch eine Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-off von 100 kDa eliminiert. Als nächstes wurde die durch die Ultrafiltrationsmembran hindurch gelaufende Fraktion auf eine Nickelsäule aufgetragen und so wurden die His-markierten Fusionsproteine eliminiert. Der durch die Säule durchgegangene Bestandteil war das Translationsprodukt, mit einer hohen Reinheit, das eine einzige Bande im SDS-PAGE zeigte. Das in den folgenden Experimenten eingesetzte S30-System wurde von Promega bezogen und die Translation wurde entsprechend dem von dem Hersteller empfohlenen Protokoll durchgeführt.
[Beispiel 15]
Expression von verschiedenen Proteinen
Nach der Bestätigung der Aktivitäten der His-markierten Komponenten des Reaktionssystems wurde ein in vitro-Proteinsynthesesystem wie in Beispiel 14 unter Verwendung von His-markierter T7RNS-Polymerase konstruiert. Unter Verwendung dieses Synthesesystems wurden Polypeptide voller Länge der E. coli DHFR, des λ-Lysozyms, des grün fluoreszierenden Proteins (GFP), der Glutathiontransferase (GST) und des T7-Gen 10-Proteins synthetisiert und die Ausbeute von jedem Produkt wurde gemessen. 13 zeigt die Ergebnisse. So wurde geklärt, dass das Synthesesystem gemäß der vorliegenden Erfindung alle für die Translation benötigen Komponenten enthält.
[Beispiel 16]
Poly(U)-poly (Phe)-Synthese
Poly(U)-poly(Phe) wurde in einem in vitro-Reaktionssystem wie folgt synthetisiert. Jedes Reaktionsgemisch enthielt Polymixpuffer mit 1 mM ATP, 1 mM GTP, 10 mM Kreatinphosphat, 2,8 A₂₆₀-Einheiten tRNSmix, 1 mM [¹⁴C] markiertes Phenylalanin und ein Faktorgemisch. Das Faktorgemisch enthielt 12 pmol Ribosom, 1 μg EF-G*, 2 μg EF-Tu*, 1 μg EF-Ts*, 60 Einheiten PheRS*, 0,2 μg Kreatinkinase (CK), 0,15 μg Myokinase (MK) und 0,054 μg Nukleotid-Diphosphatkinase* (NDK*). Bei den Faktoren und Enzymen bedeuten jene mit "*" markiert His-Markierte. Die Reaktionsgemische wurden bei 37 °C für 5 min inkubiert, dann wurden 5 μg poly (U) hinzugefügt und die Reaktion gestartet. Es wurden Proben von Po-ly(Phe) in Aliquots von 8 μl im Zeitverlauf genommen und auf 3MM-Filter mit 10 % Trichloroessigsäure ausgefällt. Aminoacyl-tRNS wurden bei 85 °C deacyliert und mit 10 Trichloressigsäure gewaschen und anschließend die Radioaktivität gemessen. Auf diese Weise wurde die Bildung des Zielproduktes bestätigt.
In den oben beschriebenen Translationsreaktionen wurden die optimalen Konzentrationen von EF-G*, EF-Tu* und EF-Ts* durch Untersuchung der poly(Phe)-Ausbeute im in vitro-Reaktionssystem unter konstanten Bedingungen bis auf Variation der Konzentration jedes Elongationsfaktors bestimmt. 7(A) zeigt die so erhaltenen Ergebnisse. In 7(A) zeigen ⦁,
bzw. ∎ die Daten von EF-G*, EF-Tu* bzw. EF-Ts*.
Weiterhin wurden die Daten der poly(Phe)-Synthese im oben beschriebenen Reaktionssystem entsprechend der vorliegenden Erfindung mit den Daten des Translationssystems unter Verwendung des S100-Extrakts verglichen. 7(B) zeigt das Ergebnis. Obwohl die Reaktion in letzterem System nach 20 Minuten stoppte (O), setzte sich die Reaktion im System der vorliegenden Erfindung sogar nach 40 Minuten noch weiter fort (⦁).
