WO2016148044A1 - 改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびその用途 - Google Patents

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太田　淳
祐介 山岸
松尾　篤
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中外製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to an aminoacyl-tRNA synthetase having an increased efficiency of aminoacylating N-methylamino acid into a corresponding tRNA and its use as compared to a natural aminoacyl-tRNA synthetase (ARS). More specifically, the present invention relates to N-methyl-phenylalanine, N-methyl-valine, N-methyl-serine, N-methyl-threonine, N-methyl-tryptophan, N-methyl-leucine rather than natural ARS. The present invention relates to an aminoacyl-tRNA synthetase having a modified amino acid sequence capable of efficiently aminoacylating the six N-methyl-substituted amino acids with a corresponding tRNA and use thereof.
  • the aminoacyl-tRNA synthetase having a modified amino acid sequence of the present invention can produce a peptide containing N-methylamino acid selectively and regioselectively with high efficiency.
  • RNA information transmission substances
  • Polypeptides and proteins are composed of 20 kinds of amino acids, but information is transcribed from DNA consisting of 4 kinds of nucleotides to RNA, and the information is translated into amino acids, which constitute the polypeptide or protein.
  • tRNA plays a role as an adapter that associates a sequence of three-letter nucleotides with a single amino acid, and is involved in the binding of tRNA and amino acid.
  • Aminoacyl-tRNA synthetase aminoacyl-tRNA synthetase (aminoacyl-tRNA) syathetase; ARS).
  • ARS is an enzyme that specifically binds an amino acid and tRNA, and there are 20 types of ARS corresponding to each of the 20 types of naturally occurring amino acids for each species, with some exceptions.
  • a tRNA having an anticodon corresponding to a codon is accurately acylated with a specific amino acid assigned to the codon among 20 protein amino acids. That is, the tRNA synthetase corresponding to a specific amino acid distinguishes the tRNA of the amino acid from the tRNA of another amino acid and binds it only to the amino acid, and does not bind to the other amino acid.
  • tRNA aminoacyl-tRNA
  • tRNA aminoacyl-tRNA
  • ARS ARS-specific recombinase
  • a protein called terminator comes and the translation ends, and the polypeptide chain is released from the ribosome. In vivo proteins are produced through these processes. And each exhibits important physiological functions in vivo.
  • cyclosporin A which is a natural molecular drug derived from natural products, is a typical example. It is a peptide produced by a microorganism consisting of 11 residues, and is an orally administrable peptide that inhibits cyclophilin, an intracellular target. .
  • Non-patent Documents 1, 2, and 2). 3 A characteristic of the peptide of cyclosporin A is that it contains an unnatural amino acid “N-methylamino acid” as a constituent component.
  • N-methylamino acid is introduced into a peptide to increase the drug-likeness of the peptide and to apply it to drug discovery.
  • Non-patent Documents 1, 2, and 2). 3 the introduction of N-methylamino acid has led to a decrease in hydrogen bond donating hydrogen, acquisition of protease resistance, and immobilization of conformation, and it has been known that it contributes to membrane permeability and metabolic stability.
  • Non-patent Documents 9 and 10, Patent Document 1 a display library, which is a collection of molecules in which a huge number of RNA or DNA (genotype), etc.
  • Non-patent Document 11 an mRNA display library or a ribosome display library using a cell-free translation system can easily handle a library containing 10 12-14 various types of molecules (Non-patent Document 11).
  • Non-Patent Document 10 a method that can prepare peptides containing non-protein amino acids by using a reconstituted cell-free translation system has been developed, and it has become possible to construct peptide display libraries containing N-methyl amino acids by combining with display technology.
  • N-methyl amino acid-containing peptides by translation of mRNA. These methods are by separately preparing “N-methylaminoacyl tRNA” in advance and adding it to the translation system.
  • Non-patent Document 5 pdCpA (5'-phospho-2'-deooxyribocytidylriboadenosine) acylated with a chemically synthesized unnatural N-methyl amino acid and 3 'obtained by transcription N-methylaminoacyl tRNA is prepared in advance by ligating tRNA lacking terminal CA with T4 RNA ligase. Amino acids such as N-methylalanine and N-methylphenylalanine have been introduced using this method (Non-patent Document 6).
  • Non-Patent Document 3 As another method, Suga et al. Have reported a method of aminoacylating N-methylamino acid previously activated by esterification to tRNA using an artificial RNA catalyst (flexizyme) (Patent Document 2). We have succeeded in introducing N-methylamino acid into translation. Although this method can be applied to various side chain structures, the aminoacylation efficiency of non-aromatic side chain amino acids is never high at 40-60% in many cases, and especially N-methylvaline can be confirmed to be translated as in the pdCpA method. Not moth (Non-Patent Document 3).
  • N-methylaminoacyl tRNA prepared outside the translation system is added to the translation reaction solution, so that N-methylaminoacyl tRNA is not regenerated in the translation system.
  • N-methylaminoacyl tRNA is consumed.
  • it is necessary to add a large amount of N-methylaminoacyl tRNA but the addition of a large amount of tRNA itself causes a decrease in peptide yield (Non-patent Document 7).
  • instability of aminoacyl-tRNA in the translation solution becomes a problem.
  • Aminoacyl-tRNA has been shown to be hydrolyzed under physiological conditions at pH 7.5 because the amino acid and tRNA are linked by an ester bond (Non-Patent Document 12), and its half-life is in the amino acid side chain. Depending on the short one is 30 minutes.
  • aminoacyl-tRNA forms a complex with aminoacyl-tRNA-elongation factor Tu (EF-Tu) to suppress hydrolysis, but aminoacyl-tRNA exceeding the concentration of EF-Tu in the translation system is hydrolyzed. End up. In other words, as the translation reaction proceeds, the deacylation of the aminoacyl tRNA added at the start of translation proceeds, and eventually the aminoacyl tRNA having N-methylamino is depleted.
  • EF-Tu aminoacyl-tRNA-elongation factor Tu
  • N-methyl amino acid introduction can be solved if there is an ARS corresponding to N-methyl amino acid having the same function as that of natural ARS for natural amino acid.
  • Murakami et al. Have reported that N-methylhistidine and N-methylphenylalanine can be introduced into a peptide in a cell-free translation system using natural HisRS and PheRS (Non-patent Documents 8 and 13).
  • N-methylvaline, N-methylleucine, N-methyllysine, and N-methyltryptophan indicate that the efficiency of translational synthesis is very low (Non-Patent Paper 8). From these reports, aminoacylation of N-methylamino acids using natural ARS and translational introduction into peptides were confirmed in terms of N-methylphenylalanine, N-methylhistidine, and N-methyl. There are only three cases of aspartic acid.
  • Patent Documents 3, 4, and 5 modified ARSs that catalyze the binding of unnatural amino acids and tRNAs, but these are modified ARSs that use amino acids centered on phenylalanine or tyrosine side chain derivatives as substrates and N-methyl amino acids as substrates. Furthermore, there is no known modified ARS that can introduce N-methylamino acid into a multi-residue peptide.
  • An object of the present invention is to provide a modified ARS modified so as to enhance the reactivity with N-methylamino acid as a substrate. More specifically, the problem to be solved by the present invention is to efficiently produce a peptide containing a plurality of N-methyl amino acids, without using a large amount of tRNA, particularly N-methyl unnatural amino acids, particularly Novel modified ARS that catalyzes an acylation reaction that binds N-methyl-phenylalanine, N-methyl-valine, N-methyl-serine, N-methyl-threonine, N-methyltryptophan, N-methylleucine to tRNA and its Is to provide a use.
  • the present inventors obtained a plurality of ARS genes using different amino acids as substrates, introduced mutations into the genes, and modified the amino acid sequence of the ARS. A mutant ARS gene coding for was constructed. These modified ARSs were expressed and recovered and incubated with tRNA in the presence of unmodified amino acids or N-methyl amino acids to evaluate aminoacylation reactions.
  • phenylalanyl tRNA synthetase PheRS
  • seryl tRNA synthetase SerRS
  • valyl tRNA synthesis N-methyl amino acid aminoacylation of multiple ARSs such as enzymes (ValRS), threonyl tRNA synthetase (ThrRS), leucyl tRNA synthetase (LeuRS), tryptophanyl tRNA synthetase (TrpRS) compared to wild-type ARS
  • ValRS threonyl tRNA synthetase
  • LeuRS leucyl tRNA synthetase
  • TrpRS tryptophanyl tRNA synthetase
  • the inventors succeeded in further improving the selectivity to N-methylvaline by reducing the aminoacylation activity of unmodified Val by introducing a mutation into the ValRS proofreading domain (Example 7). Moreover, when a sequence containing 2 or 3 consecutive valines was translated, it was confirmed that a peptide containing 2 or 3 consecutive N-methylvalines was synthesized (Example 2). Also in SerRS, the translation product incorporating N-methylserine is the main product when modified SerRS is used under the condition that the translation product incorporating unmodified serine is detected as the main product in wild-type SerRS. (Example 3).
  • TrpRS when wild-type TrpRS is used, unmodified Trp is detected as the main product, whereas when modified TrpRS is used, the translation product incorporating N-methyl Trp is observed as the main product. (Example 5).
  • LeuRS In LeuRS, when wild-type LeuRS was used, no translation product containing N-methyl Leu was observed, whereas when modified LeuRS was used, a translation product incorporating N-methyl Leu was unmodified LeuRS. (Example 6). As described above, when the modified ARS of the present invention is used, it is possible to introduce N-methylamino acid into a peptide with higher efficiency than when wild-type ARS is used.
  • the present invention provides ARS having reactivity with N-methylamino acids.
  • the present invention relates to N-methyl amino acids, particularly N-methyl-phenylalanine, N-methyl-valine, N-methyl-serine, more than natural aminoacyl-tRNA synthetase (ARS),
  • the present invention relates to each ARS in which the amino acid sequence is modified so that it can more efficiently incorporate six N-methyl-substituted amino acids of N-methyl-threonine, N-methyltryptophan, and N-methylleucine, and uses thereof.
  • ARS in which the amino acid sequence of the present invention is modified, a peptide containing any N-methyl amino acid selectively and regioselectively from these N-methyl amino acids can be produced with high efficiency.
  • the present invention relates to a method for producing a polypeptide containing an unnatural amino acid using the modified ARS of the present invention. More specifically, the amino acid sequence-modified phenylalanine, valine, serine, threonine, tryptophan, and leucine ARS were used, respectively, for N-methylphenylalanine, N-methylvaline, N-methylserine, N-methylthreonine, N -It relates to a method for producing a polypeptide comprising methyltryptophan and N-methylleucine.
  • ARS modified aminoacyl-tRNA synthetase
  • a polypeptide comprising at least one of [3] The polypeptide according to [1] or [2], wherein the N-methylamino acid is selected from the group consisting of valine, serine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and leucine. [4] The polypeptide according to any one of [1] to [3], wherein the ARS is selected from the group consisting of an alpha subunit of ValRS, SerRS, PheRS, ThrRS, TrpRS, and LeuRS.
  • TrpRS is modified at a position corresponding to 132-position methionine and / or 150-position glutamine and / or 153-position histidine of TrpRS derived from Escherichia coli.
  • peptide [10] The polypeptide according to any one of [1] to [4], wherein the LeuRS is modified at a position corresponding to position 43 tyrosine of LeuRS derived from E. coli.
  • ValRS derived from Escherichia coli (11) the position corresponding to asparagine at position 43 is glycine or alanine, and / or (b) the position corresponding to position 45 at threonine is serine, and / or (c) 279.
  • the polypeptide according to any one of [1] to [4], wherein the position corresponding to the position threonine is glycine or alanine.
  • SerRS derived from Escherichia coli the position corresponding to (a) glutamic acid at position 239 is glycine or alanine, and / or (b) the position corresponding to position 237 at threonine is serine. 4].
  • TrpRS is alanine or valine at a position corresponding to (a) 132-position methionine, and / or (b) a position corresponding to glutamine at 150-position is alanine, and / or (c) 153
  • ARS is derived from bacteria.
  • a vector comprising the polynucleotide according to [22].
  • a host cell comprising the polynucleotide according to [22] or the vector according to [23].
  • a method for producing the polypeptide according to any one of [1] to [21] comprising the step of culturing the host cell according to [24].
  • [26] A method for producing tRNA acylated with N-methylamino acid, comprising the step of contacting N-methylamino acid and tRNA in the presence of the polypeptide according to any one of [1] to [20] Including methods. [27] The method according to [26], wherein the contacting step is performed in a cell-free translation system. [28] A method for producing a polypeptide containing N-methylamino acid, comprising a step of translating in the presence of the polypeptide according to any one of [1] to [20] and N-methylamino acid . [29] The method according to [28], wherein the translation is performed in a cell-free translation system.
  • N-methylphenylalanine, N-methylvaline, N-methylthreonine, N-methylserine, N-methyltryptophan, and N-methylleucine can be converted to natural phenylalanine, valine, and threonine without complicated reactions.
  • -It can be efficiently linked to serine, tryptophan, and leucine tRNAs.
  • tRNA does not require a stoichiometric amount, and is produced with high translation efficiency even in peptide synthesis in which a plurality of N-methyl amino acids are introduced. Is useful for making.
  • the inventors of the present application and the modified PheRS05 (SEQ ID NO: 2) obtained in the present invention During the reaction, N-methylphenylalanine introduction efficiency was compared using two methods of pdCpA method in which regeneration of aminoacyl tRNA cannot be expected. As a result, the translation efficiency was higher when the modified ARS was used, and the target peptide was synthesized in a yield of about 4 to 8 times when the N-methylphenylalanine was introduced two or three consecutive times, particularly (non-native). Public data). As described above, the present invention makes it possible to more efficiently produce a polypeptide containing N-methylamino acid, which has been difficult to produce in the past.
  • An object of the present invention is to provide an enzyme mutant in which the enzyme-substrate specificity of aminoacyl-tRNA synthetase is changed. More specifically, the present invention relates to a variant of an aminoacyl tRNA synthetase capable of efficiently and selectively producing a large amount of a polypeptide containing N-methyl amino acid, and an amino acid of a natural aminoacyl tRNA synthetase. It is characterized by being prepared by modifying the sequence.
  • the present invention provides a polypeptide comprising ARS that can react with N-methylamino acid. More specifically, the present invention provides a polypeptide comprising a modified ARS, which ARS can react with N-methyl amino acids more efficiently than the original natural ARS. The present invention also provides a polypeptide comprising a modified ARS, wherein the ARS is an ARS capable of reacting more efficiently with N-methyl amino acids than the original natural ARS.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide having aminoacyl-tRNA synthetase activity, and is modified so that aminoacylation reaction with N-methylamino acid is enhanced.
  • N-methylamino acid here means, for example, aminoacylation of the corresponding tRNA with N-methylamino acid, and binding of N-methylamino acid to the tRNA or aminoacyl tRNA generated by the acylation reaction It may be the incorporation of N-methylamino acid into the synthetic protein in the translation reaction used.
  • polypeptide has aminoacyl tRNA synthetase activity includes not only the case where the polypeptide exhibits aminoacyl tRNA synthetase activity alone, but also the case where the polypeptide exhibits aminoacyl tRNA synthetase activity together with other factors.
  • the polypeptide of the present invention may be one of the subunits, and exhibits aminoacyl tRNA synthetase activity as a complex in combination with other subunits. It may be.
  • the aminoacyl-tRNA synthetase complex is formed with the modified polypeptide of the present invention together with other wild-type subunits, N- The aminoacylation reaction with methyl amino acid is enhanced.
  • a polypeptide having aminoacyl-tRNA synthetase activity modified so that aminoacylation reaction with N-methylamino acid is enhanced includes one subunit of an aminoacyl-tRNA synthetase complex composed of a plurality of subunits.
  • a polypeptide having a modified unit, which is modified so that aminoacylation reaction with N-methylamino acid possessed by an aminoacyl-tRNA synthetase complex is enhanced.
  • the polypeptide containing the modified ARS refers to a polypeptide containing the polypeptide chain of the modified ARS, and specifically, the polypeptide is a polypeptide containing the amino acid sequence of the modified ARS.
  • the original natural ARS refers to a natural ARS from which a modified ARS is derived, and may be, for example, a wild-type ARS, and includes naturally occurring polymorphisms (polymorphism). Also, being able to react with N-methylamino acid means that the modified ARS can carry out an enzymatic reaction using N-methylamino acid as a substrate.
  • the reaction may be, for example, a reaction of acylating tRNA with N-methylamino acid, specifically a reaction catalyzing a binding reaction between N-methylamino acid and tRNA.
  • the reaction may be performed in the presence of the corresponding N-methyl amino acid and the corresponding tRNA, and the binding between the N-methyl amino acid and tRNA may be detected.
  • the reaction with N-methyl amino acid may be incorporation of N-methyl amino acid into the polypeptide in translation.
  • ARS generated N-methylamino acid-tRNA by performing translation in the presence of modified ARS and N-methylamino acid, and detecting the incorporation of N-methylamino acid into the polypeptide produced by translation. Can be detected. It is judged that the higher the incorporation of N-methylamino acid into the polypeptide, the higher the reactivity with N-methylamino acid.
  • being able to react more efficiently than the original natural ARS may be a reaction that is more efficient than the original natural ARS, at least under certain conditions, or in the original ARS
  • the thing which cannot confirm a product may be that it can confirm now. For example, if a modified ARS is used rather than the original natural ARS, and a larger amount of a polypeptide incorporating N-methyl amino acid is produced, the modified ARS is more efficiently converted into an N-methyl amino acid than the original natural ARS. It is judged to react. In addition, for example, for a polypeptide containing N-methyl amino acid, the generation cannot be confirmed when the original natural ARS is used, but when the modified ARS is used, the generation can be confirmed.
  • N-methylamino acid it is judged to react with N-methylamino acid more efficiently than natural ARS. For example, if the production of a polypeptide containing N-methyl amino acids in succession for two, three or more could not be confirmed when using the original natural ARS, but could be confirmed when using a modified ARS, The modified ARS is judged to react more efficiently with N-methyl amino acids than the original natural ARS.
  • being able to react more efficiently than the original natural ARS may mean that the target reaction product is purified with higher purity than the original natural ARS at least under certain conditions.
  • a modified ARS is used rather than an original natural ARS, if a larger amount of a polypeptide incorporating N-methyl amino acid is produced than a natural amino acid derived from contamination, the modified ARS is converted into the original natural ARS. It is judged to react with N-methylamino acid more efficiently than ARS.
  • the modified ARS is more efficiently converted to N-methylamino acids than the original ARS. It is judged to react. For example, when the reactivity with respect to N-methylamino acid is relatively increased as compared with the reactivity with natural amino acid, it is judged that it reacts with N-methylamino acid more efficiently than the original natural ARS.
  • NN-methylamino acid is not particularly limited, but one corresponding to ARS is appropriately selected.
  • the modified ARS is valine ARS (ValRS)
  • the N-methyl amino acid is N-methyl valine
  • Thr threonine ARS
  • the modified ARS is serine ARS (SerRS), then the N-methyl amino acid is N-methylserine, and if the modified ARS is phenylalanine ARS ⁇ subunit (PheRS), the N-methyl amino acid is N-methylphenylalanine If the modified ARS is tryptophan ARS (TrpRS), the N-methyl amino acid is N-methyltryptophan; if the modified ARS is leucine ARS (LeuRS), the N-methyl amino acid is N-methyl leucine .
  • SerRS serine ARS
  • PheRS phenylalanine ARS ⁇ subunit
  • TrpRS tryptophan ARS
  • LeuRS leucine ARS
  • the position corresponding to position 43 asparagine and / or position 45 threonine and / or position 279 threonine of ValRS derived from E. coli is preferable.
  • a combination of any two positions selected from positions corresponding to position 43 asparagine, position 45 threonine and position 279 threonine eg, position 43 and position 45, position 43 and position 279, or position 45 and position 279) More preferably, it is a combination of positions corresponding to position 43 asparagine, position 45 threonine and position 279 threonine.
  • SerRS it can be modified at a position corresponding to 239th glutamic acid and / or 237th threonine of SerRS derived from Escherichia coli, and more preferably a combination of a position corresponding to 239th glutamic acid and 237th threonine.
  • PheRS ⁇ subunit it is preferably modified at a position corresponding to glutamine at position 169 of PheRS derived from E. coli.
  • ThrRS it can be modified at a position corresponding to 332th methionine and / or 511th histidine of ThrRS derived from E. coli.
  • TrpRS it can be modified at a position corresponding to 132 position methionine and / or 150 position glutamine and / or 153 position histidine of TrpRS derived from E. coli, preferably 132 position methionine, 150 position glutamine and 153 position. It is a combination of any two positions selected from positions corresponding to histidine (for example, combination of positions 132 and 150, positions 132 and 153, or positions 150 and 153), more preferably 132 positions methionine and 150 positions A combination of positions corresponding to glutamine and 153 histidine.
  • LeuRS it can be modified at the position corresponding to position 43 tyrosine of LeuRS derived from E. coli.
  • modified ARSs include those in which other positions are further modified.
  • the position number of each ARS is represented by 1 as the starting methionine of each ARS derived from E. coli.
  • the position number of each ARS is P07118 (SEQ ID NO: 24) for ValRS, P08312 (SEQ ID NO: 28) for PheRS ⁇ subunit, P0A8M3 (SEQ ID NO: 29) for ThrRS, P0A8L1 (SEQ ID NO: 26) for SerRS, TrpRS is represented by P00954 (SEQ ID NO: 188),
  • LeuRS is represented by 1 as the first methionine in the sequence (UniProt (http://www.uniprot.org/)) of P07813 (SEQ ID NO: 189).
  • the position corresponding to an amino acid having an ARS derived from E. coli refers to an amino acid located at a site corresponding to the amino acid of ARS derived from E. coli, and can be identified from the structural similarity between the two. By aligning the target ARS and the amino acid sequence of ARS derived from E. coli, the corresponding amino acid can be identified as the amino acid aligned at the position of the amino acid of ARS derived from E. coli.
  • Ami with ARS The position corresponding to nonoic acid is preferably a position corresponding three-dimensionally to an amino acid having ARS derived from E. coli, and the position corresponding to the three-dimensional structure is the position of the amino acid of ARS derived from E. coli in the three-dimensional structure of ARS. The amino acid position corresponding to the position is indicated.
  • ClustalW ver2.1 http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp
  • E. coli ARS uses Multiple Sequence Alignment with default parameters and is known as E. coli ARS.
  • One skilled in the art can easily align all the ARSs of other species.
  • the target ARS is not limited to prokaryotes.
  • various functional domains are added to the ARS sequence in eukaryotes in addition to the catalytic domain, and the sequence identity with ARS derived from prokaryotes is not necessarily high.
  • the catalytic site such as the amino acid recognition site and the editing site (Editing domain) are highly conserved in sequence, and even if using public alignment methods, the ARS derived from eukaryotes can be easily located in a three-dimensionally equivalent position. Identification is possible.
  • the sites corresponding to positions 43 and 45 of E. coli ValRS are the PPP (N / Y / T) X (T / S) G motif (SEQ ID NO: 180; “N / Y / T” present in ValRS of other organisms.
  • E. coli ValRS is any amino acid, preferably V, I or P, more preferably V;
  • T / S is preferably T)" N / Y / T "and” T / It may be the amino acid site of “S”.
  • the sites corresponding to positions 43 and 45 of E. coli ValRS are the PPPNXTG motif (SEQ ID NO: 181;
  • X is any amino acid, preferably V, I or P, more preferably present in ValRS of other organisms. May be the N and T amino acids of V) respectively.
  • the position corresponding to position 43 asparagine of E. coli ValRS is asparagine at position 345 in Human (Uniprot P26640), and asparagine at position 191 in Saccharomyces cervisiae (Uniprot P07806).
  • the modification of ARS preferably includes at least one substitution with an amino acid whose molecular weight is reduced by 10 or more.
  • modifications include amino acids other than Thr (T), such as Gln (Q), Asn (N), Glu (E), Met (M), Tyr (Y), and His (H).
  • the amino acid to be modified may be appropriately selected.
  • the position corresponding to position 43 asparagine of ValRS derived from E. coli is preferably modified to glycine or alanine, and corresponds to position 45 threonine of ValRS derived from E. coli. It is preferable to modify the position to be serine, and the position corresponding to threonine at position 279 of ValRS derived from E. coli is preferably modified to glycine or alanine.
  • SerRS the position corresponding to glutamic acid at position 239 of SerRS derived from E.
  • coli is preferably modified to glycine or alanine, and the position corresponding to threonine at position 237 of SerRS derived from E. coli is preferably modified to serine.
  • the position corresponding to glutamine at position 169 in the PheRS ⁇ subunit derived from E. coli is preferably modified with glycine or alanine.
  • the position corresponding to 332 methionine of ThrRS derived from E. coli is preferably modified with glycine, and the position corresponding to 511 histidine of ThrRS derived from E. coli is preferably modified with glycine.
  • the position corresponding to position 132 methionine of TrpRS derived from E. coli is preferably modified to valine or alanine, and the position corresponding to position 150 glutamine of TrpRS derived from E. coli is preferably modified to alanine. It is preferable to modify the position corresponding to histidine at position 153 of TrpRS derived from alanine.
  • the position corresponding to position 43 tyrosine of LeuRS derived from E. coli is preferably modified with glycine.
  • the present invention includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 (ValRS04, ValRS13, ValRS13-11, ValRS66 and ValRS67).
  • N-methyl Val having at least 90% identity with any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 and comprising at least one amino acid described in (i) to (iii) below:
  • a polypeptide having reactivity to (i) the amino acid at the position corresponding to position 43 of SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 is Gly or Ala;
  • the amino acid at the position corresponding to position 45 of SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 is Ser;
  • the amino acid at the position corresponding to position 279 of SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 is Gly or Ala.
  • the reactivity is (i) the amino acid at the position corresponding to position 43 is Asn, and / or (ii) the amino acid at the position corresponding to position 45 is Thr, and / or (iii) the position at position 279. It is preferable that the amino acid at the corresponding position is higher than when Thr is used.
  • the amino acid at the position corresponding to position 43 of the ValRS is Asn
  • the amino acid at the position corresponding to position 45 is Thr
  • the amino acid at the position corresponding to position 279 is Thr. It is preferable that the reactivity with respect to N-methyl Val is higher than ValRS.
  • the present invention also includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 6 to 9 (SerRS03, SerRS05, SerRS35, and SerRS37).
  • the amino acid at the position corresponding to position 237 of SEQ ID NOs: 6 to 9 is Ser; and
  • the amino acid at the position corresponding to position 239 of SEQ ID NOs: 6 to 9 is Gly or Ala.
  • the reactivity is preferably higher than when (i) the amino acid at the position corresponding to position 237 is Thr and / or (ii) the amino acid at the position corresponding to position 239 is Glu.
  • SerRS of the present invention has higher reactivity to N-methyl Ser than SerRS where the amino acid at the position corresponding to position 237 of the SerRS is Thr and the amino acid at the position corresponding to position 239 is Glu. preferable.
  • the present invention also includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-2 (PheRS05 and PheRS04).
  • the ⁇ subunit is not particularly limited.
  • a desired wild-type subunit can be used.
  • the amino acid sequence of NCBI Reference Sequence WP_000672380 (for example, WP_000672380.1) (base sequence is GenBank CP009685 (for example, CP009685).
  • Subunits containing .1) 1897337-1899721) can be used.
  • the present invention also includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10 to 11 (ThrRS03 and ThrRS14).
  • the amino acid at the position corresponding to position 332 of SEQ ID NOs: 10 to 11 is Gly; and
  • the amino acid at the position corresponding to position 511 of SEQ ID NOs: 10 to 11 is Gly.
  • the reactivity is preferably higher than when (i) the amino acid at the position corresponding to position 332 is Met and / or (ii) the amino acid at the position corresponding to position 511 is His.
  • the ThrRS of the present invention is preferably amino acid Met at a position corresponding to position 332 of the ThrRS, and is more reactive to N-methyl Thr than ThrRS where the amino acid at the position corresponding to position 511 is His. .
  • the present invention also includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 184-186 (TrpRS04, TrpRS05 and TrpRS18).
  • a polypeptide reactive to Trp (i) the amino acid at the position corresponding to position 132 of SEQ ID NOs: 184-186 is Val or Ala, (ii) the amino acid at the position corresponding to position 150 of SEQ ID NOs: 184-186 is Ala, (iii) The amino acid at the position corresponding to position 153 of SEQ ID NOs: 184-186 is Ala.
  • TrpRS of the present invention is an amino acid Met at a position corresponding to position 132 of the TrpRS, an amino acid Gln at a position corresponding to position 150, and a TrpRS at a position corresponding to position 153 is His. High reactivity to N-methyl Trp is preferred.
  • the present invention also includes the following polypeptides.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 (LeuRS02).
  • an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187 and having an amino acid position corresponding to position 43 of SEQ ID NO: 187 as Gly, and having reactivity with N-methyl Leu Having a polypeptide.
  • the reactivity is preferably higher than (i) when the amino acid at the position corresponding to position 43 is Tyr.
  • amino acid sequence identity is preferably 93% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the N-methylaminoacyl tRNA synthetase of the present invention is characterized in that tRNA can be efficiently acylated with N-methyl amino acid, which is known to improve the drug-likeness of a peptide as an unnatural amino acid. To do.
  • the N-methylaminoacyl tRNA synthetase of the present invention may be derived from any organism such as bacteria such as E. coli, yeast, animals, plants, etc., but is exemplified in the examples of the present specification.
  • Aminoacyl-tRNA synthetase (SEQ ID NOs: 1 to 11, 182 to 187) is preferred because it has high sequence conservation and therefore the corresponding mutation site can be easily identified in other species because of its versatility.
  • a polypeptide comprising a modified ARS of the present invention may be derived from a eukaryotic or prokaryotic ARS.
  • Eukaryotes include protozoa (including protozoa and unicellular green algae), fungi (including ascomycetes and basidiomycetes), plants (including moss plants, ferns, seed plants (nulls and angiosperms)), animals ( Invertebrates and vertebrates are included, and prokaryotes include archaea (including thermophilic and methane) and eubacteria (including cyanobacteria and E. coli).
  • the polypeptide containing the modified ARS of the present invention may be derived from a mammal (human, mouse, rat, guinea pig, rabbit, sheep, monkey, goat, donkey, cow, horse, pig, etc.).
  • the polypeptide containing the modified ARS of the present invention may be derived from, for example, Escherichia coli or yeast, and is preferably derived from a prokaryotic organism, such as a bacterium.
  • the polypeptide of the present invention is derived, for example, from the family Enterobacteriaceae bacteria, for example, E. coli, such as Escherichia (including E. coli, E. albertii, E. fergusonii), Shigella (S. dysenteriae).
  • the modification position is the case of E. coli, and N-methylaminoacyl tRNA synthetase derived from other organisms.
  • the amino acid at the position corresponding to the sequence position of the amino acid sequence of N-methylaminoacyl tRNA synthetase derived from E. coli is the position to be modified.
  • ARS is an enzyme that is involved in the translation mechanism of all living organisms, it is generally highly conserved. Therefore, the desired ARS can be modified based on the method of the present invention to obtain a modified ARS with an increased N-methylamino acid uptake ability.
  • the amino acid newly introduced into the N-methylaminoacyl tRNA synthetase includes, for example, its position in consideration of the distance and interaction with the N-methyl group with respect to the hydrophilicity, hydrogen bond, and side chain size of the amino acid.
  • the distance from the N-methylamino group can be adjusted by, for example, changing the amino acid having a large molecular weight to a small amino acid. Specifically, for example, the molecular weight can be reduced and the distance can be adjusted by changing threonine (Thr) to serine (Ser).
  • amino acid to be modified of N-methylaminoacyl tRNA synthetase examples include serine, valine, glycine, aspartic acid, or alanine. It is not limited.
  • amino acid to be modified is glutamic acid
  • examples of the amino acid having a small molecular weight include alanine, valine, serine, alanine, and aspartic acid, but are not limited thereto.
  • the amino acid to be modified is Thr
  • Ser is preferable as a low molecular weight amino acid
  • glycine (Gly) or alanine is used as a low molecular weight amino acid.
  • Al is preferable
  • glycine (Gly) is particularly preferable.
  • Thr can be replaced with Ser, Gln, Glu and Asn can be replaced with Gly or Ala
  • Met, His, Gln, etc. can be replaced with Gly, but it is not limited thereto. is not.
  • valine aminoacyl tRNA synthetase for example, the amino acid at positions 43 and / or 45 and / or 279 of SEQ ID NO: 24 (natural ValRS), or equivalent thereof Modification of the amino acid at the position is mentioned.
  • the amino acid to be substituted is not limited. For example, as described above, Thr is substituted with Ser, Ala or Gly, and other amino acids (eg Asn) are substituted with Gly or Ala. be able to.
  • the amino acid at position 43 of SEQ ID NO: 24 or the amino acid at the position corresponding thereto is substituted with Gly or Ala, and / or the amino acid at position 45 of SEQ ID NO: 24 or the amino acid at the position corresponding thereto is replaced with Ser. It is preferable that the amino acid at position 279 or the amino acid at the position corresponding thereto is substituted with Gly or Ala. Any one of these substitutions may be used, and any of these substitutions may be combined (for example, substitution at positions 43 and 45, substitution at positions 43 and 279, or positions 45 and 279) All) may be substituted. Further, other substitutions may be further combined.
