CN110832073A

CN110832073A - 新型单加氧酶及其用途

Info

Publication number: CN110832073A
Application number: CN201880022361.2A
Authority: CN
Inventors: 野尻增俊; 八十原良彦; 日比慎; 小川顺
Original assignee: Kaneka Corp; Kyoto University NUC
Current assignee: Kaneka Corp; Kyoto University NUC
Priority date: 2017-03-31
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2020-02-21
Also published as: US20200010814A1; JPWO2018181774A1; EP3604505A1; EP3604505A4; WO2018181774A1

Abstract

本发明的目的在于提供能够制造光学活性的β‑羟基氨基酸的新型酶蛋白。本发明通过提供由2种异源的(不同的)亚基构成的单加氧酶来解决上述课题。

Description

新型单加氧酶及其用途

技术领域

本发明涉及新型单加氧酶、及编码其的基因、以及它们的利用。

背景技术

为了提高光学活性的α,α-二取代氨基酸对肽酶的稳定性，期待其作为肽医药品的组成单元(非专利文献1)。

作为光学活性的α,α-二取代氨基酸的制造方法，例如，非专利文献2中记载了基于使用了不对称相转移催化剂的不对称烷基化反应的光学活性α,α-二取代氨基酸的制造方法。另外，专利文献1中记载了通过以L-丙氨酸和甲醛作为原料的酶反应合成α-甲基-L-丝氨酸的反应。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第4877227号公报(2012年2月15日公开)

非专利文献

非专利文献1：Claudio Mapelli et al.,J.Med.Chem.,2009,52,7788-7799.

非专利文献2：Takashi Ooi et al.,J.Am.Chem.Soc.,2003,125,5139-5151

发明内容

发明要解决的课题

然而，在非专利文献2的方法中，虽然可得到光学活性的α,α-二取代氨基酸，但存在需要保护基的导入、反应后的脱保护的工序等复杂的工序的问题。另外，在专利文献1的方法中，虽然使不需要保护基的制造方法，但仅能够合成作为L体的α-甲基-L-丝氨酸，无法合成作为其光学异构体的α-甲基-D-丝氨酸。

因此，要求用于简便且高效地制造光学活性的α,α-二取代氨基酸、例如光学活性α-甲基-D-丝氨酸的改进方法。

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供能够进行包含光学活性的α,α-二取代氨基酸的β-羟基氨基酸、例如α-甲基-D-丝氨酸的制造的新型酶蛋白质。

解决课题的方法

本发明人为了实现上述目的而进行了深入研究，结果是成功地发现并分离了在自然界中具有将2-氨基异丁酸转化为光学活性的α-甲基-D-丝氨酸的能力的微生物。另外，通过上述微生物的蛋白质组学分析及与其相关的各种分析，成功地鉴定了将2-氨基异丁酸转化为α-甲基-D-丝氨酸的新型单加氧酶。另外，对鉴定的新型单加氧酶进行了详细分析，结果发现，上述单加氧酶在使用L-异缬氨酸、D-异缬氨酸、L-氨基丁酸(L－アミノブチレート)、D-氨基丁酸(D－アミノブチレート)等作为底物的情况下也具有转化为光学活性的β-羟基氨基酸的活性，从而完成了本发明。因此，本发明的一个方式包括以下的发明。

〔1〕一种单加氧酶，其由2种异源的亚基构成。

〔2〕根据〔1〕所述的单加氧酶，其催化将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为β-羟基氨基酸的反应。

〔3〕根据〔2〕所述的单加氧酶，其中，

所述α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸为下式(1)所示的化合物，

化学式1

式中，R¹及R²各自独立地为氢或CH₃，

所述β-羟基氨基酸为下式(2)所示的化合物，

化学式2

式中，R³及R⁴各自独立地为氢或CH₃。

〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的单加氧酶，其催化下式(3)～(7)所示的反应中的至少一种以上反应，所述反应为将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为β-羟基氨基酸的反应：

式(3)

化学式3

式(4)

化学式4

式(5)

化学式5

式(6)

化学式6

式(7)

化学式7

〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的单加氧酶，其中，将所述2种异源的亚基分别设为α亚基、β亚基时，

α亚基包含选自以下(a)～(d)中的任意蛋白质，

β亚基包含选自以下(e)～(h)中的任意蛋白质：

(a)由序列号1中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(b)由在序列号1中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且在包含该蛋白质的亚基与β亚基形成了复合体时该蛋白质具有单加氧酶活性；

(c)由与序列号1中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且在包含该蛋白质的亚基与β亚基形成了复合体时该蛋白质具有单加氧酶活性；

(d)由序列号6中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(e)由序列号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(f)由在序列号2中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且在包含该蛋白质的亚基与α亚基形成了复合体时该蛋白质具有单加氧酶活性；

(g)由与序列号2中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且在包含该蛋白质的亚基与α亚基形成了复合体时该蛋白质具有单加氧酶活性；

(h)由序列号7中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

〔6〕一种用于制造β-羟基氨基酸的单加氧酶反应体系，其包含〔1〕～〔5〕中任一项所述的单加氧酶、和电子传递体系蛋白质。

〔7〕根据〔6〕所述的单加氧酶反应体系，其中，

所述电子传递体系蛋白质为选自以下(i)～(l)中的任意蛋白质、及选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质：

(i)由序列号3中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(j)由在序列号3中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质组合时具有电子传递活性；

(k)由与序列号3中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质组合时具有电子传递活性；

(l)由序列号8中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(m)由序列号4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(n)由在序列号4中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自所述(i)～(l)中的任意蛋白质组合时具有电子传递活性；

(o)由与序列号4中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自所述(i)～(l)中的任意蛋白质组合时具有电子传递活性；

(p)由序列号9中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

〔8〕一种单加氧酶基因，其编码〔1〕～〔5〕中任一项所述的蛋白质。

〔9〕一种重组载体，其包含〔8〕所述的基因。

〔10〕一种转化体，其包含〔8〕所述的基因或〔9〕所述的重组载体。

〔11〕根据〔10〕所述的转化体，其进一步包含以下所示的基因：

(1)编码电子传递体系蛋白质的基因、和/或

(2)编码转运蛋白的基因。

〔12〕根据〔11〕所述的转化体，其中，

(i)由序列号3中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(l)由序列号8中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(m)由序列号4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(p)由序列号9中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

〔13〕根据〔11〕或〔12〕所述的转化体，其中，所述转运蛋白为选自以下(q)～(t)中的任意蛋白质：

(q)由序列号5中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(r)由在序列号5中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质具有转运活性；

(s)由与序列号5中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质具有转运活性；

(t)由序列号10中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

〔14〕根据〔10〕～〔13〕中任一项所述的转化体，其中，所述转化体为红球菌(Rhodococcus)属细菌。

〔15〕一种β-羟基氨基酸的制造方法，该方法包括：

在包含α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸的培养基中对〔10〕～〔14〕中任一项所述的转化体进行培养的工序。

〔16〕根据〔15〕所述的制造方法，其中，所述转化体中含有的〔8〕所述的基因来自红球菌(Rhodococcus)属。

〔17〕罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)C31-06株(保藏编号：NITEBP-02370)。

发明的效果

根据本发明的一个方式，可以简便且高效地将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为β-羟基氨基酸而不需要保护基的导入、脱保护的工序。

具体实施方式

以下，对本发明的一个实施方式进行详细说明。需要说明的是，在本说明书中，以参考的形式引用本说明书中记载的全部学术文献及专利文献。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，表示数值范围的“A～B”是指“A以上、且B以下”。

在本说明书中使用的情况下，用语“基因”可以与“多核苷酸”、“核酸”或“核酸分子”交换使用，是指核苷酸的聚合物。这里，基因可以以DNA的形态(例如，cDNA或基因组DNA)、或RNA(例如，mRNA)的形态存在。DNA或RNA可以是双链，也可以是单链。单链DNA或RNA可以是编码链(正义链)，也可以是非编码链(反义链)。另外，基因可以化学合成，也可以改变密码子选择(Codon usage)以提高编码的蛋白质的表达。只要是编码相同氨基酸的密码子彼此，也可以进行取代。