[Beispiel 17]
Aktivitäten von Terminationsfaktoren und dem Ribosomrecyclingfaktor
Aktivitäten der Terminationsfaktoren (RF1*, RF3* und RRF*; "*" bedeutet "His-markiert") wurden mit leichten Modifikationen nach Pavrov et al. (8) gemessen. Die Reaktionsgemische (50 μl) wurden basierend auf dem im Translationsexperiment verwendeten Polymixpuffer zubereitet. Jedes Reaktionsgemisch enthielt 1 mM ATP, 1 mM GTP, 2,8 A₂₆₀-Einheiten tRNSmix, 1 mM Phenylalanin und Leucin, 50 pmol unter Verwendung von [³⁵S] radioaktivem Methionin zubereitete Formylmethionyl-tRNS und ein His-markiertes Faktor- und Enzymgemisch (wie nachfolgend beschrieben). Das Faktor- und Enzymgemisch enthielt 12 pmol Ribosom, 1 μg IF1*, 2 μg IF2*, 0,75 μg IF3*, 1 μg EF-G*, 2 μg EF-Tu*, 1 μg EF-Ts*, 0,5 μg RF1*, 0,5 μg RF3*, 0,5 μg RRF*, 50 Einheiten PheRS* und 300 Einheiten LeuRS*. RF1*, RF3* und RRF* wurden jeweils von diesem Faktor- und Enzymgemisch abhängig von der Zielsetzung entfernt, so dass die jeweiligen Reaktionsgemische erhalten wurden. Jedes Reaktionsgemisch wurde bei 37 °C für 5 min vorinkubiert und dann wurde 1 μg MFL-mRNS hinzugefügt, um die Translation zu initiieren. Es wurden Proben des Reaktionsgemisches in Aliquots von 5 μl im Zeitverlauf genommen und jede Probe wurde zu dem gleichen Volumen 1 N HCl gegeben, um die Reaktion zu beenden. Weiterhin wurde 200 μl Ethylacetat hinzugefügt, um das Tripeptid (fMFL) zu eluieren, und die Radioaktivität wurde mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
Die Aktivitäten der Terminationsfaktoren RF1*, RF3* und RRF* wurden unter Verwendung eines in vitro-Translationssystems für synthetische mRNS, die fMet-Phe-Leu-Stop (fMFL) kodiert, gemessen. Und zwar wurde fMFL-mRNS in ein System translatiert, das RF1*, RF3* und RRF* als Terminationsfaktoren enthält (⦁), in ein System, das RF1* und RRF* enthält (•), in ein System, das RF1* und RF3* enthält
, in ein System, das nur RF1* enthält
, in ein System, das RF3* und RRF* enthält (O) und in ein System, das frei von irgendwelchen Terminationsfakoren ist (auch RRF*)
und die Ausbeuten wurden gemessen. 4 zeigt die Ergebnisse. In 4 entspricht das im ersten Durchgang synthetisierte Peptid ungefähr 1000 cpm auf der y-Achse. Das System, das RF1*, RF3* und RRF* (⦁) enthält, zeigt einen linearen Anstieg der fMFL-Ausbeute im Laufe der Zeit, was zeigt, dass RF1*, RF3* und RRF* im Vergleich zu anderen Systemen die Aktivitäten besitzt. Im System ohne RF1* (O) fand keine Peptidsynthese statt. In den Systemen ohne RRF*
erfolgte kein Ribosomenrecycling.
[Beispiel 18]
DHFR-Synthese
DHFR, das [³⁵S] Methionin enthält, wurde unter Verwendung des in vitro-Translationssystems gemäß der vorliegenden Erfindung und eines weiteren Translationssystems unter Verwendung des S30-Systems (Promega) synthetisiert. Jedes Produkt wurde durch 12 % SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) abgetrennt und mit einem BAS-1000-System (Fuji Film) detektiert, gefolgt von der Messung der Radioaktivität. 8(A) zeigt die Ergebnisse der Abtrennung durch SDS-PAGE.