  • N43 and / or T45 and / or T279 of SEQ ID NO: 24 or an amino acid corresponding to them it is preferable to substitute N43G and / or T45S and / or T279A Is preferred.
  • SerRS serine aminoacyl tRNA synthetase
  • the amino acid at position 237 and / or 239 of SEQ ID NO: 26 naturally SerRS
  • the amino acid at the position corresponding thereto is exemplified.
  • the amino acid to be substituted is not limited, but for example, as described above, Thr can be substituted with Ser, and other amino acids (eg, Glu) can be substituted with Gly or Ala.
  • the amino acid at position 237 of SEQ ID NO: 26 or the amino acid at the position corresponding thereto is substituted with Ser, and / or the amino acid at position 239 of SEQ ID NO: 26, or the amino acid at the position corresponding thereto is replaced with Gly or Ala. It is preferable to do. Any one of these substitutions may be performed, or both may be substituted. Further, other substitutions may be further combined. More specifically, it is preferable to substitute T237 and / or E239 of SEQ ID NO: 26, or an amino acid corresponding to them, and to substitute T237S and / or E239G (or E239A).
  • the amino acid at position 169 of SEQ ID NO: 28 (natural PheRS ⁇ subunit) or an amino acid at a position corresponding thereto may be mentioned.
  • the amino acid to be substituted is not limited.
  • Thr it is substituted with Ser, and in other cases, glycine (Gly) or alanine (Ala) (more preferably Gly) Can be substituted.
  • Gly glycine
  • Ala alanine
  • other substitutions may be further combined. More specifically, it is preferable to substitute Q169 of SEQ ID NO: 28 or an amino acid at a position corresponding thereto, and preferably to Q169G (or Q169A).
  • ThrRS threonine aminoacyl tRNA synthetase
  • modification of the amino acid at position 332 and / or 511 of SEQ ID NO: 29 (natural ThrRS), or the amino acid at the position corresponding thereto is mentioned.
  • the amino acid to be substituted is not limited, but for example, as described above, Thr can be substituted with Ser, and other amino acids (for example, Met and His) can be substituted with Gly.
  • replacing the amino acid at position 332 of SEQ ID NO: 29 or the amino acid at the position corresponding thereto with Gly, and / or replacing the amino acid at position 511 of SEQ ID NO: 29 or the amino acid at the position corresponding thereto with Gly Is preferred.
  • substitutions may be performed, or both may be substituted. Further, other substitutions may be further combined. More specifically, it is preferable to substitute M332 and / or H511 of SEQ ID NO: 29, or an amino acid corresponding to them, and preferably to M332G and / or H511G.
  • TrpRS tryptophan aminoacyl tRNA synthetase
  • the amino acid to be substituted is not limited.
  • Met can be substituted with Val or Ala
  • other amino acids eg, Gln
  • the amino acid at position 132 of SEQ ID NO: 188 or the amino acid at the position corresponding thereto is substituted with Val or Ala
  • / or the amino acid at position 150 of SEQ ID NO: 188 or the amino acid at the position corresponding thereto is replaced with Ala
  • M132 and / or Q150 and / or H153 of SEQ ID NO: 188, or an amino acid at a position corresponding thereto it is preferable to substitute M132V and / or Q150A and / or H153A Is preferred.
  • the amino acid at position 43 of SEQ ID NO: 189 (natural LeuRS) or an amino acid at a position corresponding thereto may be mentioned.
  • the amino acid to be substituted is not limited.
  • Thr can be substituted with Gly.
  • the amino acid at position 43 of SEQ ID NO: 189 or the amino acid at the position corresponding thereto is preferably substituted with Gly.
  • other substitutions may be further combined. More specifically, it is preferable to substitute Y43 of SEQ ID NO: 189 or an amino acid at a position corresponding to them, and preferably substitute Y43G.
  • the method for producing a mutant of N-methylaminoacyl tRNA synthetase in which an amino acid at a specific position in the present invention is modified with another amino acid can be performed by a known gene manipulation technique. For example, using a primer in which the base sequence encoding the target amino acid position is replaced with the base sequence encoding the amino acid to be modified, the DNA substituted with the base sequence encoding the amino acid to be modified is amplified and amplified. The DNA fragments can be ligated to obtain DNA encoding a full-length aminoacyl-tRNA synthetase mutant, which can be easily produced by expressing it in a host cell such as E. coli.
  • the primer used in this method is about 20 to 70 bases, preferably about 20 to 50 bases. Since this primer has a mismatch of 1 to 3 bases with the original base sequence before modification, it is preferable to use a primer having a relatively long length, for example, 20 bases or more.
  • the method for producing a mutant of N-methylaminoacyl tRNA synthetase in which the amino acid at a specific position of the present invention is modified with another amino acid is not limited to the above-described method, and a known point mutation is used.
  • Various gene manipulation techniques such as technology, gene synthesis techniques, and methods of introducing modified fragments with restriction enzymes can be used. Expression is not limited to E. coli, and animal cells and cell-free translation systems can also be used. .
  • the modified ARS of the present invention includes SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187 (PheRS05, PheRS04, ValRS04, ValRS13, ValRS13-11, SerRS03, SerRS05, SerRS35, SerRS37, ThrRS03, ThrRS14, ValRS66, ValRS67, TrpRS04, RS , LeuRS02), and a polypeptide functionally equivalent to the polypeptide.
  • a functionally equivalent polypeptide is an ARS having a high structural identity with a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187, and is an N-methyl amino acid Is a polypeptide having reactivity to.
  • a polypeptide in which amino acids are modified according to the above description is a polypeptide having an increased reactivity to N-methylamino acid as compared to ARS before modification.
  • the increase in reactivity with N-methyl amino acid may be, for example, an increase in substrate specificity for N-methyl amino acid (for example, reactivity with N-methyl amino acid / reactivity with unmodified amino acid).
  • Such a polypeptide includes, for example, one or more amino acids (preferably 1 to 20 amino acids, such as 1 to 10 amino acids, 1 to 7 amino acids) in the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187. , 1 to 5 amino acids, 1 to 3 amino acids, 1 to 2 amino acids, or 1 amino acid) are substituted, deleted, inserted, and / or added.
  • amino acids preferably 1 to 20 amino acids, such as 1 to 10 amino acids, 1 to 7 amino acids
  • a polypeptide functionally equivalent to the modified ARS consisting of the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187 is usually an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187.
  • the polynucleotide encoding the functionally equivalent polypeptide is usually a base sequence encoding the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 11,182-187 (for example, SEQ ID NOs: 12 to 22,190-195).
  • High identity is specifically 70% or more, preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more identity. is there.
  • the identity of the amino acid sequence or base sequence can be determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90: 5873-7) by Karlin and Altschul. Based on this algorithm, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (Altschul et al., J.Mol.Biol.1990 (1990) 215: 403-10).
  • BLASTN a base sequence
  • the polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acids corresponding to positions 43, 45 and 279 of SEQ ID NO: 24 (ValRS) are Are polypeptides that are not Asn, Thr, and Thr, respectively (ie, at least one of the three different polypeptides), and the amino acids corresponding to positions 43, 45, and 279 are Asn, Thr, and Thr, respectively.
  • ValRS amino acids corresponding to positions 43, 45 and 279 of SEQ ID NO: 24
  • a polypeptide having increased reactivity to N-methyl Val as compared to a certain polypeptide can be mentioned.
  • the polypeptide is (i) an amino acid corresponding to position 43 is Gly or Ala, and / or (ii) an amino acid corresponding to position 45 is Ser, and / or (iii) an amino acid corresponding to position 279 is A polypeptide that is Gly or Ala.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, but preferably (i) the amino acid corresponding to position 43 is Gly or Ala, and / or (ii) position 45.
  • a polypeptide in which the corresponding amino acid is Ser and / or (iii) the amino acid corresponding to position 279 is modified to Gly or Ala.
  • the polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acids corresponding to positions 237 and 239 of SEQ ID NO: 26 (SerRS) are each Thr And non-Glu polypeptides (ie, at least one of the two different polypeptides), which is N-methyl Ser as compared to a polypeptide whose amino acids corresponding to positions 237 and 239 are Thr and Glu, respectively. And polypeptides with increased reactivity to.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6 to 9 (SerRS03, SerRS05, SerRS35, and SerRS37), (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, inserting and / or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 6 to 9, (c) a polypeptide encoded by a base sequence having high identity with the base sequence described in any one of SEQ ID NOs: 17 to 20 (SerRS03, SerRS05, SerRS35, and SerRS37 DNA), or (d) A polypeptide encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of the base sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 17 to 20.
  • the polypeptide is preferably a polypeptide in which (i) the amino acid corresponding to position 237 is Ser, and / or (ii) the amino acid corresponding to position 239 is Gly or Ala.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, but preferably (i) the amino acid corresponding to position 237 is Ser and / or (ii) corresponds to position 239 A polypeptide in which the amino acid is modified to Gly or Ala.
  • Such a polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acid corresponding to position 169 of SEQ ID NO: 28 (PheRS) is not Gln, and A polypeptide having an increased reactivity to N-methyl Phe compared to a polypeptide whose site is Gln.
  • the polypeptide is preferably a polypeptide whose amino acid corresponding to position 169 is Gly or Ala.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, preferably polypeptides in which the amino acid corresponding to position 169 is modified to Gly or Ala.
  • the polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acids corresponding to positions 332 and 511 of SEQ ID NO: 29 (ThrRS) are Met And non-His (ie, at least one of the two different polypeptides), and N-methylThr as compared to the polypeptide in which the amino acid corresponding to positions 332 and 511 is Met and His, respectively. And polypeptides with increased reactivity to.
  • the polypeptide is preferably a polypeptide in which (i) the amino acid corresponding to position 332 is Gly and / or (ii) the amino acid corresponding to position 511 is Gly.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, but preferably the amino acid corresponding to position 332 is Gly and / or the amino acid corresponding to position 511 is modified to Gly. Polypeptide.
  • the polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acids corresponding to positions 132, 150 and 153 of SEQ ID NO: 188 (TrpRS) Are polypeptides that are not Met, Gln, and His, respectively (that is, polypeptides that differ in at least one of the three positions), and the amino acids corresponding to positions 132, 150, and 153 are Met, Gln, and His, respectively.
  • TrpRS amino acids corresponding to positions 132, 150 and 153 of SEQ ID NO: 188
  • a polypeptide having increased reactivity to N-methyl Trp as compared to a certain polypeptide can be mentioned.
  • the polypeptide is preferably (i) the amino acid corresponding to position 132 is Val or Ala, and / or (ii) the amino acid corresponding to position 150 is Ala and / or (iii) the amino acid corresponding to position 153 Is a polypeptide in which Ala.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, but preferably (i) the amino acid corresponding to position 132 is Val or Ala, and / or (ii) position 150.
  • a polypeptide in which the corresponding amino acid is Ala and / or (iii) the amino acid corresponding to position 153 is modified to Ala.
  • polypeptide of the present invention is the polypeptide described in any of the following (a) to (d), wherein the amino acid corresponding to position 43 of SEQ ID NO: 189 (LeuRS) is not Tyr
  • LeuRS amino acid corresponding to position 43 of SEQ ID NO: 189
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having high identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 187 (LeuRS02); (b) a polypeptide comprising an amino acid sequence obtained by substituting, deleting, inserting and / or adding one or more amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 187, (c) a polypeptide encoded by a nucleotide sequence having high identity with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 195 (LeuRS02 DNA), or (d) A polypeptide encoded by a DNA that hybridizes under stringent conditions with a complementary strand of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 195.
  • the polypeptide is preferably a polypeptide whose amino acid corresponding to position 43 is Gly.
  • Such polypeptides include natural polypeptides and artificially modified polypeptides, but are preferably polypeptides in which the amino acid corresponding to position 43 is modified to Gly.
  • the polypeptide of the present invention is a polypeptide obtained by modifying a natural ARS, it is a polypeptide having a higher reactivity to N-methyl amino acid than the ARS before modification, and the polypeptide of the present invention is a natural polypeptide.
  • ARS or an artificially produced polypeptide is a polypeptide having reactivity with N-methyl amino acid, that is, a polypeptide having an activity of acylating tRNA with N-methyl amino acid.
  • the reactivity is compared between the modified ARS and the natural ARS, if the ARS is composed of a plurality of subunits, the same subunit is used in addition to the subunits to be compared. They can be natural (or wild type) subunits or modified subunits, as long as they are the same in both ARSs.
  • high identity is, for example, 70% or more, preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more.
  • the amino acid sequence to be substituted, deleted, inserted and / or added may be 1 or several, for example 1 to 20, preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 To 8, more preferably 1 to 7, more preferably 1 to 6, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, more preferably 1 to 2.
  • stringent conditions in hybridization are, for example, conditions of “1 X SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more severe conditions are “0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” More severe conditions are the conditions of “0.2 mm X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”, and more severe conditions are the conditions of “0.1 mm X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • combinations of the above SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art will understand the above or other factors that determine the stringency of hybridization (eg, probe concentration, probe length, hybridization conditions). It is possible to realize the same stringency as described above by appropriately combining the reaction time and the like.
  • the present invention also relates to a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention includes any polynucleotide as long as it contains the coding sequence of the above-mentioned polypeptide of the present invention, and includes genomic DNA, cDNA, and artificially generated DNA based on them. Both are included.
  • Genomic DNA includes exons and introns. That is, genomic DNA may or may not contain an intron, and may or may not contain an untranslated region (5′UTR and / or 3′UTR), a transcriptional regulatory region, or the like.
  • the cDNA may include a nucleic acid sequence derived from a part of the intron sequence and encoding an amino acid sequence.
  • polynucleotide includes a degenerate polynucleotide composed of any codon as long as it is a codon encoding the same amino acid.
  • the polynucleotide of the present invention may be a polynucleotide derived from a desired organism.
  • the polynucleotide of the present invention may be obtained by any method.
  • complementary DNA (cDNA) prepared from mRNA
  • DNA prepared from genomic DNA DNA obtained by chemical synthesis
  • DNA obtained by PCR amplification using RNA or DNA as a template and appropriate combinations of these methods All DNAs constructed in this way are also included.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared by cloning from a genomic DNA or RNA encoding the polypeptide of the present invention and introducing a mutation according to a conventional method.
  • the polypeptide of the present invention is encoded from any tissue or cell that expresses and produces the polypeptide of the present invention according to a conventional method.
  • Prepare mRNA For example, it can be carried out by subjecting total RNA prepared by a method such as guanidine thiocyanate method, hot phenol method or AGPC method to affinity chromatography using oligo (dT) cellulose, poly U-sepharose or the like.
  • a known method such as using reverse transcriptase (Mol. Cell. Biol., Vol. 2, p. 161, 1982; Mol. Cell. Biol., Vol. 3, p 280, 1983; Gene, Vol.25, p.263, 1983), etc., synthesize cDNA strand, convert cDNA to double-stranded cDNA, and incorporate this cDNA into plasmid vector, phage vector, cosmid vector, etc.
  • a cDNA library is prepared by transforming E. coli or transfecting E. coli after in vitro packaging.
  • polynucleotide of the present invention for example, SEQ ID NO: 12 to 22,190-195 or a part thereof as a probe, whereby a target gene can be obtained.
  • the polynucleotide of the present invention for example, SEQ ID NOs: 12 to 22,190-195) or a part thereof can be used as a primer and directly amplified by PCR. The site and length of the probe or primer may be appropriately determined.
  • the present invention also relates to a vector (recombinant vector) containing a polynucleotide encoding the above-described polypeptide of the present invention.
  • the vector of the present invention is not particularly limited as long as it can be replicated or self-replicated in either a prokaryotic cell and / or a eukaryotic cell, and includes a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector.
  • cloning vectors examples include pUC19, ⁇ gt10, ⁇ gt11, and the like.
  • a vector having a promoter capable of expressing the polynucleotide is preferable.
  • the recombinant vector of the present invention is conveniently prepared by ligating a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention to a recombination vector (plasmid DNA and bacterial phage DNA) available in the art by a conventional method. can do.
  • a recombination vector Plasmid DNA and bacterial phage DNA
  • Examples of the recombination vector used include plasmids derived from E. coli (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC19, etc.), yeast-derived plasmids (pSH19, pSH15, etc.), and Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110, pTP5, pC194, etc.). Illustrated.
  • phages include bacteriophages such as ⁇ phage, and animal and insect viruses (pVL1393, manufactured by Invitrogen) such as retroviruses, vaccinia viruses, nuclear polyhedrosis viruses, and lentiviruses.
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • pVL1393 animal and insect viruses
  • retroviruses such as retroviruses, vaccinia viruses, nuclear polyhedrosis viruses, and lentiviruses.
  • An expression vector is useful for the purpose of expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention to produce the polypeptide of the present invention.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it has a function of expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention in either a prokaryotic cell and / or a eukaryotic host cell and producing these polypeptides. Not.
  • pMAL C2 pEF-BOS (Nucleic Acid Research, Vol.18, 1990, p.5322 etc.) or pME18S (Experimental Medicine Separate Volume “Gene Engineering Handbook”, 1992 etc.) can be mentioned.
  • the present invention also relates to fusion of the polypeptide of the present invention with another protein.
  • the fusion polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide of the polypeptide of the present invention reactive with N-methylamino acid and another polypeptide, and is reactive with N-methylamino acid. As long as the polypeptide chain is included, the fusion polypeptide itself may not be reactive with N-methylamino acid.
  • the fusion polypeptide of the present invention is prepared, for example, as a fusion protein with GST (Glutathione S-transferase)
  • the cDNA encoding the polypeptide of the present invention is subcloned into, for example, the plasmid pGEX4T1 (Pharmacia). It can be prepared by transforming Escherichia coli DH5 ⁇ and the like and culturing the transformant.
  • HA influenza agglutinin
  • immunoglobulin constant region ⁇ -galactosidase
  • MBP maltose binding protein
  • FLAG Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210
  • a tag (6 ⁇ His) consisting of several (for example, 6) His (histidine) residues.
  • influenza agglutinin HA
  • human c-myc fragment VSV-GP fragment
  • p18HIV fragment T7-tag
  • HSV-tag HSV-tag
  • E-tag SV40T antigen fragment
  • lck tag a known peptide such as ⁇ -tubulin fragment, B-tag, Protein C fragment, Stag, StrepTag, HaloTag and the like.
  • the vector of the present invention uses a bacterium, particularly Escherichia coli, as the host cell, the vector contains at least a promoter-operator region, a start codon, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, a stop codon, a terminator region, and a replicable unit. It is preferable that it contains.
  • the expression vector preferably contains at least a promoter, a start codon, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, and a stop codon.
  • the vector also includes DNA encoding a signal peptide, an enhancer sequence, 5 ′ and 3 ′ untranslated regions of a gene encoding the polypeptide of the present invention, splicing junction, polyadenylation site, selectable marker region or A duplicatable unit may be included.
  • it may contain a marker gene (a gene amplification gene, a drug resistance gene, etc.) that makes it possible to select a host that has been amplified and transformed.
  • a marker gene a gene amplification gene, a drug resistance gene, etc.
  • Examples include dihydrofolate reductase (DHFR) gene, thymidine kinase gene, neomycin resistance gene, glutamate synthase gene, adenosine deaminase gene, ornithine decarboxylase gene, hygromycin-B-phosphotransferase gene, aspartate transcarbamylase gene, etc. be able to.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • thymidine kinase gene thymidine kinase gene
  • neomycin resistance gene glutamate synthase gene
  • glutamate synthase gene adenosine deaminase gene
  • ornithine decarboxylase gene hygromycin-B-phosphotransferase gene
  • aspartate transcarbamylase gene etc.
  • the promoter-operator region for expressing the polypeptide of the present invention in bacteria can contain a promoter, an operator, and a Shine-Dalgarno (SD) sequence (for example, AAGG).
  • SD Shine-Dalgarno
  • examples include those containing Trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, tac promoter and the like.
  • promoters for expressing the polypeptide of the present invention in yeast include PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter.
  • PH05 promoter When the host is Bacillus, SL01 promoter, SP02 promoter, penP promoter and the like can be mentioned.
  • SV40-derived promoters when the host is a eukaryotic cell such as a mammalian cell, SV40-derived promoters, retrovirus promoters, heat shock promoters, and the like can be mentioned.
  • SV40 is a retrovirus.
  • an enhancer is an effective method for expression.
  • a suitable start codon is exemplified by methionine codon (ATG).
  • methionine codon examples include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, TAA).
  • As the terminator region a commonly used natural or synthetic terminator can be used.
  • a replicable unit refers to a DNA that has the ability to replicate its entire DNA sequence in a host cell, a natural plasmid, an artificially modified plasmid (a DNA fragment prepared from a natural plasmid) and Synthetic plasmids and the like are included.
  • Suitable plasmids include plasmid pBR322 or an artificial modification thereof (DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme) in E.Ecoli, yeast 2 ⁇ plasmid or yeast chromosomal DNA in yeast,
  • Examples of mammalian cells include plasmid pRSVneo (ATCC 37198), plasmid pSV2dhfr (ATCC 37145), plasmid pdBPV-MMTneo (ATCC 37224), plasmid pSV2neo (ATCC 37149), and the like.
  • polyadenylation site and splicing junction site those commonly used by those skilled in the art, such as those derived from SV40, respectively, can be used.
  • the expression vector of the present invention is prepared by linking at least the above promoter, start codon, polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention, stop codon and terminator region continuously and circularly to appropriate replicable units. be able to.
  • an appropriate DNA fragment for example, a linker, other restriction enzyme cleavage sites, etc.
  • the present invention also relates to a recombinant cell transformed with the above-described vector of the present invention, and the recombinant cell of the present invention can be prepared by introducing the above-described expression vector into a host cell.
  • the host cell used in the present invention is not particularly limited as long as it is compatible with the above-described expression vector and can be transformed, and is a natural cell or artificially established usually used in the technical field of the present invention.
  • Examples include various cells such as recombinant cells, such as bacteria (Escherichia, Bacillus), yeasts (Saccharomyces, Pichia, etc.), animal cells or insect cells.
  • E. coli or animal cells such as E. coli (DH5 ⁇ , TB1, HB101, etc.), mouse-derived cells (COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.), rat-derived cells (PC12, PC12h, etc.) ), Hamster-derived cells (BHK, CHO, etc.), monkey-derived cells (COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc.) and human-derived cells (Hela, diploid fibroblast-derived cells, myeloma cells, HepG2, etc. And the like.
  • E. coli DH5 ⁇ , TB1, HB101, etc.
  • mouse-derived cells COP, L, C127, Sp2 / 0, NS-1 or NIH3T3, etc.
  • rat-derived cells PC12, PC12h, etc.
  • Hamster-derived cells BHK, CHO, etc.
  • monkey-derived cells COS1, COS3, COS7, CV1, Velo, etc
  • Introduction of the expression vector into the host cell can be performed according to a conventional method ([E. coli, Bacillus subtilis etc.): Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 69, p.2110, 1972; Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979; J. Mol.Biol., Vol.56, p.209, 1971; [in the case of Saccharomyces cerevisiae]: Proc Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978; J.
  • the polypeptide of the present invention is produced by culturing transformed recombinant cells (hereinafter used to include inclusion bodies) containing the expression vector prepared as described above in a nutrient medium according to a conventional method. be able to.
  • the polypeptide of the present invention can be produced by culturing recombinant cells as described above, particularly animal cells, and secreting them into the culture supernatant.
  • the obtained culture is filtered or centrifuged to obtain a culture filtrate (supernatant), and the polypeptide of the present invention is used according to conventional methods generally used for purifying and isolating natural or synthetic proteins from the culture filtrate. Is purified and isolated.
  • Isolation and purification methods include, for example, methods using solubility such as salting out, solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and other methods utilizing molecular weight differences, Methods using charge such as ion exchange chromatography and hydroxylapatite chromatography, methods utilizing specific affinity such as affinity chromatography, methods utilizing hydrophobicity differences such as reverse phase high performance liquid chromatography, etc. Examples thereof include a method using the difference in isoelectric point such as electric point electrophoresis.
  • the culture is subjected to a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells.
  • a conventional method such as filtration or centrifugation to collect the cells or cells.
  • the membrane containing the protein of the present invention by a method such as centrifugation or filtration Get a minute.
  • the membrane fraction is solubilized using a surfactant such as Triton TM -X100 to obtain a crude solution.
  • the crude solution can be isolated and purified by using a conventional method as exemplified above.
  • the present invention also relates to a polynucleotide (cDNA or genomic DNA) encoding the above-described polypeptide of the present invention or an oligonucleotide that hybridizes to its complementary strand.
  • the oligonucleotide is an oligonucleotide that hybridizes to a base sequence containing at least the modified site of ARS of the present invention or a complementary strand thereof.
  • the oligonucleotide of the present invention is preferably a partial fragment of a polynucleotide encoding the modified ARS of the present invention, and a fragment containing the base of the modified site of the modified ARS or its complementary strand.
  • the oligonucleotide of the present invention is represented by SEQ ID NOs: 3 to 5,182 and 183 (ValRS04, ValRS13, ValRS13-11, ValRS66 and ValRS67) in the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Val.
  • Oligonucleotide comprising an amino acid corresponding to position 43 of the amino acid sequence described and / or an amino acid corresponding to position 45 and / or a base encoding a codon corresponding to the amino acid corresponding to position 279, or an oligonucleotide consisting of its complementary sequence It may be.
  • the amino acid corresponding to position 43 is preferably Gly or Ala (more preferably Gly)
  • the amino acid corresponding to position 45 is preferably Ser
  • the amino acid corresponding to position 279 is preferably Gly or Ala (more preferably Ala).
  • the oligonucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Ser, and has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 6 to 9 (SerRS03, SerRS05, SerRS35, and SerRS37). It may be an oligonucleotide comprising a base encoding a codon corresponding to the amino acid corresponding to position 237 and / or the amino acid corresponding to position 239, or an oligonucleotide consisting of a complementary sequence thereof.
  • the amino acid corresponding to position 237 is preferably Ser
  • the amino acid corresponding to position 239 is preferably Gly or Ala (more preferably Gly).
  • the oligonucleotide of the present invention corresponds to the 169th position of the amino acid sequence described in SEQ ID NOS: 1-2 (PheRS04 and PheRS05) in the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Phe. It may be an oligonucleotide comprising a base encoding a codon corresponding to the amino acid to be synthesized, or an oligonucleotide consisting of a complementary sequence thereof.
  • the amino acid corresponding to position 169 is preferably Gly or Ala.
  • the oligonucleotide of the present invention corresponds to position 332 of the amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 10 to 11 (ThrRS03 and ThrRS14) in the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Thr. And / or an oligonucleotide comprising a base encoding a codon corresponding to the amino acid corresponding to position 511, or an oligonucleotide consisting of a complementary sequence thereof.
  • the amino acid corresponding to position 332 is preferably Gly
  • the amino acid corresponding to position 511 is preferably Gly.
  • the oligonucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Trp, and is located at position 132 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 184-186 (TrpRS04, TrpRS05 and TrpRS18). It may be an oligonucleotide comprising a base encoding a codon corresponding to the corresponding amino acid and / or the amino acid corresponding to position 150 and / or the amino acid corresponding to position 153, or an oligonucleotide consisting of a complementary sequence thereof.
  • the amino acid corresponding to position 132 is preferably Val or Ala (more preferably Val)
  • the amino acid corresponding to position 150 is preferably Ala
  • the amino acid corresponding to position 279 is preferably Ala. is there.
  • the oligonucleotide of the present invention corresponds to the amino acid corresponding to position 43 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 187 (LeuRS02) in the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methyl Leu. It may be an oligonucleotide comprising a codon-encoding base or an oligonucleotide consisting of its complementary sequence.
  • the amino acid corresponding to position 43 here is preferably Gly.
  • the length of the partial fragment of the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having reactivity with N-methylamino acid is not particularly limited, but is, for example, at least 15 consecutive bases, preferably 16 bases or more, more preferably 17 bases or more, more preferably 18 bases or more, more preferably 20 bases or more, more preferably 25 bases or more, more preferably 28 bases or more, more preferably 30 bases or more, more preferably 32 bases or more, more preferably 35 It is at least a base, more preferably at least 40 bases, more preferably at least 50 bases.
  • the oligonucleotide of the present invention further comprises an oligonucleotide having another sequence at both ends or one end (5 ′ end and / or 3 ′ end) in addition to the above-mentioned partial fragment of the polynucleotide encoding the ARS of the present invention. But you can.
  • the oligonucleotide of the present invention has, for example, 500 bases or less, more preferably 300 bases or less, more preferably 200 bases or less, more preferably 100 bases or less, more preferably 70 bases or less, more preferably 60 bases or less, more Preferably it is 50 bases or less.
  • the oligonucleotide of the present invention is useful for producing a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention (for example, introducing a mutation), and also useful for detecting a nucleic acid encoding the polypeptide of the present invention.
  • the oligonucleotides of the invention can also be used as probes in DNA or RNA hybridization procedures.
  • Examples of the purpose of using the DNA as a probe include a continuous partial base sequence of 20 bases or more that hybridizes to the polynucleotide of the present invention, preferably a continuous partial base sequence of 30 bases or more, more preferably continuous. Partial base sequence of 40 bases or 50 bases or more, more preferably 100 bases or more partial base sequences, more preferably 200 bases or more partial base sequences, particularly preferably 300 bases or more partial bases Examples include sequences.
  • the polypeptide, polynucleotide, and oligonucleotide of the present invention can be made into a composition by appropriately combining carriers or media.
  • Production of the composition can be carried out using methods known to those skilled in the art.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterile water or physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative , And can be appropriately combined with a binder or the like. They can also be formulated by mixing in a unit dosage form as required by accepted pharmaceutical practice.
  • the present invention also provides a cell transformed with a polynucleotide (including DNA and RNA) encoding a mutant of the aforementioned N-methylaminoacyl tRNA synthetase.
  • a polynucleotide including DNA and RNA
  • Such cells may be prokaryotic cells or eukaryotic cells.
  • mutant of the N-methylaminoacyl tRNA synthetase of the present invention expressed in a cell is directly used for protein synthesis in the cell, a cell corresponding to the purpose can be used.
  • a method for transformation a known method can be employed.
  • the present invention also provides a method for producing a polypeptide containing an N-methyl amino acid by using the ARS in which the amino acid sequence of the present invention is modified as described above.
  • the ARS having a modified amino acid sequence of the present invention includes not only intracellular use but also in vitro (cell-free system) use.
  • tRNA can be repeatedly acylated during the translation reaction, so that N methylaminoacyl tRNA can be continuously supplied, and translation It becomes possible to avoid the addition of a large amount of tRNA that inhibits.
  • the present invention provides a method for producing unnatural amino acids efficiently, selectively, particularly regioselectively, and in large quantities.
  • the modified ARS of the present invention can be prepared using a known genetic recombination technique as described above, but can be generally prepared as follows. First, a plasmid containing the natural ARS gene is used as a template, site-specific mutations are introduced into specific positions and specific amino acids by PCR using the primers, the template plasmid is digested with restriction enzymes, and then transformed into E. coli, etc. Convert and clone the desired mutagenesis plasmid.
  • the site-directed mutagenesis using the primer is repeated in the same manner as described above, using the plasmid in which the mutation is introduced at a specific position as a template.
  • a plasmid DNA encoding is constructed. Further, when amino acid mutations are introduced, the same process may be performed.
  • the prepared DNA is transformed into Escherichia coli BL21 and the like simultaneously with the plasmid pREP4 encoding the rack repressor (LacI), and the resulting transformant is isolated and cultured, and then induced to induce expression with IPTG.
  • the obtained strain is then disrupted, and the mutant ARS is purified by passing the supernatant through an affinity column using a His tag.
  • a specific mutant ARS sequence is gene-synthesized and transferred to an expression vector, and then the target protein is purified with an affinity column using protein expression and various purification tags.
  • the method for producing a mutant of N-methylaminoacyl tRNA synthetase in which the amino acid at a specific position of the present invention is modified with another amino acid is not limited to the above-described method, and a known point mutation is used.
  • Various gene manipulation techniques such as technology, gene synthesis techniques, and methods of introducing modified fragments with restriction enzymes can be used.
  • Expression is not limited to E. coli, and animal cells and cell-free translation systems can also be used.
  • the purification method is not limited to the affinity column using polyhistidine, and various peptide tags and purification columns can be used.
  • the substrate specificity of the obtained variant can be confirmed using, for example, any one of the following three assay methods.
  • the first method uses modified ARS in place of wild-type ARS, and further translation under a cell-free translation system in which it is reconstituted with N-methylated amino acids instead of natural amino acids.
  • the reaction is carried out, N-methylamino acid is aminoacylated in the translation system, and it is confirmed by mass spectrometry that the N-methylamino acid is introduced into the peptide corresponding to the codon on the mRNA.
  • the second method estimates the peptide yield by labeling the generated peptide by translation experiments using amino acids labeled with a radioisotope or fluorescent molecule, and separating and visualizing the peptide by electrophoresis or an analytical column. Is.
  • modified ARS the transduction efficiency of the corresponding N-methylamino acid is higher than when using wild-type ARS. Therefore, the radioactivity and fluorescence of peptides observed in electrophoresis and chromatograms are increased. Is observed more strongly.