另外，用语“蛋白质”可以与“肽”或“多肽”交换使用。在本说明书中使用的情况下，碱基及氨基酸的表示适当使用IUPAC及IUB规定的1字母表示或3字母表示。

＜1.单加氧酶＞

在本发明的一个实施方式中，提供由至少2种异源的(不同的)亚基构成的单加氧酶(换言之，由2种以上不同的亚基构成的杂合单加氧酶)。

单加氧酶是氧化酶的一种，是将1原子氧导入底物的酶。目前已知的单加氧酶的大部分从结构的观点考虑是以单一的酶的形式发挥功能的酶，尚不知道本发明的一个实施方式中的由复合体(异源的亚基)构成的单加氧酶。因此，具有上述结构的本发明的一个实施方式中的单加氧酶的发现是令人惊讶的，可以催化目前的单加氧酶无法进行或反应性低的反应。因此，本发明的一个实施方式提供一种目前没有的新型且有用的单加氧酶。

本发明的一个实施方式中的单加氧酶优选由2种异源的(不同的)亚基构成。亚基的数量只要在与其它亚基形成复合体时具有单加氧酶活性即可，没有特别限定，例如，可以为2个、3个、4个、5个等。

本发明的一个实施方式中的单加氧酶的各亚基的结构只要在与其它亚基形成复合体时具有单加氧酶活性即可，没有特别限定，例如，可以由单体、二聚体、三聚体、四聚体等构成。另外，本发明的一个实施方式中的单加氧酶只要产生单加氧酶活性即可，可以由包含上述的亚基的异源二聚体、异源三聚体、异源四聚体、异源五聚体、异源六聚体等构成。

本发明的一个实施方式中的单加氧酶只要具有上述所示的特征结构即可，其细节部分可以适当变更。当然，这样的变更了细节部分的单加氧酶也包含在本申请发明的范围中。

本发明的一个实施方式中的单加氧酶的来源为菌类，例如为放线菌，可以列举例如：红球菌(Rhodococcus)属、诺卡氏菌(Nocardia)属等。优选上述单加氧酶来自于红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)。更优选来自于罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)。

如后述的实施例所示，本发明的一个实施方式中的单加氧酶可以由罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)C31-06株获得。罗克劳红球菌(Rhodococcuswratislaviensis)C31-06株保藏于国家高级工业科学技术学院国际专利生物保藏中心(独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許生物寄託センター)(292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8122号室(千葉県木更津市かずさ鎌足2－5－8122号室))，保藏人：国立大学法人京都大学大学院农学研究科日比慎(606-8502京都府京都市左京区北白川追分町)，保藏编号：NITE BP-02370(保藏日(国内保藏日)：2016年10月6日、转存日：2018年3月12日、由国内保藏编号NITE P-02370转存)。因此，本发明也提供该罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)C31-06株。

本发明的一个实施方式中的单加氧酶可以催化将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为光学活性的β-羟基氨基酸的反应。即，能够催化将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为光学活性的β-羟基氨基酸的反应的单加氧酶、优选为能够催化将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为光学活性的β-羟基氨基酸的反应的来自于红球菌属的单加氧酶为本发明的另一个优选的实施方式。

在本说明书中，“α-氨基酸”是指氨基酸的α位被单取代的氨基酸。作为本实施方式中的α-氨基酸，可以列举例如：L-氨基丁酸、D-氨基丁酸等，但并不限定于此。

在本说明书中，“α,α-二取代氨基酸”是指氨基酸的α位被双取代的氨基酸。作为本实施方式中的α,α-二取代氨基酸，可以列举例如：2-氨基异丁酸、L-异缬氨酸、D-异缬氨酸等，但并不限定于此。

在本说明书中，“β-羟基氨基酸”是指氨基酸的β位被羟基化的氨基酸，只要是通过本发明的一个实施方式中的单加氧酶而使α-氨基酸、α,α-二取代氨基酸等底物具有光学活性的氨基酸即可，没有特别限定。作为本实施方式中的β-羟基氨基酸，可以列举例如：α-甲基-D-丝氨酸、(2S,3S)-2-甲基苏氨酸、(2R,3R)-2-甲基苏氨酸、L-别-苏氨酸、D-别-苏氨酸等。在本说明书，“光学活性的β-羟基氨基酸”的用语可以与“β-羟基氨基酸”相同含义地使用。

可以预想本发明的一个实施方式中的单加氧酶通过催化α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸的β位的羟基化而转化成β-羟基氨基酸。通过这样的作用机理，只要通过上述单加氧酶转化为光学活性的β-羟基氨基酸即可，α-氨基酸、α,α-二取代氨基酸及β-羟基氨基酸可以为任意的氨基酸。

在本发明的一个实施方式中，通过单加氧酶转化为β-羟基氨基酸的α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸优选为以下式(1)所示的化合物：

化学式8

(式中，R¹及R²各自独立地为氢或烷基。)。

在上述R¹为烷基的情况下，其碳原子数可以为1～5个，优选为1～3个，更优选为1个。另外，在上述R¹为烷基的情况下，烷基可以为直链状、支链状、环状中的任一种，优选可以为直链状。

在上述R²为烷基的情况下，与上述R¹相同。

需要说明的是，式中＊可以是手性碳原子，也可以不是手性碳原子。

另外，在本发明的一个实施方式中，通过单加氧酶由α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化的β-羟基氨基酸优选为以下式(2)所示的化合物：

化学式9

(式中，R³及R⁴各自独立地为氢或烷基。)。

在上述R³为烷基的情况下，其碳原子数可以为1～5个，优选为1～3个，更优选为1个。另外，在上述R³为烷基的情况下，烷基可以为直链状、支链状、环状中的任一种，优选可以为直链状。

在上述R⁴为烷基的情况下，与上述R³相同。

需要说明的是，式中＊可以是手性碳原子，也可以不是手性碳原子，优选＊中的任一者、更优选＊两方可以为手性碳原子。

在本发明的一个实施方式中，优选为催化以下式(3)～(7)所示的反应中至少一个以上反应的单加氧酶，所述反应将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为光学活性的β-羟基氨基酸。

式(3)

化学式10

式(4)

化学式11

式(5)

化学式12

式(6)

化学式13

式(7)

化学式14

在上述式所示的将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为光学活性的β-羟基氨基酸的反应中，本发明的一个实施方式中的单加氧酶优选能够进行转化使得得到的β-羟基氨基酸的光学纯度为60％以上，更优选能够进行转化为80％以上，进一步优选能够进行转化为85％以上，特别优选能够进行转化为87％以上。

对于本发明的一个实施方式中的单加氧酶而言，将上述2种异源的亚基分别设为α亚基、β亚基时，优选α亚基包含选自以下(a)～(d)中的任意蛋白质，β亚基包含选自以下(e)～(h)中的任意蛋白质：

(a)由序列号1中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(d)由序列号6中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(e)由序列号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(h)由序列号7中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

上述(a)及(e)的蛋白质是由序列号1及2所示的氨基酸序列构成的蛋白质，均来自于罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)。序列号1是由全长378氨基酸残基构成的多肽，在Protein Discover Software(Thermo Scientific公司)中Protein ID标识为peg.803。另外，序列号2是由全长373氨基酸残基构成的多肽，在Protein DiscoverSoftware(Thermo Scientific公司)中Protein ID标识为peg.804。

上述(b)及(f)的蛋白质是与具有序列号1及2所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，在(b)的蛋白质的情况下，只要在包含该蛋白质的亚基与β亚基形成复合体后具有单加氧酶活性即可，其具体序列没有限定，在(f)的蛋白质的情况下，只要在包含该蛋白质的亚基与α亚基形成复合体后具有单加氧酶活性即可，其具体序列没有限定。这里，任选缺失、取代或添加的氨基酸的数量只要不失去上述功能即可，没有限定，可以是能够通过部位特异性诱变法等公知的导入法进行取失、取代或添加的程度的数量，优选为5氨基酸以内，更优选为3氨基酸以内(例如，3、2或1氨基酸)。另外，在说明书中，“突变”主要是指通过部位特异性诱变法等人工导入的突变，但也可以是天然存在的相同的突变。

取代的氨基酸残基优选被保存了氨基酸支链性质的其它氨基酸取代。例如，作为氨基酸支链的性质，可以列举：疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族支链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基支链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子支链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸及酰胺支链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基支链的氨基酸(R、K、H)、具有含芳香族支链的氨基酸(H、F、Y、W)(括号内均为氨基酸的单字母表示)。具有通过对某氨基酸序列实施1个或多个氨基酸残基的缺失、添加和/或其它氨基酸的取代而进行修饰而得到的氨基酸序列的多肽保持其生物学活性。另外，突变后的氨基酸残基更优选突变为尽可能具有共同性质的氨基酸残基。

在本说明书中，“在功能上同等”是指，对象蛋白质具有与目标蛋白质同等(相同和/或类似)的生物学功能、生化学功能。生物学性质可以包括表达的部位的特异性、表达量等。对于导入了突变的蛋白质是否具有希望的功能而言，在使用了其蛋白质作为亚基的一部分的情况下，可以通过调查是否具有单加氧酶活性来判断。