Auf der anderen Seite wurde die Aktivität der DHFR wie folgt gemessen. In einem Reaktionsgemisch mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 50 μM DHF (Dihydrofolsäure) und 60 μM NADPH (reduziertes Nikotinamidadenindinukleotidphosphat), wurde DHFR bei 30 °C synthetisiert und der Rückgang in der A₃₄₀ jede Minute gemessen. 8(B) zeigt die Ergebnisse.
9 zeigt die Reaktionsverläufe im in vitro-Translationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung und im S30-System. Im in vitro-Translationssystem der vorliegenden Erfindung
setzte sich die Reaktion sogar nach 120 Minuten noch fort, während im S30-System (⦁) die DHFR-Ausbeute nach 20 Minuten ihren Höhepunkt erreichte.
Um den Energieverbrauch zu untersuchen wurde Nukleosidtriphosphat im in vitro-Translationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung und im S30-System hydrolysiert. Die Hydrolyse wurde in jedem System in der folgenden Art beobachtet, während die Daten verglichen wurden. Unter Verwendung von DHFR-Matrizen bzw. Templaten (engl.: templates) wurde die Translation in Reaktionsgemischen mit [α-³²P] ATP oder GTP bei 37 °C durchgeführt. Von jedem Reaktionsgemisch wurden Proben in Aliquots von 2 μl im Zeitverlauf genommen und jede Probe wurde zu 150 μl 10 % Ameisensäure zugegeben. Dann wurden die Gemische auf einer Polyethylen-imin-TLC-Platte als Spot aufgetragen, und die Reaktionsprodukte wurden unter Verwendung von 0,75 M Kaliumphosphatpuffer (pH 3,75) entwickelt. Nach Lufttrocknung wurde die TLC-Platte mit einer Plastikfolie bedeckt und einer Autoradiographie unterzogen. 10 zeigt die Ergebnisse, wobei die Daten des S30-Systems links und die Daten des Systems der Erfindung rechts aufgeführt sind. Im S30-System nahm ATP im Laufe der Zeit ab, während die Menge an ATP auf einem fast konstanten Level im System gemäß der vorliegenden Erfindung gehalten wurde. Um das synthetisierte DHFR zu reinigen wurden Ribosomen unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Cut-off von 100 kDa eliminiert. Als nächstes wurden alle His-markierten Komponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, eliminiert, indem das Reaktionsgemisch durch eine Nickelsäule hindurch gegangen ist. Das Reaktionsgemisch vor dem Lauf durch die Nickelsäule und das nach dem Lauf durch die Nickelsäule erhaltene Produkt wurden mit einem 12 % SDS-PAGE entwickelt und mit Coomassieblau gefärbt. 14 zeigt die Ergebnisse, wobei Spur 1 die Marker, Spur 2 das Reaktionsgemisch und Spur 3 das Produkt (DHFR) darstellt, was zeigt, dass das Produkt als eine einfache Bande erhalten wurde.
[Beispiel 19]
Einbau von Valinresten durch Valyl-Suppressor-tRNS (Modell des Einbaus von nicht natürlichen Aminosäuren)
Im in vitro-Translationssystem gemäß der vorliegenden Erfindung, das RF2* ("*" bedeutet "His-markiert") als Ersatz für RF1* als Terminationsfaktor enthält, wurde eine DHFR-Matrize bzw. Templat (engl.: template), in der Asn an der Position 37 (ATA-Kodon) in ein UAG-Kodon umgewandelt wurde, unter Verwendung einer chemisch synthetisierten Valyl-Suppressor-tRNS translatiert. Als Ergebnis wurde ein verkürztes Protein, das an der Position 37 endet, in der Probe mit RF1* (11, Spur 2) synthetisiert, während eine schwache Bande, die diesem verkürzten Protein zugeschrieben werden kann, in dem von RF1* freien System (ohne RF2) ( 11, Spur 3) beobachtet wurde. Durch Einfügen von RF2* in dieses System wurde ein Proteinprodukt an gleicher Position (11, Spur 4) wie normales DHFR (11, Spur 1) beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde bes tätigt, dass der an die Suppressor-tRNS angefügte Valinrest an Position 37 der DHFR eingebaut worden ist.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Durch das Markieren von Proteinkomponenten, die ein Reaktionssystem ausmachen, können individuelle Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, sicher gereinigt werden, und so kann ein Reaktionssystem, das mit keinen unbekannten Komponenten verunreinigt ist, aufgebaut werden. Darüber hinaus wird es dadurch möglich, ein so synthetisiertes Zielprotein einfach in großer Reinheit zu isolieren.