  • the third method involves reacting the modified ARS with the corresponding tRNA and N-methylamino acid in a test tube and separating the resulting N-methylaminoacyl tRNA from the unreacted tRNA by electrophoresis. Quantifies the efficiency of the acylation reaction. When modified ARS is used, more acylated tRNA is detected compared to wild-type ARS.
  • the modified ARS of the present invention has an increased reactivity to N-methyl amino acids compared to the ARS before modification.
  • An increase in reactivity to N-methyl amino acid may be an increase in reaction rate, with an increase in the amount of reaction product acylated with N-methyl amino acid, or an increase in substrate specificity for N-methyl amino acid. There may be. Also, the increase in reactivity with N-methylamino acid may be qualitative or quantitative.
  • the reaction is carried out under the same conditions except that ARS before modification or ARS after modification is used, and the reactivity (reaction rate) of N-methylamino acid as a substrate in ARS after modification compared to ARS before modification If the amount of the reaction product or the like significantly increases, it is judged that the reactivity to N-methylamino acid has increased. Also, the substrate specificity for N-methyl amino acid compared to the reaction rate for unmodified amino acids or reaction products, even if the reaction rate or amount of reaction products using N-methyl amino acid as substrate is not significantly increased. However, if the ARS after modification is increased compared to the ARS before modification, it is judged that such modified ARS has increased reactivity to N-methylamino acids.
  • the reaction rate using N-methylamino acid as a substrate or the amount of the reaction product is increased in the modified ARS compared to the unmodified ARS.
  • the modified ARS of the present invention incorporated an amount of tRNA aminoacylated with N-methylamino acid or N-methylamino acid when measured under the same conditions using the ARS before modification and the ARS after modification.
  • the amount of peptide is significantly increased, preferably at least 10%, preferably 20%, preferably 1.3 times or more, preferably 1.5 times or more, preferably 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably 5 times or more. More preferably, it increases 10 times or more, more preferably 20 times or more, further preferably 30 times or more, more preferably 50 times or more, and further preferably 100 times or more.
  • the modified ARS of the present invention when measured under the same conditions using the ARS before modification and the ARS after modification, the quantitative ratio of “N-methyl amino acid reaction product / unmodified amino acid reaction product” is changed.
  • the ARS after modification is significantly increased, preferably at least 10%, preferably 20%, preferably 1.3 times or more, preferably 1.5 times or more, preferably 2 times or more, preferably 3 times or more, Preferably it is 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, more preferably 30 times or more, still more preferably 50 times or more, more preferably 100 times or more.
  • the modified ARS of the present invention when measured under the same conditions using the ARS before modification and the ARS after modification, is continuous when a nucleic acid encoding a polypeptide containing consecutive N-methyl amino acids is translated.
  • the amount of N-methyl amino acid-containing polypeptide produced is significantly increased in the modified ARS compared to the unmodified ARS, preferably at least 10%, preferably 20%, preferably 1.3 times or more, preferably 1.5 times Above, preferably 2 times or more, preferably 3 times or more.
  • the consecutive N-methyl amino acids may be, for example, 2 consecutive and / or 3 consecutive.
  • the reactivity to N-methylamino acid can be measured according to the above confirmation method. Specifically, for example, a peptide produced by translation is electrophoresed, and a peptide incorporating N-methylamino acid or N-methylamino acid is detected. The band intensity of the unincorporated peptide can be regarded as reactive by measuring qualitatively or quantitatively. Alternatively, the peak value in mass spectrometry can be measured, and the peak value of a peptide incorporating N-methyl amino acid or the peak value of a peptide not incorporating N-methyl amino acid can be measured and regarded as reactive.
  • peptide synthesis is performed in the presence of an unmodified amino acid and N-methyl amino acid, and the quantitative ratio of “N-methyl amino acid reaction product / unmodified amino acid reaction product” is measured.
  • it is significantly increased, preferably at least 10%, preferably 20%, preferably 1.3 times or more, preferably 1.5 times or more, preferably 2 times or more, preferably 3 times or more, more preferably Is 5 times or more, more preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more.
  • the reaction conditions may be appropriately determined as long as the same conditions are used in the ARS before modification and the ARS after modification.
  • the substrate concentration of the unmodified amino acid and N-methylamino acid during the reaction may be adjusted as appropriate, as long as the reactivity to N-methylamino acid is increased under any concentration condition.
  • the unmodified amino acid may be additive-free (only the endogenous amino acid originally contained in the cell-free translation system), or 0.1 ⁇ M to 1 ⁇ m, such as 0.1 to 500 ⁇ M, 0.1 to 250 ⁇ M, 0.1 to 100 ⁇ M,
  • the reaction may be carried out by appropriately adjusting between 0.1 and 50 ⁇ M.
  • the N-methyl amino acid may be reacted, for example, by adjusting it appropriately between 50 ⁇ M and 10 ⁇ m, for example, 100 ⁇ M to 5 ⁇ mM, 200 ⁇ M to 2 ⁇ mM, and 500 ⁇ M to 1 ⁇ mM.
  • the method of the present invention can be widely applied to the modification of N-methylamino acid tRNA synthetase of other species.
  • a peptide in which a specific amino acid is substituted with its N-methylated unnatural amino acid can be created in a prokaryotic translation system.
  • Such a peptide can also be prepared by modifying ARS derived from other organisms in the same manner as in the present invention.
  • N-methylamino acid can be used as a substrate in tRNA acylation.
  • the modified ARS of the present invention makes it possible to acylate a tRNA using N-methyl amino acid and translate an N-methyl amino acid-containing peptide.
  • N-methylaminoacyl tRNA using the modified ARS of the present invention, for example, similar to the reaction in the chemical synthesis method such as the pdCpA method, the modified ARS is reacted with the corresponding N-methyl amino acid and tRNA in a test tube.
  • the product, N-methylaminoacyl tRNA may be isolated by a known nucleic acid purification method such as ethanol precipitation, and added to the translation system.
  • a polypeptide having an N-methylamino acid introduced at the target position or a polypeptide-mRNA fusion is prepared.
  • the modified ARS of the present invention has substrate specificity for tRNA and amino acids. Because of the high level, even in a mixture of translation reaction solutions containing other tRNAs and amino acids, the modified ARS, N-methylamino acid, and tRNA generate the target N-methylaminoacyl tRNA accurately and efficiently. Therefore, the isolation and purification as described above is not essential, and the reaction solution in which tRNA is acylated with N-methylamino acid is used for the translation reaction as it is, or simultaneously with the tRNA acylation reaction with N-methylamino acid. Translation reaction can be performed. Further, since there is no chemical synthesis of a substrate such as pdCpA amino acid or activated amino acid, and it can be carried out using a commercially available reagent, it is highly convenient.
  • the corresponding tRNA does not require stoichiometric consideration.
  • aminoacyl-tRNA is supplied by a chemical synthesis method, N-methylaminoacyl-tRNA is reduced by the reaction and the reaction efficiency is lowered.
  • ARS if ARS is used, translation efficiency is good in peptide synthesis in which a plurality of N-methylamino acids are introduced.
  • aminoacyl tRNA is constantly deacylated by hydrolysis reaction or peptide transfer reaction, but the modified ARS of the present invention recognizes the released tRNA and newly acylates N- ⁇ amino acid, N- ⁇ aminoacyl tRNA can be continuously supplied.
  • the modified ARS of the present invention is used to produce peptides with high translation efficiency and to produce highly diverse peptide libraries. Useful.
  • the modified ARS of the present invention has improved reactivity with N-methylamino acid as compared with natural ARS, it can be used in the presence of a lower concentration of N-methylamino acid than when natural ARS is used.
  • An acylation reaction can be performed on tRNA. That is, the absolute amount of N-methyl amino acid required for peptide translation does not require as much N-methyl amino acid as when natural ARS is used.
  • the N-methyl amino acid-containing peptide can be translated at a lower concentration of ARS than when the native ARS is used to translate the N-methyl amino acid-containing peptide. That is, the absolute amount of the modified ARS of the present invention required for peptide translation is significantly smaller than that when a N-methyl amino acid-containing peptide is translated using natural ARS.
  • N-methyl amino acid-containing peptide in order to translate an N-methyl amino acid-containing peptide, the substrate, N-methyl amino acid or ARS corresponding to the amino acid, is higher in concentration than other natural amino acids or ARS corresponding to other natural amino acids.
  • ARS which should originally use N-methylamino acid as a substrate, uses other natural amino acids in the acylation reaction, or excessive N-methylamino acid becomes another natural amino acid.
  • the use of the modified ARS of the present invention can be expected to reduce the problem.
  • a modified ARS that catalyzes acylation of tRNA (A) a tRNA binding site (b) an N-methyl amino acid substrate binding site, and (c) a catalytic active site having an activity of catalyzing an acyl transfer reaction from the N-methyl amino acid substrate to the 3 ′ end of tRNA, Including It is characterized in that tRNA and N-methylamino acid can be accurately recognized and acylated in the translation reaction mixture, and further, the acylation reaction can be repeated again by reusing the released tRNA after the acyl transfer reaction. , Said modified ARS.
  • the modified ARS of the present invention may include (d) a calibration site that hydrolyzes tRNA acylated with an undesired amino acid, in addition to (a), (b), and (c).
  • the modified ARS of the present invention can be used to synthesize tRNA acylated with the desired N-methyl amino acid substrate.
  • the method for producing an acylated tRNA by the modified ARS of the present invention includes the following steps: (a) providing one or more modified ARSs of the present invention; (b) providing a tRNA; (C) providing an N-methylamino acid; and (d) contacting the modified ARS with the tRNA and N-methylamino acid to acylate the tRNA.
  • a step of recovering a reaction product containing an acylated tRNA may be further included.
  • the recovery step it is not necessary to purify the acylated tRNA, and the reaction mixture can be recovered and used as it is. Deacylation can be prevented by not separating and purifying the produced aminoacyl-tRNA from ARS.
  • N-methylamino acid is used as a substrate.
  • Particularly preferred are N-methylphenylalanine, N-methylvaline, N-methylthreonine, N-methyltryptophan, N-methylleucine and / or N-methylserine.
  • an ARS substrate (amino acid corresponding to the ARS) is appropriately selected.
  • tRNA corresponding to ARS of the corresponding natural amino acid can be used as tRNA.
  • the “corresponding natural amino acid” is an N-methyl amino acid whose amino acid is not N-methylated.
  • the corresponding amino acid is phenylalanine, which is a tRNA that recognizes UUU, or UUC as a codon (having a corresponding anticodon).
  • the corresponding amino acid is valine, which is a tRNA that recognizes GUU, GUC, GUA, or GUG as a codon (having a corresponding anticodon).
  • the corresponding amino acid is serine, which is a tRNA that recognizes UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, or AGC as a codon (having a corresponding anticodon).
  • the corresponding amino acid is threonine, which is a tRNA that recognizes ACU, ACC, ACA, or ACG as a codon (having a corresponding anticodon).
  • the corresponding amino acid is tryptophan, which is a tRNA that recognizes UGG as a codon (having a corresponding anticodon).
  • the corresponding amino acid is leucine, which is a tRNA that recognizes UUA, UUG, CUU, CUC, CUA or CUG as a codon (having a corresponding anticodon).
  • leucine which is a tRNA that recognizes UUA, UUG, CUU, CUC, CUA or CUG as a codon (having a corresponding anticodon).
  • tRNA that recognizes a codon corresponding to the corresponding amino acid (having a corresponding anticodon) can be used.
  • a pellet obtained by ethanol precipitation of the reaction solution may be dissolved in an appropriate buffer (for example, 1 mM potassium acetate, pH 5, etc.) and added to the translation system.
  • Typical reaction conditions include, for example, 0.5 to 40 ⁇ M tRNA at a final concentration, 0.1 to 10 ⁇ M modified ARS of the present invention, 0.1 to 10 mM N-methyl amino acid, 0.1 to 10 mM ATP, 0.1 to 10 mM
  • a reaction buffer solution containing MgCl 2 at pH 7.5 and 0.1 M is reacted at 37 ° C. for 5 minutes to 1 hour.
  • tRNA in order to perform an aminoacylation reaction, for example, 1 to 50 ⁇ M tRNA, 10 to 200 (for example, 50 to 200) mM HEPES-K (pH 7.0 to 8.0 (for example, 7.6)), 1 to 100 (for example 10) )
  • the tRNA can be refolded by heating the mM KCl solution at 95 ° C. for 2 minutes and then allowing it to stand at room temperature for 5 minutes or more.
  • the acylation reaction using the modified ARS of the present invention is simple because it can be carried out with a commercially available N-methylamino acid without requiring a substrate or an activated amino acid that requires synthesis, and an acylated tRNA can be combined with a substrate. It can also be set as a kit product for obtaining.
  • the minimum contents of the kit may include (a) one or more modified ARSs of the present invention, (b) N-methylamino acid, and (c) tRNA. Containers, instructions for use, etc. may be included.
  • the N-methyl amino acid in (b) and the tRNA in (c) are an N-methyl amino acid and a tRNA that are substrates for the modified ARS in (a), respectively. That is, tRNA is a tRNA that recognizes a codon corresponding to a natural amino acid corresponding to an N-methyl amino acid (having a corresponding anticodon).
  • N-methyl amino acid-binding tRNA can be used to produce a polypeptide having an N-methyl amino acid introduced at a desired site.
  • the method includes the step of translating a nucleic acid encoding the polypeptide of interest in the presence of the modified ARS of the present invention.
  • the method for producing an N-methyl amino acid-containing polypeptide using the modified ARS of the present invention includes (a) a step of providing the modified ARS of the present invention, (b) instead of the wild-type ARS.
  • a step of constructing a cell-free translation system reconstituted using the modified ARS of the present invention includes (c) a step of providing mRNA having a codon corresponding to an anticodon of tRNA serving as a substrate of the modified ARS at a desired site, (d) ) Adding the mRNA to the cell-free translation system to produce a polypeptide having an N-methyl amino acid introduced at a desired site.
  • N-methylamino acids include N-methylalanine, N-methylleucine, N-methyltryptophan, N-methylphenylalanine and N-methylvaline. It is preferable to use N-methylthreonine and / or N-methylserine, particularly preferably N-methylphenylalanine, N-methylvaline, N-methylthreonine, N-methyltryptophan, N-methylleucine and / or N -Methylserine.
  • a specific method of polypeptide synthesis may be basically performed in accordance with a known method, and can be performed, for example, in the same manner as described in WO2013100132, but various modifications are possible. Generally, it can carry out according to the following description.
  • the translation system it is preferable to use a cell-free translation system in which translation factors such as PURESYSTEM (registered trademark) (BioComber, Japan) ⁇ are reconstructed.
  • the factors constituting the translation system can be freely manipulated, for example, by removing phenylalanine and its ARS from within the translation system, instead of adding N-methylphenylalanine and the modified phenylalanine ARS of the present invention, for example, N-methylphenylalanine can be introduced site-specifically into codons such as UUU or UUC that encode phenylalanine.
  • ATP and GTP are preferably used at 0.1-10 mM as ribonucleosides.
  • HEPES-KOH is preferably used as a buffer at 5-500 mM and pH 6.5-8.5, and other examples include, but are not limited to, Tris-HCl and phosphoric acid.
  • the salts acetates such as potassium acetate and ammonium acetate, and glutamates such as potassium glutamate can be used, and it is preferably used at 10 to 1000 mM.
  • magnesium component magnesium acetate is preferably used at 2-200 mM, and other examples include, but are not limited to, magnesium chloride.
  • creatine kinase is preferably used at 0.4 to 40 ⁇ g / mL, and creatine phosphate is preferably used at 2-200 to mM.
  • other energy regeneration systems represented by pyruvate kinase and phosphoenolpyruvate can also be used.
  • the nucleoside converting enzyme myokinase and nucleoside diphosphate kinase are preferably used at 0.1-10 unit / mL and 0.2-20 ⁇ g / mL, respectively.
  • Inorganic pyrophosphatase is preferably used as a diphosphate degrading enzyme at 0.2 to 20 unit / mL.
  • Spermidine is preferably used as a polyamine at 0.2 to 20 mM, and other examples include spermine, but are not limited thereto.
  • dithiothreitol is preferably used at 0.1 to 10 mM, and other examples include ⁇ -mercaptoethanol, but are not limited thereto.
  • tRNA include E. coli.
  • E. coli MRE600 (RNase negative) -derived tRNA (Roche) is preferably used at 0.5 to 50 mg / mL, and other E.coli-derived tRNA can be substituted.
  • 10-HCO-H4folate is preferably used at 0.1 to 10 mM
  • methionyl tRNA transformylase is preferably used at 0.05 to 5 ⁇ M.
  • IF1 is preferably used at 0.5-50 ⁇ M
  • IF2 is preferably used at 0.1-50 ⁇ M
  • IF3 is preferably used at 0.1-50 ⁇ M.
  • EF-G is preferably used at 0.1-50 ⁇ M, EF-Tu at 1-200 ⁇ M, and EF-Ts at 1-200 ⁇ M.
  • RF-2, RF3 and RRF are preferably used at 0.1-10 ⁇ M as translation termination factors, respectively.
  • Ribosomes are preferably used at 1-100 ⁇ M.
  • the amino acids that serve as substrates for peptide synthesis are the 20 natural amino acids that constitute proteins and their derivatives, and it is preferable that only the amino acids contained in the peptide to be synthesized are used at 0.25 to 10 mM.
  • mRNA is used at 0.1-10 ⁇ M as a template for peptide synthesis.
  • commercially available enzymes such as T7 RNA polymerase, T3 RNA polymerase, and SP6 RNA polymerase can be used, as long as they are selected to match the promoter sequence of the template DNA. It is often preferable to use at 1-100 ⁇ g / mL.
  • nucleoside CTP and UTP serving as substrates are preferably used at 0.1 to 10 mM. The solution in which these factors are mixed is allowed to stand, for example, at 37 ° C. for 1 hour to achieve translational synthesis of the peptide, and the temperature and reaction time are not limited thereto.
  • the modified ARS of the present invention can also be combined with other non-natural amino acid introduction techniques such as the pdCpA method or the flexizyme method.
  • other non-natural amino acid introduction techniques such as the pdCpA method or the flexizyme method.
  • a polypeptide containing both can be synthesized. it can.
  • the modified ARS of the present invention is inserted into an expression vector or genome to express the modified ARS in the cell, and the N-methyl amino acid is added to the medium using the N-methyl amino acid as a substrate.
  • the polypeptide can be expressed.
  • tRNA natural amino acid tRNA corresponding to N-methylamino acid can be used. These may be purified products from the living body containing modified bases, or may be tRNAs containing no modified bases generated by using the In vitro transcription reaction. In addition, a mutant tRNA in which a mutation other than the part recognized by ARS in tRNA can be used as a substrate.
  • Example 1 ARS that tolerates N-methylphenylalanine
  • ⁇ PheRS wild type and mutant plasmid preparation> Starting from a plasmid (pQE-32 (2) 2_wtPheRS) containing the ORF sequence (SEQ ID NOs: 27 and 28) of the wild-type PheRS ⁇ subunit gene of E. coli, site-specific mutation using PCR was introduced into Table 1 The described mutant PheRS plasmid (having His-tag (6xHis) at the N-terminus) was constructed.
  • Table 2 shows combinations of the template plasmid, the forward primer and the reverse primer used.
  • the sequence of each primer is SEQ ID NO: 30 to 33 in order from “F.F02” to “F.F05”, and SEQ ID NO: 34 to 37 in order from “R.F02” to “R.F05”.
  • 0.5 ⁇ L of 10 U / ⁇ L DpnI was added to the PCR reaction solution, and the template DNA was digested by further incubation at 37 ° C. for 1.5 hours, and the obtained mutant DNA was purified.
  • the obtained gene mutant DNA and pREP4 (Invitrogen, V004-50) encoding the lacI gene were simultaneously transformed into Escherichia coli strain XL-1 Blue (STRATAGENE, 200366), and the transformed strain was treated with ampicillin and kanamycin.
  • the target plasmid was purified from a clone obtained by seeding on the agar medium containing it, and it was confirmed that the mutation was introduced.
  • mutant protein was purified from the obtained supernatant using a Qiagen Ni-NTA spin column kit (Qiagen, 31314) according to the product manual. Finally, excess imidazole was removed using a desalting column PD miniTrap G-25 (GE Healthcare 28-9180-07) according to the product manual.
  • the cells are suspended in 1 L of CHAPS solution (0.5% CHAPS (DOJINDO: 349-04722), 50% TBS (TaKaRa, T903)) and mixed with 10 ⁇ L of 30 KU / ⁇ l rLysozyme (Novagen, 71110-3). And stirred for 10 minutes at room temperature. Subsequently, 2 mL of 1M MgCl 2 and 320 ⁇ L of Benzonase Nuclease (Novagen, 70746-3) were added and stirred at room temperature for 20 minutes. Thereafter, imidazole having a final concentration of 20 mM was added, and the insoluble fraction was separated by centrifugation.
  • CHAPS solution 0.5% CHAPS (DOJINDO: 349-04722), 50% TBS (TaKaRa, T903)
  • 10 ⁇ L of 30 KU / ⁇ l rLysozyme Novagen, 71110-3
  • the supernatant was obtained by using a column packed with 15 mL of Ni Sepharose High Performance (GE Healthcare) and AKTA10S (GE Healthcare), using an imidazole concentration gradient (initial concentration 20 mM, final concentration 500 mM).
  • the mutant protein was purified by Finally, dialysis cassette (MWCO10,000, Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes 70mL, Thermo Scientific Pierce Co.) was used, 3L of Stock solutions (50 mM Hepes-KOH, 100 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 1 mM Dialysis was performed using DTT, pH 7.6) three times (2 hours, twice, overnight) to obtain a mutant protein.
  • D-tRNAPhe (SEQ ID NO: 38) tRNAPhe DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGGGGATTGAAAATCCCCGTGTCCTTGGTTCGATTCCGAGTCCGGGCACCA
  • R-tRNAPhe (SEQ ID NO: 39) tRNAPhe RNA sequence: GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGGGGAUUGAAAAUCCCCGUGUCCUUGGUUCGAUUCCGAGUCCGGGCACCA
  • ⁇ Aminoacylation reaction> In order to carry out the aminoacylation reaction, a 40 ⁇ M transcribed tRNAPhe, 10 mM HEPES-K (pH 7.6), 10 mM KCl solution was heated at 95 ° C. for 2 minutes, and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes or longer to remove the tRNA. Folding was performed.
  • mutants 04 and 05 When the activity of the aminoacylation reaction was evaluated, the aminoacylation activity of N-methyl-phenylalanine was improved in mutants 04 and 05 compared to the wild type (FIG. 1).
  • the nucleotide sequence of variant 04 is shown in SEQ ID NO: 12, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of variant 05 is shown in SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2.
  • DF template DNA
  • RF translation template mRNA
  • DF (SEQ ID NO: 40) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • R-F (SEQ ID NO: 41) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • ⁇ Cell-free translation system In order to confirm the translational introduction of N-methylphenylalanine, translation synthesis of a polypeptide containing the desired N-methylphenylalanine was performed by adding N-methylamino acid and PheRS to the cell-free translation system.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 0.
  • PheRS wild type or mutant and phenylalanine or N-methylphenylalanine were added to a solution containing 250 ⁇ M each of 1 ⁇ M template mRNA, arginine, aspartic acid, lysine, methionine, and tyrosine at 37 ° C.
  • the peptide was synthesized by translation for 1 hour.
  • peptide translation experiments were performed using radioisotope-labeled aspartic acid. Specifically, 1 ⁇ M template mRNA (RF (SEQ ID NO: 41)), arginine, lysine, methionine, tyrosine (final concentration 250 ⁇ M each), 14 C-aspartic acid (final concentration 37 ⁇ M, Moravek Biochemicals, MC139) was added, and PheRS wild type or mutant 05 (final concentration 0.1 ⁇ M) and phenylalanine (final concentration 250 ⁇ M) or N-methylphenylalanine (final concentration 1 mM or 250 ⁇ M) were added, Incubated at 37 ° C.
  • RF SEQ ID NO: 41
  • peak intensity ratio N-methylphenylalanine peak intensity / phenylalanine peak intensity
  • peak intensity ratio N-methylphenylalanine peak intensity / phenylalanine peak intensity
  • PheRS mutant 05 had higher aminoacylation activity of N-methylphenylalanine compared to PheRS wild type, and as a result, promoted translational synthesis of peptides containing N-methylphenylalanine.
  • Peptide sequence P-F1 (SEQ ID NO: 42) formylMetArgPheArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeF1 (SEQ ID NO: 42) formylMetArg [MePhe] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • the amount of peptide produced when translating a sequence containing 2 consecutive and 3 consecutive N-methylphenylalanines is 4 to 4 more when using the PheRS mutant (PhrRS05) of the present invention than when using the pdCpA method. It turned out to be 8 times higher.
  • Table 3 shows the introduction of site-specific mutations using the PCR method starting with a plasmid (PQE-32 (2) 2_wtVALRS) that encodes an ORF sequence (SEQ ID NO: 23, 24) containing the E. coli wild-type ValRS gene.
  • a ValRS plasmid (having His-tag (6xHis) at the N-terminus) was constructed.
  • each primer is in order from “F.V2" to “F.V19”, “F.V46” to “F.V48”, and “F.V13-01” to “F.V13-16”.
  • 0.5 ⁇ L of 10 U / ⁇ L DpnI was added to the PCR reaction solution, and the template DNA was digested by further incubation at 37 ° C. for 1.5 hours, and the obtained mutant DNA was purified.
  • the obtained gene mutant DNA and pREP4 (Invitrogen, V004-50) encoding the lacI gene were simultaneously transformed into Escherichia coli strain XL-1 Blue (STRATAGENE, 200366), and the transformed strain was treated with ampicillin and kanamycin.
  • the target plasmid was purified from a clone obtained by seeding on the agar medium containing it, and it was confirmed that the mutation was introduced.
  • the above-described operations were repeated to obtain the target mutagenesis plasmid. Table 4 shows combinations of primers and templates in that case.
  • E. coli BL21 strain transformed with a mutant plasmid and pREP4 (Invitrogen, V004-50) was cultivated at 37 ° C. with a transformant obtained in 4 mL of LB medium containing kanamycin and ampicillin. Thereafter, when the OD value at 600 nm reached 0.4 to 0.8, IPTG having a final concentration of 0.5 mM was added and further cultured at 37 ° C. for 4 hours, and then the cells were collected by a centrifuge.
  • the mutant protein was purified from the obtained supernatant using a Qiagen Ni-NTA spin column kit (Qiagen, 31314) according to the product manual. Finally, excess imidazole was removed using a desalting column PD miniTrap G-25 (GE Healthcare 28-9180-07) according to the product manual.
  • D-tRNAVal2A (SEQ ID NO: 117) tRNAVal2A DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGCGTCCGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACCACCTTGACATGGTGGGGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTCGGACGCACCA
  • R-tRNAVal2A (SEQ ID NO: 118) tRNAVal2A RNA sequence: GCGUCCGUAGCUCAGUUGGUUAGAGCACCACCUUGACAUGGUGGGGGUCGGUGGUUCGAGUCCACUCGGACGCACCA
  • ⁇ Aminoacylation reaction To perform the aminoacylation reaction, a 40 ⁇ M transcribed tRNA, 10 mM HEPES-K (pH 7.6), 10 mM KCl solution was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes or longer to remove the tRNA. Folding was performed.
  • RV (SEQ ID NO: 120) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • D-V2 (SEQ ID NO: 121) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • R-V2 (SEQ ID NO: 122) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • D-V3 (SEQ ID NO: 123) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • R-V3 (SEQ ID NO: 124) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGCGUGUCGUCGUCUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCUCG
  • ⁇ Cell-free translation system In order to confirm the translational introduction of N-methylvaline, translation synthesis of a polypeptide containing the desired N-methylvaline was performed by adding N-methylvaline and a ValRS mutant to the cell-free translation system.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.
  • Mass spectrometry using MALDI-TOF MS was performed to detect peptides into which N-methylvaline had been translated. Specifically, a solution was prepared by adding 1 ⁇ M template mRNA (RV (SEQ ID NO: 120)) and arginine, lysine, methionine, tyrosine, aspartic acid (each final concentration 250 ⁇ M) to the cell-free translation system described above, ValRS (final concentration 0.1-1 ⁇ M) and N-methylvaline (final concentration 5 mM) were added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • RV template mRNA
  • ValRS final concentration 0.1-1 ⁇ M
  • N-methylvaline final concentration 5 mM
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • the translation product was identified by measuring MALDI-TOF MS spectrum using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix.
  • SEQ ID NO: 24 As a result of translation using wild-type ValRS (SEQ ID NO: 24), a peak corresponding to the peptide sequence P-V1 into which valine mixed in the cell-free translation system was introduced (FIG.
  • Peptide sequence P-V1 (SEQ ID NO: 125) formylMetArgValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeV1 (SEQ ID NO: 125) formylMetArg [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • ValRS13-11 mutant with further improved aminoacylation activity on N-methylvaline>
  • the plasmid introduced with the target mutation was prepared as described above, and ValRS mutant was prepared by carrying out expression and purification in E. coli (Table 3).
  • ValRS13-11 SEQ ID NO: 5
  • ValRS13-11 showed higher activity against N-methylvaline than ValRS13.
  • ValRS13 and ValRS13-11 When the aminoacylation reaction of N-methylvaline with ValRS wild type, ValRS13 and ValRS13-11 was confirmed, it was observed that ValRS13-11 synthesized more aminoacyl tRNA than ValRS13 (FIG. 6, lane 8 vs lane). 9 and lane 12 vs lane 13). In particular, when N-methylvaline was at a low concentration of 1.25 ⁇ m, there was a large difference in the amount of synthesis of ValRS13 and ValRS13-11, indicating that ValRS13-11 has high activity.
  • the same experiment was performed using template mRNAs (R-V2V (SEQ ID NO: 122), R-V3 (SEQ ID NO: 124)) encoding a peptide sequence in which N-methyl valine is continuous or triple continuous.
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • ValRS13-11 when ValRS13-11 was added, translation synthesis of the target peptide sequence P-MeV3 containing 3 residues of N-methylvaline as the main product was observed (FIG. 7 (f), PeakPMeV10). Peptide sequences P-MeV5 and P-MeV6 containing valine were also observed, but the peak intensity was suppressed more than ValRS13 (FIG. 7 (f), Peak-MeV11 and MeV12). From these results, it was shown that ValRS13-11 improved the aminoacylation activity for N-methylvaline compared to ValRS13, leading to an increase in the amount of translational synthesis of the peptide containing the target N-methylvaline.
  • Peptide sequence P-MeV2 (SEQ ID NO: 126) formylMetArg [MeVal] [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeV4 (SEQ ID NO: 126) formylMetArg [MeVal] ValArgAspTyrLysAspAspAspLys Or formylMetArgVal [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeV3 (SEQ ID NO: 127) formylMetArg [MeVal] [MeVal] [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeV5 (SEQ ID NO: 127) formylMetArg [MeVal] [MeVal] ValArgAspTyrLysAspAspAspLys Or formylMetArg [MeVal] Val [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspLys Or formylMetArgVal [MeVal] [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-MeV6 (SEQ ID NO: 127) formylMetArg [MeVal] ValValArgAspTyrLysAspAspAspLys Or formylMetArgVal [MeVal] ValArgAspTyrLysAspAspAspLys Or formylMetArgValVal [MeVal] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Table 5 shows the introduction of site-specific mutations using the PCR method, starting with a plasmid encoding an ORF sequence (SEQ ID NO: 25, 26) containing the E. coli wild-type SerRS gene (PQE-32 (2) 2_wtSERRS).
  • the mutated SerRS plasmid (having His-tag (6xHis) at the N-terminus) was constructed.
  • each primer is “F.S2” to “F.S8”, “F.S15” to “F.S23”, and “F.S33” to “F.S38” in order from SEQ ID NO: 128. 149, “R.S2” to “R.S8”, “R.S15” to “R.S23”, and “R.S33” to “R.S38” are SEQ ID NOS: 150 to 171 in this order. Thereafter, 0.5 ⁇ L of 10 U / ⁇ L DpnI was added to the PCR reaction solution, and the template DNA was digested by further incubation at 37 ° C. for 1.5 hours, and the obtained mutant DNA was purified.
  • the obtained gene mutant DNA and pREP4 (Invitrogen, V004-50) encoding the lacI gene were simultaneously transformed into Escherichia coli strain XL-1 Blue (STRATAGENE, 200366), and the transformed strain was treated with ampicillin and kanamycin.
  • the target plasmid was purified from a clone obtained by seeding on the agar medium containing it, and it was confirmed that the mutation was introduced.
  • E. coli BL21 strain transformed with a mutant plasmid and pREP4 (Invitrogen, V004-50) was cultivated at 37 ° C. with a transformant obtained in 4 mL of LB medium containing kanamycin and ampicillin. Thereafter, when the OD value at 600 nm reached 0.4 to 0.8, IPTG having a final concentration of 0.5 mM was added and further cultured at 37 ° C. for 4 hours, and then the cells were collected by a centrifuge.