上述(c)及(g)的蛋白质是指与具有序列号1及2所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，在(c)的蛋白质的情况下，只要是在包含该蛋白质的亚基与β亚基形成复合体后具有单加氧酶活性即可，其具体序列没有限定，在(g)的蛋白质的情况下，只要是在包含该蛋白质的亚基与α亚基形成复合体后具有单加氧酶活性即可，其具体序列没有限定。

氨基酸序列的同源性是指，在氨基酸序列整体(或表达功能所需要的区域)中至少具有80％以上、优选为85％以上、更优选为90％以上、进一步优选为95％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。氨基酸序列的同源性可以利用BLASTN(核酸水平)、BLASTX(氨基酸水平)的程序(Altschul et al.J.Mol.Biol.,215:403-410,1990)来确定。该程序基于Karlin及Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:2264-2268,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:5873-5877,1993)。在利用BLASTN分析碱基序列时，参数设为例如score＝100、wordlength＝12。另外，在利用BLASTX分析氨基酸序列的情况下，参数设为例如score＝50、wordlength＝3。另外，在使用Gapped BLAST程序分析氨基酸序列的情况下，可以如Altschul等(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)记载的那样进行。在使用BLAST和Gapped BLAST程序的情况下，使用各程序的默认参数。这些分析方法的具体方式是公知的。为了以最佳的状态对比较对象的碱基序列或氨基酸序列进行比对，可以允许添加或缺失(例如，间隙等)。

在本说明书中，“同源性”是指性质类似的氨基酸残基数的比例(homology、positive等)，更优选为相同氨基酸残基数的比例、即同一性(identity)。需要说明的是，对于氨基酸的性质，如上所述。

对于上述(d)及(h)的蛋白质，序列号6及7分别表示编码由序列号1及2所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的碱基序列(Open Reading Frame:ORF)。

作为得到上述基因/蛋白质的方法，可以使用通常进行的多核苷酸修饰方法。即，通过对具有蛋白质的遗传信息的多核苷酸的特定碱基进行取代、缺失、插入和/或添加，可以制备具有希望的重组蛋白质的遗传信息的多核苷酸。作为修饰多核苷酸的碱基的具体方法，可以列举例如：使用市售的试剂盒(KOD-Plus Site-Directed Mutagenesis Kit(东洋纺)、Transformer Site-Directed Mutagenesis Kit(Clontech)、QuickChange SiteDirected Mutagenesis Kit(Stratagene)等)、或者利用聚合酶链式反应法(polymerasechain reaction：PCR)。这些方法是本领域技术人员公知的。

另外，上述基因可以仅由编码上述蛋白质的多核苷酸构成，也可以添加有其它的碱基序列。作为添加的碱基序列，没有特别限定，可以列举编码标记(例如，组氨酸标签、Myc标签或FLAG标签等)、融合蛋白(例如，链霉亲和素、细胞色素、GST、GFP或MBP等)、启动子序列、以及信号序列(例如，内质网转移信号序列(小胞体移行シグナル配列)及分泌序列等)的碱基序列等。添加这些碱基序列的部位没有特别限定，例如，可以是被翻译的蛋白质的N末端，也可以是C末端。

＜2.单加氧酶反应体系＞

在本发明的一个实施方式中，提供用于制造包含上述单加氧酶和电子传递体系蛋白质的β-羟基氨基酸的单加氧酶反应体系。

本单加氧酶反应体系是上述单加氧酶通过经由电子传递体系蛋白质提供氧化还原能力来制造β-羟基氨基酸的体系，只要是包含上述单加氧酶和电子传递体系蛋白质、且能够制造β-羟基氨基酸的体系即可，没有特别限定。

本单加氧酶反应体系可以是在生物体内构建的体系，也可以是在生物体外人工构建的体系。从单加氧酶蛋白质的稳定性及活性的观点考虑，本单加氧酶反应体系优选为在生物体内构建的体系。

本单加氧酶反应体系在生物体内的构建可以是生物原本具有该体系，也可以在不具有该体系的生物中人工导入该体系。

人工导入本单加氧酶反应体系的方法及导入对象没有特别限定，例如，可以通过后述的＜4.载体＞及＜5.转化体＞项中记载的方法来进行。

本单加氧酶反应体系中的电子传递体系蛋白质只要是提供用于上述单加氧酶产生单加氧酶活性的氧化还原能力的蛋白质即可，没有特别限定。

作为电子传递体系蛋白质，可以列举例如：铁氧还蛋白及铁氧还蛋白还原酶的组合(铁氧还蛋白例如为里斯克蛋白(Rieske protein)、假单胞氧还蛋白(putidaredoxin)、皮质铁氧还蛋白等，铁氧还蛋白还原酶例如为黄素蛋白还原酶、假单胞氧还蛋白还原酶、皮质铁氧还蛋白还原酶等)、黄素氧还蛋白及黄素氧还蛋白还原酶的组合、P450还原酶等。

在本发明的一个实施方式中，电子传递体系蛋白质优选为选自以下(i)～(l)中的任意蛋白质、及选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质：

(i)由序列号3中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(j)由在序列号3中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性；

(k)由与序列号3中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自以下(m)～(p)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性；

(l)由序列号8中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(m)由序列号4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(n)由在序列号4中记载的氨基酸序列中取代、缺失、插入和/或添加了1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自所述(i)～(l)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性；

(o)由与序列号4中记载的氨基酸序列具有80％以上的同源性的氨基酸序列构成的蛋白质，且该蛋白质在与选自所述(i)～(l)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性；

(p)由序列号9中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

上述(i)及(m)的蛋白质是由序列号3及4所示的氨基酸序列构成的蛋白质，均来自于罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)。序列号3是由全长322氨基酸残基构成的多肽，在Protein Discover Software(Thermo Scientific公司)中Protein ID标识为peg.801。另外，序列号4是由全长169氨基酸残基构成的多肽，在Protein DiscoverSoftware(Thermo Scientific公司)中Protein ID标识为peg.802。

上述(j)及(n)的蛋白质是与具有序列号3及4所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，在(j)的蛋白质的情况下，只要在与选自(m)～(p)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性即可，其具体序列没有限定，在(n)的蛋白质的情况下，只要在与选自(i)～(l)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性即可，其具体序列没有限定。

上述(k)及(o)的蛋白质是与具有序列号3及4所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等，在(k)的蛋白质的情况下，只要在与选自(m)～(p)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性即可，其具体序列没有限定，在(o)的蛋白质的情况下，只要在与选自(i)～(l)中的任意蛋白质组合后具有电子传递活性即可，其具体序列没有限定。

对于上述(l)及(p)的蛋白质，序列号8及9分别表示编码序列号3及4所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的碱基序列(Open Reading Frame:ORF)。

需要说明的是，在本实施方式中，电子传递体系蛋白质并不限定于选自上述(i)～(l)的蛋白质、及选自上述(m)～(p)的蛋白质，包含与电子传递体系相关的其它蛋白质。

关于基因/蛋白质相关的一般的记载(例如，用语的定义等)，引用＜1.单加氧酶＞项的记载。

＜3.基因＞

在本发明的一个实施方式中，提供编码上述蛋白质的单加氧酶基因。

在本实施方式中，上述蛋白质可以是构成＜1.单加氧酶＞项中记载的本发明的一个实施方式中的单加氧酶的蛋白质。

＜4.载体＞

在本发明的一个实施方式中，提供包含＜3.基因＞项中记载的基因的载体。作为本载体，为了制备转化体，在宿主细胞内不仅包含用于表达上述基因的表达载体，还包含用于生产重组蛋白的载体。

作为成为上述载体的母体的基材载体，可以使用通常使用的各种载体。可以用于例如质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据导入的细胞或导入方法而适当选择。即，载体的具体种类没有特别限定，可以适当选择能够在宿主细胞中表达的载体。根据宿主细胞的种类，为了可靠地表达上述基因，可以选择适当的启动子序列，使用将其和上述基因导入各种质粒等而成的质粒作为表达载体。所述表达载体可以利用例如噬菌体载体、质粒载体、病毒载体、逆转录病毒载体、染色体载体、附加体载体及来自病毒的载体(例如，细菌质粒、噬菌体、酵母附加体、酵母染色体要素及病毒(例如，杆状病毒、乳多空病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假性狂犬病毒、疱疹病毒、慢病毒及逆转录病毒))以及来自于它们的组合的载体(例如，粘粒及噬菌体)。