Obwohl darauf hingewiesen wurde, dass in Zellen und Zellextrakten enthaltene Lipopolysaccharide (LPSs) verschiedene unerwünschte Effekte als Endotoxine auf lebende Körper ausüben, gibt es ein technisches Problem, dass diese LPSs nur schwer von Zielpeptidprodukten abgetrennt werden können. Dieses Problem kann jedoch durch Verwendung eines in vitro-Peptidsynthesesystems gemäß der vorliegenden Erfindung gelöst werden.
Auf Grund des Aufbaus eines Reaktionssystems, das frei von jeglichen unbekannten Komponenten ist, kann eine Reaktion über einen langen Zeitraum fortgeführt werden, z.B. für 2 Stunden oder länger, sogar in einem Batchsystem. Darüber hinaus wird es für theoretisch möglich erachtet, das Volumen eines Reaktionsgemischs zu erhöhen.
Unter Verwendung eines Flusssystems kann die Reaktion für eine längere Zeit fortgeführt werden, was die praktische Produktion und Reinigung eines Proteins in einem in vitro-Reaktionssystem ermöglicht. D.h., dass dieses Verfahren es ermöglicht, bestimmte Enzyme ökonomisch bereitzustellen, die wegen hoher Kosten bisher zögerlich in medizinischen Behandlungen angewendet wurden. Als Ergebnis kann der Anwendungsbereich medizinischer Behandlungen mit der Verabreichung von Enzymen erweitert werden, die als ein Substitut für wenigstens einen Bereich der Gentherapie, der unter technischen Beschaffungsproblemen leidet, eingesetzt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein System, das Terminationsfaktoren enthält und ein System, das frei von Terminationsfaktoren ist, endgültig aufgebaut werden und so können Ribosomen-Displays leicht und selektiv hergestellt werden. Darüber hinaus wird es ermöglicht, nicht natürliche Aminosäurereste genauer an die gewünschten Positionen einzufügen.
Herkömmliche zellfreie Proteinsynthesesysteme unter der Verwendung von prokaryotischem Zellextrakt leiden unter einem Problem, dass die Stabilität einer mRNS stark herabgesetzt ist, wenn Transkription und Translation nicht gleichzeitig durchgeführt werden. Im Gegensatz dazu kann die Reaktion der Translation einer mRNS im Reaktionssystem der vorliegenden Erfindung stabil ablaufen.
Nach der Beendigung der Genomanalysen geht die Hauptrichtung der molekularbiologischen Studien zur Genanalyse über. Unter diesen Umständen trägt das Reaktionssystem der vorliegenden Erfindung, das die Genexpression und -identifikation von Proteinprodukten beschleunigt und damit die Überprüfung von Genfunktionen vereinfacht, beachtlich zum Fortschritt der wissenschaftlichen Technologie bei.
Referenz

1) Crowe, J., Dobeli, H., Gentz, R., Hochuli, E., Stuber, D., and Henco, K. (1994). 6xHis-Ni-NTA chromatography as a superior technique in recombinant protein expression/purification. Methods Mol Biol 31, 371–87.
2) Hochuli, E., Dobeli, H., and Schacher, A. (1987). New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues. J Chromatogr 411, 177–84.
3) Smith, D. B., and Johnson, K. S. (1988). Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67, 31–40.

Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats unter Verwendung entweder (a) eines Reaktionssystems zur Transkription einer DNS in eine RNS und anschließenden Translation der erzeugten RNS oder (b) eines Reaktionssystems zur In-vitro-Translation einer RNS, dadurch gekennzeichnet, dass sämtliche der Proteinkomponenten, die das Reaktionssystem ausmachen, mit einer Markierung markiert ist, die in der Lage ist, selektiv an ein Adsorptionsmittel zu binden, und das Adsorptionsmittel zur Aufnahme der markierten Proteinkomponenten nach der Translation des Peptids oder eines Peptidderivats verwendet wird, wodurch gestattet wird, das hergestellte Peptid oder Peptidderivat von den das Reaktionssystem ausmachenden markierten Proteinkomponenten zu trennen.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats nach Anspruch 1, wobei das Reaktionssystem ein prokaryotisches Reaktionssystem ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats nach Anspruch 2, wobei das prokaryotische Reaktionssystem ein Escherichia coli-Reaktionssystem ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Vielzahl von Kombinationen von Markierungen und Adsorptionsmitteln in dem Verfahren verwendet werden.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei (a) das Reaktionssystem zur Transkription einer DNS in eine RNS und anschließenden Translation der erzeugten RNS oder (b) das Reaktionssystem zur In-vitro-Translation einer RNS frei von Terminationsfaktoren ist.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Paar der Markierung und des Adsorptionsmittels in der Lage sind, sich bei der Affinitätschromatographie gegenseitig zu beeinflussen.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats nach Anspruch 6, wobei die Kombination der Markierung und des Adsorptionsmittels, die in der Lage sind, sich bei der Affinitätschromatographie gegenseitig zu beeinflussen, aus Kombinationen von Substanzen ausgewählt ist, die eine Bindung zwischen einem Protein oder einem Peptidfragment und einem Metallion, eine Bindung zwischen einem Antigen und einem Antikörper, eine Bindung zwischen einem Protein und einem Protein oder einem Peptidfragment, eine Bindung zwischen einem Protein und einer spezifischen niedermolekularen Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminosäuren, DNS, Farbstoffen, Vitaminen, und Lectinen, eine Bindung zwischen einem Protein und einem Saccharid oder eine Bindung zwischen einem Protein oder einem Peptidfragment und einem Ionenaustauschharz, ausbilden können.
Verfahren zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivats nach Anspruch 7, wobei die Kombination der Substanzen, die eine Bindung zwischen einem Protein oder einem Peptidfragment und einem Metallion ausbilden, aus einer Histidin-Markierung und einem Nickel-Komplex oder einem Kobaltkomplex besteht.
Verfahren zur Herstellung eines Peptides oder eines Peptidderivates nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Paar der Markierung und des Adsorptionsmittels in der Lage ist, magnetisch aneinander zu haften.
Kit aus Proteinkomponenten für ein Reaktionssystem zur Herstellung eines Peptids oder eines Peptidderivates durch Transkriptior. entweder (a) einer DNS in eine RNS und anschließenden Translation der erzeugten RNS oder (b) In-vitro-Translation einer RNS, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit sämtliche Proteinkomponenten umfasst, die das Reaktionssystem ausmachen, und dass sämtliche Proteinkomponenten des Kits mit einer Markierung markiert sind, die in der Lage ist, selektiv an ein Adsorptionsmittel zu binden.
Kit aus Proteinkomponenten nach Anspruch 10, wobei das Reaktionssystem ein prokaryotisches Reaktionssystem ist.
Kit aus Proteinkomponenten nach Anspruch 11, wobei das prokaryotische Reaktionssystem ein Escherichia coli-Reaktionssystem ist.
Kit aus Proteinkomponenten einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Reaktionssystem frei von Terminationsfaktoren ist.
Kit aus Proteinkomponenten nach einem der Ansprüche 10 bis 13, mit einem Adsorptionsmittel zur Aufnahme der markierten Proteinkomponenten.
Kit aus Proteinkomponenten nach einem der Ansprüche 10 bis 13, mit einer Vielzahl von Kombinationen oder Paaren der Markierung mit dem Adsorptionsmittel zur Aufnahme der markierten Proteinkomponenten.