  • ⁇ Small-scale purification of SerRS wild type and mutant> Next, the obtained microbial cells were crushed, and the target mutant protein was purified from the supernatant. Specifically, the cells are suspended in 600 ⁇ L of CHAPS solution (0.5% CHAPS (DOJINDO: 349-04-722), 50% TBS (TaKaRa, T903)), and 6 ⁇ L of 30 U / ⁇ l rLysozyme (Novagen, 71110 -3), and then incubated at room temperature for 10 minutes, further mixed with 2 ⁇ L of 2.5 U / ⁇ L of benzonase nuclease (Novagen, 70746-3), then incubated at room temperature for 20 minutes and centrifuged.
  • CHAPS solution 0.5% CHAPS (DOJINDO: 349-04-722), 50% TBS (TaKaRa, T903)
  • 6 ⁇ L of 30 U / ⁇ l rLysozyme Novagen, 71110 -3
  • the mutant protein was purified from the obtained supernatant using a Qiagen Ni-NTA spin column kit (Qiagen, 31314) according to the product manual. Finally, excess imidazole was removed using a desalting column PD miniTrap G-25 (GE Healthcare 28-9180-07) according to the product manual.
  • E. coli tRNA R-tRNASer3 (R-tRNASer3 (SEQ ID NO: 172) was subjected to in vitro transcription using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1300) in the presence of 7.5 mM GMP. SEQ ID NO: 173) was synthesized and purified by RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • D-tRNASer3 (SEQ ID NO: 172) tRNASer3 DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGTGAGGTGGCCGAGAGGCTGAAGGCGCTCCCCTGCTAAGGGAGTATGCGGTCAAAAGCTGCATCCGGGGTTCGAATCCCCGCCTCACCGCCA
  • R-tRNASer3 (SEQ ID NO: 173) tRNASer3 RNA sequence: GGUGAGGUGGCCGAGAGGCUGAAGGCGCUCCCCUGCUAAGGGAGUAUGCGGUCAAAAGCUGCAUCCGGGGUUCGAAUCCCCGCCUCACCGCCA
  • ⁇ Aminoacylation reaction To perform the aminoacylation reaction, a 40 ⁇ M transcribed tRNA, 10 mM HEPES-K (pH 7.6), 10 mM KCl solution was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes or longer to remove the tRNA. Folding was performed.
  • Template mRNA (RS (SEQ ID NO: 175) was synthesized from template DNA (DS (SEQ ID NO: 174)) by in vitro transcription reaction using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1300). And purified with RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • CT21 (SEQ ID NO: 174) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTCCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • RS (SEQ ID NO: 175) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUCCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • N-methylserine and SerRS were added to the cell-free translation system to perform translational synthesis of the desired N-methylserine-containing polypeptide.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1. 5 mg / ml E.
  • coli MRE600 RNase negative -derived tRNA (Roche), 0.1 mM 10-HCO-H4folate, 4 ⁇ g / ml creatine kinase, 3 ⁇ g / ml myokinase, 2 unit / ml inorganic pyrophosphatase, 1.1 ⁇ g / ml Nucleoside diphosphate kinase, 0.6 ⁇ M methionyl tRNA transformylase, 0.26 ⁇ M EF-G, 0.24 ⁇ M RF2, 0.17 ⁇ M RF3, 0.5 ⁇ M RRF, 2.7 ⁇ M IF1, 0.4 ⁇ M IF2, 1.5 ⁇ M F3, 40 ⁇ M EF-Tu, 84 ⁇ M EF-Ts, 1.2 ⁇ M ribosome, 0.03 ⁇ M ArgRS, 0.13 ⁇ M AspRS, 0.11 ⁇ M LysRS, 0.03 ⁇ M MetRS, 0.02 ⁇ M TyrRS
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to detect a peptide into which N-methylserine was translated, mass spectrometry using MALDI-TOF MS was performed. Specifically, a solution was prepared by adding 1 ⁇ M template mRNA (RS (SEQ ID NO: 175)) and arginine, lysine, methionine, tyrosine, aspartic acid (each final concentration 250 ⁇ M) to the cell-free translation system described above, SerRS (final concentration 0.1-2 ⁇ M) and N-methylserine (final concentration 5 mM) were added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • RS template mRNA
  • arginine arginine
  • lysine lysine
  • methionine methionine
  • tyrosine aspartic acid
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • the translation product was identified by measuring MALDI-TOF MS spectrum using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix.
  • Peptide sequence P-CT21Ser (SEQ ID NO: 176) formylMetArgSerArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-CT21MeSer (SEQ ID NO: 176) formylMetArg [MeSer] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • ⁇ ThrRS wild type and mutant protein preparation An expression vector having a polyhistidine sequence at the N-terminus and containing the mutations described in Table 7 was constructed. Subsequently, this vector was transformed into an expression strain, and the target mutant protein was purified from the supernatant after cell disruption using a nickel column.
  • Template mRNA (RT (SEQ ID NO: 178) was synthesized from template DNA (DT (SEQ ID NO: 177)) by in vitro transcription using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1300). And purified with RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • DT (3lib15 # 09) (SEQ ID NO: 177) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGGCTGGTCCGGGTTTTATGACTAAGAGTGGTAGTGGTAGTTAAGCTTCG
  • RNA sequence GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAGGCUGGUCCGGGUUUUAUGACUAAGAGUGGUAGUGGUAGUUAAGCUUCG
  • ⁇ Cell-free translation system In order to confirm the translational introduction of N-methylthreonine, translation synthesis of a polypeptide containing the desired N-methylthreonine was performed by adding N-methylthreonine and a ThrRS mutant to a cell-free translation system.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to detect a peptide into which N-methylthreonine was translated, mass spectrometry using MALDI-TOF MS was performed. Specifically, a solution in which 1 ⁇ M template mRNA (RT (SEQ ID NO: 178)) and glycine, proline, alanine, phenylalanine, lysine, methionine, and serine (each final concentration 250 ⁇ M) is added to the above cell-free translation system. Preparation, ThrRS (final concentration 2 ⁇ M) and N-methylthreonine (final concentration 5 mM) were added, and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • RT template mRNA
  • ThrRS final concentration 2 ⁇ M
  • N-methylthreonine final concentration 5 mM
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • the translation product was identified by measuring MALDI-TOF MS spectrum using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix.
  • Peptide sequence P-3lib15Thr (SEQ ID NO: 179) formylMetLysAlaGlyProGlyPheMetThrLysSerGlySerGlySerGlySer
  • Peptide sequence P-3lib15MeThr (SEQ ID NO: 179) formylMetLysAlaGlyProGlyPheMet [MeThr] LysSerGlySerGlySer
  • Example 5 Development of ARS that tolerates N-methyltryptophan ⁇ TrpRS wild-type and mutant protein preparation> An expression vector having a polyhistidine sequence at the N-terminus and containing the mutations described in Table 8 was constructed. Subsequently, this vector was transformed into an expression strain, and the target mutant protein was purified from the supernatant after cell disruption using a nickel column.
  • a template mRNA (SEQ ID NO: 197) was synthesized from the template DNA (DW (SEQ ID NO: 196) by an in vitro transcription reaction using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1300). And purified with RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • CT29 SEQ ID NO: 196
  • DNA sequence GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTGGCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • RW (SEQ ID NO: 197) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUGGCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • ⁇ Cell-free translation system In order to confirm the translational introduction of N-methyltryptophan, translation synthesis of a polypeptide containing the desired N-methyltryptophan was performed by adding N-methyltryptophan and a TrpRS mutant to the cell-free translation system.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to detect a peptide into which N-methyltryptophan was translated, mass spectrometry using MALDI-TOF MS was performed. Specifically, a solution was prepared by adding 1 ⁇ M template mRNA (RW (SEQ ID NO: 197)) and arginine, lysine, methionine, tyrosine, aspartic acid (each final concentration 250 ⁇ M) to the cell-free translation system described above. TrpRS (final concentration 5 ⁇ M) and N-methyltryptophan (final concentration 5 mM) were added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • RW SEQ ID NO: 197
  • TrpRS final concentration 5 ⁇ M
  • N-methyltryptophan final concentration 5 mM
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • the translation product was identified by measuring MALDI-TOF MS spectrum using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix.
  • TrpRS wild-type TrpRS
  • a peak corresponding to the target peptide peak P-CT29MeTrp containing N-methyltryptophan ((FIG. 11 (a), Peak MeW1) was observed.
  • the main product was a peak corresponding to the peptide P-CT29Trp derived from Trp mixed in a trace amount in the translation system (FIG. 11 (a), PeakW1), while the TrpRS variant 04 ( SEQ ID NO: 184), TRPRS variant 05 (SEQ ID NO: 185) and TrpRS variant 18 (SEQ ID NO: 186) were used for experiments.
  • a peak derived from P-CT29MeTrp (Peak MeW2-4, FIG.
  • TrpRS 11 (b) )-(d) was observed as the main product, which indicates that peptides with MePrp introduced at a higher purity were synthesized than when wild-type TrpRS was used, and these TrpRS variants were ARS that can introduce MeTrp into peptides more efficiently than wild-type TrpRS It was suggested that
  • Peptide sequence P-CT29Trp (SEQ ID NO: 198) formylMetArgTrpArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-CT29MeTrp (SEQ ID NO: 199) formylMetArg [MeTrp] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Example 6 Development of ARS that tolerates N- methylleucine ⁇ LeuRS wild-type and mutant protein preparation> An expression vector having a polyhistidine sequence at the N-terminus and containing the mutations described in Table 9 was constructed. Subsequently, this vector was transformed into an expression strain, and the target mutant protein was purified from the supernatant after cell disruption using a nickel column.
  • Template mRNA (RL (SEQ ID NO: 201) was synthesized from template DNA (DL (SEQ ID NO: 200) by in vitro transcription using RiboMAX Large Scale RNA production System T7 (Promega, P1300). And purified with RNeasy Mini kit (Qiagen).
  • CT23 (SEQ ID NO: 200) DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTCTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
  • RL (SEQ ID NO: 201) RNA sequence: GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUCUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
  • ⁇ Cell-free translation system In order to confirm the translational introduction of N-methylleucine, translation synthesis of a polypeptide containing the desired N-methylleucine was performed by adding N-methylleucine and a LeuRS mutant to the cell-free translation system.
  • the translation system used was the PURE system, a reconstituted cell-free protein synthesis system derived from E. coli. Specifically, a basic cell-free translation solution (1 mM GTP, 1 mM ATP, 20 mM creatine phosphate, 50 mM HEPES-KOH pH 7.6, 100 mM potassium acetate, 9 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, 1 mM dithiothreitol, 1.
  • ⁇ Detection by mass spectrometry> In order to detect a peptide into which N-methylleucine was translated, mass spectrometry using MALDI-TOF MS was performed. Specifically, a solution was prepared by adding 1 ⁇ M template mRNA (RL (SEQ ID NO: 201)) and arginine, lysine, methionine, tyrosine, aspartic acid (each final concentration 250 ⁇ M) to the cell-free translation system described above, LeuRS (final concentration 0.4-2 ⁇ M) and N-methylleucine (final concentration 5 mM) were added and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • RL SEQ ID NO: 201
  • arginine, lysine, methionine, tyrosine, aspartic acid each final concentration 250 ⁇ M
  • LeuRS final concentration 0.4-2 ⁇ M
  • N-methylleucine final concentration 5 mM
  • the obtained translation reaction product was purified by SPE C-TIP (Nikkyo Technos) and analyzed by MALDI-TOF MS.
  • the translation product was identified by measuring MALDI-TOF MS spectrum using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid as matrix.
  • the intensity ratio was comparable to the peak of peptide P-CT23Leu (Peak L2, Fig. 12 (b)) containing. This means that peptides with more MeLeu introduced were synthesized than when wild-type LeuRS was used, and this LeuRS variant was more efficient than wild-type LeuRS. It was suggested that this is an ARS that can introduce MeLeu.
  • Peptide sequence P-CT23Leu (SEQ ID NO: 202) formylMetArgLeuArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Peptide sequence P-CT23MeLeu (SEQ ID NO: 203) formylMetArg [MeLeu] ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
  • Example 7 Development of modified ValRS with improved selectivity to N-methylvaline by improving valine hydrolyzing ability in Editing domain ⁇ ValRS wild type and mutant protein preparation>
  • a modified ValRS expression vector having a polyhistidine sequence at the N-terminal and containing a catalytic domain mutation (N44G, T45S) and a calibration domain mutation T279A (G) that improves the activity to N-methylvaline was constructed (Table). Ten). Subsequently, this vector was transformed into an expression strain, and the target mutant protein was purified from the supernatant after cell disruption using a nickel column.
  • D-tRNAVal1 (SEQ ID NO: 204) tRNAVal1 DNA sequence: GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTGATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTCCCTTACAAGGAGGGGGTCGGCGGTTCGATCCCGTCATCACCCACCA
  • R-tRNA Val1 (SEQ ID NO: 205) tRNAVal1 RNA sequence: GGGUGAUUAGCUCAGCUGGGAGAGCACCUCCCUUACAAGGAGGGGGUCGGCGGUUCGAUCCCGUCAUCACCCACCA
  • ⁇ Aminoacylation reaction To perform the aminoacylation reaction, a 50 ⁇ M transcribed tRNA, 10 mM HEPES-K (pH 7.6), 10 mM KCl solution was heated at 95 ° C. for 2 minutes and then allowed to stand at room temperature for 5 minutes or longer to remove the tRNA. Folding was performed.
  • a modified aminoacyl-tRNA synthetase having an increased reactivity to N-methylamino acid compared to natural aminoacyl-tRNA-synthetase (ARS) is provided.
  • the modified aminoacyl-tRNA synthetase of the present invention includes N-methyl such as N-methyl-phenylalanine, N-methyl-valine, N-methyl-serine, N-methyl-threonine, N-methyl-tryptophan, N-methyl-leucine, etc.
  • the substituted amino acid can be aminoacylated to the corresponding tRNA with higher efficiency than the natural aminoacyl tRNA synthetase.
  • a polypeptide containing N-methylamino acid can be more efficiently produced.

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Abstract

本発明は、天然型アミノアシルtRNA合成酵素 (aminoacyl-tRNA synthetase；ARS) よりも、N-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇した改変アミノアシルtRNA合成酵素を提供する。本発明の改変アミノアシルtRNA合成酵素は、N-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N－メチルートリプトファン、N－メチルーロイシンなどのN-メチル置換アミノ酸を、対応するtRNAに、天然型アミノアシルtRNA合成酵素よりも高い効率でアミノアシル化することができる。本発明により、N-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを、より効率的に製造することができる。

Description

改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素およびその用途
　本発明は、天然型アミノアシルtRNA合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetase；ARS)よりも、N-メチルアミノ酸を対応するtRNAにアミノアシル化する効率が上昇したアミノアシルtRNA合成酵素およびその用途に関する。より具体的には本発明は、天然型ARSよりも、N-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N－メチルートリプトファン、N－メチルーロイシンの６つのN-メチル置換アミノ酸を対応するtRNAにより効率良くアミノアシル化することができるアミノ酸配列が改変されたアミノアシルtRNA合成酵素およびその用途に関する。本発明のアミノ酸配列が改変されたアミノアシルtRNA合成酵素により、N-メチルアミノ酸を選択的に、かつ位置選択的に含有するペプチドを高効率で製造することができる。
　地球上の生物は一般的に、DNA (＝情報貯蔵物質)の情報が、RNA (＝情報伝達物質) を介して、タンパク質（＝機能物質）の構造ならびにその構造によって生じる機能を規定している。ポリペプチドやタンパク質は20種類のアミノ酸からなるが、4種類のヌクレオチドからなるDNAからRNAに情報が転写され、その情報がアミノ酸に翻訳され、それらがポリペプチドやタンパク質を構成する。
　翻訳の際、3文字のヌクレオチドの並びを1種のアミノ酸に対応させるアダプターとしての役割を果たすのがtRNAであり、tRNAとアミノ酸との結合に関与するのが、アミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA syathetase；ARS）である。
　ARSはアミノ酸とtRNAとを特異的に結合させる酵素であり、生物種毎に、一部の例外を除き天然に存在する２０種類のアミノ酸それぞれに対応して２０種類のARSが存在し、任意のコドンに対応するアンチコドンを有するtRNAを、20種類のタンパク性アミノ酸のうちコドンに割りつけられた特定のアミノ酸で正確にアシル化する。すなわち、ある特定のアミノ酸に対応するtRNA合成酵素は、当該アミノ酸のtRNAを他のアミノ酸のtRNAから識別してこれに当該アミノ酸にしか結合させず、他のアミノ酸とは結合させない。
　mRNAのポリペプチド鎖への翻訳では、対応するアミノ酸が結合したtRNA（アミノアシルtRNA）が、mRNAの開始コドンから順に対応して、リボソーム上でmRNAと水素結合し、次のコドンに対応して結合した隣接アミノアシルtRNA上のアミノ酸にペプチジル転移する。転移によりアミノ酸が外れた、先のtRNAは、mRNAから遊離し、再び対応するアミノ酸との結合をARSにより触媒される。mRNAのストップコドンに至ると、終結因子と呼ばれるタンパク質がやってきて翻訳は終了し、ポリペプチド鎖がリボソームから開放される。生体内のタンパク質はこれらの過程を経て製造される。そして生体内でそれぞれ重要な生理機能を発揮する。
　一方、同じ生体内で生理活性を発揮する医薬品の分野では、従来の分子量500未満の低分子化合物では難しいとされてきた創薬分野への、中分子と呼ばれる分子量500～2000の化合物による、新たな医薬品創出の可能性が期待されている。例えば、天然物由来の中分子薬剤であるシクロスポリンＡはその代表例であり、11残基から成る微生物が産生するペプチドで、細胞内標的であるサイクロフィリンを阻害する、経口投与可能なペプチドである。
　シクロスポリンＡのペプチドの特徴として、「N-メチルアミノ酸」という非天然型アミノ酸を構成成分に含むことが挙げられる。これに端を発し、近年、N-メチルアミノ酸をペプチドに導入することでペプチドのdrug-likenessを高め、さらにそれを創薬へ応用する研究が複数報告されている(非特許文献１,２，３)。特に、N-メチルアミノ酸の導入は水素結合供与性水素の減少、プロテアーゼ耐性の獲得、コンフォーメーションの固定化につながり、膜透過性や代謝安定性に寄与することも知られるようになった(非特許文献１, ４、特許文献１)。
　このことからN-メチルアミノ酸を複数含む多様なペプチドのライブラリーから医薬品の候補物質を選択する創薬方法が考えられ、なかでも無細胞翻訳系を利用したN-メチルアミノ酸含有ペプチドのmRNAディスプレイライブラリーなどは、その多様性、スクリーニングの簡便性の点から期待が集まっている (非特許文献９，１０、特許文献１)。まず膨大な種類のRNAもしくはDNA(遺伝型)などとそれがコードするペプチド(表現型)がそれぞれ1対1対応を形成している分子の集まりであるディスプレイライブラリーを構築し、続いて標的タンパクなどに結合反応させた後に、洗浄にて非結合分子を除去してライブラリーに含まれる極まれな微量の所望の分子を選択した後にそのRNA(DNA)の配列を解読することによって結合するペプチドの配列情報を簡便に得ることが出来る。特に無細胞翻訳系を利用するmRNAディスプレイライブラリーやribosomeディスプレイライブラリーは1012-14の多様な種類の分子を含むライブラリーを簡便に扱うことが出来る(非特許文献１１)。また最近再構成無細胞翻訳系を利用することで非タンパク性アミノ酸を含むペプチドを調製できる方法が開発され、ディスプレイ技術と組み合わせることでN-メチルアミノ酸含有ペプチドディスプレイライブラリーの構築が可能となってきた（非特許文献１０）。
　mRNAの翻訳によるN-メチルアミノ酸含有ペプチドの調製方法として、これまでいくつかの方法が知られている。それらの方法は、「N-メチルアミノアシルtRNA」を予め別途調製し、これを翻訳系に添加することによる。
　まず、Hechtらが開発したpdCpA法（非特許文献５）では、化学合成した非天然N-メチルアミノ酸でアシル化されたpdCpA（5’-phospho-2’-deooxyribocytidylriboadenosine）と転写で得た3’末端のCAが欠如したtRNAをT4 RNA ligaseにより連結することで、予めN‐メチルアミノアシルtRNAを作製する。この方法を用いてN‐メチルアラニンやN‐メチルフェニルアラニンといったアミノ酸が導入されている(非特許文献６)。しかし、本願発明者らがいくつかの非天然N-メチルアミノ酸とtRNAの結合体をpdCpA法で調製して無細胞翻訳系に加えたところ、N-メチルアミノ酸を複数導入しようとすると翻訳効率が悪くなり、特に、N-メチルバリンにおいては導入し得なかった（非公開データ）。
　別の方法として、Sugaらはあらかじめエステル化により活性化したN‐メチルアミノ酸を人工RNA触媒（フレキシザイム）を用いてtRNAにアミノアシル化させる方法を報告しており（特許文献２）、複数種類のN‐メチルアミノ酸を翻訳導入させることに成功している。この方法は様々な側鎖構造に適用できるものの、非芳香族側鎖アミノ酸のアミノアシル化効率は多くの場合40-60%と決して高くなく、特にN-メチルバリンはpdCpA法同様に翻訳導入が確認できていない (非特許文献３)。
　さらに、Szostakらの方法では、大腸菌から抽出したtRNAをもとに野生型ARSを用いてアミノアシルtRNAを得た後、3ステップから成る化学的なN-メチル化反応を経てN‐メチルアミノアシルtRNAを調製する。しかし、この方法で効率よく翻訳が進行する側鎖は、バリン、ロイシン、スレオニンの3種に限られている。また、この方法では煩雑な操作が必要である上、N-メチル化反応が完全に進行しないことによって、出発物質である天然アミノ酸が微量に混入するといった、反応制御の難しさが生成物の純度に直結する（非特許文献２）。
　さらにこれらの手法では、翻訳系の外で調製されたN-メチルアミノアシルtRNAを翻訳反応液に添加する形をとるため、翻訳系内でN‐メチルアミノアシルtRNAが再生成されることはなく、翻訳過程においてN‐メチルアミノアシルtRNAは消費される一方になる。このため、大量のN‐メチルアミノアシルtRNA添加が必要になるが、大量のtRNA添加はそれ自体がペプチド収量を低下させる一因となる（非特許文献７)。さらに翻訳溶液中でのアミノアシルtRNAの不安定さが問題となる。アミノアシルtRNAはアミノ酸とｔＲＮＡがエステル結合で連結しているため、ｐＨ７．５の生理的条件下において加水分解されることが示されており（非特許論文１２）、その半減期はアミノ酸側鎖に依存して短いもので30分である。またアミノアシルtRNAはアミノアシル-tRNA-延長因子Tu（EF-Tu）と複合体を形成することで加水分解が抑制されるが、翻訳系中のEF-Tuの濃度を超過したアミノアシルtRNAは加水分解されてしまう。つまり翻訳反応が進行するにつれ、翻訳開始時に添加したアミノアシルtRNAのデアシル化は進み、最終的にはN-メチルアミノを持つアミノアシルtRNAが枯渇することになる。実際、Szostakらはこれを問題視し、複数のN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドの合成を行う場合は、N-メチルアミノアシルtRNAを2回に分けて翻訳開始時と反応途中に添加している(非特許文献２)。
　一方、N-メチルアミノ酸導入に関する上記課題は、天然型のアミノ酸に対する天然型のARSと同様の機能を有するN-メチルアミノ酸に対応するARSが存在すれば解決できるが、ARSはその厳密な基質認識能を有しており限界がある。例外として、Murakamiらは天然型HisRS、PheRSを用いて、N-メチルヒスチジンおよびN-メチルフェニルアラニンを無細胞翻訳系でペプチドに導入できることを報告している（非特許文献８、１３）。またSzostakらは、天然型ARSを用いてN-メチルバリン、N-メチルロイシン、N-メチルアスパラギン酸、N-メチルヒスチジン、N-メチルリシン、N-メチルトリプトファンの6種類のN-メチルアミノ酸のアミノアシル化を同定している（非特許文献１４）。しかし、無細胞翻訳系と天然型ARSを用いた後の報告では、N-メチルヒスチジンおよびN-メチルアスパラギン酸を含むペプチドの翻訳合成をマススペクトルで同定し、ある程度の収量が得られることを報告している一方、N-メチルバリン、N-メチルロイシン、N-メチルリシン、N-メチルトリプトファンの場合は、翻訳合成の効率が非常に低いことを示している（非特許論文８）。これらの報告から、天然型ARSを用いたN-メチルアミノ酸のアミノアシル化およびペプチドへの翻訳導入が確認されているのは、実質的には、N-メチルフェニルアラニンおよび N-メチルヒスチジン、N-メチルアスパラギン酸の３例に過ぎない。
　そこで、天然型のARSを改変し、非天然型アミノ酸のtRNAへの結合を触媒する機能を持たせることを考えた場合、いくつかの先行技術がある（特許文献３，４，５）。これらは非天然のアミノ酸とtRNAとの結合を触媒する改変ARSであるが、これらは、フェニルアラニンあるいはチロシンの側鎖誘導体を中心とするアミノ酸を基質としており、N-メチルアミノ酸を基質とする改変ARS、さらにはN-メチルアミノ酸を複数残基ペプチド中に導入できる改変ARSは知られていない。
WO2013/100132 WO2007/066627 WO2003/014354 WO2007/103307 WO2002/085923
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　本発明は、N-メチルアミノ酸を基質とする反応性を高めるように改変された改変ARSを提供することを課題とする。より具体的には、本発明が解決しようとする課題は、N-メチルアミノ酸を複数含有するペプチドを効率よく製造するために、tRNAを大量に使用することなく、N-メチル非天然アミノ酸、特にN-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N－メチルトリプトファン、N－メチルロイシンをtRNAに結合させるアシル化反応を触媒する新規な改変ARS及びその用途を提供することである。
　N-メチルアミノ酸に対する反応性を高めたARSを取得するため、本発明者らは異なるアミノ酸を基質とする複数のARS遺伝子を取得し、当該遺伝子に変異を導入してアミノ酸配列が改変されたARSをコードする変異ARS遺伝子を構築した。これらの改変ARSを発現させて回収し、非修飾アミノ酸またはN-メチルアミノ酸の存在下でtRNAと共にインキュベートして、アミノアシル化反応を評価した。N-メチルアミノ酸とARSと相互作用における立体構造の推定と、度重なる試行錯誤の結果、本発明者らは、フェニルアラニルtRNA合成酵素（PheRS）、セリルtRNA合成酵素（SerRS）、バリルtRNA合成酵素（ValRS）、スレオニルtRNA合成酵素（ThrRS）、ロイシルtRNA合成酵素（LeuRS）、トリプトファニルtRNA合成酵素(TrpRS)などの複数のARSに関して、野生型ARSと比較してN-メチルアミノ酸のアミノアシル化反応の活性が上昇した改変ARSを取得することに成功した。
　例えば0.1μMの野生型PheRSは、1 mMのN-メチルフェニルアラニンを添加しても、翻訳合成されたペプチドへの取り込みはほとんど観測されなかった一方、0.1μMの改変PheRSを用いた場合、0.25 mM N-メチルフェニルアラニン添加時でさえ、ペプチドへの取り込みが明確に観測された（実施例１）。MALDI-TOF MSを用いた質量分析により、ペプチドに翻訳導入されたフェニルアラニンとN-メチルフェニルアラニンの含量を調べたところ、そのピーク値の比率（N-メチルフェニルアラニンのピーク強度/フェニルアラニンのピーク強度）は、0.25 mM N-メチルフェニルアラニン添加時において野生型PheRSでは0.8であったのに対し、改変PheRSαサブユニットを用いた場合では12.4と劇的に上昇した（実施例１）。また、フェニルアラニンを2連続または3連続含む配列を翻訳させたところ、それぞれN-メチルフェニルアラニンを2連続または3連続含むペプチドが合成されることが確認され、その効率はpdCpA法を用いた場合よりも有意に高かった。またValRSにおいても、5mM N-メチルバリンの存在下で翻訳合成を行い、ペプチド産物の質量分析を行ったところ、野生型ValRSでは、非修飾バリンが取り込まれたペプチドが主生成物として検出されたのに対し、改変ValRSではN-メチルバリンが導入されたペプチドが主生成物として観測された（実施例２）。そして、ValRSの校正ドメインに変異を導入することで非修飾Valのアミノアシル化活性を低下させることで、N-メチルバリンへの選択性をより向上させることに成功した（実施例７）。また、バリンを2連続または3連続含む配列を翻訳させたところ、それぞれN-メチルバリンを2連続または3連続含むペプチドが合成されることが確認された（実施例２）。またSerRSにおいても、野生型SerRSにおいては非修飾セリンを取り込んだ翻訳産物が主生成物として検出される条件下で、改変SerRSを用いた場合は、N-メチルセリンを取り込んだ翻訳産物が主生成物として検出された（実施例３）。またThrRSにおいても、野生型ThrRSを用いた場合は非修飾Thrを取り込んだ翻訳産物が検出される条件下において、改変ThrRSを用いた場合、N-メチルThrを取り込んだ翻訳産物は観測された一方、非修飾Thrを取り込んだ翻訳産物はほとんど観測されず、野生型ThrRSを用いた場合に比べて高純度でN-メチルThrが導入されたペプチドが合成されることが示された（実施例４）。TrpRSにおいても、野生型TrpRSを用いた場合は非修飾Trpが主生成物として検出される一方、改変TrpRSを用いた場合、N-メチルTrpを取り込んだ翻訳産物が主生成物として観測されるようになった（実施例５）。LeuRSにおいては、野生型LeuRSを用いた場合はN-メチルLeuを含む翻訳産物が観測されなかったのに対し、改変LeuRSを用いた場合はN-メチルLeuを取り込んだ翻訳産物が非修飾型Leuを含むそれとほぼ程度で生成されていることが分かった（実施例６）。このように本発明の改変ARSを用いれば、野生型ARSを用いた場合に比べて、より高い効率でペプチド中にN-メチルアミノ酸を導入することが可能となる。
　従って、以下の発明が提供される。