优选在细菌中的使用的载体中可以包含例如：pQE60、pQE70、pQE80及pQE9(可以由Qiagen获得)；pTipQC1(可以由Qiagen或Hokkaido System Science获得)、pTipRT2(由Hokkaido System Science获得)；pBS载体、Phagescript载体、Bluescript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A及pNH46A(由Stratagene获得)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540及pRIT5(由Addgene获得)；pRSF(由MERCK等获得)；以及pAC(由Nippon Gene获得)。另外，优选的真核生物载体中可以包含：pWLNE0、pSV2CAT、pOG44、pXT1及pSG(由Stratagene获得)；以及pSVK3、pBPV、pMSG及pSVL(由Addgene获得)。

另外，上述基因的插入物优选可操作地连接于适当的启动子。作为其它适当的启动子，可以利用本领域技术人员已知的启动子，没有特别限定，可以列举例如：lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子、lacI启动子、lacZ启动子、T3启动子、T7启动子、SV40初期启动子及后期启动子、以及逆转录病毒LTR的启动子。

上述载体优选进一步包含用于转录起始、转录终止的部位、以及在转录区域中用于翻译的核糖体结合部位。由载体构建物表达的成熟转录物的编码部分在要翻译的多肽的起始包含转录起始AUG，而且在终止的适当位置包含终止密码子。

作为导入载体的宿主，没有特别限定，可以优选使用各种细胞。作为适当的宿主的代表例，可以列举：细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞等，没有特别限定。用于上述宿主细胞的适当的培养培养基及条件可以利用本领域公知的培养基及条件。

将上述载体导入宿主细胞的方法、即转化方法没有特别限定，可以优选使用磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射法、阳离子脂质体介导的转染、电穿孔、转导或感染等现有公知的方法。这样的方法记载于Davis等的Basic Methods In MolecularBiology(1986)的大量的标准研究室操作手册。

＜5.转化体＞

在本发明的一个实施方式中，提供包含＜3.基因＞项中记载的基因或＜4.载体＞项中记载的重组载体的转化体。这里，“包含基因或载体”是指通过公知的基因工学方法(基因操作技术)可表达地导入对象细胞(宿主细胞)内。另外，上述“转化体”不仅包括细胞、组织、器官，还包括生物个体。

作为本转化体的制备方法(生产方法)，可以举出对上述的载体进行转化的方法。另外，成为转化对象的生物也没有特别限定，可以举出以上述宿主细胞示例出的各种生物。

作为本发明的一个实施方式中使用的宿主细胞，可以列举：细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞等，从导入及表达效率的观点考虑，优选为放线菌。

作为放线菌，可以列举例如：红球菌(Rhodococcus)属、诺卡氏菌(Nocardia)属细菌等，可以优选使用红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)、玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)、罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)、小球诺卡氏菌(Nocardia globerula)等。如后述的实施例中使用的那样，特别优选使用红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)作为宿主细胞。

在本发明的一个实施方式中，上述转化体优选进一步包含以下所示的基因：

(1)编码电子传递体系蛋白质的基因、和/或

(2)编码转运蛋白的基因。

作为本电子传递体系蛋白质，没有特别限定，例如，可以是＜2.单加氧酶反应体系＞项中记载的电子传递体系蛋白质。

本转运蛋白只要是具有将成为上述单加氧酶的底物的物质导入转化体内部的功能的蛋白质即可，没有特别限定。

作为转运蛋白，可以列举例如：渗透酶(例如，同向转运体、反向转运体、单向转运体等)、ABC转运体等。

在本发明的一个实施方式中，转运蛋白优选为选自以下(q)～(t)中的任意蛋白质：

(q)由序列号5中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(t)由序列号10中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

上述(q)的蛋白质时由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质，来自于罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)。序列号5是由全长480氨酸残基构成的多肽，在Protein Discover Software(Thermo Scientific公司)中Protein ID标识为peg.800。

上述(r)的蛋白质只要是与具有序列号5所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等、且具有转运活性即可，其具体的序列没有限定。

上述(s)的蛋白质只要是与具有序列号5所示的氨基酸序列的蛋白质在功能上同等的突变体、衍生物、变体、等位基因、同源物、直向同源物、部分肽、或与其它蛋白质/肽的融合蛋白等、且具有转运活性即可，其具体的序列没有限定。

对于上述(t)的蛋白质，序列号10表示编码由序列号5所示的氨基酸序列构成的蛋白质的基因的碱基序列(Open Reading Frame:ORF)。

需要说明的是，在本实施方式中，转运蛋白并不限定于选自上述(q)～(t)中的蛋白质，可以包含与细胞膜上的物质运输(转运)相关的其它蛋白质。

关于与基因/蛋白质相关的一般的记载(例如，用语的定义等)，引用＜1.单加氧酶＞项的记载。

通过使转化体包含编码上述(1)电子传递体系蛋白质的基因，可以促进对上述单加氧酶提供氧化还原能力，其结果是，具有可以高效地进行β-羟基氨基酸的制造的优点。

对于编码上述(1)电子传递体系蛋白质的基因而言，在导入目标的宿主/转化体不具有对上述单加氧酶提供氧化还原能力的电子传递体系蛋白质时，可以作为其补偿的成分而发挥功能；在具有对上述单加氧酶提供氧化还原能力的电子传递体系蛋白质时，可以作为增强提供氧化还原能力的成分而发挥功能。

另外，通过使转化体包含编码(2)转运蛋白的基因，可以促进单加氧酶底物导入转化体内部，其结果是具有高效地进行β-羟基氨基酸的制造的优点。

＜6.β-羟基氨基酸的制造方法＞

在本发明的一个实施方式中，提供β-羟基氨基酸的制造方法，该方法包括：在包含α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸的培养基中培养＜5.转化体＞项中记载的转化体的工序。本实施方式中的β-羟基氨基酸的制造可以使用＜5.转化体＞项中记载的转化体，其它的具体构成、条件、材料、以及使用设备等没有特别限定。

作为上述转化体，优选为放线菌，特别是红球菌属细菌，尤其优选使用红城红球菌(Rhodococcus erythropolis)。通过使用这样的细菌，可以高效率地制造β-羟基氨基酸。

在本实施方式中，利用上述转化体进行的β-羟基氨基酸的制造是通过在培养基中同时存在转化体、和作为底物的α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸而成立的。α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸添加于培养基的时期没有特别限定，例如，可以在与使转化体内导入的基因表达的同时添加，或者可以在使转化体内导入的基因表达的前后的任意时期添加，或者在上述两种时期添加。本实施方式可以是将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸添加于已经包含转化体的培养基的方式，也可以通过将转化体投入已经包含α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸的培养基来进行。这样的条件并不限于上述，本领域技术人员可以适当设定，以便能够高效率地制造β-羟基氨基酸。

在本实施方式中，α-氨基酸、α,α-二取代氨基酸及β-羟基氨基酸可以是＜1.单加氧酶＞项记载的氨基酸。

关于培养上述转化体的工序，可以优选利用现有公知的方法作为转化体的宿主菌株的培养方法，没有特别限定。例如，培养时的温度可以按照通常方法，优选设为20～45℃，更优选设为25～35℃。反应时间也没有特别限定，优选从表达导入基因起培养1～120小时，更优选培养24～72小时。

对于从培养物或菌体采集β-羟基氨基酸的方法，可以按照用于得到微生物产物的常用方法来进行，没有特别限定。

此外，上述＜1＞～＜6＞各项目中记载的内容在其它项目中也可以适当引用。另外，本发明并不限定于上述的各实施方式，可以在权利要求所示的范围进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。以下，通过实施例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。

实施例

〔实施例1〕2-氨基异丁酸同化性微生物的分离及羟化活性的评价

使用由0.1％2-氨基异丁酸、0.1％氯化铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.03％七水硫酸镁、0.01％Difco Yeast Nitogen Base w/o Amino Acids and AmmoniumuSulfate构成的2ml富集用液体培养基，将从自然界采集的各种土壤样品在28℃下振荡培养5天(浓度均以(w/v)％表示(以下，全部实施例同样处理))。将生长了微生物的培养液接种于2ml新的富集用液体培养基。重复数次该操作后，在用相同成分制备的1.5％琼脂板培养基中分离了2-氨基异丁酸同化性微生物。将分离的各微生物再次接种于2ml的富集用液体培养基，在28℃下振荡培养了5天。然后，以8000g通过10分钟的离心操作收集菌体，将用0.85％食盐水进行了2次清洗的湿菌体用于以下的静息菌体反应。静息菌体反应通过将10mM 2-氨基异丁酸、10mM葡萄糖、1mM氨基氧乙酸、5％湿菌体在50mM HEPES缓冲液(pH7.5)中以300rpm振荡4小时来进行。