　本発明は、N-メチルアミノ酸に対する反応性を有するARSを提供する。具体的には、本発明は、天然型アミノアシルtRNA合成酵素(aminoacyl-tRNA synthetase；ARS)よりも、N-メチルアミノ酸、特にN-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N－メチルトリプトファン、N－メチルロイシンの６つのN-メチル置換アミノ酸をより効率良く取り込むことができるアミノ酸配列が改変されたそれぞれのARSおよびその用途に関する。本発明のアミノ酸配列が改変されたARSにより、これらのN-メチルアミノ酸から、任意のN-メチルアミノ酸を選択的に、かつ位置選択的に含有するペプチドを高い効率で製造することができる。
　さらに本発明は、本発明の改変ARSを用いて、非天然のアミノ酸を含有するポリペプチドを製造する方法に関する。より詳細には、アミノ酸配列が改変されたフェニルアラニン、バリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、およびロイシンのARSを用いて、それぞれ、N-メチルフェニルアラニン、N-メチルバリン、N-メチルセリン、N-メチルスレオニン、N－メチルトリプトファン、およびN－メチルロイシンを含有してなるポリペプチドを製造する方法に関する。
　すなわち本発明は、以下の発明を提供する。
〔１〕改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）を含むポリペプチドであって、当該ARSはN-メチルアミノ酸を元の天然のARSより効率よく取り込む反応をすることができるポリペプチド。
〔２〕N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変された、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）活性を有するポリペプチドであって、該改変が、分子量が10以上減少するアミノ酸への置換を少なくも１つ含む、ポリペプチド。
〔３〕前記N-メチルアミノ酸が、バリン、セリン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびロイシンからなる群より選択される〔１〕または〔２〕に記載のポリペプチド。
〔４〕前記ＡＲＳが、ＶａｌＲＳ、ＳｅｒＲＳ、ＰｈｅＲＳのαサブユニット、ＴｈｒＲＳ、ＴｒｐRSおよびＬｅｕＲＳからなる群より選択される〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔５〕前記ＶａｌＲＳが、大腸菌由来のＶａｌＲＳの43位アスパラギンおよび/または45位スレオニンおよび/または279位スレオニンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔６〕前記SerＲＳが、大腸菌由来のSerＲＳの239位グルタミン酸および/または237位スレオニンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔７〕前記PheＲＳαサブユニットが、大腸菌由来のPheＲＳαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔８〕前記ThrＲＳが、大腸菌由来のThrＲＳの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔９〕前記TrpＲＳが、大腸菌由来のTrpＲＳの132位メチオニンおよび/または150位グルタミンおよび/または153位ヒスチジンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１０〕前記LeuＲＳが、大腸菌由来のLeuＲＳの43位チロシンに相当する位置で改変された、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１１〕前記ＶａｌＲＳが、大腸菌由来のＶａｌＲＳの（ａ）43位アスパラギンに相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または（ｂ）45位スレオニンに相当する位置がセリン、および／または（ｃ）279位スレオニンに相当する位置がグリシンまたはアラニンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１２〕前記SerＲＳが、大腸菌由来のSerＲＳの（ａ）239位グルタミン酸に相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または（ｂ）237位スレオニンに相当する位置がセリンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１３〕前記PheＲＳαサブユニットが、大腸菌由来のPheＲＳαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置がグリシンまたはアラニンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１４〕前記ThrＲＳが、大腸菌由来のThrＲＳの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置がそれぞれグリシンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１５〕前記TrpＲＳが、大腸菌由来のTrpＲＳの(a)132位メチオニンに相当する位置がアラニンまたはバリン、および／または（ｂ）150位グルタミンに相当する位置がアラニン、および／または（ｃ）153位ヒスチジンに相当する位置がアラニンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１６〕前記LeuＲＳが、大腸菌由来のLeuＲＳの43位チロシンに相当する位置がグリシンである、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１７〕前記ARSが、細菌由来のものである〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載のポリペプチド。
〔１８〕前記細菌が、大腸菌である〔１７〕に記載のポリペプチド。
〔１９〕下記（a）および（ｂ）で構成される群から選択される、〔１〕～〔１８〕のいずれかに記載のポリペプチド。
（a） 配列番号：１乃至１１および１８２乃至１８７からなる群から選択されたアミノ酸を含むポリペプチド
（b） 配列番号：１乃至１１および１８２乃至１８７からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
〔２０〕配列番号：１乃至１１および１８２乃至１８７からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
〔２１〕〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチド。
〔２２〕〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔２３〕〔２２〕に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
〔２４〕〔２２〕に記載のポリヌクレオチドまたは〔２３〕に記載のベクターを含む宿主細胞。
〔２５〕〔２４〕に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、〔１〕～〔２１〕のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
〔２６〕N-メチルアミノ酸でアシル化されたtRNAの製造方法であって、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、N-メチルアミノ酸およびtRNAを接触させる工程を含む方法。
〔２７〕前記接触させる工程が、無細胞翻訳系で行われる〔２６〕に記載の方法。
〔２８〕N-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを製造する方法であって、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載のポリペプチドおよびN-メチルアミノ酸の存在下、翻訳を行う工程を含む方法。
〔２９〕前記翻訳を行う工程が、無細胞翻訳系で行われる〔２８〕に記載の方法。
　本発明の改変ARSにより、煩雑な反応を経ることなくN-メチルフェニルアラニン・N-メチルバリン・N-メチルスレオニン・N-メチルセリン・N-メチルトリプトファン・N-メチルロイシンを天然型のフェニルアラニン・バリン・スレオニン・セリン・トリプトファン・ロイシンのtRNAに効率良く連結できる。
　また本発明の改変ARSを用いた方法によれば、tRNAは化学量論量を必要とせず、N-メチルアミノ酸を複数導入するペプチド合成においても翻訳効率良く製造し、多様性の高いペプチドライブラリーを作製するのに有用である。
　また本願発明者らは、「翻訳反応中に絶えずアミノアシルｔRNAを供給する」というARSの特性がもたらす翻訳効率への影響を確かめるために、本願発明で得られた改変PheRS０５（配列番号2）と翻訳反応中ではアミノアシルｔRNAの再生が期待できないpdCpA法の二つ方法を用いてN-メチルフェニルアラニンの導入効率の比較を行った。その結果、改変ARSを用いた場合の方が翻訳効率が高く、特にN-メチルフェニルアラニンの２連続導入、３連続導入の場合は４－８倍程度の収量にて目的ペプチドが合成された（非公開データ）。このように本発明は、従来では生産が困難であったN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを、より効率的に製造することを可能とするものである。
改変PheRSのアミノアシル化反応の活性を評価した図である。野生型PheRSに比べ、PheRS04およびPheRS05を用いた場合、N-メチルフェニルアラニンでアシル化された合成ペプチドのバンドがより濃く観察される（レーン8, 9 vs. 12, 13）。 PheRS変異体を用いた翻訳合成ペプチドの電気泳動による確認を示す図である。野生型PheRSに比べ、改変PheRSを用いた場合、N-メチルフェニルアラニンを含有するペプチドのバンドがより濃く観察される（レーン2, 3 vs. 5, 6）。 改変PheRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析による検出を示す図である。(a) 0.1μM wt PheRS, 0.25 mM Phe, (b) 0.1μM wt PheRS, 0.25 mM MePhe, (c) 0.1μM wt PheRS, 1 mM MePhe を用いて翻訳合成した場合のマススペクトル。 改変PheRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析による検出を示す図である。(d) 0.1μM PheRS05, 0.25 mM Phe, (e) 0.1μM PheRS05, 0.25 mM MePhe, (f) 0.1μM PheRS05, 1 mM MePhe を用いて翻訳合成した場合のマススペクトル。 改変ValRSを用いたアミノアシル化反応を示す図である。変異体13（ValRS13）にて野生型よりも多くN-メチルバリンでアシル化されたtRNAが観測される（レーン10）。 改変ValRSを用いた翻訳ペプチドの質量分析を示す図である。(a) 野生型ValRS、(b) ValRS13、(c) ValRS04を用いて翻訳したペプチドのマススペクトル。ValRS13を用いたとき、MeValが含有されたペプチドが主生成物として観測される。 ValRS13-11を用いたアミノアシル化反応を示す図である。変異体13-11（ValRS13-11）では、野生型や変異体13（ValRS13）に比べてより多くのN-メチルバリンでアシル化されたtRNAが観測される。 ValRS13とValRS13-11の活性比較を示す図である。ValRS13 ((a), (c), (e) ) 及びValRS13-11 ((b), (d), (f)) を用いて翻訳したN-メチルペプチド含有ペプチドのマススペクトル。ValRS13-11を用いて翻訳した方が目的のN-メチルバリン含有ペプチドの純度が高いことがわかる。 改変SerRSを用いたアミノアシル化反応を示す図である。変異体 03, 35, 37にてN-メチルセリンでアシル化されたtRNAが観測される（レーン3, 25, 27）。 改変SerRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析を示す図である。(a) 野生型, (b) SerRS03, (c) SerRS05, (d) SerRS35, (e) SerRS37 を用いて翻訳したN-メチルセリン含有ペプチドのマススペクトル。野生型に比べ、各改変体を用いた場合の方が純度よく目的のMeSer含有ペプチドが合成されている。 改変ThrRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析を示す図である。(a) 野生型, (b) ThrRS03, (c) ThrRS14を用いて翻訳したN-メチルスレオニン含有ペプチドのマススペクトル。野生型に比べ、各改変体を用いた場合の方が純度よく目的のMeThr含有ペプチドが合成されている。 改変TrpRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析を示す図である。(a)野生型TrpRS、(b)TrpRS04、(c)TrpRS05 、(d)TrpRS18を用いて翻訳したペプチドのマススペクトル。TrpRS04,05,18を用いたとき、MeWが含有されたペプチドが主生成物として観測される。 改変LeuRSを用いた翻訳合成ペプチドの質量分析を示す図である。(a)野生型LeuRS、(b)LeuRS02を用いて翻訳したペプチドのマススペクトル。LeuRS02を用いたとき、MeLが含有されたペプチドが主生成物として観測される。 校正ドメインに変異を持った改変ValRSを用いたMeValのアミノアシル化反応を示す図である。変異体１３－１１，６６，６７の3者に大きな活性の違いはない（レーン１７，１８，１９）。 校正ドメインに変異を持った改変ValRSを用いたValのアミノアシル化反応を示す図である。変異体１３－１１に比べ変異体６６，６７に活性の減弱が見られた（レーン１７vs１８，１９）。
　本発明はアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の酵素－基質特異性を変えた酵素変異体を提供することを目的としたものである。より詳細には、本発明は、効率よく、選択的に、N-メチルアミノ酸を含有するポリペプチドを大量に製造することができるアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を、天然のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸配列を改変することにより調製することを特徴とするものである。
　本発明は、N-メチルアミノ酸と反応することができるARSを含むポリペプチドを提供する。より具体的には本発明は、改変ARSを含むポリペプチドであって、当該ARSは、元の天然のARSより効率よくN-メチルアミノ酸と反応することができるポリペプチドを提供する。また本発明は、改変ARSを含むポリペプチドであって、当該ARSはN-メチルアミノ酸を元の天然のARSより効率よく取り込む反応をすることができるARSであるポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドは、アミノアシルtRNA合成酵素活性を有するポリペプチドであって、N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変されている。ここでN-メチルアミノ酸を取り込むとは、例えばN-メチルアミノ酸で対応するtRNAをアミノアシル化することを言い、当該tRNAへのN-メチルアミノ酸の結合、あるいは当該アシル化反応で生成したアミノアシルtRNAを用いた翻訳反応における合成タンパク質へのN-メチルアミノ酸の取り込みであってよい。また、ポリペプチドがアミノアシルtRNA合成酵素活性を有するとは、当該ポリペプチドが単独でアミノアシルtRNA合成酵素活性を示す場合のみならず、他の因子と共同でアミノアシルtRNA合成酵素活性を示す場合を含む。例えばアミノアシルtRNA合成酵素が複数のサブユニットから構成される場合、本発明のポリペプチドはその１つのサブユニットであってよく、他のサブユニットと合せて複合体としてアミノアシルtRNA合成酵素活性を示すものであってよい。そのような場合、本発明の改変ポリペプチドを、他の野生型サブユニットと共にアミノアシルtRNA合成酵素複合体を形成させた場合、野生型のサブユニットからなるアミノアシルtRNA合成酵素複合体に比べ、N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強している。すなわち本発明において、N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変された、アミノアシルtRNA合成酵素活性を有するポリペプチドには、複数のサブユニットからなるアミノアシルtRNA合成酵素複合体の一つのサブユニットを改変したポリペプチドであって、アミノアシルtRNA合成酵素複合体が持つN-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変されたポリペプチドを含む。
　また改変ARSを含むポリペプチドとは、改変ARSのポリペプチド鎖を含むポリペプチドを言い、具体的には、当該ポリペプチドは、改変ARSのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。また元の天然のARSとは、改変ARSが由来する天然のARSを言い、例えば野生型ARSであってよく、また天然に存在する多型（ポリモルフィズム）が含まれる。またN-メチルアミノ酸と反応することができるとは、改変ARSがN-メチルアミノ酸を基質として酵素反応をすることができることを言う。当該反応は、例えばN-メチルアミノ酸でtRNAをアシル化する反応であってよく、具体的には、N-メチルアミノ酸とtRNAとの結合反応を触媒する反応であってよい。例えばARSが基質とするアミノ酸に応じて、それに該当するN-メチルアミノ酸および該当するtRNAの存在下で反応を行わせ、N-メチルアミノ酸とtRNAとの結合を検出すればよい。あるいはN-メチルアミノ酸との反応は、翻訳におけるポリペプチドへのN-メチルアミノ酸の取り込みであってもよい。例えば改変ARSおよびN-メチルアミノ酸の存在下で翻訳を行わせ、翻訳されて生成するポリペプチドへのN-メチルアミノ酸の取り込みを検出することで、ARSがN-メチルアミノ酸-tRNAを生成させたことが検出できる。ポリペプチドへのN-メチルアミノ酸の取り込みが高いほど、N-メチルアミノ酸と反応性は高いと判断される。
　また、元の天然のARSより効率よく反応することができるとは、少なくともある条件において、元の天然のARSよりも高い効率で反応することであってよく、または、元のARSでは反応や反応産物が確認できないものが、確認できるようになることであってもよい。例えば、元の天然のARSよりも改変ARSを用いた場合に、N-メチルアミノ酸を取り込んだポリペプチドが多く生成されれば、その改変ARSは元の天然のARSより効率よくN-メチルアミノ酸と反応すると判断される。また、例えばN-メチルアミノ酸を含むあるポリペプチドについて、元の天然のARSを用いた場合は生成が確認できないが、改変ARSを用いた場合は生成が確認できた場合も、その改変ARSは元の天然のARSより効率よくN-メチルアミノ酸と反応すると判断される。例えば、2、3またはそれ以上連続してN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドの生成が、元の天然のARSを用いた場合は確認できず、改変ARSを用いた場合は確認できた場合は、当該改変ARSは、元の天然のARSよりもN-メチルアミノ酸と効率よく反応すると判断される。
　また、元の天然のARSより効率よく反応することができるとは、少なくともある条件において、元の天然のARSよりも高い純度で目的反応物が精製されることであってもよい。例えば、元の天然のARSよりも改変ARSを用いた場合に、混入に由来する天然アミノ酸に比べてN-メチルアミノ酸を取り込んだポリペプチドが多く生成されれば、その改変ARSは元の天然のARSより効率よくN-メチルアミノ酸と反応すると判断される。あるいは、N-メチルアミノ酸を用いた反応効率が変わらないのに対して、天然のアミノ酸に対する反応効率が低下していることが確認できれば、その改変ARSは元のARSより効率よくN-メチルアミノ酸と反応すると判断される。例えば、天然のアミノ酸に対する反応性と比較してN-メチルアミノ酸に対する反応性が相対的に上昇する場合は、元の天然のARSより効率よくN-メチルアミノ酸に反応すると判断される。
　N-メチルアミノ酸に特に制限はないが、ARSに対応するものが適宜選択される。例えば、改変ARSがバリンのARS（ValRS）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルバリンであり、改変ARSがスレオニンのARS（Thr）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルスレオニンであり、改変ARSがセリンのARS（SerRS）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルセリンであり、改変ARSがフェニルアラニンのARSαサブニット（PheRS）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルフェニルアラニンであり、改変ARSがトリプトファンのARS（TrpRS）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルトリプトファンであり、改変ARSがロイシンのARS（LeuRS）であれば、N-メチルアミノ酸はN-メチルロイシンである。
　ARSの改変部位は、例えばValRSであれば、大腸菌由来のValRSの43位アスパラギンおよび/または45位スレオニンおよび/または279位スレオニンに相当する位置が好ましい。好ましくは43位アスパラギン、45位スレオニンおよび279位スレオニンに相当する位置から選ばれるいずれか２つの位置の組み合わせ（例えば43位および45位、43位および279位、あるいは45位および279位の組み合わせ）であり、より好ましくは43位アスパラギン、45位スレオニンおよび279位スレオニンに相当する位置の組み合わせである。またSerRSの場合は、大腸菌由来のSerRSの239位グルタミン酸および/または237位スレオニンに相当する位置で改変することができ、より好ましくは、239位グルタミン酸および237位スレオニンに相当する位置の組み合わせである。PheRSαサブユニットの場合は、大腸菌由来のPheRSの169位グルタミンに相当する位置で改変することが好ましい。またThrRSの場合は、大腸菌由来のThrRSの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置で改変することができる。またTrpRSの場合は、大腸菌由来のTrpRSの132位メチオニンおよび/または150位グルタミンおよび/または153位ヒスチジンに相当する位置で改変することができ、好ましくは、132位メチオニン、150位グルタミンおよび153位ヒスチジンに相当する位置から選ばれるいずれか２つの位置の組み合わせ（例えば132位および150位、132位および153位、あるいは150位および153位の組み合わせ）であり、より好ましくは132位メチオニン、150位グルタミンおよび153位ヒスチジンに相当する位置の組み合わせである。またLeuRSの場合は、大腸菌由来のLeuRSの43位チロシンに相当する位置で改変することができる。なおこれらの改変ARSは、他の位置がさらに改変されているものも含まれる。ここで、各ARSの位置番号は大腸菌由来の各ARSの開始メチオニンを１として表されている。具体的には、各ARSの位置番号は、ValRSはP07118（配列番号24）、PheRSαサブユニットはP08312（配列番号28）、ThrRSはP0A8M3（配列番号29）、SerRSはP0A8L1（配列番号26）、TrpRSはP00954（配列番号188）、LeuRSはP07813（配列番号189）の配列（UniProt（http://www.uniprot.org/）における一番初めのメチオニンを１として表される。また、あるARSにおいて、大腸菌由来のARSのあるアミノ酸に相当する位置とは、大腸菌由来のARSのそのアミノ酸に相当する部位に位置するアミノ酸をいい、両者の構造的類似性から同定することが可能である。例えば、目的とするARSと大腸菌由来のARSのアミノ酸配列を整列させることで、大腸菌由来のARSのアミノ酸の位置に整列されるアミノ酸として、当該相当するアミノ酸を同定することができる。本発明において大腸菌由来のARSのあるアミノ酸に相当する位置とは、好ましくは大腸菌由来のARSのあるアミノ酸に立体的に相当する位置である。立体的に相当する位置は、ARSの立体構造において、大腸菌由来のARSのそのアミノ酸の位置に対応しているアミノ酸の位置をさしている。
　立体的に相当する位置の同定は、例えばClustalW ver2.1 （http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp）でMultiple Sequence Alignmentをデフォルトのパラメーターを用いて利用し、大腸菌ARSと知られている他生物種のARSすべてをアライメントすることで、当業者であれば容易に可能である。特に、対象となるARSについては原核生物に限られるものではない。一般的には、真核生物におけるARS配列には、触媒ドメイン以外にも様々な機能ドメインが付加され、原核生物由来のARSとの配列同一性は必ずしも高くはない。一方で、アミノ酸認識部位といった触媒部位や校正部位(Editing domain)については配列の保存性は高く、パブリックのアライメント手法を用いても容易に真核生物由来のARSについても立体的に相当する位置の同定が可能である。
　例えば、大腸菌ValRSの43位および45位に相当する部位は、他生物のValRSに存在するPPP(N/Y/T)X(T/S)Gモチーフ（配列番号180；「N/Y/T」は好ましくはN；Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはV、IまたはP、より好ましくはV；「T/S」は好ましくはT）のそれぞれ「N/Y/T」および「T/S」のアミノ酸部位であってよい。より好ましくは、大腸菌ValRSの43位および45位に相当する部位は、他生物のValRSに存在するPPPNXTGモチーフ（配列番号181；Xは任意のアミノ酸であり、好ましくはV、IまたはP、より好ましくはV）のそれぞれNおよびTのアミノ酸であってよい。例えば大腸菌ValRSの43位アスパラギンに相当する位置はHuman（Uniprot P26640）では345位のアスパラギンであり、Saccharomyces cervisiae(Uniprot P07806)では191位のアスパラギンである。
　ARSの改変は、好ましくは分子量が10以上減少するアミノ酸への置換を少なくも１つ含む。そのような改変としては、例えばThr (T) 以外のアミノ酸、例えば Gln (Q), Asn (N), Glu (E), Met (M), Tyr(Y)および His (H) からなる群より選択されるアミノ酸をAla (A) または Gly (G) に改変（好ましくはGlyに改変）すること、また、例えば、Thr (T) を Ser (S) に改変すること、また、例えば、Met (M) を Val (V) に改変することが挙げられる。
　改変するアミノ酸は適宜選択してよいが、例えばValRSであれば、大腸菌由来のValRSの43位アスパラギンに相当する位置はグリシンまたはアラニンに改変することが好ましく、大腸菌由来のValRSの45位スレオニンに相当する位置はセリンに改変することが好ましく、大腸菌由来のValRSの279位スレオニンに相当する位置はグリシンまたはアラニンに改変することが好ましい。SerRSであれば、大腸菌由来のSerRSの239位グルタミン酸に相当する位置はグリシンまたはアラニンに改変することが好ましく、大腸菌由来のSerRSの237位スレオニンに相当する位置はセリンに改変することが好ましい。PheRSであれば、大腸菌由来のPheRS αサブユニットの169位グルタミンに相当する位置はグリシンまたはアラニンに改変することが好ましい。ThrRSであれば、大腸菌由来のThrRSの332位メチオニンに相当する位置はグリシンに改変することが好ましく、大腸菌由来のThrRSの511位ヒスチジンに相当する位置はグリシンに改変することが好ましい。TrpRSであれば、大腸菌由来のTrpRSの132位メチオニンに相当する位置はバリンまたはアラニンに改変することが好ましく、大腸菌由来のTrpRSの150位グルタミンに相当する位置はアラニンに改変することが好ましく、大腸菌由来のTrpRSの153位ヒスチジンに相当する位置はアラニンに改変することが好ましい。LeuRSであれば、大腸菌由来のLeuRSの43位チロシンに相当する位置はグリシンに改変することが好ましい。
　具体的には本発明は、以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号3～5,182および183（ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号3～5,182および183のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ以下の(i)～(iii)に記載の少なくとも１つのアミノ酸を含むN-メチルValに対する反応性を有するポリペプチド；
(i) 配列番号3～5,182および183の43位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである、
(ii) 配列番号3～5,182および183の45位に相当する位置のアミノ酸がSerである、及び、
(iii) 配列番号3～5,182および183の279位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである。
　なお当該反応性は、(i) 43位に相当する位置のアミノ酸がAsnである、および/または (ii) 45位に相当する位置のアミノ酸がThrである、および/または (iii) 279位に相当する位置のアミノ酸がThrである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のValRSは、当該ValRSの43位に相当する位置のアミノ酸がAsnであり、45位に相当する位置のアミノ酸がThrであり、かつ、279位に相当する位置のアミノ酸がThrであるValRSよりもN-メチルValに対する反応性が高いことが好ましい。
　また本発明は、以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号6～9（SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号6～9のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ以下の(i)及び(ii)に記載の少なくとも１つのアミノ酸を含むN-メチルSerに対する反応性を有するポリペプチド；
(i) 配列番号6～9の 237位に相当する位置のアミノ酸がSerである、及び、
(ii) 配列番号6～9の239位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaである。
　なお当該反応性は、(i) 237位に相当する位置のアミノ酸がThrである、および/または (ii) 239位に相当する位置のアミノ酸がGluである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のSerRSは、当該SerRSの237位に相当する位置のアミノ酸がThrであり、かつ239位に相当する位置のアミノ酸がGluであるSerRSよりもN-メチルSerに対する反応性が高いことが好ましい。
　また、本発明は以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号1～2（PheRS05およびPheRS04）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号1～2のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ配列番号1～2のいずれかの169位に相当する位置のアミノ酸がGlyまたはAlaであるアミノ酸配列を含むN-メチルPheに対する反応性を有するポリペプチド。なお当該反応性は、当該位置のアミノ酸がGlnである場合よりも高いことが好ましい。なお上記のポリペプチドはARSのαサブユニットであるので、βサブユニットと共に複合体を形成させることで機能的なARSを取得することができる。βサブユニットとしては特に制限はなく、例えば所望の野生型サブユニットを用いることはできるが、一例を挙げればNCBI Reference Sequence WP_000672380（例えばWP_000672380.1）のアミノ酸配列（塩基配列はGenBank CP009685 (例えばCP009685.1) の1897337 - 1899721）を含むサブユニットを用いることができる。
　また本発明は、以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号10～11（ThrRS03およびThrRS14）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号10～11のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ以下の(i)および(ii)に記載の少なくとも１つのアミノ酸を含むN-メチルThrに対する反応性を有するポリペプチド； 
(i) 配列番号10～11の332位に相当する位置のアミノ酸がGlyである、および、
(ii) 配列番号10～11の511位に相当する位置のアミノ酸がGlyである。
なお当該反応性は、(i) 332位に相当する位置のアミノ酸がMetである、および/または (ii) 511位に相当する位置のアミノ酸がHisである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のThrRSは、当該ThrRSの332位に相当する位置のアミノ酸Metであり、かつ511位に相当する位置のアミノ酸がHisであるThrRSよりもN-メチルThrに対する反応性が高いことが好ましい。
　また本発明は、以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号184-186（TrpRS04,TrpRS05およびTrpRS18）のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号184-186のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ以下の(i)～(iii)のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸を含むN-メチルTrpに対する反応性を有するポリペプチド；
(i) 配列番号184-186の132位に相当する位置のアミノ酸がValまたはAlaである、
(ii) 配列番号184-186の150位に相当する位置のアミノ酸がAlaである、
(iii) 配列番号184-186の153位に相当する位置のアミノ酸がAlaである。
　なお当該反応性は、(i) 132位に相当する位置のアミノ酸がMetである、および/または (ii) 150位に相当する位置のアミノ酸がGlnである、および/または (iii) 153位に相当する位置のアミノ酸がHisである場合よりも高いことが好ましい。例えば本発明のTrpRSは、当該TrpRSの132位に相当する位置のアミノ酸Metであり、150位に相当する位置のアミノ酸Glnであり、かつ153位に相当する位置のアミノ酸がHisであるTrpRSよりもN-メチルTrpに対する反応性が高いことが好ましい。
　また本発明は、以下のポリペプチドが含まれる。
(a) 配列番号187（LeuRS02）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
(b) 配列番号187のアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有し、かつ配列番号187の43位に相当する位置のアミノ酸がGlyであるアミノ酸配列を含み、N-メチルLeuに対する反応性を有するポリペプチド。
　なお当該反応性は、(i) 43位に相当する位置のアミノ酸がTyrである場合よりも高いことが好ましい。
　ここで、アミノ酸配列の同一性は、好ましくは93％以上、より好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上、98％以上、または99％以上である。
　本発明のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、非天然型アミノ酸としてペプチドのdrug-likenessを向上させることが知られているN-メチルアミノ酸によりｔＲＮＡを効率的にアシル化することができることを特徴とするものである。また、本発明のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、大腸菌などの細菌類、酵母、動物、植物などのいずれの生物由来のものであってもよいが、本明細書の実施例に例示されたアミノアシルtRNA合成酵素（配列番号1～11、182～187）と配列保存性が高く、それゆえに対応する変異箇所が他生物種において特定しやすいものが、汎用性があることから好ましい。例えば本発明の改変ARSを含むポリペプチドは、真核生物または原核生物のARSに由来してもよい。真核生物としては、原生生物（原生動物および単細胞緑藻類を含む）、菌類（子嚢菌および担子菌を含む）、植物（コケ植物，シダ植物，種子植物（裸子・被子）を含む）、動物（無脊椎動物，脊椎動物を含む）が挙げられ、原核生物としては古細菌（好熱菌・メタン菌を含む）および真正細菌（ラン藻類や大腸菌を含む）が挙げられる。本発明の改変ARSを含むポリペプチドは、哺乳動物（ヒト、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、サル、ヤギ、ロバ、ウシ、ウマ、ブタ等）由来であってもよい。また本発明の改変ARSを含むポリペプチドは、例えば大腸菌または酵母由来であってよく、好ましくは原核生物由来、例えば細菌由来であることが好ましい。本発明のポリペプチドは、例えば腸内細菌科（Family Enterobacteriaceae）細菌由来、例えば大腸菌由来であり、例えばEscherichia属（E. coli、E. albertii、E. fergusoniiを含む）、Shigella属（S. dysenteriae、S. flexneri、S. boydii、S. sonnei、S. enterica、S. bongoriを含む）、Citrobacter属（C. rodentium、C. koseri、C. farmeri、C. youngaeを含む）、Kluyvera属（K. ascorbataを含む）、Trabulsiella属（T. guamensisを含む）、Klebsiella属などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また、本明細書の実施例では、一例として大腸菌由来のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いてきたために、改変位置は大腸菌の場合であって、他の生物由来のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素を用いる場合には、配列相同性において大腸菌由来のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素のアミノ酸の配列位置に相当する位置のアミノ酸が改変されるべき位置となる。ARSはあらゆる生物に備わる翻訳機構の根幹に関わる酵素であることから、一般に保存性が極めて高い。したがって、所望のARSについて本発明の方法に基づいて改変を行い、N-メチルアミノ酸の取り込み能が上昇した改変ARSを取得することができる。
　N-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素に新たに導入するアミノ酸としては、アミノ酸の親水性や水素結合、側鎖の大きさについてN-メチル基との距離や相互作用などを考慮して、例えば、その位置のアミノ酸がNメチル基と立体反発するのを防ぐ場合には、例えば、分子量の大きなアミノ酸から小さなアミノ酸に改変することで、N-メチルアミノ基との距離を調整することができる。具体的には、例えば、スレオニン（Thr）をセリン（Ser）にするなどして、分子量を小さくし、距離を調整することができる。
　また例えば、N-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の改変対象となるアミノ酸がアスパラギンである場合は、分子量の小さなアミノ酸として、例えば、セリン、バリン、グリシン、アスパラギン酸、またはアラニンを挙げることができるがこれに限定されるものではない。また改変対象となるアミノ酸がグルタミン酸である場合は、分子量の小さなアミノ酸として、例えば、アラニン、バリン、セリン、アラニン、アスパラギン酸をあげることができるが、これに限定されるものではない。また、例えば、改変対象となるアミノ酸がThrである場合は、分子量の小さなアミノ酸として、例えば、Serが好ましく、それ以外のアミノ酸の場合は、分子量の小さなアミノ酸として、例えば、グリシン（Gly）またはアラニン（Ala）が好ましく、中でもグリシン(Gly）が好ましい。具体的な一例を示せば、ThrはSerに置換し、Gln、Glu及びAsnは、GlyまたはAlaに置換し、Met、His、Gln等はGlyに置換することができるが、それに限定されるものではない。
　より具体的に例示すれば、バリンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ValRS）の改変においては、例えば配列番号24（天然のValRS）の43位および/または45位および/または279位のアミノ酸、またはそれらに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、ThrであればSer、AlaまたはGlyに置換し、それ以外のアミノ酸（例えばAsn）であればGlyまたはAlaに置換することができる。例えば配列番号24の43位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyまたはAlaに置換すること、および/または、配列番号24の45位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をSerに置換すること、279位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyまたはAlaに置換することは好ましい。これらの置換はどちらか１つであってもよく、これらの置換のいずれかを組み合わせてもよく（例えば43位と45位の置換、43位と279位の置換、または45位と279位の置換）、これらすべてを置換してもよい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号24のN43および/またはT45および/またはT279、またはそれらに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、N43Gおよび/またはT45Sおよび/またはT279Aに置換することが好ましい。
　また、セリンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（SerRS）の改変においては、例えば配列番号26（天然のSerRS）の237位および/または239位のアミノ酸、またはそれらに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、ThrであればSerに置換し、それ以外のアミノ酸（例えばGlu）であればGlyもしくはAlaに置換することができる。例えば配列番号26の237位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をSerに置換すること、および/または、配列番号26の239位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyもしくはAlaに置換することは好ましい。これらの置換はどちらか１つであってもよく、両者を置換してもよい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号26のT237および/またはE239、またはそれらに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、T237Sおよび/またはE239G（もしくはE239A）に置換することが好ましい。
　また、フェニルアラニンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素αサブユニット（PheRS α）の改変においては、例えば配列番号28（天然のPheRS αサブユニット）の169位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、Thrである場合はSerに置換し、それ以外の場合はグリシン（Gly）またはアラニン（Ala）（より好ましくはGly）に置換することができる。例えば配列番号28の169位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyに置換することは好ましい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号28のQ169、またはそれに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、Q169G（もしくはQ169A）に置換することが好ましい。
　また、スレオニンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ThrRS）の改変においては、例えば配列番号29（天然のThrRS）の332位および/または511位のアミノ酸、またはそれらに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、ThrであればSerに置換し、それ以外のアミノ酸（例えばMetやHis）であればGlyに置換することができる。例えば配列番号29の332位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyに置換すること、および/または、配列番号29の511位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyに置換することは好ましい。これらの置換はどちらか１つであってもよく、両者を置換してもよい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号29のM332および/またはH511、またはそれらに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、M332Gおよび/またはH511Gに置換することが好ましい。
　また、トリプトファンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（TrpRS）の改変においては、例えば配列番号188（天然のTrpRS）の132位および/または150位および/または153位のアミノ酸、またはそれらに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、MetであればValまたはAlaに置換し、それ以外のアミノ酸（例えばGln）であればAlaに置換することができる。また例えば配列番号188の132位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をValまたはAlaに置換すること、および/または、配列番号188の150位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をAlaに置換すること、および／または、153位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をAlaに置換することは好ましい。これらの置換はどちらか１つであってもよく、これらの置換のいずれかを組み合わせてもよく（例えば132位と150位の置換、132位と153位の置換、または150位と153位の置換）、すべてを置換してもよい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号188のM132および/またはQ150および/またはH153、またはそれらに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、M132Vおよび/またはQ150Aおよび/またはH153Aに置換することが好ましい。
　また、ロイシンアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（LeuRS）の改変においては、例えば配列番号189(天然のLeuRS)の43位のアミノ酸、またはそれらに相当する位置のアミノ酸の改変が挙げられる。どのアミノ酸に置換するかは限定されるものではないが、例えば上述の通り、ThrであればGlyに置換することができる。例えば配列番号189の43位のアミノ酸、またはそれに相当する位置のアミノ酸をGlyに置換することが好ましい。また、他の置換をさらに組み合わせてもよい。より具体的に例示すれば、配列番号189のY43、またはそれらに相当する位置のアミノ酸を置換することが好ましく、Y43Gに置換することが好ましい。
　本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の製造方法としては、公知の遺伝子操作技術により行うことができる。例えば、目的のアミノ酸の位置をコードする塩基配列を改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したプライマーを用いて、改変すべきアミノ酸をコードする塩基配列に置換したＤＮＡを増幅させて、増幅させたＤＮＡ断片を連結させて全長のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体をコードするＤＮＡを得て、これを大腸菌などの宿主細胞を用いて発現させることにより簡便に製造することができる。この方法において使用するプライマーとしては２０～７０塩基、好ましくは２０～５０塩基程度である。このプライマーは改変前の元の塩基配列とは１～３塩基がミスマッチとなるので、比較的長いもの、例えば２０塩基以上のものを使用するのが好ましい。
　また、本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の製造方法としては、前記した方法に限定されるものではなく、公知のポイントミューテーション技術や遺伝子合成技術、制限酵素により改変断片を導入する方法など、各種の遺伝子操作技術を使用することができ、発現も大腸菌に限定されず、動物細胞や無細胞翻訳系も使用することができる。
　本発明の改変ARSとしては、配列番号：1～11,182-187（PheRS05、PheRS04、ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、SerRS03、SerRS05、SerRS35、SerRS37、ThrRS03、ThrRS14、ValRS66、ValRS67、TrpRS04、TrpRS05、TrpRS18、LeuRS02）のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチド、および該ポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドが含まれる。ここで機能的に同等なポリペプチドとは、配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと構造的に高い同一性を持つARSであって、N-メチルアミノ酸に対する反応性を有するポリペプチドである。より具体的には、配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドと構造的に高い同一性を持つARSにおいて、上の記載に従ってアミノ酸が改変されたポリペプチドであって、それにより改変前のARSに比べ、N-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇したポリペプチドである。N-メチルアミノ酸に対する反応性の上昇は、例えばN-メチルアミノ酸に対する基質特異性（例えばN-メチルアミノ酸との反応性／非修飾アミノ酸との反応性の値）の上昇であってよい。
　そのようなポリペプチドには、例えば配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１または複数のアミノ酸（好ましくは1から20アミノ酸、例えば1から10アミノ酸、1から7アミノ酸、1から5アミノ酸、1から3アミノ酸、1から2アミノ酸、または1アミノ酸）が置換、欠失、挿入、および/または付加されているポリペプチドが含まれる。またそのようなポリペプチドは、例えば配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および/または付加されているポリペプチドであってもよい。
　また、配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる改変ARSと機能的に同等なポリペプチドは、通常、配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有する。また当該機能的に同等なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、通常、配列番号：1～11,182-187のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列（例えば配列番号：12～22,190-195）と高い同一性を有する。高い同一性とは、具体的には70%以上であり、好ましくは80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性である。
　アミノ酸配列または塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90:5873-7）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul et al., J.Mol.Biol. (1990) 215:403-10）。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 100、wordlength = 12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターは例えばscore = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（NCBI （National Center for Biotechnology Information）の BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）のウェブサイトの情報を参照することができる。
　また、本発明のポリペプチドとしては、下記 (a) ～ (d) のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号24（ValRS）の43位、45位および279位に相当するアミノ酸が、それぞれAsn、ThrおよびThrではないポリペプチド（すなわち3箇所のうち少なくとも一箇所は異なるポリペプチド）であって、当該43位、45位および279位に相当するアミノ酸がそれぞれAsn、ThrおよびThrであるポリペプチドと比べてN-メチルValに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号3～5,182および183（ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67）のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号3～5,182および183のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号14～16,190および191（ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67のDNA）のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号14～16,190および191のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 43位に相当するアミノ酸がGlyまたはAla、および/または (ii) 45位に相当するアミノ酸がSer、および/または (iii) 279位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 43位に相当するアミノ酸がGlyまたはAla、および/または (ii) 45位に相当するアミノ酸がSer、および/または (iii) 279位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaに改変されているポリペプチドである。
　また、本発明のポリペプチドとしては、下記 (a) ～ (d) のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号26（SerRS）の237位および239位に相当するアミノ酸が、それぞれThrおよびGluではないポリペプチド（すなわち2箇所のうち少なくとも一箇所は異なるポリペプチド）であって、当該237位および239位に相当するアミノ酸がそれぞれThrおよびGluであるポリペプチドと比べてN-メチルSerに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号6～9（SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37）のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号6～9のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号17～20（SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37のDNA）のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号17～20のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 237位に相当するアミノ酸がSer、および/または (ii) 239位に相当するアミノ酸がGlyもしくはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 237位に相当するアミノ酸がSer、および/または (ii) 239位に相当するアミノ酸がGlyもしくはAlaに改変されているポリペプチドである。
　このような本発明のポリペプチドとしては、下記 (a) ～ (d) のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号28（PheRS）の169位に相当するアミノ酸がGlnではなく、かつ、その部位がGlnであるポリペプチドと比べてN-メチルPheに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号1～2（PheRS05およびPheRS04）のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号1～2のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号12～13（PheRS05およびPheRS04のDNA）のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号12～13のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、169位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、169位に相当するアミノ酸がGlyまたはAlaに改変されているポリペプチドである。
　また、本発明のポリペプチドとしては、下記 (a) ～ (d) のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号29（ThrRS）の332位および511位に相当するアミノ酸が、それぞれMetおよびHisではないポリペプチド（すなわち2箇所のうち少なくとも一箇所は異なるポリペプチド）であって、当該332位および511位に相当するアミノ酸がそれぞれMetおよびHisであるポリペプチドと比べてN-メチルThrに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号10～11（ThrRS03およびThrRS14）のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号10～11のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号21～22（ThrRS03およびThrRS14のDNA）のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号21～22のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 332位に相当するアミノ酸がGly、および/または (ii) 511位に相当するアミノ酸がGlyであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは332位に相当するアミノ酸がGly、および/または511位に相当するアミノ酸がGlyに改変されているポリペプチドである。
　また、本発明のポリペプチドとしては、下記 (a) ～ (d) のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号188（TrpRS）の132位、150位および153位に相当するアミノ酸が、それぞれMet、GlnおよびHisではないポリペプチド（すなわち3箇所のうち少なくとも一箇所は異なるポリペプチド）であって、当該132位、150位および153位に相当するアミノ酸がそれぞれMet、GlnおよびHisであるポリペプチドと比べてN-メチルTrpに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号184-186（TrpRS04、TrpRS05およびTrpRS18）のいずれかに記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号184-186のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号192-194（TrpRS04、TrpRS05およびTrpRS18のDNA）のいずれかに記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号192-194のいずれかに記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、(i) 132位に相当するアミノ酸がValまたはAla、および/または (ii) 150位に相当するアミノ酸がAlaであるおよび/または (iii) 153位に相当するアミノ酸がAlaであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、(i) 132位に相当するアミノ酸がValまたはAla、および/または (ii) 150位に相当するアミノ酸がAla、および/または (iii) 153位に相当するアミノ酸がAlaに改変されているポリペプチドである。
　また、本発明のポリペプチドとしては、下記 (a)～(d)のいずれかに記載のポリペプチドであって、配列番号189（LeuRS）の43位に相当するアミノ酸が、Tyrではないポリペプチドであって、当該43位に相当するアミノ酸がTyrであるポリペプチドと比べてN-メチルLeuに対する反応性が上昇しているポリペプチドが挙げられる。
(a) 配列番号187（LeuRS02）に記載のアミノ酸配列と高い同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b) 配列番号187のいずれかに記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸を置換、欠失、挿入および/または付加したアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(c) 配列番号195（LeuRS02のDNA）に記載の塩基配列と高い同一性を有する塩基配列によりコードされるポリペプチド、または
(d) 配列番号195に記載の塩基配列の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチド。
　当該ポリペプチドは、好ましくは、43位に相当するアミノ酸がGlyであるポリペプチドである。このようなポリペプチドには天然のポリペプチドおよび人工的に改変したポリペプチドが含まれるが、好ましくは、43位に相当するアミノ酸がGlyに改変されているポリペプチドである。
　本発明のポリペプチドは、天然のARSを改変したポリペプチドである場合は、改変前のARSよりもN-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇しているポリペプチドであり、本発明のポリペプチドが天然のARSや人工的に作出したポリペプチドである場合は、N-メチルアミノ酸に対して反応性を有するポリペプチド、すなわちN-メチルアミノ酸でtRNAをアシル化する活性を有するポリペプチドである。なお改変ARSと天然のARSで反応性を比較するときに、ARSが複数のサブユニットで構成される場合は、比較するサブユニット以外にサブユニットは同じものを用いて比較する。それらは、両者のARSで同じである限り、天然（または野生型）のサブユニットでも改変されたサブユニットでもよい。
　高い同一性とは、上述の通り、例えば70%以上であり、好ましくは80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を言う。また置換、欠失、挿入および/または付加するアミノ酸配は、1または数個であってよく、例えば1～20個、好ましくは1～15個、より好ましくは1～10個、より好ましくは1～8個、より好ましくは1～7個、より好ましくは1～6個、より好ましくは1～5個、より好ましくは1～4個、より好ましくは1～3個、より好ましくは1～2個、より好ましくは1個である。またハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件とは、例えば、「1 X SSC、0.1％ SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5 X SSC、0.1％ SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2 X SSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.1 X SSC、0.1％ SDS、65℃」程度の条件である。ただし、上記のSSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であればハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　また本発明は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のポリヌクレオチドは、前述の本発明のポリペプチドのコード配列を含むポリヌクレオチドであれば、いかなるポリヌクレオチドをも包含し、ゲノミックＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびそれらを基に人為的に作出したDNAのいずれをも包含する。ゲノミックDNAは、エキソンおよびイントロンを含む。すなわちゲノミックDNAは、イントロンを含んでも含まなくてもよく、また、非翻訳領域（5'UTRおよび/または3'UTR）や転写調節領域等を含んでも含まなくてもよい。またcDNAは、イントロン配列の一部に由来する核酸配列であってアミノ酸配列をコードする核酸配列を含んでいてもよい。
　また、該ポリヌクレオチドは、同一のアミノ酸をコードするコドンであればどのようなコドンから構成される縮重ポリヌクレオチドをも含む。また、本発明のポリヌクレオチドは、所望の生物由来のポリヌクレオチドであってよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、いかなる方法で得られるものであってもよい。例えばmRNAから調製される相補DNA（cDNA）、ゲノムDNAから調製されるDNA、化学合成によって得られるDNA、RNAまたはDNAを鋳型としてPCR法で増幅させて得られるDNAおよびこれらの方法を適当に組み合わせて構築されるDNAをも全て包含する。本発明のポリヌクレオチドは、常法に従って本発明のポリペプチドをコードするゲノムDNAまたはRNAからクローン化し、変異を導入すること等により作製することができる。
　例えば、本発明のポリペプチドをコードするmRNAからcDNAをクローン化する方法としては、まず、本発明のポリペプチドを発現、産生する任意の組織あるいは細胞から常法に従って該本発明のポリペプチドをコードするmRNAを調製する。例えばグアニジンチオシアネート法、熱フェノール法もしくはAGPC法等の方法を用いて調製した全RNAをオリゴ（dT）セルロースやポリＵ－セファロース等によるアフィニティ・クロマトグラフィーにかけることによって行うことができる。
　次いで得られたmRNAを鋳型として、例えば逆転写酵素を用いる等の公知の方法（Mol.Cell.Biol., Vol.2, p.161, 1982; Mol.Cell. Biol., Vol.3, p.280, 1983; Gene, Vol.25, p.263, 1983）等によりcDNA鎖を合成し、cDNAの二本鎖cDNAへの変換し、このcDNAをプラスミドベクター、ファージベクターまたはコスミドベクター等に組み込み、大腸菌を形質転換して、あるいはインビトロパッケージング後、大腸菌に形質移入（トランスフェクト）することによりcDNAライブラリーを作製する。
　これを本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号：12～22,190-195）またはその一部をプローブとしてスクリーニングを行うことにより、目的の遺伝子を取得することができる。あるいは、本発明のポリヌクレオチド（例えば配列番号：12～22,190-195）またはその一部をプライマーとして用いて、PCRにより直接増幅することもできる。プローブやプライマーの部位や長さは適宜決定してよい。
　本発明はまた、上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクター（組み換えベクター）に関する。本発明のベクターとしては、原核細胞及び／または真核細胞のいずれかの宿主内で複製保持または自己増殖できるものであれば特に制限されず、プラスミドベクター、ファージベクター、およびウイルスベクター等が包含される。
　クローニング用ベクターとしては例えば、pUC19、λgt10、λgt11等が例示される。なお、本発明のポリペプチドを宿主細胞内で発現し得る細胞を単離する場合には、該ポリヌクレオチドを発現し得るプロモーターを有したベクターであることが好ましい。
　本発明の組換えベクターとしては、簡便には当業界において入手可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテリアファージDNA）に本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを常法により連結することによって調製することができる。
　用いられる組換え用ベクターとして、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC12、pUC13、pUC19等）、酵母由来プラスミド（pSH19、pSH15等）、枯草菌由来プラスミド（pUB110、pTP5、pC194等）が例示される。
　また、ファージとしては、λファージなどのバクテリオファージが、さらにレトロウイルス、ワクシニアウイルス、核多角体ウイルス、レンチウイルスなどの動物や昆虫のウイルス（pVL1393、インビトロゲン製）が例示される。
　本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させ本発明のポリペプチドを生産させる目的においては、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、原核細胞および／または真核細胞のいずれかの宿主細胞中で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現し、これらポリペプチドを生産する機能を有するものであれば特に制限されない。
　例えば、pMAL C2、pEF-BOS（NucleicAcid Research, Vol.18, 1990, p.5322等）あるいはpME18S（実験医学別冊「遺伝子工学ハンドブック」、１９９２年等）等を挙げることができる。
　また本発明は、本発明のポリペプチドと他の別のタンパクとの融合に関する。本発明の融合ポリペプチドは、N-メチルアミノ酸に対して反応性を持つ本発明のポリペプチドと他のポリペプチドとの融合ポリペプチドであり、N-メチルアミノ酸に対して反応性を持つ本発明のポリペプチド鎖を含む限り、融合ポリペプチド自体はN-メチルアミノ酸に対して反応性を持たなくてもよい。本発明の融合ポリペプチドは、例えば、GST（Glutathione S-transferase）との融合蛋白として調製する場合には、本発明のポリペプチドをコードするcDNAを、例えば、プラスミドpGEX4T1（Pharmacia製）中にサブクローニングし、大腸菌DH5α等を形質転換して該形質転換体を培養することにより調製することができる。
　あるいは、HA（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β－ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等との融合体として調製することができる。さらには、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al., BioTechnology (1988) 6, 1204-1210）、数個（例えば6個）のHis（ヒスチジン）残基からなるタグ（6×His、10×His等）、インフルエンザ凝集素（HA）、ヒトc-mycの断片、VSV-GPの断片、p18HIVの断片、T7-tag、HSV-tag、E-tag、SV40T抗原の断片、lck tag、α-tubulinの断片、B-tag、Protein C の断片、Stag、StrepTag、HaloTag等の公知のペプチドとの融合体として調製することができる。
　本発明のベクターは、宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、該ベクターは、少なくともプロモーター－オペレーター領域、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域および複製可能単位を含んでいることが好ましい。
　宿主として酵母、動物細胞または昆虫細胞を用いる場合には、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドンを含んでいることが好ましい。
　また該ベクターは、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、エンハンサー配列、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の５'側および３'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー領域または複製可能単位などを含んでいてもよい。
　また、所望により、遺伝子増幅および形質転換された宿主を選抜することを可能とするマーカー遺伝子（遺伝子増幅遺伝子、薬剤耐性遺伝子等）を含んでいてもよい。
　例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒグロマイシン－Ｂ－ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、アスパルテートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示することができる。
　細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター－オペレータ－領域は、プロモーター、オペレーター及びShine-Dalgarno(SD) 配列（例えば、AAGGなど）を含むことができる。
　例えば宿主がエシェリキア属菌の場合、例えばTrpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、tacプロモーターなどを含むものが例示される。
　酵母中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーターとしては、PH05プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターが挙げられる。
　宿主がバチルス属菌の場合は、SL01プロモーター、SP02プロモーター、penPプロモーターなどが挙げられる。
　また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。好ましくは、SV40、レトロウイルスである。しかし、特にこれらに限定されるものではない。また、発現にはエンハンサーの利用も効果的な方法である。
　好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が例示される。終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG、TGA、TAA）が例示される。ターミネーター領域としては、通常用いられる天然または合成のターミネーターを用いることができる。
　複製可能単位とは、宿主細胞中でその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡを言い、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）および合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとしては、E. coli ではプラスミドpBR322、もしくはその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミド、もしくは酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo (ATCC 37198)、プラスミドpSV2dhfr (ATCC 37145)、プラスミドpdBPV-MMTneo (ATCC 37224)、プラスミドpSV2neo (ATCC 37149) 等があげられる。
　エンハンサー配列、ポリアデニレーション部位およびスプライシング接合部位については、例えばそれぞれSV40に由来するもの等、当業者において通常使用されるものを用いることができる。
　本発明の発現ベクターは、少なくとも、上述のプロモーター、開始コドン、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドンおよびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製可能単位に連結することによって調製することができる。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4 DNAリガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限酵素切断部位など）を用いることができる。
　本発明はまた、上述した本発明のベクターで形質転換された組み換え細胞に関し、本発明の組み換え細胞は、上述の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより調製することができる。
　本発明で用いられる宿主細胞としては、前記の発現ベクターに適合し、形質転換されうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞あるいは人工的に樹立された組換細胞など種々の細胞、例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞または昆虫細胞などが例示される。
　好ましくは大腸菌あるいは動物細胞であり、例えば、大腸菌（DH5α、TB1、HB101等）、マウス由来細胞（COP、L、C127、Sp2/0、NS-1またはNIH3T3等）、ラット由来細胞（PC12, PC12h)、ハムスター由来細胞（BHK及びCHO等）、サル由来細胞（COS1、COS3、COS7、CV1及びVelo等）およびヒト由来細胞（Hela、２倍体線維芽細胞に由来する細胞、ミエローマ細胞およびHepG2等）などが例示される。
　発現ベクターの宿主細胞への導入（形質転換（形質移入））は常法に従って行うことができる（［E.coli、Bacillus subtilis 等の場合］： Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.69, p.2110, 1972； Mol. Gen. Genet., Vol.168, p.111, 1979； J. Mol.Biol., Vol.56, p.209, 1971； ［Saccharomyces cerevisiaeの場合］： Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol.75, p.1927, 1978； J. Bacteriol., Vol.153, p.163, 1983）； ［動物細胞の場合］： Virology, Vol.52, p.456, 1973； ［昆虫細胞の場合］： Mol. Cell. Biol., Vol.3, p.2156-2165, 1983）。
　本発明のポリペプチドは、上記の如く調製される発現ベクターを含む形質転換組み換え細胞（以下、封入体を包含する意味で使用する。）を、常法に従って、栄養培地で培養することによって製造することができる。
　本発明のポリペプチドは、上述のような組み換え細胞、特に動物細胞を培養し、培養上清中に分泌させること等により製造することができる。
　得られた培養物を濾過または遠心分離等の方法で培養濾液（上清）を得、該培養濾液から天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法に従って本発明のポリペプチドを精製、単離する。
　単離、精製方法としては、例えば塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティ・クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
　一方、本発明のポリペプチドが培養された組み換え細胞（大腸菌など）のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、培養物を濾過または遠心分離などの常法に付して菌体あるいは細胞を集め、適当な緩衝液に懸濁し、例えば超音波やリゾチーム及び凍結融解などの方法で細胞等の細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明のタンパクを含有する膜画分を得る。該膜画分をTritonTM－X100等の界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を得る。そして、当該粗溶液を先に例示したような常法を用いることにより、単離、精製することができる。
　本発明はまた、上述の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（cDNAやゲノミックDNA）またはその相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。例えば当該オリゴヌクレオチドは、少なくとも本発明のARSの改変部位を含む塩基配列またはその相補鎖にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。また本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明の改変ARSをコードするポリヌクレオチドの部分断片であって、当該改変ARSの改変部位の塩基を含む断片またはその相補鎖が好ましい。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルValと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号3～5,182および183（ValRS04、ValRS13、ValRS13-11、ValRS66およびValRS67）に記載のアミノ酸配列の43位に相当するアミノ酸および/または45位に相当するアミノ酸および/または279位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで43位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyもしくはAla（より好ましくはGly）であり、45位に相当するアミノ酸は、好ましくはSerであり、279位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyもしくはAla（より好ましくはAla）である。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルSerと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号6～9（SerRS03、SerRS05、SerRS35、およびSerRS37）に記載のアミノ酸配列の237位に相当するアミノ酸および/または239位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで237位に相当するアミノ酸は、好ましくはSerであり、239位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyまたはAla（より好ましくはGly）である。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルPheと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号1～2（PheRS04、およびPheRS05）に記載のアミノ酸配列の169位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで169位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyまたはAlaである。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルThrと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号10～11（ThrRS03、およびThrRS14）に記載のアミノ酸配列の332位に相当するアミノ酸および/または511位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで332位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyであり、511位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyである。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルTrpと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号184-186（TrpRS04,TrpRS05およびTrpRS18）に記載のアミノ酸配列の132位に相当するアミノ酸および/または150位に相当するアミノ酸および/または153位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで132位に相当するアミノ酸は、好ましくはValもしくはAla（より好ましくはVal）であり、150位に相当するアミノ酸は、好ましくはAlaであり、279位に相当するアミノ酸は、好ましくはAlaである。
　例えば本発明のオリゴヌクレオチドは、N-メチルLeuと反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号187（LeuRS02）に記載のアミノ酸配列の43位に相当するアミノ酸に対応するコドンをコードする塩基を含むオリゴヌクレオチド、またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであってよい。ここで43位に相当するアミノ酸は、好ましくはGlyである。
　N-メチルアミノ酸と反応性を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの部分断片の長さに特に制限はないが、例えば連続する少なくとも15塩基であり、好ましくは16塩基以上、より好ましくは17塩基以上、より好ましくは18塩基以上、より好ましくは20塩基以上、より好ましくは25塩基以上、より好ましくは28塩基以上、より好ましくは30塩基以上、より好ましくは32塩基以上、より好ましくは35塩基以上、より好ましくは40塩基以上、より好ましくは50塩基以上である。
　また本発明のオリゴヌクレオチドは、上記の本発明のARSをコードするポリヌクレオチドの部分断片に加え、両端または片端（5'端および/または3'端）に他の配列からなるオリゴヌクレオチドをさらに含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば500塩基以下であり、より好ましくは300塩基以下、より好ましくは200塩基以下、より好ましくは100塩基以下、より好ましくは70塩基以下、より好ましくは60塩基以下、より好ましくは50塩基以下である。
　本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする核酸の作製（例えば変異の導入）に有用であり、また、本発明のポリペプチドをコードする核酸を検出するためにも有用である。例えば本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ＤＮＡハイブリダイゼーションまたはＲＮＡハイブリダイゼーションの操作におけるプローブとして使用できる。当該ＤＮＡをプローブとして用いる目的においては、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイゼーションする、連続した２０塩基以上の部分塩基配列が挙げられ、好ましくは、連続した３０塩基以上の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した４０塩基上または５０塩基以上の部分塩基配列、さらに好ましくは連続した１００塩基以上の部分塩基配列、より好ましくは連続した２００塩基以上の部分塩基配列、特に好ましくは連続した３００塩基以上の部分塩基配列が挙げられる。
　本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドは、適宜担体もしくは媒体を組み合わせて組成物とすることができる。組成物の製造、当業者に公知の方法を用いて行うことができる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせることができる。また、これらは一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化され得る。
　また本発明は、前記したN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびRNAを含む）を用いて形質転換された細胞を提供する。このような細胞としては、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
　また、細胞内で発現した本発明のN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体を、その細胞内でそのまま蛋白質合成に使用する場合には、その目的に応じた細胞を用いることができる。形質転換する方法としては、公知の方法を採用することができる。
　また本発明は、前記してきた本発明のアミノ酸配列が改変されたARSを用いて、N-メチルアミノ酸を含有するポリペプチドを製造する方法を提供する。
　また、本発明のアミノ酸配列が改変されたARSは細胞内における使用のみならず、インビトロ（セルフリー系）における使用も包含している。
　いずれの場合においても、pdCpA法などの化学合成法を用いる先行技術とは異なり翻訳反応中に繰り返しtRNAをアシル化することが可能なため、NメチルアミノアシルtRNAの持続的な供給ができることと、翻訳を阻害するtRNAの大量添加を回避することが可能となる。
　したがって、本発明は、非天然アミノ酸を効率よく、選択的に、特に位置選択的に、かつ大量に製造する方法を提供するものである。
＜本発明の改変ARSの一般的調製方法＞
　本発明の改変ARSは、上述の通り公知の遺伝子組み換え技術を用いて作製することができるが、一般的に次のように調製することができる。まず、天然型ARS遺伝子を含むプラスミドを鋳型とし、そのプライマーを用いたＰＣＲによって特定の位置及び特定のアミノ酸に部位特異的変異を導入し、制限酵素にて鋳型プラスミドを消化した後大腸菌等に形質転換し、目的の変異導入プラスミドをクローニングする。
　二アミノ酸目のアミノ酸変異を導入する場合は、続いて、特定の位置に変異が導入されたプラスミドを鋳型とし、プライマーを用いた部位特異的変異導入を上記と同様に繰り返し、二アミノ酸置換体をコードするプラスミドDNAを構築する。さらにアミノ酸変異を導入する場合も同様に行えばよい。
　作成したDNAを、ラックリプレッサー（LacI）をコードするプラスミドpREP4等と同時に大腸菌BL21株などへ形質転換し、得られた形質転換株を単離培養した後、IPTGにて発現誘導を行う。得られた菌株は、その後破砕し、上清を、Hisタグを利用したアフィニティーカラムに通すこと等により変異ARSを精製する。
　あるいは次の方法によっても調製することができる。すなわち、特定の変異ARS配列を遺伝子合成し、発現ベクターに乗せ換えた後、タンパク発現、種々の精製タグを利用したアフィニティーカラムにより目的タンパク質を精製する。
　また、本発明の特定の位置のアミノ酸が他のアミノ酸で改変されたN-メチルアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の変異体の製造方法としては、前記した方法に限定されるものではなく、公知のポイントミューテーション技術や遺伝子合成技術、制限酵素により改変断片を導入する方法など、各種の遺伝子操作技術を使用することができ、発現も大腸菌に限定されず、動物細胞や無細胞翻訳系も使用することができる。また精製方法もポリヒスチジンを利用したアフィニティーカラムに限定されるものではなく、様々なペプチドタグや精製カラムを用いることができる。
＜得られた本発明の改変ARSの基質特異性確認方法＞
　また、得られた改変体について、例えば以下の3種のいずれかのアッセイ方法を用いて基質特異性を確認することができる。
　第１の方法は、野生型ARSの代わりに改変ARSを用い、さらには天然のアミノ酸の代わりに、それがN‐メチル化されたアミノ酸を用いて再構成した無細胞翻訳系のもとで翻訳反応を行い、翻訳系内でN‐メチルアミノ酸をアミノアシル化させ、mRNA上のコドンに対応してそのN‐メチルアミノ酸がペプチド中に導入されていることを、質量分析により確認する。
　第２の方法は、放射性同位体あるいは蛍光分子で標識したアミノ酸を用いた翻訳実験により、生成したペプチドを標識し、それを電気泳動や分析カラムにて分離、可視化することでペプチドの収量を見積もるものである。この場合、改変ARSを用いた場合は野生型のARSを用いた場合と比べ、対応するN-メチルアミノ酸の翻訳導入効率が高まるため、電気泳動やクロマトグラムで観測されるペプチドの放射能や蛍光がより強く観測される。
　第３の方法は、試験管内で改変ARSと対応するtRNA、N-メチルアミノ酸の三者を反応させ、その結果生成するN‐メチルアミノアシルtRNAを、電気泳動により未反応のtRNAと分離させることで、アシル化反応の効率を定量化させるものである。改変ARSを用いた場合は野生型ARSと比べアシル化されたtRNAがより多く検出される。