将结果示于表1。如表1所示，在3种微生物中确认了α-甲基-D-丝氨酸的生成。

表1

¹每mg湿细胞每min 1nmol MeSer

²对映体过量的α-甲基-D-丝氨酸

＜分析条件＞

·测定仪器：LCMS-2010A(岛津制作所)

·柱：Xbridge C18柱(5μm：2.1×150mm)(Waters Japan)

·柱箱温度：40℃

·流动相A：10mM乙酸铵(pH5.0)

·流动相B：甲醇

·流速：0.3ml/分

·梯度设定：0～0.5分钟0～1％流动相B、0.5～18分钟1～5％流动相B、18～19分钟5～9％流动相B、19～29.5分钟9～17％流动相B、29.5～40分钟17～60％流动相B

·MS条件：加热块温度200℃、Curved desolvation line温度250℃、Detectorvoltage 1.5kV、nebulizing gas flow 1.51/分

使用AccQ-Tag derivation kit(Waters Japan)将分析溶液中的氨基酸衍生化后供于LCMS分析。

〔实施例2〕R.wratislaviensis C31-06株的蛋白质组学分析

使用250ml的2-氨基异丁酸诱导液体培养基(0.1％2-氨基异丁酸、0.1％氯化铵、0.1％磷酸二氢钾、0.1％磷酸氢二钾、0.03％七水硫酸镁、0.01％Difco Yeast NitogenBase w/o Amino Acids and Ammoniumu Sulfate)、或250ml的非诱导培养基(在2-氨基异丁酸诱导液体培养基中使用0.05％葡萄糖来代替0.1％2-氨基异丁酸)在28℃下将R.wratislaviensis C31-06株培养38.5小时(分别n＝3)。对各培养菌体在4℃、8000g下通过10分钟的离心分离收集菌体，悬浮于包含7M尿素、2.0mM硫脲、2％CHAPS、10mM二硫苏糖醇、1tablet/10ml蛋白酶抑制剂(Complete Mini,Roche)的50mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液。添加0.10mm微珠，用Multi-Beads Shocker破碎菌体，然后，在4℃、20000g下进行了15分钟的离心分离。将得到的离心上清作为细胞溶解液使用。使用最小量的200mM TEAB缓冲液(pH8.0)清洗沉淀物与细胞溶解液合并，用0.45μm的过滤器进行了过滤。接着，使用200mMTEAB缓冲液替换滤液。向替换的滤液中添加9.5mM Tris(2-carboxyethyl)phosphine，在55℃下处理了60分钟。然后，添加碘乙酰胺，使其为17.9mM，在室温下处理了30分钟。最后，添加2～4倍量的冷丙酮，在-20℃下处理了3小时。通过以4℃、13000g进行10分钟的离心分离，回收了蛋白质。通过37℃下2分钟的处理除去了残留丙酮。

接着，进行了蛋白质的胰蛋白酶消化。具体而言，用200mM TEAB缓冲液悬浮回收的蛋白质，然后，使用47.6ng/μl的胰蛋白酶在37℃下过夜进行了消化处理。然后，使用tandemmass tag(TMT)6-plex labeling kit(Thermo Fisher Scientific)在41μl的乙腈中对得到的消化物进行标签化。在室温下60分钟的反应后，添加8μl的5％羟胺，混合了15分钟。接着，在真空下使液体蒸发，然后，溶解于100μl的0.1％三氟乙酸。

将如上所述得到的胰蛋白酶消化蛋白质供于LCMS分析(Prominence Nano FlowSystem(岛津制作所))。使用具备蛋白质数据库的Protein Discover Software(ThermoScientific公司)进行了诱导蛋白质的鉴定，所述蛋白质数据库是基于得到的质量分析的数据、和R.wratislaviensis C31-06株的基因组信息(由Hokkaido System Science获得)而制成的。将结果示于表2。

表2

※logFC通过log2(诱导区蛋白量-非诱导区蛋白量)来计算。

＜分析条件＞

·测定仪器：Prominence Nano Flow System(岛津制作所)

·柱：Monolithic silica capillary柱(500cm长、0.1mm ID)(Kyoto Monotech)

·柱箱温度：40℃

·流动相A：0.1％甲酸水溶液

·流动相B：0.1％甲酸乙腈

·流速：500ml/分

·梯度设定：0～600分钟5～45％流动相B

·MS条件：LTQ Velos linear ion trap mass spectrometer(ThermoScientific)、2.3kV的ESI voltage、LTQ Velos ion trap上的离子迁移管温度＝280℃

〔实施例3〕2-氨基异丁酸羟化酶及电子传递体系蛋白质的鉴定

由于预想实施例2中得到的Protein ID peg.801-804是催化2-氨基异丁酸羟化反应的复合体，因此尝试了获得编码其的基因。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.801-804的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(pTipQC1_5’Hyd)：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGTTGCACCAACCTCGAA(序列号11)(10μM、1μl)

·引物(pTipQC1_3’Hyd)：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTACTAGAGATCGAGGACGAGCC(序列号12)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用NcoI和HindIII进行了限制酶处理的载体pTipQC1(Hokkaido SystemScience)。接着，使用本质粒pQAH1对E.coli JM109进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中于28℃下培养过夜。从本菌体获得pQAH1后，使用本质粒对Rhodococcus erythropolis L88(Hokkaido System Science)进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部分添加至新的2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)，在28℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.8(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加硫链丝菌素，使其为0.2μg/ml的浓度。接着，作为反应底物，添加2-氨基异丁酸，使其为10mM的浓度，开始振荡反应。

其结果是在48小时的反应后确认到2.7mM的α-甲基-D-丝氨酸的生成。

通过以上可知，peg.801-804是催化2-氨基异丁酸羟化反应的复合体。

＜分析条件＞

·测定仪器：Shimadzu LC-VP(岛津制作所)

·柱：Xbridge C18柱(5μm：2.1×150mm)(Waters Japan)

·柱箱温度：40℃

·流动相A：Waters AccQ-Tag Eluent A

·流动相B：甲醇

·流速：0.3ml/分

·梯度设定：0～0.1分钟0％流动相B、0.1～0.5分钟0～1％流动相B、0.5～18分钟1～5％流动相B、18～19分钟5～9％流动相B、19～29.5分钟9～17％流动相B、29.5～40分钟17～60％流动相B、40～43分钟60～0％流动相B、43～55分钟0％流动相B

·检测：荧光检测器(激发波长250nm发光波长395nm)

使用AccQ-Tag derivation kit(Waters Japan)将分析溶液中的氨基酸衍生化后供于LC分析。

〔实施例4〕peg.803、804的功能分析

〔4.1〕

尝试了构建表达Protein ID peg.801、802、803的转化放线菌。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.801、802、803的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(pTipQC1_5’803)：TGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACCATCATCGAACACGG(序列号13)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用NcoI和HindIII进行了限制酶处理的载体pTipQC1(Qiagen)。接着，使用本质粒pQAH-d804对E.coli JM109进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中于28℃下培养过夜。在从本菌体获得pQAH-d804后，使用本质粒对Rhodococcuserythropolis L88(Hokkaido System Science)进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部分添加至新的2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)，在28℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.8(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加硫链丝菌素，使其为0.2μg/ml的浓度。接着，作为反应底物，添加2-氨基异丁酸，使其为10mM的浓度，开始振荡反应。

其结果是在48小时的反应后没有在培养上清中确认到α-甲基-D-丝氨酸的生成。

根据实施例3的结果和本结果可知，peg.804蛋白质对于羟化活性表达是必要的。

〔4.2〕

接下来，尝试了构建表达Protein ID peg.801、802、804的转化放线菌。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.801、802、804的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(joint802-4_3’)：CGCTACCGATTACAAACTTGGACATTCTTAACCAACCTTTCCTGGGC(序列号14)(10μM、1μl)

或者

·引物(joint804-2_5’)：CCCGAGCCCAGGAAAGGTTGGTTAAGAATGTCCAAGTTTGTAATCGG(序列号15)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将2种PCR产物插入用NcoI和HindIII进行了限制酶处理的载体pTipQC1(Qiagen)。接着，使用本质粒pQAH-d803对E.coli JM109进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中于28℃下培养过夜。从本菌体获得pQAH-d803后，使用本质粒对Rhodococcuserythropolis L88(Hokkaido System Science)进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部分添加至新的2ml的LB培养基(含20μg/ml氯霉素)，在28℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.8(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加硫链丝菌素，使其为0.2μg/ml的浓度。接着，作为反应底物，添加2-氨基异丁酸，使其为10mM的浓度，开始振荡反应。