　上述の通り、本発明の改変ARSは、改変前のARSに比べ、N-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇している。N-メチルアミノ酸に対する反応性の上昇は、反応速度の上昇であってもよく、N-メチルアミノ酸でアシル化された反応生成物の量の増大、またはN-メチルアミノ酸に対する基質特異性の上昇であってもよい。またN-メチルアミノ酸に対する反応性の上昇は、定性的または定量的なものであってよい。例えば、改変前のARSまたは改変後のARSを用いること以外は同一の条件下で反応を行い、改変前のARSに比べ改変後のARSにおいて、N-メチルアミノ酸を基質とした反応性（反応速度または反応生成物の量など）が有意に上昇すれば、N-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇したと判断される。また、たとえN-メチルアミノ酸を基質とする反応速度または反応生成物の量が有意に上昇していなくても、非修飾アミノ酸に対する反応速度または反応生成物と比較したN-メチルアミノ酸に対する基質特異性が、改変前のARSに比べ改変後のARSにおいて上昇していれば、そのような改変ARSはN-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇したと判断される。好ましくは、本発明の改変ARSは、N-メチルアミノ酸を基質とする反応速度または反応生成物の量が、改変前のARSに比べ改変後のARSにおいて上昇している。
　例えば本発明の改変ARSは、改変前のARSおよび改変後のARSを用いてある同じ条件で測定した場合、N-メチルアミノ酸でアミノアシル化されたtRNAの量、あるいはN-メチルアミノ酸が取り込まれたペプチドの量が、有意に上昇、好ましくは少なくとも10％、好ましくは20％、好ましくは1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、好ましくは2倍以上、好ましくは3倍以上、さらに好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上、さらに好ましくは30倍以上、さらに好ましくは50倍以上、さらに好ましくは100倍以上上昇する。あるいは本発明の改変ARSは、改変前のARSおよび改変後のARSを用いてある同じ条件で測定した場合、「N-メチルアミノ酸反応生成物／非修飾アミノ酸反応生成物」の量比が、改変前ARSに比べ、改変後のARSにおいて有意に上昇、好ましくは少なくとも10％、好ましくは20％、好ましくは1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、好ましくは2倍以上、好ましくは3倍以上、さらに好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上、さらに好ましくは30倍以上、さらに好ましくは50倍以上、さらに好ましくは100倍以上上昇する。あるいは本発明の改変ARSは、改変前のARSおよび改変後のARSを用いてある同じ条件で測定した場合、連続するN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドをコードする核酸を翻訳させた場合に、連続するN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドの生成量が、改変前ARSに比べ、改変後のARSにおいて有意に上昇、好ましくは少なくとも10％、好ましくは20％、好ましくは1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、好ましくは2倍以上、好ましくは3倍以上上昇する。連続するN-メチルアミノ酸は、例えば2連続および/または3連続であってよい。
　N-メチルアミノ酸に対する反応性は、上記の確認方法に従って測定することができ、具体的には、例えば翻訳生成させたペプチドを電気泳動し、N-メチルアミノ酸を取り込んだペプチドやN-メチルアミノ酸を取り込んでいないペプチドのバンド強度を定性的または定量的に測定して反応性とみなすことができる。あるいは質量分析におけるピーク値を測定し、N-メチルアミノ酸を取り込んだペプチドのピーク値やN-メチルアミノ酸を取り込んでいないペプチドのピーク値を測定して反応性とみなすことができる。
　例えば本発明の改変ARSの基質特異性は、非修飾アミノ酸およびN-メチルアミノ酸の存在下でペプチド合成を行い、「N-メチルアミノ酸反応生成物／非修飾アミノ酸反応生成物」の量比を測定した場合、改変前ARSに比べ、有意に上昇、好ましくは少なくとも10％、好ましくは20％、好ましくは1.3倍以上、好ましくは1.5倍以上、好ましくは2倍以上、好ましくは3倍以上、さらに好ましくは5倍以上、さらに好ましくは10倍以上、さらに好ましくは20倍以上上昇している。
　反応条件は、改変前のARSおよび改変後のARSにおいて同一の条件を用いる限り、適宜決定すればよい。反応時の非修飾アミノ酸およびN-メチルアミノ酸の基質濃度は適宜調製してよく、いずれかの濃度条件でN-メチルアミノ酸に対する反応性の上昇が生じればよい。好ましくは、非修飾アミノ酸は、無添加（無細胞翻訳系に元から含まれる内在性アミノ酸のみ）であってよく、あるいは0.1μM～1 mM、例えば0.1～500μM、0.1～250μM、0.1～100μM、0.1～50μMの間で適宜調節して反応させてよい。N-メチルアミノ酸は、例えば 50μM～10 mM、例えば100μM～5 mM、200μM～2 mM、500μM～1 mMの間で適宜調節して反応させてよい。
　上記の調製方法により得た改変ARSを用いて、N-メチルアミノ酸を部位特異的に組み込んだペプチド及びペプチド-mRNA融合体の生産に適用することが可能となる。
　さらに、ここで使用したARSの生物種間保存性は高いことから、他の生物種のN-メチルアミノ酸ｔＲＮＡ合成酵素の改変に本発明の方法を広く適用することができることは明らかである。
　また、本発明の改変ARSを利用することで、原核生物の翻訳系内で、特定のアミノ酸をそのN-メチル化した非天然アミノ酸に置換したペプチドを作成することが出来る。このようなペプチドの作成は、他の生物由来のARSを本発明と同様に改変することでも可能になる。
＜本発明の改変ARSを用いたｔＲＮＡのアシル化反応＞
　本発明の改変ARSを用いれば、ｔＲＮＡのアシル化においてN-メチルアミノ酸を基質とすることが可能となる。本発明の改変ARSは、N-メチルアミノ酸を用いてtRNAをアシル化し、N-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳することを可能とする。
　本発明の改変ARSを用いてN-メチルアミノアシルtRNAを生成させるには、例えばpdCpA法などの化学合成法における反応と同様に、改変ＡＲＳとそれに対応するN-メチルアミノ酸及びtRNAを試験管内で反応させ、その生成物であるN-メチルアミノアシルtRNAをエタノール沈殿のような公知の核酸精製法にて単離し、それを翻訳系内に加えてもよい。これにより目的の位置にN-メチルアミノ酸が導入されたポリペプチド、あるいはポリペプチド-mRNA融合体が作成される。
　また、特定のtRNAとそれに対応するN-メチルアミノ酸のみを基質として含む反応液中で反応を行う必要がある化学合成法とは違い、本発明の改変ARSはtRNAやアミノ酸への基質特異性が高いことから、他のtRNAやアミノ酸を含む翻訳反応液という混合物においても、改変ARS、N-メチルアミノ酸、tRNAの3者は、正確かつ効率よく目的のN-メチルアミノアシルtRNAを生成する。従って、上記のような単離精製作業は必須ではなく、N-メチルアミノ酸でtRNAをアシル化した反応溶液をそのまま翻訳反応に使用したり、またはN-メチルアミノ酸によるtRNAのアシル化の反応と同時に翻訳反応を行わせることができる。また、pdCpAアミノ酸や活性化アミノ酸といった基質の化学合成がなく、市販の試薬を用いて実施することができるため、簡便性が高い。
　そして、もっとも重要な特徴として、本発明の改変ARSを用いてペプチド翻訳を行う場合、該当するｔRNAを化学量論的な配慮を必要としないことが挙げられる。化学合成法でアミノアシルtRNAを供給する場合は反応によりN-メチルアミノアシルtRNAが減少し反応効率が低下するが、ARSを用いれば、N-メチルアミノ酸を複数導入するペプチド合成においても翻訳効率が良い。翻訳系内においてアミノアシルtRNAは加水分解反応やペプチド転移反応により絶えずデアシル化を受けるが、本発明の改変ARSは開放されたtRNAを認識して新たにN-αアミノ酸をアシル化し、翻訳系内においてN-αアミノアシルtRNAを絶えず供給することが出来る。そのため、生成されるポリペプチドに比べ、必要なtRNA量は少なくて済む。大量のtRNA添加はそれ自体がペプチド収量を低下させる一因となるため、N-αアミノ酸含有ペプチドを翻訳効率良く製造し、多様性の高いペプチドライブラリーを作製するのに本発明の改変ARSは有用である。
　さらに、本発明の改変ARSは、天然型ARSと比べN-メチルアミノ酸との反応性が向上していることから、天然のARSを用いた場合よりも低い濃度のN-メチルアミノ酸の存在下で、tRNAに対してアシル化反応を行うことができる。すなわち、ペプチド翻訳に必要なN-メチルアミノ酸の絶対量として、天然のARSを用いた場合ほど大量のN-メチルアミノ酸を必要としない。
　その上、本発明の改変ARSを用いることで、天然型ARSを用いてN-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳させる場合よりも低い濃度のARSでN-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳することができる。すなわち、ペプチド翻訳に必要な本発明の改変ARSの絶対量は、天然型のARSを用いてN-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳させる場合よりも有意に少なくて済む。
　これらの特徴は、アミノアシル化反応の直交性を向上させるのに重要である。すなわち、N-メチルアミノ酸含有ペプチドを翻訳するために、基質である、N-メチルアミノ酸あるいはそのアミノ酸に対応するARSを、他の天然のアミノ酸あるいは他の天然のアミノ酸に対応するARSよりも高濃度に必要とすればするほど、本来N-メチルアミノ酸を基質とすべきARSが他の天然のアミノ酸をアシル化反応に使用する、あるいは、過剰に存在するN-メチルアミノ酸が他の天然のアミノ酸に対応するARSによるアシル化反応に使用されるといった非特異的な反応が起きやすくなり、結果として得られる翻訳ペプチドが、N-メチルアミノ酸含有ペプチドと該当する天然アミノ酸ペプチドの混合物になる、というペプチドライブラリーの課題が生じることになる。しかし、本発明の改変ARSを使用すれば、その問題を低減することが期待できる。
　従って、本発明の改変ARSの特徴は次のように表すことができる。
ｔＲＮＡのアシル化を触媒する改変ARSであって、
（ａ）ｔＲＮＡ結合部位
（ｂ）N-メチルアミノ酸基質結合部位、及び
（ｃ）N-メチルアミノ酸基質からｔＲＮＡの３’末端へのアシル基転移反応を触媒する活性を有する触媒活性部位、
を含み、
　ｔRNAおよびN-メチルアミノ酸を、翻訳反応混合物の中でも正確に認識してアシル化し、さらにアシル基転移反応後の解放されたｔＲＮＡを再利用して再びアシル化反応を繰り返すことができることを特徴とする、前記改変ARS。
　さらに、本発明の改変ＡＲＳは前記（a）, (b), (c)に加えて、(d)望まれないアミノ酸でアシル化されたtRNAを加水分解する校正部位を含んでもよい。
＜本発明の改変ARSを用いたアシル化ｔＲＮＡの合成＞
　本発明の改変ARSを用いて、所望のN-メチルアミノ酸基質でアシル化されたｔＲＮＡを合成できる。
　本発明の改変ARSによる、アシル化されたｔＲＮＡの製造方法は以下の工程を含む
（ａ）１つ以上の本発明の改変ARSを提供する工程；（ｂ）ｔＲＮＡを提供する工程；
（ｃ）N-メチルアミノ酸を提供する工程；及び（ｄ）前記改変ARSと、前記ｔＲＮＡ及びN-メチルアミノ酸とを接触させて、ｔＲＮＡをアシル化する工程。
　また上記工程に加え、（ｅ）アシル化されたｔＲＮＡを含む反応生成物を回収する工程をさらに含んでもよい。但し、回収する工程においては、アシル化されたｔＲＮＡを精製する必要はなく、反応混合物をそのまま回収して使用することができる。生成されたアミノアシルtRNAをARSから分離・精製しないことで、デアシル化を防ぐことができる。
　この方法において基質として用いるのは、N-メチルアミノ酸である。特に好ましくはN-メチルフェニルアラニン・N-メチルバリン・N-メチルスレオニン・N-メチルトリプトファン・N-メチルロイシンおよび/またはN-メチルセリンである。基質として用いるN-メチルアミノ酸は、ARSが基質とするもの（そのARSに該当するアミノ酸）が適宜選択される。
　本発明の改変ARSによる、アシル化されたｔＲＮＡの製造方法において、ｔＲＮＡとしては該当する天然アミノ酸のARSに対応するtRNAを用いることができる。「該当する天然アミノ酸」とは、N-メチルアミノ酸に対して、そのアミノ酸がN-メチル化されていないものである。例えば、N-メチルフェニルアラニンであれば、該当するアミノ酸はフェニルアラニンであり、コドンとしてUUU, またはUUCを認識する（対応するアンチコドンを有する）ｔRNAのことである。またN-メチルバリンであれば、該当するアミノ酸はバリンであり、コドンとしてGUU, GUC, GUA, またはGUGを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAのことである。N-メチルセリンであれば、該当するアミノ酸はセリンであり、コドンとして UCU, UCC, UCA, UCG, AGU, またはAGCを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAのことである。N-メチルスレオニンであれば、該当するアミノ酸はスレオニンであり、コドンとして ACU, ACC, ACA, またはACGを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAのことである。N-メチルトリプトファンであれば、該当するアミノ酸はトリプトファンであり、コドンとして UGGを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAのことである。N-メチルロイシンであれば、該当するアミノ酸はロイシンであり、コドンとしてUUA, UUG, CUU, CUC, CUAまたはCUGを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAのことである。その他のN-メチルアミノ酸においても、該当するアミノ酸に対応するコドンを認識する（対応するアンチコドンを有する）tRNAを用いることができる。
　溶液中で改変ARSによるｔＲＮＡのアシル化を行う場合、反応溶液をエタノール沈殿したペレットを適当な緩衝液（例えば１ｍＭの酢酸カリウム、ｐＨ５等）に溶解し、翻訳系に添加すれば良い。一般的な反応条件としては、例えば、最終濃度で0.5～４0μMのtRNA、0.１～１０μMの本発明の改変ARS、0.1～10mMのN-メチルアミノ酸、0.1-10mMのATP、0.1-10mMのMgCl2を含むpH7.5、0.1Mの反応緩衝液を、３７℃で5分～1時間、反応させる。
　さらに、アミノアシル化反応を行うために、例えば1～50μMのｔＲＮＡ、10～200（例えば50～200） mM HEPES-K（ｐＨ7.0～8.0（例えば７．６））、1～100（例えば10） mM KCl溶液を９５℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでｔＲＮＡのリフォールディングを行うことができる。このｔＲＮＡ溶液を最終濃度1～40（例えば10）μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度25～100（例えば50） mM HEPES-K[pH7.0～8.0（例えば7.6）], 1～10（例えば2） mM ATP, 10～100（例えば100） mM 酢酸カリウム、1～20（例えば10） mM 酢酸マグネシウム、0.1～10（例えば1） mM DTT、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、改変ARS（最終濃度0.1～10（例えば0.5）μM）およびN-メチルアミノ酸(最終濃度0.1～10（例えば1） mM)と混合し、37℃で5～60（例えば10）分間インキュベートすることで調製できる。
　このように本発明の改変ARSを用いたアシル化反応は基質や合成が必要な活性化アミノ酸を必要とせず市販のN-メチルアミノ酸で実施できるので簡便であり、基質と組み合わせてアシル化ｔＲＮＡを得るためのキット化製品とすることもできる。キットの最低限の内容としては、（ａ）1つ以上の本発明の改変ARS、（ｂ）N-メチルアミノ酸、及び（ｃ）ｔＲＮＡを含んでいればよいが、さらに、反応緩衝液、反応容器、使用説明書等を含んでいてもよい。ここで、（ｂ）のN-メチルアミノ酸および（ｃ）のｔＲＮＡは、それぞれ（ａ）の改変ARSの基質となるN-メチルアミノ酸およびｔＲＮＡである。すなわちｔＲＮＡは、N-メチルアミノ酸に該当する天然アミノ酸に対応するコドンを認識する（対応するアンチコドンを有する）ｔＲＮＡである。
＜本発明の改変ARSを用いたN-メチルアミノ酸含有ポリペプチドの合成＞
　N-メチルアミノ酸結合ｔＲＮＡを用いて、N-メチルアミノ酸が所望の部位に導入されたポリペプチドを製造することができる。当該方法は、目的のポリペプチドをコードする核酸を、本発明の改変ARSの存在下で翻訳させる工程を含む。
　より具体的には、例えば本発明の改変ARSを用いた、N-メチルアミノ酸含有ポリペプチドの製造方法は、（ａ）本発明の改変ARSを提供する工程、（ｂ）野生型ARSの代わりに本発明の改変ARSを用いて再構成した無細胞翻訳系を構築する工程、（ｃ）改変ARSの基質となるｔＲＮＡのアンチコドンに対応するコドンを所望の部位に有するｍＲＮＡを提供する工程、（ｄ）前記の無細胞翻訳系に前記ｍＲＮＡを加えて、N-メチルアミノ酸が所望の部位に導入されたポリペプチドを製造する工程、を含む。以下では（ｄ）のポリペプチドの製造に特に関連する事項を説明する。
　本発明の改変ARSを用いて、ｔＲＮＡをN-メチルアミノ酸でアシル化する際、N-メチルアミノ酸としてはN-メチルアラニン、N-メチルロイシン、N-メチルトリプトファン、N-メチルフェニルアラニン・N-メチルバリン・N-メチルスレオニン・および/またはN-メチルセリンを用いることが好ましく、特に好ましいのは、N-メチルフェニルアラニン・N-メチルバリン・N-メチルスレオニン・N－メチルトリプトファン・N－メチルロイシンおよび/またはN-メチルセリンである。
　ポリペプチド合成の具体的な方法は、基本的には公知の方法に準じて行えばよく、例えばWO2013100132に記載したのと同様に行うことができるが、種々の改変が可能である。一般的には、以下の記載に従って行うことができる。
　翻訳系は、PURESYSTEM（登録商標） (BioComber, Japan) に代表されるような翻訳因子が再構成された無細胞翻訳系を用いるのが好適である。これにより翻訳系を構成する因子を自由に操作することができ、例えばフェニルアラニンやそのARSを翻訳系内から除去し、代わりにN-メチルフェニルアラニンと本発明の改変フェニルアラニンARSを添加することにより、例えばフェニルアラニンがコードされるUUUあるいはUUCといったコドンに部位特異的にN-メチルフェニルアラニンを導入することができる。
　無細胞翻訳系には、リボヌクレオシドとしてATPおよびGTPは0.1-10 mMで使用されることが好ましい。またバッファーとしてＨＥＰＥＳ－ＫＯＨは、5-500 mMかつpH 6.5-8.5で使用されることが好ましく、その他にもTris-HClやリン酸等が挙げられるが、これらに限られるものではない。塩類としては、酢酸カリウムおよび酢酸アンモニウムなどの酢酸塩、ならびにグルタミン酸カリウム等のグルタミン酸塩を使用でき、10-1000 mMで使用されることが好ましい。マグネシウム成分として酢酸マグネシウムは、2-200 mMで使用されることが好ましく、その他にも塩化マグネシウム等が挙げられるが、これらに限られるものではない。エネルギー再生系の成分として、クレアチンキナーゼは0.4 - 40μg/mLで使用されることが好ましく、クレアチンリン酸は2－200 mMで使用されることが好ましい。さらにその他のピルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸に代表されるエネルギー再生系も利用できる。ヌクレオシド変換酵素としてミオキナーゼ、ヌクレオシド二リン酸キナーゼは、それぞれ0.1-10 unit/mL、0.2-20 μg/mLで使用されることが好ましい。二リン酸分解酵素として無機ピロフォスファターゼは0.2-20 unit/mLで使用されることが好ましい。ポリアミンとしてスペルミジンは、0.2-20 mMで使用されることが好ましく、その他にもスペルミン等が挙げられるが、これらに限られるものではない。還元剤としてジチオスレイトールは0.1-10 mMで使用されることが好ましく、その他にもβ-メルカプトエタノール等が挙げられるが、これらに限られるものではない。tRNAとしては、例えばE．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社）を0.5 - 50 mg/mLで使用されることが好ましく、その他のE. coli由来tRNAでも代替できる。翻訳開始反応で使用されるホルミルメチオニンを合成するためのホルミルドナーおよび酵素として10-HCO-H4folateは0.1-10 mM、メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼは0.05-5μMで使用されることが好ましい。翻訳開始因子としてIF1は0.5-50μＭ、IF2は0.1-50μＭ、IF3は0.1-50μＭで使用されることが好ましい。翻訳伸長因子としてEF-Gは0.1-50μＭ、EF-Tuは1-200μＭ、EF-Tsは1-200μＭで使用されることが好ましい。翻訳終結因子としてRF-2、RF3およびRRFはそれぞれ0.1-10μＭで使用されることが好ましい。リボソームは1-100μＭで使用されることが好ましい。アミノアシルtRNA合成酵素は20種類存在するが、合成したいペプチドに含まれているアミノ酸に対応する酵素のみを加えればよく、例えばＡｒｇＲＳ、ＡｓｐＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＭｅｔＲＳ、ＴｙｒＲＳはそれぞれ0.01-1μＭで使用されることが好ましい。ペプチド合成の基質となるアミノ酸は、タンパク質を構成する天然の20種類のアミノ酸およびこれらの誘導体であり、合成したいペプチドに含まれるアミノ酸だけを0.25-10 mMで使用されることが好ましい。ペプチド合成の鋳型としてmRNAは0.1-10μＭで使用されることが好ましい。一方、無細胞翻訳系中で鋳型DNAからmRNAの転写を行う場合は、T7RNAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼおよびSP6RNAポリメラーゼなどの市販の酵素を使用でき、鋳型DNAのプロモーター配列に適合するように適時選択すればよく、1-100μg/mLで使用されることが好ましい。またこの場合、基質となるヌクレオシドCTPおよびUTPは0.1-10 mMで使用されることが好ましい。これらの因子を混合した溶液を例えば３７℃で1時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成され、温度や反応時間はこれらに限られるものではない。
　また、本発明の改変ARSはpdCpA法あるいはフレキシザイム法といった、他の非天然アミノ酸導入技術と組み合わせることもできる。例えば、N-メチルフェニルアラニンを改変フェニルアラニンARSを翻訳系に加えながら、N-メチルグリシンをpdCpA法により結合させたアミノアシルtRNAを同時に翻訳系に加えることで、両者が含まれるポリペプチドを合成することもできる。
　あるいは、本発明の改変ARSを、発現ベクターあるいはゲノムに挿入することにより細胞内にて改変ARSを発現し、培地に添加N-メチルアミノ酸を基質にすることにより細胞内にてN-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを発現できる。
　ｔＲＮＡとしては、N-メチルアミノ酸に該当する天然アミノ酸のｔRNAを用いることができる。これらは修飾塩基を含む生体内からの精製物でもよいし、In vitro 転写反応を利用して生成させた修飾塩基を含まないtRNAでもよい。また、tRNAの中でARSに認識される部分以外に変異を加えた変異tRNAも基質にすることができる。
　上述した発明の内容を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、これは例示であり本発明の範囲はこれに限定されない。明細書及び特許請求の範囲の記載に基づき種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
　なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
実施例１：Nメチルフェニルアラニンを許容するARS
＜PheRS野生型および変異体のプラスミド調製＞
　大腸菌野生型ＰｈｅＲＳαサブユニット遺伝子のＯＲＦ配列（配列番号：27、28）を含むプラスミド（pQE-32(2)2_wtPheRS）を出発物質とし、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異を導入により表１に記載した変異ＰｈｅＲＳプラスミド（N末端にHis-tag(6xHis)を有する）を構築した。具体的には、１０ｎｇ／μＬの鋳型　2μＬ、２ｘ　ＫＯＤ　Ｆｘ　ｂｕｆｆｅｒ　(ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１)、１０μL、１０μＭ　Fowardプライマー　０．６μL、１０μＭ　Reverseプライマー ０．６μＬ、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　４μＬ、　ＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１)　０．４μＬ、Ｈ２Ｏ　２．４μＬを混合し、続いてその反応液を９４℃　２分加熱した後、９８℃１０秒、６８℃７分の加熱からなるサイクルに１０サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表２に示す。各プライマーの配列は、「F.F02」から「F.F05」までは順に配列番号：30から33、「R.F02」から「R.F05」までは順に配列番号：34から37である。その後、PCR反応液に10Ｕ／μＬのＤｐｎＩ　０．５μLを添加し、さらに３７℃　１．５時間のインキュベートにより鋳型ＤＮＡを消化させ、得られた変異ＤＮＡを精製した。続いて、得られた遺伝子変異ＤＮＡとｌａｃＩ遺伝子をコードするｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を同時に大腸菌株ＸＬ－１　Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、２００２３６）に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
＜PheRS野生型および変異体の小スケール発現＞
　続いて、得られた変異遺伝子とPheRSβサブユニットをコードした遺伝子を含むプラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質ヘテロダイマーの発現を行った。まず、変異プラスミドとｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を形質転換した大腸菌ＢＬ２１株をカナマイシン、アンピシリンと０．５％のグルコースを含むＬＢ培地４ｍＬにて３７℃で培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4～0.8に達してから０．５ｍＭ終濃度のＩＰＴＧを添加し、さらに４時間３７℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
＜PheRS野生型および変異体の小スケール精製＞
　次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を６００μLのＣＨＡＰＳ溶液（０．５　％　ＣＨＡＰＳ (ＤＯＪＩＮＤＯ: ３４９－０４７２２)、５０　％　ＴＢＳ　（ＴａＫａＲａ、Ｔ９０３））に懸濁し、６μＬの３０Ｕ／μｌ　ｒLｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，　７１１１０－３）、２μＬの２．５Ｕ/μＬのｂｅｎｚｏｎａｓｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ, ７０７４６－３）を混合した後、室温にて３０分インキュベートし、その後終濃度１５ｍＭのイミダゾールを添加した後、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のＮｉ－ＮＴＡ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、　３１３１４）を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムＰＤ　ｍｉｎｉＴｒａｐ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア　２８－９１８０－０７）を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
＜PheRS野生型および変異体の大スケール精製＞
　活性が確認された変異タンパク質については大量調製を行った。具体的には、αサブユニットの変異遺伝子とβサブユニットの野生型遺伝子を含むプラスミド、及びｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を形質転換した大腸菌ＢＬ２１株をカナマイシン、アンピシリンと０．５％のグルコースを含むＬＢ培地３Ｌにて３７℃で培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4に達してから０．５ｍＭ終濃度のＩＰＴＧを添加し、さらに４時間３７℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。上記菌体を１LのＣＨＡＰＳ溶液（０．５　％　ＣＨＡＰＳ (ＤＯＪＩＮＤＯ: ３４９－０４７２２)、５０　％　ＴＢＳ　（ＴａＫａＲａ、Ｔ９０３））に懸濁し、１０μＬの３０ＫＵ／μｌ　ｒLｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，　７１１１０－３）を混合し、室温で１０分間攪拌した。続いて、２ｍＬの１Ｍ　ＭｇＣｌ２、３２０μＬのＢｅｎｚｏｎａｓｅ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ, ７０７４６－３）を添加し、室温にて２０分攪拌した。その後終濃度２０ｍＭのイミダゾールを添加した後、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清をＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　（ＧＥヘルスケア社）１５ｍＬを充填したカラムとＡＫＴＡ１０Ｓ（ＧＥヘルスケア社）を利用し、イミダゾール濃度のグラジェント（初期濃度２０ｍＭ，最終濃度５００ｍＭ）により変異タンパク質を精製した。最後に、透析カセット（ＭＷＣＯ１０，０００、Ｓｌｉｄｅ－Ａ-Ｌｙｚｅｒ Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ　Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ　７０ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｉｅｒｃｅ社）を用い、３ＬのＳｔｏｃｋ溶液（５０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ－ＫＯＨ, １００ ｍＭ ＫＣｌ, １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２, １ ｍＭ ＤＴＴ,　ｐＨ７．６）を用いて３回（２時間２回、一夜1回）透析を実施し、変異タンパク質を得た。
＜PheRS野生型および変異体のN-メチルフェニルアラニンのアミノアシル化反応＞
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAPheの合成]
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－ｔＲＮＡＰｈｅ (配列番号38)）から、７．５ mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA（Ｒ－ｔＲＮＡＰｈｅ (配列番号39)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－ｔＲＮＡＰｈｅ（配列番号38）
tRNAPhe DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGGGGATTGAAAATCCCCGTGTCCTTGGTTCGATTCCGAGTCCGGGCACCA
Ｒ－ｔＲＮＡＰｈｅ（配列番号39）
tRNAPhe RNA配列:
GCCCGGAUAGCUCAGUCGGUAGAGCAGGGGAUUGAAAAUCCCCGUGUCCUUGGUUCGAUUCCGAGUCCGGGCACCA
＜アミノアシル化反応＞
　アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写ｔＲＮＡPhe、10 mM HEPES-K（ｐＨ７．６）、10 mM KCl溶液を９５℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでｔＲＮＡのリフォールディングを行った。このｔＲＮＡ溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 PheRS野生型もしくは変異体（最終濃度0.5μM）およびフェニルアラニン(最終濃度0.25 mM、渡辺化学工業、G00029)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度1 mM、渡辺化学工業、J00040)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー（90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール）を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE (12% (w/v) polyacrylamide gel, pH5.2)で分析し、未反応tRNAとアミノアシル化tRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた。
　アミノアシル化反応の活性を評価したところ、野生型と比較して変異体04、05においてN-メチル-フェニルアラニンのアミノアシル化活性の向上が見られた（図1）。変異体04の塩基配列を配列番号12に、アミノ酸配列を配列番号1に示す。また変異体05の塩基配列を配列番号13に、アミノ酸配列を配列番号2に示す。
＜PheRS野生型および変異体によるN-メチルフェニルアラニンの翻訳導入＞
[In vitro転写反応による鋳型DNA-Fの合成]
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－F (配列番号40)）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により翻訳用鋳型mRNA（Ｒ－F (配列番号41)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－F（配列番号40）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－F（配列番号41）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルフェニルアラニンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルアミノ酸とPheRSを無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルフェニルアラニンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，４４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、PheRS野生型もしくは変異体とフェニルアラニンもしくはN-メチルフェニルアラニンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成を行った。
＜電気泳動による検出＞
　N-メチルフェニルアラニンが翻訳導入されたペプチドを検出するためにラジオアイソトープでラベルしたアスパラギン酸を利用してペプチド翻訳実験を行った。具体的には、上述の無細胞翻訳系に１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ（Ｒ－F (配列番号41)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン（各々最終濃度２５０μＭ）、１４Ｃ-アスパラギン酸(最終濃度３７μＭ、Ｍｏｒａｖｅｋ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、MC139)を加えた溶液を調製し、PheRS野生型もしくは変異体05(最終濃度0.1μM)とフェニルアラニン(最終濃度250μＭ)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度１ｍＭもしくは250μＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応溶液に対して等量の2Xサンプルバッファー(ＴＥＦＣＯ社、catNo.06-323)を加え、95℃で3分間加熱後、電気泳動（16% Peptide-PAGE mini、ＴＥＦＣＯ社、TB-162）を実施した。泳動後のゲルは、Clear Dry Quick Dry Starter KIT(ＴＥＦＣＯ社、03-278)を用いて乾燥させ、イメージングプレート(GEヘルスケア社、28-9564-75)に約16時間露光させ、バイオアナライザーシステム(Typhoon FLA 7000、GEヘルスケア社)で検出し、ImageQuantTL(GEヘルスケア社)で解析した。
　0.1μM PheRS野生型の存在下で、0.25 mMおよび1 mM N-メチルフェニルアラニン添加時には、翻訳合成されたペプチドのバンドはほとんど観測されなかった(図２)。一方、0.1μM PheRS変異体05の存在下では、0.25 mM N-メチルフェニルアラニン添加時においても、ペプチドのバンドが観測された。これにより、PheRS変異体05のN-メチルフェニルアラニンに対するアミノアシル化活性が向上していること及びN-メチルフェニルアラニンを含むペプチド翻訳合成が高収率に進行したことを確認した。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルフェニルアラニンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－F (配列番号41)）と各アミノ酸、アルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、PheRS(最終濃度0.1μM)とフェニルアラニン(最終濃度250μＭ)もしくはN-メチルフェニルアラニン(最終濃度１ｍＭもしくは250μＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いた。
　コントロール実験としてPheRS野生型（配列番号28）もしくはPheRS変異体05（配列番号2） が0.1μM存在下において、２５０μＭのフェニルアラニンを添加して翻訳実験を行った場合、どちらもフェニルアラニンが導入されたピーク（Calculated [M+H]+ = 1631.7）が検出された(図３(a), (d))。
　続いて、PheRS野生型に対して、0.25 mＭのN-メチルフェニルアラニンを添加して翻訳合成を実施すると、N-メチルフェニルアラニンのピーク(Calculated [M+H]+ = 1645.7)およびフェニルアラニンのピークが観測された(図3（b）)。この現象は、N-メチルフェニルアラニンに混入しているフェニルアラニンがPheRS野生型に認識され、アミノアシル化反応が起こり、翻訳合成が進行したと考えられる。さらに1 mM N-メチルフェニルアラニンの条件では、N-メチルフェニルアラニン由来のピーク強度が増加した（図３(c)）。各アミノ酸濃度でのピーク強度比を算出したところ(計算式：ピーク強度比＝N-メチルフェニルアラニンのピーク強度/フェニルアラニンのピーク強度)、0.25 mM では0.8、1 mMでは2.6となった。
　次にPheRS変異体05に対して、0.25 mＭまたは1 mMのN-メチルフェニルアラニンを添加して翻訳合成を実施したところ、N-メチルフェニルアラニンのピークが顕著に検出され、フェニルアラニンとのピーク強度比は0.25 mM では12.4、1 mMでは16.0であった(図３ (e), (f))。これらの結果より、PheRS野生型と比較して、PheRS変異体05はN-メチルフェニルアラニンのアミノアシル化活性が高く、その結果、N-メチルフェニルアラニンを含むペプチドの翻訳合成を促進することを確認した。
ペプチド配列Ｐ－F1（配列番号42）
formylMetArgPheArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeF1（配列番号42）
formylMetArg[MePhe]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1631.7（配列Ｐ－F1に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1645.7（配列Ｐ－MeF1に対応するペプチド。）
＜pdCpA法との比較＞
　N-メチルフェニルアラニンの取り込み効率をpdCpA法と比較した。フェニルアラニンを1個、2連続、または3連続含む配列を用いて無細胞翻訳系による翻訳を行い、電気泳動で合成されたペプチドのバンドを検出した。本発明のPheRS変異体（PhrRS05（配列番号2））を用いた場合とpdCpA法を用いた場合で比較したところ、いずれの場合もpdCpA法に比べ本発明のPheRS変異体を用いた方が高い量の合成ペプチドが検出され、翻訳効率が高いことが確認された。特にN-メチルフェニルアラニンを２連続、および３連続含む配列を翻訳させた場合のペプチド生成量は、本発明のPheRS変異体（PhrRS05）を用いた場合が、pdCpA法を用いた場合よりも4～8倍高いことが判明した。
実施例２：N-メチルバリンを許容するARS
＜ValRS野生型および変異体のプラスミド調製＞
　大腸菌野生型ValＲＳ遺伝子を含むＯＲＦ配列（配列番号23、24）をコードしたプラスミド（PQE-32(2)2_wtVALRS）を出発物質とし、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異を導入により表３に記載した変異を持つValRSプラスミド（N末端にHis-tag(6xHis)を有する）を構築した。具体的には、１０ｎｇ／μＬの鋳型　2μＬ、２ｘ　ＫＯＤ　Ｆｘ　ｂｕｆｆｅｒ　(ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１) 10μL、１０μＭ　Fowardプライマー　0.6μL、１０μＭ　Reverseプライマー 0.6μＬ、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　4μＬ、　ＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１) 0.4μＬ、Ｈ２Ｏ　2.4μＬを混合し、続いてその反応液を９４℃　２分加熱した後、９８℃１０秒、６８℃７分の加熱からなるサイクルに１０サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表４に示す。各プライマーの配列は、「F.V2」から「F.V19」、「F.V46」から「F.V48」、および「F.V13-01」から「F.V13-16」までは順に配列番号：43から79、「R.V2」から「R.V19」、「R.V46」から「R.V48」、および「R.V13-01」から「R.V13-16」までは順に配列番号：80から116である。その後、PCR反応液に10Ｕ／μＬのＤｐｎＩ　０．５μLを添加し、さらに３７℃　１．５時間のインキュベートにより鋳型ＤＮＡを消化させ、得られた変異ＤＮＡを精製した。続いて、得られた遺伝子変異ＤＮＡとｌａｃＩ遺伝子をコードするｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を同時に大腸菌株ＸＬ－１　Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、２００２３６）に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
　また、多段階の変異導入が必要なプラスミド構築には、上記操作を繰り返すことで目的の変異導入プラスミドを得た。その場合のプライマー及び鋳型の組み合わせを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
＜ValRS野生型および変異体の小スケール発現＞
　続いて、得られた変異プラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質の発現を行った。まず、変異プラスミドとｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を形質転換した大腸菌ＢＬ２１株をカナマイシン、アンピシリンを含むＬＢ培地4ｍＬにて得られた形質転換株を３７℃にて培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4～0.8に達してから０．５ｍＭ終濃度のＩＰＴＧを添加し、さらに４時間３７℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
＜ValRS野生型および変異体の小スケール精製＞
　次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を６００μLのＣＨＡＰＳ溶液（０．５　％　ＣＨＡＰＳ (ＤＯＪＩＮＤＯ: ３４９－０４７２２)、５０　％　ＴＢＳ　（ＴａＫａＲａ、Ｔ９０３））に懸濁し、６μＬの３０Ｕ／μｌ　　ｒLｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，　７１１１０－３）を混合した後、室温にて1０分インキュベートし、さらに２μＬの２．５Ｕ/μＬのｂｅｎｚｏｎａｓｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ, ７０７４６－３）を混合した後、室温にて２０分インキュベートし、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のＮｉ－ＮＴＡ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、　３１３１４）を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムＰＤ　ｍｉｎｉＴｒａｐ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア　２８－９１８０－０７）を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
＜ValRS野生型および変異体のN-メチルバリンのアミノアシル化反応＞
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAValの合成]
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－ｔＲＮＡVal２A (配列番号117)）から、７．５ mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA（Ｒ－ｔＲＮＡVal２A (配列番号118)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－ｔＲＮＡVal2A（配列番号117）
ｔＲＮＡVal2A DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGCGTCCGTAGCTCAGTTGGTTAGAGCACCACCTTGACATGGTGGGGGTCGGTGGTTCGAGTCCACTCGGACGCACCA
Ｒ－ｔＲＮＡVal2A（配列番号118）
ｔＲＮＡVal2A RNA配列:
GCGUCCGUAGCUCAGUUGGUUAGAGCACCACCUUGACAUGGUGGGGGUCGGUGGUUCGAGUCCACUCGGACGCACCA