根据实施例3的结果和本结果可知，peg.803蛋白质对于羟化活性表达是必要的。

〔比较例1〕对转化大肠杆菌的反应性评价

尝试了构建表达Protein ID peg.801-804的转化大肠杆菌。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.803、804的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：Tsk Gflex DNA Polymerase(Takara Bio)(1.25单位/μl、1μl)

·引物(pQE60_5’Hyd)：GAATTCATTAAAGAGGAGAAATTAACCATGGTTGCACCAACCTCGAA(序列号16)(10μM、1μl)

·引物(pQE60_3’Hyd)：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTACTAGAGATCGAGGACGAGCC(序列号17)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、58℃15秒钟、68℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用NcoI和HindIII进行了限制酶处理的载体pQE60(Qiagen)。接着，使用本质粒pQEHyd对E.coli JM109进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中于28℃下培养过夜。接着，将培养液的一部添加至250ml的TB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)，在28℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.6(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加IPTG，使其为1mM的浓度。在16小时的培养后，作为反应底物，添加2-氨基异丁酸，使其为10mM的浓度，开始振荡反应。

其结果是在48小时的反应后确认到0.2mM的α-甲基-D-丝氨酸的生成。与实施例3相比，这是α-甲基-D-丝氨酸的生成量少的结果。

通过以上可知，作为本反应体系的宿主，与大肠杆菌相比，在红球菌属细菌中反应性更高。

〔实施例5〕peg.800导入的反应性评价

基于同源性检索的结果，预想实施例2中得到的Protein ID peg.800为2-氨基异丁酸的转运体，因此尝试了获得编码peg.800的基因。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.800的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(pTipRT2_NdeI_5’800)：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGACAGTGAATCATTCCCA(序列号18)(10μM、1μl)

·引物(pTipRT2_HindIII_3’800)：TGGTGATGGTGATGCTCGAGAGATCTATCAGATTCTGGGCTGCAGAA(序列号19)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用NdeI和HindIII进行了限制酶处理的载体pTipRT2(Hokkaido SystemScience)。接着，使用本质粒pRAT1对E.coli JM109进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)中于28℃下培养过夜。从本菌体获得pRAT1，使用本质粒对实施例3中制备的pQAH1 Rhodococcus erythropolis L88进行了转化。将本转化体(pQAH1/pRAT1 Rhodococcus erythropolis L88)在2ml的LB培养基(含5μg/ml四环素、20μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部添加至新的2ml的LB培养基(含5μg/ml四环素、20μg/ml氯霉素)，在28℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.8(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加硫链丝菌素，使其为0.2μg/ml的浓度。接着，作为反应底物，添加2-氨基异丁酸，使其为10mM的浓度，开始振荡反应。

其结果是在48小时的反应后于培养上清中确认到8.5mM的α-甲基-D-丝氨酸的生成。

在本实施例中，由于确认到了比实施例3更多的产物，因此可知peg.800蛋白质使反应性提高。

需要说明的是，生成的α-甲基-D-丝氨酸的光学纯度为93.5％ee。

＜分析条件＞

·测定仪器：LCMS-2010A(岛津制作所)

·柱：Xbridge C18柱(5μm：2.1×150mm)(Waters Japan)

·柱箱温度：40℃

·流动相A：5％乙酸

·流动相B：乙腈/甲醇＝90/10

·流速：0.25ml/分

·梯度设定：0～0.1分钟5％流动相B、0.1～30分钟5～35％流动相B、30～40分钟90％流动相B、40～50分钟5％流动相B

将25μl的反应溶液与25μl的0.8％三乙胺乙腈溶液混合，使用用50μl的2,3,4,6,-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异氰酸酯进行了衍生化样品，进行了光学纯度分析。

〔实施例6〕底物特异性评价

通过与实施例5相同的方法在LB培养基中培养了pQAH1/pRAT1Rhodococcuserythropolis L88。用0.2μg/ml的硫链丝菌素诱导了蛋白质的表达后，将各10mM的L-异缬氨酸、D-异缬氨酸、L-氨基丁酸、D-氨基丁酸与5％葡萄糖一起添加。在26小时的反应后，通过实施例1中示出的LCMS分析法对反应上清进行了分析。

根据其结果，由于对于各基质确认到分子量增加了16的产物，因此可知进行了羟化反应。根据NMR及旋光度分析的结果可知，确认到在以L-异缬氨酸作为底物时，生成了(2S,3S)-2-甲基苏氨酸，在以D-异缬氨酸作为底物时，生成了(2R,3R)-2-甲基苏氨酸，在以L-氨基丁酸作为底物时，生成了L-别-苏氨酸，在以D-氨基丁酸作为底物时，生成了D-别-苏氨酸。

需要说明的是，(2S,3S)-2-甲基苏氨酸及(2R,3R)-2-甲基苏氨酸的NMR的结果如下所示(表3)。

表3

〔实施例7〕peg.803、804的结构分析

尝试了构建表达Protein ID peg.803、804的转化大肠杆菌。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(pQE_804_5’)：TCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGGTTGCACCAACCTCGAA(序列号20)(10μM、1μl)

·引物(pQE_803_3’)：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTATTAGTCCGCCTGATTCGTAA(序列号21)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用BamHI和HindIII进行了限制酶处理的载体pQE80(Qiagen)。接着，使用本质粒pQE804-803对E.coli Rosetta 2(DE3)进行了转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部分添加至200ml的TB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml氯霉素)，在20℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.6(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加IPTG，使其为0.5mM的浓度。在16小时的培养后，通过离心分离回收菌体，用0.85％NaCl清洗了2次。将本菌体悬浮于0.5MNaCl、30mM咪唑、20mM HEPES(pH8.0)后，进行了超声波破碎。将离心分离得到的本破碎液的上清导入HisTALON Superflow(1.6×2.5cm)(Takara Bio)，以0.5M NaCl、30mM咪唑、150mMHEPES(pH8.0)进行洗脱，由此回收了包含peg.803、804的酶级分。通过超滤将本酶级分浓缩后，导入Superdex 200Increase 10/300GL column(1.0×30cm)(GE Healthcare)，使用10mM HEPES(pH8.0)、0.14M NaCl测定了peg.803、804的分子量，结果为约180,000。由于peg.803、804的推测分子量分别为42,000、43,000，因此与上述SDS-PAGE分析的结果组合可知，peg.803与peg.804以等摩尔缔合在一起。

通过以上可以推测，上述单加氧酶分别由peg.803及peg.804构成，作为单加氧酶整体，采取异源四聚体结构。

〔实施例8〕peg.801的辅酶的鉴定

尝试了构建表达Protein ID peg.801的转化大肠杆菌。

具体而言，在以下的PCR条件下进行PCR，得到了peg.801的PCR产物。

＜PCR条件＞

·模板：R.wratislaviensis C31-06株的基因组(100ng/μl、1μl)

·聚合酶：PrimeSTAR Max Premix(2×)(Takara Bio)(25μl)

·引物(pQE_801_5’)：TCGCATCACCATCACCATCACGGATCCATGACCAATTCAGATAGTTC(序列号22)(10μM、1μl)

·引物(pQE_801_3’)：CAACAGGAGTCCAAGCTCAGCTAATTACTAGAGATCGAGGACGAGCC(序列号23)(10μM、1μl)

·扩增条件：98℃10秒钟、55℃5秒钟、72℃1分钟进行30循环。

使用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(New England BioLabs)将PCR产物插入用BamHI和HindIII进行了限制酶处理的载体pQE80(Qiagen)。接着，使用本质粒pQE-801对E.coli Rosetta 2(DE3)进行转化。将本转化体在2ml的LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml氯霉素)中于28℃下培养过夜。将培养液的一部分添加至200ml的TB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml氯霉素)，在20℃下进行了振荡培养。培养液浊度为0.6(吸收波长：600nm)后，为了诱导蛋白质的表达，添加IPTG，使其为0.5mM的浓度。在16小时的培养后，通过离心分离回收菌体，用0.85％NaCl清洗了2次。将本菌体悬浮于0.5M NaCl、30mM咪唑、20mM HEPES(pH8.0)后，进行了超声波破碎。将离心分离后的本破碎液的上清导入HisTALON Superflow(1.6×2.5cm)(Takara Bio)，用0.5M NaCl、30mM咪唑、150mM HEPES(pH8.0)进行洗脱，由此回收了包含peg.801的酶级分。通过超滤将本酶级分浓缩后，导入MonoQ 10/100GL column(1.0×10cm)(GE Healthcare)，用1M NaCl、20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行洗脱，得到了peg.801的纯化酶。将0.77μg/ml的peg.801添加于包含10-150μMNADH或NADPH、20-100μM二氯吲哚酚、100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)的反应液，测定了peg.801的酶活性。

测定了本反应中的Km值，结果是相对于NADH为8.2μM，相对于NADPH为6.2mM。因此可知，peg.801需要NADH作为辅酶。

工业实用性

本发明可以用于要求稳定的蛋白质供给的领域，例如，可以用于肽医药的制造等领域。

保藏编号

NITE BP-02370

序列表

<110> 株式会社钟化(Kaneka Corporation)

国立大学法人京都大学(KYOTO UNIVERSITY)

<120> 新型单加氧酶及其用途

<130> B161123

<150> JP 2017-071338

<151> 2017-03-31

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 378

<212> PRT

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 1

Met Thr Ile Ile Glu His Gly Ser Leu Gly Thr Leu Pro Ala Pro Ser

1 5 10 15

Val Thr Thr Gly Ile Val Asp Ala Asp Ile His Pro Val Pro Gln Asp

20 25 30

Gly Ala Leu Glu Pro Tyr Leu Asp Asp Arg Trp Lys Lys His Ile Arg

35 40 45

Glu Tyr Gly Val Arg Thr Thr Thr Gly Leu Gln Phe Ile Ser Glu Tyr

50 55 60

Pro Gln Met Tyr Gly Gly Ala Met Arg Ala Asp Ala Trp Pro Glu Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Pro Gly Ser Asp Arg Glu Leu Leu Arg Thr Gln Leu Leu Asp

85 90 95

Lys His Asn Ile Gln Leu Gly Val Leu Gln Cys Leu Ala Pro Gly Gly

100 105 110

Gln Thr Leu Asn Pro Ala Gly Gln Ala Leu Asn Gln Glu Leu Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Cys Arg Ala Thr Asn Asp Trp Gln Leu Glu His Leu Val Tyr

130 135 140

Pro Asp Pro Arg Met Arg Ala Ala Ile Pro Val Thr Phe Glu Thr Pro

145 150 155 160

Asp Tyr Ala Val Ala Glu Ile Glu Arg Val Gly Ala Asp Pro Gly Val

165 170 175

Val Ala Val Leu Gly Thr Ser Lys Thr Leu Glu Pro Leu Gly Ser Arg

180 185 190

Lys Tyr Trp Pro Ile Tyr Glu Ala Ser Val Ala Gln Asn Leu Pro Ile

195 200 205

Gln Phe His Leu Ser Gln Gly Gly Gly His Ala Asn Thr Gly Thr Gly

210 215 220

Trp Thr Ser Tyr His Thr Glu Tyr His Thr Gly His Val Gln Ser Phe

225 230 235 240

Gln Ser Gln Leu Leu Ser Leu Val Leu Ser Gly Thr Phe Asp Arg Phe

245 250 255

Pro Thr Leu Lys Val Met Phe Val Glu Gly Asn Val Ala His Phe Ala

260 265 270

Pro Leu Ile Gln Arg Met Asp Tyr Thr Trp Glu Thr Leu Arg Gly Glu

275 280 285

Leu Pro Asp Leu Gln Arg Lys Pro Ser Glu Tyr Ile Arg Asp His Ile

290 295 300

Trp Ala Ser Thr Gln Pro Ile Asp Glu Pro Glu Lys Pro Glu His Leu

305 310 315 320

Ala Glu Leu Leu Glu Glu Phe Cys Gly Asp Asn Val Val Phe Ala Thr

325 330 335

Asp Tyr Pro His Phe Asp Phe Asp Asp Pro Glu Thr Ala Phe Pro Arg

340 345 350

Ser Phe Pro Val Asp Leu Arg Asp Lys Ile Leu Arg Gly Asn Gly Met

355 360 365

Arg Phe Phe Gly Val Thr Asn Gln Ala Asp

370 375

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 2

Met Val Ala Pro Thr Ser Asn Pro Gly Val Pro Asp Glu Leu Asp Gly

1 5 10 15

Val Pro Ala Val Val Asp Cys Asp Val His Ala Val Leu Pro Ser Pro

20 25 30

His Ser Leu Ile Pro Tyr Leu Asp Glu Tyr Trp Ala Asp Gln Leu Val

35 40 45

Ala Gln Leu Ala Pro Thr Tyr Glu Pro Asn Tyr His Pro Arg Gly Ser

50 55 60

Ala Ile Ala Gln His Ser Asp Ala Ser Val Asp Glu Asn Gly Arg Ala

65 70 75 80

Ala Thr Thr Ala Glu Asn Leu Val Lys Asp Val Phe Ala Asp Gly Phe

85 90 95

Thr Asp Phe Ala Val Val Asn Cys Leu Tyr Gly Val Gln Gln Ile His

100 105 110

Gln Pro Arg Arg Glu Met Ala His Ala Arg Ala Leu Asn His Trp Ile

115 120 125

Ala Asn Glu Trp Leu Asp Lys Asp Asp Arg Leu Arg Ala Ser Ile Val

130 135 140

Val Pro Gln Gly Ser Pro Arg Ala Ala Ala Glu Glu Ile Asp Phe Trp

145 150 155 160

Ser Gly Asp Lys Arg Phe Val Gln Val Leu Leu Leu Gly Gln Ser Glu

165 170 175

Leu Leu Tyr Gly Arg Glu Ile Asn Trp Pro Ile Trp Glu Ala Ala Glu

180 185 190

Ala Ala Gly Leu Pro Val Thr Leu His Ile Gly Gly Val Phe Arg Gln

195 200 205

Ala Pro Thr Ser Val Gly Trp Pro Ala Ser His Leu Glu Trp Tyr Val

210 215 220

Gly Gln Gln Ser Asn Ile Glu Ala Gln Leu Asn Ser Ile Ile Ser Glu

225 230 235 240

Gly Ile Leu Gln Lys Phe Pro Lys Thr Lys Ile Leu Leu Ser Glu Leu

245 250 255

Gly Phe Asn Trp Leu Pro Pro Phe Met Trp Lys Phe Asp Lys Leu Trp

260 265 270

Lys Ser Tyr Arg Pro Asp Ile Pro Trp Val Gln Glu Ser Pro Leu Glu

275 280 285

Leu Ile Arg Glu His Val Arg Val Thr Thr Ser Pro Ser Asp Gly Ala

290 295 300

Glu Glu Ala Gly Arg Leu Asp Ser Ile Val Asp Arg Leu Gly Ser Asp

305 310 315 320

Arg Met Leu Val Tyr Ser Ser Asp Tyr Pro His Lys His His Ser Gly

325 330 335

Pro Arg Asp Ile Glu Asn Gly Thr His Ser Pro Glu Leu Leu Asp Arg

340 345 350

Ile Tyr Arg Arg Asn Ala Phe Asp Leu Tyr Asn Leu Val Val Pro Ser

355 360 365

Pro Gly Lys Val Gly

370

<210> 3

<211> 322

<212> PRT

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 3

Met Thr Asn Ser Asp Ser Ser Asp Ala Val Ala Glu Val Asp Val Ile

1 5 10 15

Ile Asp Gly Ile Thr Asn Glu Ala Asp Gly Ile Ile Ser Leu Thr Phe

20 25 30

Ala Ser Leu Thr Gly Asp Lys Met Pro Arg Trp Glu Pro Gly Ala His

35 40 45

Ile Asp Val Leu Leu Gly Pro Glu Leu Glu Arg Gln Tyr Ser Leu Cys

50 55 60

Gly Asp Val Asn Asp Glu Arg Thr Leu Arg Val Ala Val Leu Arg Glu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gln Trp Val His Glu Arg Leu Ser Val