＜アミノアシル化反応＞
　アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写ｔＲＮＡ、10 mM HEPES-K（ｐＨ７．６）、10 mM KCl溶液を９５℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでｔＲＮＡのリフォールディングを行った。このｔＲＮＡ溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 ValRS野生型もしくは変異体（最終濃度0.2-1μM）およびN-メチルバリン (最終濃度5 mM)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー（90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール）を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた（図４)。
　この結果、変異体１３にてN-メチルバリンでアシル化されたtRNAが観測され、野生型ValRSよりもNメチルバリンに対するアミノアシル化活性が高いことが示された（図４、レーン2 ｖｓ10）。
＜ValRS野生型および変異体によるN-メチルバリンの翻訳導入＞
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－V,D-V2, D-V3 (それぞれ配列番号119、121、123)）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により翻訳用鋳型mRNA（Ｒ－V, R-V2, R-V3 (それぞれ配列番号120、122、124)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－V（配列番号119）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－V（配列番号120）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
Ｄ－V2（配列番号121）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－V2（配列番号122）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUGUCGUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
Ｄ－V3（配列番号123）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTGTCGTCGTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－V3（配列番号124）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGCGUGUCGUCGUCUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルバリンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルバリンとValRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルバリンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，８４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、ValRS野生型もしくは変異体とN-メチルバリンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルバリンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－V (配列番号120)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、ValRS(最終濃度0.1-1μM)とN-メチルバリン (最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを測定して同定した。
　野生型ValRS（配列番号24）を用いて翻訳した結果、無細胞翻訳系内に混入しているバリンが導入されたペプチド配列Ｐ－V1に相当するピーク (（図５(a),　Peak V1、m/z: [H+M]+ = 1583.6）が主生成物として観測された。種々の変異ValRSを用いて同様の実験を行ったところ、ValRS04(配列番号3)、ValRS13（配列番号4）を用いた場合、N-メチルバリンが導入されたペプチド配列Ｐ－MeV1に相当するピーク (（図５(ｂ),　Peak MeV1、m/z: [H+M]+ = 1597.5、図５(c),　Peak MeV2、m/z: [H+M]+ = 1597.5）が主生成物として観測された。このことから、ValRS04,ValRS13は野生型ValRSよりもN－メチルバリンに対する活性が向上していることが翻訳の観点からも示された。また、翻訳系に混入しているバリンが導入されたペプチドP-V1に相当するピーク（図５(b) Peak V2, (c)Peak V3）も同時に観測されたが、そのピーク強度はValRS13の方が小さいことから、ValRS13の方がN-メチルバリンに対する活性が高いことが示唆された（図５(b), (c)）。
ペプチド配列Ｐ－V1（配列番号125）
formylMetArgValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeV1（配列番号125）
formylMetArg[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1583.7（配列Ｐ－V1に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1597.7（配列Ｐ－MeV1に対応するペプチド。）
＜N-メチルバリンに対するアミノアシル化活性がさらに向上したValRS13-11変異体の作製＞
　上述のValRS13に対してさらに変異を導入することで、N-メチルバリンに対する活性の向上を目指した。目的の変異を導入したプラスミドは上述のように調製し、大腸菌での発現・精製を実施することでValRS変異体を調製した（表３）。アミノアシル化反応および翻訳合成によるスクリーニングの結果、ValRS13と比較してValRS13-11（配列番号5）がN-メチルバリンに対して高い活性を示した。
　ValRS野生型、ValRS13およびValRS13-11によるN-メチルバリンのアミノアシル化反応を確認したところ、ValRS13よりもValRS13-11のほうがアミノアシルtRNAの合成量が多いことが観測された（図６、レーン8　vs　レーン9およびレーン12 vs レーン13）。特にN-メチルバリンが1.25 mMの低濃度時には、ValRS13とValRS13-11の合成量に大きな差が生じ、ValRS13-11が高い活性を持つことが示された。
　次にValRS13およびValRS13-11を用いて、N-メチルバリンを有するペプチドの翻訳合成を確認するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－V (配列番号120)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、ValRS(最終濃度4μM)とN-メチルバリン (最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。またN-メチルバリンが2連続もしくは3連続するペプチド配列をコードする鋳型mRNA(R－V２ (配列番号122)、R-V3 (配列番号124))を用いて、同様の実験を行った。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。
　N-メチルバリンが１つ含まれる鋳型ｍRNA(Ｒ－V (配列番号120))を用いた場合、ValRS13およびValRS13-11によって目的のN-メチルバリンが含まれたペプチド配列P- MeV1の合成が確認された（図７(a) Peak MeV1, (b) Peak MeV2）。また無細胞翻訳系内に混入しているバリンが導入されたペプチド配列Ｐ－V1に相当するピークがわずかに観測された（図７(a) Peak V1、(b)Peak V2）。
　次にN-メチルバリンが2連続で含まれる鋳型mRNA(R－V２ (配列番号122))を用いた場合、どちらのValRS変異体でも主生成物としてN-メチルバリンが2残基含まれたペプチド配列P- MeV2の合成が確認された（図７(c) Peak MeV3、(d)Peak MeV5）。一方で、N-メチルバリン1残基とバリン1残基が含まれるペプチド配列P-MeV4（図７(c) Peak MeV4、(d)Peak MeV6）が観測されたが、ValRS13と比較してValRS13-11では、ややこのピーク強度が抑制された。
　最後にN-メチルバリンが3連続で含まれる鋳型mRNA(R－V３ (配列番号124))を用いて翻訳実験を行った。ValRS13を添加した場合、N-メチルバリン3残基を含む目的のペプチド配列P-MeV3の合成は見られるが（図７(e),　Peak MeV7）、主生成物としてはN-メチルバリン2残基とバリン1残基からなるペプチド配列P-MeV5を与えた（図７(e),　Peak MeV8）。またN-メチルバリン1残基とバリン2残基からなるペプチド配列P-MeV6も観察された（図７(e),　Peak MeV9）。その一方で、ValRS13-11を添加した場合、主生成物としてN-メチルバリン3残基を含む目的のペプチド配列P-MeV3の翻訳合成が観察された（図７(f),　Peak MeV10）。バリンを含むペプチド配列P-MeV5およびP-MeV6も観測されたが、ValRS13よりもピーク強度が抑制された（図７(f),　Peak MeV11およびMeV12）。これらの結果より、ValRS13と比較してValRS13-11がN-メチルバリンに対するアミノアシル化活性が向上し、目的のN-メチルバリンを含むペプチドの翻訳合成量の増加につながったことが示された。
ペプチド配列Ｐ－MeV2（配列番号126）
formylMetArg[MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeV4（配列番号126）
formylMetArg[MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeV3（配列番号127）
formylMetArg[MeVal][MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeV5（配列番号127）
formylMetArg[MeVal][MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArg[MeVal]Val[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal][MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－MeV６（配列番号127）
formylMetArg[MeVal]ValValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgVal[MeVal]ValArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
もしくは
formylMetArgValVal[MeVal]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1710.8（配列Ｐ－MeV2に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1696.8（配列Ｐ－MeV4に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1823.9（配列Ｐ－MeV3に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1809.9（配列Ｐ－MeV5に対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1795.9（配列Ｐ－MeV6に対応するペプチド。）
実施例３：　Nメチルセリンを許容するARSの開発
＜SerRS野生型および変異体のプラスミド調製＞
　大腸菌野生型SerＲＳ遺伝子（PQE-32(2)2_wtSERRS）を含むＯＲＦ配列（配列番号25、26）をコードしたプラスミドを出発物質とし、ＰＣＲ法を用いた部位特異的変異を導入により表５に記載した変異SerＲＳプラスミド（N末端にHis-tag(6xHis)を有する）を構築した。具体的には、１０ｎｇ／μＬの鋳型　2.5μＬ、 ２ｘ　ＫＯＤ　Ｆｘ　ｂｕｆｆｅｒ　(ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１)12.5μL、１０μＭ　Fowardプライマー　0.75μL、１０μＭ　Reverseプライマー 0.75μＬ、２　ｍＭ　ｄＮＴＰ　5μＬ、　ＫＯＤ　ＦＸ（ＴＯＹＯＢＯ社 ＫＦＸ－１０１) 0.5μＬ、Ｈ２Ｏ　3μＬを混合し、続いてその反応液を９４℃　２分加熱した後、９８℃１０秒、６８℃７分の加熱からなるサイクルに１０サイクル晒し、変異遺伝子を増幅した。なお、用いた鋳型プラスミド及びFowardプライマー、Reverseプライマーの組み合わせを表６に示した。各プライマーの配列は、「F.S2」から「F.S8」、「F.S15」から「F.S23」、および「F.S33」から「F.S38」までは順に配列番号：128から149、「R.S2」から「R.S8」、「R.S15」から「R.S23」、および「R.S33」から「R.S38」までは順に配列番号：150から171である。その後、PCR反応液に10Ｕ／μＬのＤｐｎＩ　０．５μLを添加し、さらに３７℃　１．５時間のインキュベートにより鋳型ＤＮＡを消化させ、得られた変異ＤＮＡを精製した。続いて、得られた遺伝子変異ＤＮＡとｌａｃＩ遺伝子をコードするｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を同時に大腸菌株ＸＬ－１　Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ、２００２３６）に形質転換し、その形質転換株をアンピシリンとカナマイシンを含む寒天培地に撒くことで得られたクローンから目的プラスミドを精製し、変異が導入されていることを確認した。
　また、多段階の変異導入が必要なプラスミド構築には、上記操作を繰り返すことで目的の変異導入プラスミドを得た。その場合のプライマー及び鋳型の組み合わせを表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜SerRS野生型および変異体の小スケール発現＞
　続いて、得られた変異プラスミドを大腸菌に導入し、変異タンパク質の発現を行った。まず、変異プラスミドとｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ００４－５０）を形質転換した大腸菌ＢＬ２１株をカナマイシン、アンピシリンを含むＬＢ培地4ｍＬにて得られた形質転換株を３７℃にて培養した。その後、600 nmでのOD値が0.4～0.8に達してから０．５ｍＭ終濃度のＩＰＴＧを添加し、さらに４時間３７℃で培養した後、遠心分離機により菌体を集めた。
＜SerRS野生型および変異体の小スケール精製＞
　次に、得られた菌体を破砕し、その上清から目的の変異タンパク質を精製した。具体的には、上記菌体を６００μLのＣＨＡＰＳ溶液（０．５　％　ＣＨＡＰＳ (ＤＯＪＩＮＤＯ: ３４９－０４７２２)、５０　％　ＴＢＳ　（ＴａＫａＲａ、Ｔ９０３））に懸濁し、６μＬの３０Ｕ／μｌ　ｒLｙｓｏｚｙｍｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ，　７１１１０－３）を混合した後、室温にて1０分インキュベートし、さらに２μＬの２．５Ｕ/μＬのｂｅｎｚｏｎａｓｅ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ, ７０７４６－３）を混合した後、室温にて２０分インキュベートし、遠心分離により不溶性画分を分離した。続いて、得られた上清に対し、キアゲン社のＮｉ－ＮＴＡ　ｓｐｉｎ　ｃｏｌｕｍｎ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、　３１３１４）を用いてプロダクトマニュアルに従って変異タンパク質を精製した。最後に、脱塩カラムＰＤ　ｍｉｎｉＴｒａｐ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア　２８－９１８０－０７）を用い、プロダクトマニュアルに従って過剰なイミダゾールを除去した。
＜SerRS野生型および変異体のN-メチルセリンのアミノアシル化反応＞
[In vitro転写反応による大腸菌tRNASerの合成]
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－ｔＲＮＡSer3 (配列番号172)）から、７．５ mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA（Ｒ－ｔＲＮＡSer3 (配列番号173)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－ｔＲＮＡSer3（配列番号172）
ｔＲＮＡSer3 DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGTGAGGTGGCCGAGAGGCTGAAGGCGCTCCCCTGCTAAGGGAGTATGCGGTCAAAAGCTGCATCCGGGGTTCGAATCCCCGCCTCACCGCCA
Ｒ－ｔＲＮＡSer3（配列番号173）
ｔＲＮＡSer3 RNA配列:
GGUGAGGUGGCCGAGAGGCUGAAGGCGCUCCCCUGCUAAGGGAGUAUGCGGUCAAAAGCUGCAUCCGGGGUUCGAAUCCCCGCCUCACCGCCA
＜アミノアシル化反応＞
　アミノアシル化反応を行うために、40μM 転写ｔＲＮＡ、10 mM HEPES-K（ｐＨ７．６）、10 mM KCl溶液を９５℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでｔＲＮＡのリフォールディングを行った。このｔＲＮＡ溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 SerRS野生型もしくは変異体（最終濃度0.1-2μM）およびN-メチルセリン(最終濃度1 mM)と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー（90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.001%(w/v)キシレンシアノール）を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた（図８)。
　この結果、変異体０３（配列番号6）、３５（配列番号8），３７（配列番号9）にてN-メチルセリンでアシル化されたtRNAが観測され、野生型SerRSよりもＮ－メチルセリンのアミノアシル化活性が高くなっていることが示唆された。（図８、レーン3, 25, 27）。
＜SerRS野生型および変異体によるN-メチルセリンの翻訳導入＞
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－S (配列番号174)）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA（Ｒ－S (配列番号175)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－S(CT21)（配列番号174）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTCCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－S（配列番号175）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUCCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルセリンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルセリンとSerRSを無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルセリンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，８４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、SerRS野生型もしくは変異体とN-メチルセリンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルセリンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－S (配列番号175)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、SerRS(最終濃度0.1-2μM)とN-メチルセリン(最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを測定して同定した。
　野生型SerRS（配列番号25）を用いて翻訳した結果、N-メチルセリンを含有した目的のペプチドピークＰ－CT21MeSerに相当するピーク(図９(a)、Peak MeS1 m/z: [H+M]+ = 1585.6)は観測されたものの、主生成物としては、翻訳系に微量に混入するSerに由来したと考えられるSer含有ペプチドＰ－CT21Serに相当するピーク(図９(a)、Peak S1 m/z: [H+M]+ =1571.6)が観測された（図９(a)）。他方、変異が導入されたSerRS改変体（Ser03（配列番号6）, 05 (配列番号7））を用いて同様の実験を行った場合、同様にＰ－CT21Serに相当するピーク（図９(b)Peak S2,(c)Peak S3）は観測されるものの、こちらは副生成物であり主生成物はＰ－CT21MeSerであることが分かった（図９(b)Peak MeS2、（c）Peak MeS3）。特に、SerRS３５，３７を用いた場合Ｐ－CT21Serに相当するピークは観測されず、純度高くCT21MeSerが合成されることが示された（図９(d)Peak MeS4,(e)Peak MeS5）。以上のことから、これらの改変SerRSは野生型SerRSに比べMeSerに対する活性が向上していることが示された。
ペプチド配列Ｐ－CT21Ser（配列番号176）
formylMetArgSerArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－CT21MeSer（配列番号176）
formylMetArg[MeSer]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1571.7（配列Ｐ－CT21Serに対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1585.7（配列Ｐ－CT21MeSerに対応するペプチド。）
実施例４：N‐メチルスレオニンを許容するARSの開発
＜ThrRS野生型および変異体のタンパク質調製＞
　Ｎ末端にポリヒスチジン配列を有し、表７に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
＜ThrRS野生型および変異体によるN-メチルスレオニンの翻訳導入＞
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－T (配列番号177)）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA（Ｒ－T (配列番号178)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－T (3lib15#09)（配列番号177）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGGCTGGTCCGGGTTTTATGACTAAGAGTGGTAGTGGTAGTTAAGCTTCG
Ｒ－T（配列番号178）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAUAUGAAGGCUGGUCCGGGUUUUAUGACUAAGAGUGGUAGUGGUAGUUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルスレオニンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルスレオニンとThrRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルスレオニンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，93μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，２．７３μＭ　ＡlaＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．０９μＭ　ＧｌｙＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．６８μＭ　ＰｈｅＲＳ，０．１６μＭ　ＰｒｏＲＳ、０．２５μＭ　ＳｅｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、グリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、メチオニン、セリンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、ＴｈｒRS野生型もしくは変異体とN-メチルスレオニンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルスレオニンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－T (配列番号178)）とグリシン、プロリン、アラニン、フェニルアラニン、リシン、メチオニン、セリン（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、ＴｈｒRS (最終濃度2μM)とN-メチルスレオニン (最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを測定して同定した。
　野生型ThrRS（配列番号29）を用いて翻訳した結果、N-メチルスレオニンを含有した目的のペプチドピークＰ－3lib15MeThrに相当するピーク((図１０(a)、Peak MeT1)及びそのカリウム塩に相当するピーク(図１０(a)、Peak MeT2)を主生成物として観測できたものの、同時に、翻訳系に微量に混入するThrに由来したペプチドＰ－3lib15Thrに相当するピーク(図１０(a)、PeakT1)及びそのカリウム塩に相当するピーク(図１０(a)、PeakT2)も観測され、翻訳生成物の純度に問題が生じることが分かった（図１０(a)）。一方で、変異が導入されたThrRS改変体03（配列番号10）, およびThrRS改変体14（配列番号11）を用いて実験を行ったところ、Ｐ－CT21MeThrに由来するピーク（Peak MeT3-6、図１０）が同様に観測された上、ペプチド配列Ｐ－3lib15Thrに相当するピークはほとんど観測されないことが分かった(図１０(b), (c))。すなわち、野生型ThrRSを用いた場合に比べて高純度でMeThrが導入されたペプチドが合成されていることが示され、ThrRS改変体０３及び１４は野生型ThrRSに比べて、より効率よくペプチド中にMeThrを導入することができるARSであることが示唆された。
ペプチド配列Ｐ－3lib15Thr（配列番号179）
formylMetLysAlaGlyProGlyPheMetThrLysSerGlySerGlySer
ペプチド配列Ｐ－3lib15MeThr（配列番号179）
formylMetLysAlaGlyProGlyPheMet[MeThr]LysSerGlySerGlySer
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1470.7,　 [K+M]+ = 1508.8（配列Ｐ－3lib15Thrに対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1484.7,　 [K+M]+ = 1522.8（配列Ｐ－3lib15MeThrに対応するペプチド。）
実施例５：N‐メチルトリプトファンを許容するARSの開発
＜TrpRS野生型および変異体のタンパク質調製＞
　Ｎ末端にポリヒスチジン配列を有し、表８に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
＜TrpRS野生型および変異体によるN-メチルトリプトファンの翻訳導入＞
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－W (配列番号196）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA（Ｒ－W (配列番号197)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－W (CT29)（配列番号196）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTTGGCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－W（配列番号197）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUUGGCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルトリプトファンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルトリプトファンとTrpRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルトリプトファンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，８４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、TrpRS野生型もしくは変異体とN-メチルトリプトファンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルトリプトファンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－W (配列番号197)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、TrpRS (最終濃度5μM)とN-メチルトリプトファン(最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを測定して同定した。
　野生型TrpRS（配列番号188）を用いて翻訳した結果、N-メチルトリプトファンを含有した目的のペプチドピークＰ－CT29MeTrpに相当するピーク((図11(a)、Peak MeW1)を観測できたものの、主生成物としては翻訳系に微量に混入するTrpに由来したペプチドＰ－CT29Trpに相当するピーク(図11(a)、PeakW1)であった。一方で、変異が導入されたTrpRS改変体04 （配列番号184）, TrpRS改変体05（配列番号185）およびTrpRS改変体18（配列番号186）を用いて実験を行ったところ、Ｐ－CT29MeTrpに由来するピーク（Peak MeW2-4, 図11(b)-(d)を主生成物として観測した。すなわち、野生型TrpRSを用いた場合に比べて高純度でMeTrpが導入されたペプチドが合成されていることが示され、これらのTrpRS改変体は野生型TｒｐRSに比べて、より効率よくペプチド中にMeTrpを導入することができるARSであることが示唆された。
ペプチド配列Ｐ－CT29Trp（配列番号198）
formylMetArgTrpArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－CT29MeTrp（配列番号199）
formylMetArg[MeTrp]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1670.7（配列Ｐ－CT29Trpに対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1684.7（配列Ｐ－CT29MeTrpに対応するペプチド。）
実施例6：　Nメチルロイシンを許容するARSの開発
＜LeuRS野生型および変異体のタンパク質調製＞
　Ｎ末端にポリヒスチジン配列を有し、表9に記載した変異を含んだ発現ベクターを構築した。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
＜LeuRS野生型および変異体によるN-メチルロイシンの翻訳導入＞
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－L (配列番号200）から、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により鋳型用mRNA（Ｒ－L (配列番号201)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－L (CT23)（配列番号200）
DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAACAAGGAGAAAAACATGCGTCTCCGTGACTACAAGGACGACGACGACAAGTAAGCTTCG
Ｒ－L（配列番号201）
RNA配列:
GGGUUAACUUUAACAAGGAGAAAAACAUGCGUCUCCGUGACUACAAGGACGACGACGACAAGUAAGCUUCG
＜無細胞翻訳系＞
　N-メチルロイシンの翻訳導入を確かめるため、N-メチルロイシンとLeuRS変異体を無細胞翻訳系に加えることで、所望のN-メチルロイシンを含有するポリペプチドの翻訳合成を行った。翻訳系は、大腸菌由来の再構成無細胞タンパク質合成系であるPURE systemを用いた。具体的には、基本的な無細胞翻訳液（１ｍＭ　ＧＴＰ，１ｍＭ　ＡＴＰ，２０ｍＭクレアチンリン酸，５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＫＯＨ　ｐＨ７．６，１００ｍＭ　酢酸カリウム，９ｍＭ　酢酸マグネシウム，２ｍＭスペルミジン，１ｍＭ　ジチオスレイトール，１．５ｍｇ／ｍｌ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＲＥ６００（ＲＮａｓｅネガティブ）由来ｔＲＮＡ（Ｒｏｃｈｅ社），０．１ｍM　10-HCO-H4folate、４μｇ／ｍｌ　クレアチンキナーゼ，３μｇ／ｍｌ　ミオキナーゼ，２ｕｎｉｔ／ｍｌ　無機ピロフォスファターゼ，１．１μｇ／ｍｌ　ヌクレオシド二リン酸キナーゼ，０．６μＭ　メチオニルｔＲＮＡトランスフォルミラーゼ，０．２６μＭ　ＥＦ－Ｇ，０．２４μＭ　ＲＦ２，０．１７μＭ　ＲＦ３，０．５μＭ　ＲＲＦ，２．７μＭ　ＩＦ１，０．４μＭ　ＩＦ２，１．５μＭ　ＩＦ３，４０μＭ　ＥＦ－Ｔｕ，８４μＭ　ＥＦ－Ｔｓ，１．２μＭ　リボソーム，０．０３μＭ　ＡｒｇＲＳ，０．１３μＭ　ＡｓｐＲＳ，０．１１μＭ　ＬｙｓＲＳ，０．０３μＭ　ＭｅｔＲＳ，０．０２μＭ　ＴｙｒＲＳ（自家調製タンパクは基本的にHisタグ付加タンパクとして調製した））に、１μＭ　鋳型ｍＲＮＡ、アルギニン、アスパラギン酸、リシン、メチオニン、チロシンをそれぞれ２５０μＭずつ加えた溶液に対して、LeuRS野生型もしくは変異体とN-メチルロイシンを添加し、３７℃で１時間静置することでペプチドの翻訳合成が達成された。
＜質量分析による検出＞
　N-メチルロイシンが翻訳導入されたペプチドを検出するために、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを用いた質量分析を実施した。具体的には、上述の無細胞翻訳系に1μＭ　鋳型mRNA（Ｒ－L (配列番号201)）とアルギニン、リシン、メチオニン、チロシン、アスパラギン酸（各々最終濃度２５０μＭ）を加えた溶液を調製し、LeuRS (最終濃度0.4-2μM)とN-メチルロイシン (最終濃度５ｍＭ)を添加し、３７℃で６０分間保温した。得られた翻訳反応物を、SPE C-TIP（日京テクノス社）で精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳで分析した。翻訳産物はマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を用いてＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳスペクトルを測定して同定した。
　野生型LeuRS（配列番号189）を用いて翻訳した結果、N-メチルロイシンを含有した目的のペプチドピークＰ－CT23MeLeuに相当するピークは観測されず、翻訳系に微量に混入するLeuに由来したペプチドＰ－CT23Leu (図12(a)、PeakL1)をほぼ単一生成物として観測した。一方で、変異が導入されたLeuRS改変体02 （配列番号187）,を用いて実験を行ったところ、Ｐ－CT29MeLeuに由来するピーク（Peak MeL1, 図12(b)）が観測され、それはLeuを含むペプチドＰ－CT23Leu（Peak L2, 図12(b)）のピークと同程度の強度比であった。これはすなわち、野生型LeuRSを用いた場合に比べ、より多くのMeLeuが導入されたペプチドが合成されていることを示しており、このLeuRS改変体は野生型LeuRSに比べて、より効率よくペプチド中にMeLeuを導入することができるARSであることが示唆された。
ペプチド配列Ｐ－CT23Leu（配列番号202）
formylMetArgLeuArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
ペプチド配列Ｐ－CT23MeLeu（配列番号203）
formylMetArg[MeLeu]ArgAspTyrLysAspAspAspAspLys
MALDI-TOF MS:
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1597.7（配列Ｐ－CT23Leuに対応するペプチド。）
Calc.　m/z: [H+M]+ = 1611.7（配列Ｐ－CT23MeLeuに対応するペプチド。）
実施例７：Editing domainでのバリン加水分解能を向上させることでN‐メチルバリンへの選択性を向上させた改変ValRSの開発
＜ValRS野生型および変異体のタンパク質調製＞
　Ｎ末端にポリヒスチジン配列を有し、N-メチルバリンへの活性を向上させる触媒ドメインの変異（N44G,T45S）及び校正ドメインの変異T279A(G)を含んだ改変ValRSの発現ベクターを構築した（表10）。続いて、このベクターを発現株へと形質転換し、細胞破砕後の上清からニッケルカラムを用いて目的の変異タンパク質を精製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
＜ValRS変異体のバリン及びN-メチルバリンのアミノアシル化反応＞
[In vitro転写反応による大腸菌tRNAValの合成]
　鋳型ＤＮＡ（Ｄ－ｔＲＮＡVal1(配列番号204)）から、７．５ mM GMP存在下、RiboMAX Large Scale RNA production System T7（Promega社，Ｐ１３００）を用いたin vitro 転写反応により大腸菌tRNA（Ｒ－ｔＲＮＡVal1 (配列番号205)）を合成し、RNeasy Mini kit（Qiagen社）により精製した。
Ｄ－ｔＲＮＡVal1（配列番号204）
ｔＲＮＡVal1 DNA配列:
GGCGTAATACGACTCACTATAGGGTGATTAGCTCAGCTGGGAGAGCACCTCCCTTACAAGGAGGGGGTCGGCGGTTCGATCCCGTCATCACCCACCA
Ｒ－ｔＲＮＡVal1（配列番号205）
ｔＲＮＡVal1 RNA配列:
GGGUGAUUAGCUCAGCUGGGAGAGCACCUCCCUUACAAGGAGGGGGUCGGCGGUUCGAUCCCGUCAUCACCCACCA
＜アミノアシル化反応＞
　アミノアシル化反応を行うために、50μM 転写ｔＲＮＡ、10 mM HEPES-K（ｐＨ７．６）、10 mM KCl溶液を９５℃で2分間加熱し、その後室温に5分以上静置させることでｔＲＮＡのリフォールディングを行った。このｔＲＮＡ溶液を最終濃度10μMになるように、アシル化バッファー(最終濃度50 mM HEPES-K[pH7.6], 2 mM ATP, 100 mM 酢酸カリウム、10 mM 酢酸マグネシウム、1 mM DTT、2 mM spermidine、0.1 mg/mL Bovine Serum Albumin)を添加後、 ValRS変異体（最終濃度2μM）およびN-メチルバリン (最終濃度0.08-5 mM)またはバリン（最終濃度0.031-0.25mM）と混合し、37℃で10分間インキュベートした。反応溶液に4倍量のローディングバッファー（90 mM 酢酸ナトリウム[pH5.2]、10 mM EDTA、95%(w/w)ホルムアミド、0.1%(w/v)キシレンシアノール）を添加し、6M尿素を含む酸性PAGE で分析し、未反応tRNAとアミノアシルtRNAを分離することでアミノアシル化活性を確認した。RNAの染色は、SYBR Gold (Life Technologies)を用い、検出にはLAS4000(GEヘルスケア)を用いた。
　この結果、N-メチルバリンを基質にした場合、変異体１３－１１と変異体６６（配列番号182），６７（配列番号183）のアシル化能は各にてN-メチルバリン濃度にて大差ないことが分かった（図13　例えばlane17-19）。その一方バリンを基質にした場合、変異体１３－１１に比べ、変異体６６，６７のアシル化能が減弱していることが分かった（図14　例えばlane17-19）。このことから、新たに校正ドメインに変異を導入した変異多６６，６７はバリンに対するアミノアシル化活性が減弱することで、よりN-メチルバリンに対する選択性が向上した改変ValRSと言える事が分かった。
　本発明によって、天然型アミノアシルtRNA合成酵素 (aminoacyl-tRNA synthetase；ARS) よりも、N-メチルアミノ酸に対する反応性が上昇した改変アミノアシルtRNA合成酵素が提供された。本発明の改変アミノアシルtRNA合成酵素は、N-メチル-フェニルアラニン、N-メチル-バリン、N-メチル-セリン、N-メチル-スレオニン、N－メチルートリプトファン、N－メチルーロイシンなどのN-メチル置換アミノ酸を、対応するtRNAに、天然型アミノアシルtRNA合成酵素よりも高い効率でアミノアシル化することができる。本発明により、N-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを、より効率的に製造することができる。

Claims (15)

  1. 改変アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＲＳ）を含むポリペプチドであって、当該ARSはN-メチルアミノ酸を元の天然のARSより効率よく取り込む反応をすることができるポリペプチド。
  2. N-メチルアミノ酸によるアミノアシル化反応が増強するように改変された、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）活性を有するポリペプチドであって、該改変が、分子量が10以上減少するアミノ酸への置換を少なくも１つ含む、ポリペプチド。
  3. 前記N-メチルアミノ酸が、バリン、セリン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファンおよびロイシンからなる群より選択される請求項１または２に記載のポリペプチド。
  4. 前記ＡＲＳが、ＶａｌＲＳ、ＳｅｒＲＳ、ＰｈｅＲＳのαサブユニット、ＴｈｒＲＳ、ＴｒｐＲＳおよびＬｅｕＲＳからなる群より選択される請求項１～３のいずれかに記載のポリペプチド。
  5. 前記ＡＲＳが、下記(a)～（ｌ）から選ばれるいずれかのＡＲＳを含む、請求項１～４いずれかに記載のポリペプチド；
    (a)大腸菌由来のＶａｌＲＳの43位アスパラギンおよび/または45位スレオニンおよび/または279位スレオニンに相当する位置が改変されたＶａｌＲＳ、
    (b)大腸菌由来のSerＲＳの239位グルタミン酸および/または237位スレオニンに相当する位置が改変されたSerＲＳ、
    (c)大腸菌由来のPheＲＳαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置が改変されたPheＲＳαサブユニット、
    (d)大腸菌由来のThrＲＳの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置が改変されたThrＲＳ、
    (e)大腸菌由来のTrpＲＳの132位メチオニンおよび/または150位グルタミンおよび/または153位ヒスチジンに相当する位置が改変されたTrpＲＳ、
    (f)大腸菌由来のLeuＲＳの43位チロシンに相当する位置が改変されたLeuＲＳ、
    (g)大腸菌由来のＶａｌＲＳの（ａ）43位アスパラギンに相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または（ｂ）45位スレオニンに相当する位置がセリン、および/または（c）279位スレオニンに相当する位置がグリシンまたはアラニンであるValＲＳ、
    (h)大腸菌由来のSerＲＳの（ａ）239位グルタミン酸に相当する位置がグリシンまたはアラニン、および/または（ｂ）237位スレオニンに相当する位置がセリンであるSerＲＳ、
    (i)大腸菌由来のPheＲＳαサブユニットの169位グルタミンに相当する位置がグリシンまたはアラニンであるPheＲＳαサブユニット、
    (j)大腸菌由来のThrＲＳの332位メチオニンおよび/または511位ヒスチジンに相当する位置がそれぞれグリシンであるThrＲＳ、
    (k)大腸菌由来のTrpＲＳの（ａ）132位メチオニンに相当する位置がアラニンまたはバリン、および/または（ｂ）150位グルタミンに相当する位置がアラニン、および/または（c）153位ヒスチジンに相当する位置がアラニンであるTrpＲＳ、
    及び、
    (l)大腸菌由来のLeuＲＳの43位チロシンに相当する位置がグリシンであるLeuＲＳ。
  6. 前記ARSが、細菌由来のものである請求項１～５のいずれかに記載のポリペプチド。
  7. 前記細菌が、大腸菌である請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 下記（a）および（ｂ）で構成される群から選択される、請求項１～４のいずれかに記載のポリペプチド。
    （a） 配列番号：１乃至１１および１８２乃至１８７からなる群から選択されたアミノ酸を含むポリペプチド
    （b） 配列番号：１乃至１１および１８２乃至１８７からなる群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
  9. 請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項９に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  11. 請求項９に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
  12. 請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチドを製造する方法。
  13. N-メチルアミノ酸でアシル化されたtRNAの製造方法であって、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチドの存在下、N-メチルアミノ酸およびtRNAを接触させる工程を含む方法。
  14. N-メチルアミノ酸を含むポリペプチドを製造する方法であって、請求項１～８のいずれかに記載のポリペプチドおよびN-メチルアミノ酸の存在下、翻訳を行う工程を含む方法。
  15. 前記翻訳を行う工程が、無細胞翻訳系で行われる請求項１４に記載の方法。
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