85 90 95

Gly Asp Lys Ile Arg Ile Arg Gly Pro Arg Asn His Phe Arg Leu Val

100 105 110

Glu Ala Gln Glu Tyr Leu Phe Ile Ala Gly Gly Ile Gly Ile Thr Pro

115 120 125

Ile Leu Pro Met Ile Ala Asp Cys Glu Ala Arg Gly Ser Arg Trp Ser

130 135 140

Leu Val Tyr Gly Gly Arg Ser Thr Asp Ser Met Ala Phe Thr Thr Gln

145 150 155 160

Leu Ala Lys His Gln Asp Arg Val Arg Phe Trp Pro Gln Asp Glu Asn

165 170 175

Gly His Ile Asp Ile Arg Gly Phe Leu Gly Asp Pro Arg Pro Gly Thr

180 185 190

Ala Ile Tyr Cys Cys Gly Pro Gly Pro Leu Leu Asp Ala Val Glu Asp

195 200 205

Val Cys Ser Gln Trp Pro Thr Asp Ala Leu His Leu Glu Arg Phe Arg

210 215 220

Pro Arg Ala Gly Ala Met Glu Gly Pro Glu Ser Pro Phe Glu Val Glu

225 230 235 240

Leu Glu Gln Ser Asn Met Val Val Thr Val Ala Val Gly Gln Thr Ile

245 250 255

Val Asp Ala Cys Lys Ser Ala Gly Val His Ile Pro Thr Ser Cys Gly

260 265 270

Glu Gly Thr Cys Gly Thr Cys Glu Thr Val Val Leu Glu Gly Val Pro

275 280 285

Glu His Arg Asp Ser Tyr Leu Thr Ala Gln Glu Arg Glu Ser Asn Glu

290 295 300

Val Val Met Pro Cys Cys Ser Arg Ser Arg Thr Ser Arg Leu Val Leu

305 310 315 320

Asp Leu

<210> 4

<211> 169

<212> PRT

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 4

Met Ser Lys Phe Val Ile Gly Ser Val Asn Asp Ile Pro Pro Gly Ser

1 5 10 15

Arg Lys Ile Val Thr Leu Asp Gly Arg Ser Val Gly Ile Phe Asn Leu

20 25 30

Asp Gly Asp Tyr Phe Ala Leu Leu Asn Gln Cys Pro His Lys Gly Ala

35 40 45

Glu Val Cys Ser Thr Gly Thr Ile Phe Gly Ile Ser His Ala Asp Lys

50 55 60

Pro Asn Glu Pro Ile Ala Tyr Glu Arg Glu Arg Ser Ile Arg Cys Pro

65 70 75 80

Trp His Gln Trp Glu Phe Asp Ile Arg Thr Gly Gln Ser Phe Tyr Asp

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Pro Lys Gly Glu Arg Ile Arg Lys Tyr Asn Val Ser Val Val Ala Gly

100 105 110

Ala Glu Val Ala Gly Asp Ser Glu Glu Gly Val Lys Asn Gly Pro Tyr

115 120 125

Val Met Glu Gly Tyr Glu Val Ser Val Glu Asp Asp Leu Val Val Val

130 135 140

Asp Thr Ser Arg Arg Arg Ala Gly Val Gly Asn Asn Met Pro Thr Ala

145 150 155 160

Asp Ala Ala Gln Thr Asp Leu Thr Val

165

<210> 5

<211> 480

<212> PRT

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 5

Met Thr Val Asn His Ser His Glu Gln Leu Asn Glu Asp Gly Leu Ala

1 5 10 15

Gln Gly Leu Asn Lys Arg His Ile Arg Met Ile Ala Ile Gly Gly Ala

20 25 30

Ile Gly Val Gly Leu Phe Leu Gly Ser Gly Lys Gly Ile Ser Tyr Ala

35 40 45

Gly Pro Ala Val Ile Gly Val Tyr Ala Val Thr Gly Val Phe Ile Phe

50 55 60

Ile Ile Met Arg Ala Leu Gly Glu Leu Leu Met Tyr Arg Pro Val Thr

65 70 75 80

Gly Ser Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Glu Phe Leu Gly Pro Phe Val Gly

85 90 95

Phe Val Thr Gly Trp Gly Tyr Trp Phe Thr Trp Thr Ile Ile Gly Met

100 105 110

Ala Glu Ile Thr Ala Ala Gly Ile Phe Ala Lys Phe Trp Phe Pro Glu

115 120 125

Met Pro Gln Tyr Leu Thr Ala Leu Ile Ala Leu Ile Ala Ile Val Ile

130 135 140

Leu Asn Leu Ala Lys Val Gly Phe Phe Gly Glu Ala Glu Phe Trp Phe

145 150 155 160

Ala Ser Ile Lys Val Ile Ala Ile Val Ser Leu Ile Gly Ser Gly Ile

165 170 175

Phe Met Leu Val Phe Arg Val Gly Ser Ala Gly Lys Glu Gly Ser Ile

180 185 190

Thr Asn Leu Trp Asp His Gly Gly Met Ala Pro His Gly Leu Leu Ala

195 200 205

Val Leu Leu Ala Phe Gln Ile Val Val Phe Ser Tyr Gln Gly Val Glu

210 215 220

Leu Ile Gly Met Thr Ala Ala Glu Ala Lys Asp Arg Glu Asn Val Leu

225 230 235 240

Pro Lys Ala Ile Asn Ser Ile Pro Trp Arg Ile Gly Val Phe Tyr Val

245 250 255

Gly Thr Leu Ile Val Leu Leu Ser Leu Phe Pro Trp Thr Gln Phe Gly

260 265 270

Pro Thr Glu Ser Pro Phe Val Lys Gly Phe Thr Gln Ile Gly Leu Pro

275 280 285

Ala Ala Ala Ser Ile Met Asn Phe Val Val Leu Ala Ser Ala Leu Ser

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Ala Ser Asp Gly Leu Ala Pro Lys Arg Phe Glu Lys Thr Asn Arg Gly

325 330 335

His Val Pro Ala Ala Ala Ile Ile Ala Ser Gly Ala Leu Met Leu Val

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Gly Val Ala Ile Asn Ala Val Val Pro Glu Lys Ala Phe Ser Tyr Ile

355 360 365

Ser Ser Val Ala Thr Leu Gly Ala Ile Trp Ser Trp Gly Val Ile Leu

370 375 380

Val Cys His Leu Arg Tyr Arg Arg Arg Val Glu Gln Gly Glu Val Thr

385 390 395 400

Glu Ser Ser Phe Lys Leu Pro Tyr Ala Lys Pro Leu Cys Trp Ser Thr

405 410 415

Leu Ala Phe Leu Gly Gly Val Leu Val Leu Leu Ala Phe Asp Glu Ser

420 425 430

Gln Arg Ile Ala Leu Tyr Ala Leu Pro Val Trp Ala Val Leu Phe Ala

435 440 445

Gly Gly Tyr Tyr Phe Ser Ser Arg Ser Asn Arg Ser Gly Asn Gln Ala

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Asp Asp Arg Ala Pro Arg Asp Asp Gln Pro Val Leu Gln Pro Arg Ile

465 470 475 480

<210> 6

<211> 1137

<212> DNA

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 6

atgaccatca tcgaacacgg tagcctcggt acgctgccgg cgccgagcgt gacgactggc 60

attgttgatg ccgacatcca cccggttccc caagacggtg cactggaacc gtacctggat 120

gatcgttgga agaagcacat ccgtgagtat ggtgtgcgga ccaccaccgg tttgcagttc 180

atcagtgagt acccgcagat gtacggcggc gccatgcgag ctgatgcatg gcctgagtcc 240

ggttaccctg gctcggaccg agagcttctc cggacccagc tgctggacaa gcacaacatc 300

cagctgggag ttctccagtg cctcgccccg ggaggccaga ccctgaaccc cgccggccag 360

gccctgaacc aggaacttgc ggcggcactg tgcagggcaa caaatgattg gcagctcgag 420

cacctcgtgt acccggaccc ccggatgcga gcggcaattc cggtcacgtt cgagacgccc 480

gactacgctg ttgctgagat cgagcgggtt ggagcggacc cgggcgtggt cgccgtactg 540

ggtacgagca agacgctcga accgctgggc agcaggaagt actggccgat ctacgaagcc 600

tcagtcgcgc agaacctgcc gattcagttc cacctgtccc agggaggtgg acacgccaac 660

acgggaactg ggtggacgtc ctaccacacg gaataccaca caggtcacgt tcagagcttc 720

cagtcgcagc tactgagcct ggtcctgtcg ggaacgttcg accgattccc cacgctcaag 780

gtgatgttcg tcgaaggaaa cgtcgctcat ttcgctccgc tcattcagcg aatggactac 840

acgtgggaga cgctccgagg tgagctgccc gaccttcagc ggaagccttc cgagtacatt 900

cgcgatcaca tctgggcatc gacgcagccg atcgatgagc cggagaagcc ggaacacctc 960

gccgagctcc tcgaggaatt ctgcggcgac aacgtcgtct tcgcaaccga ctacccgcat 1020

ttcgacttcg acgacccgga aaccgcattc ccgcgtagct tccccgtgga cctgcgggac 1080

aagattctcc gcggaaacgg tatgaggttc ttcggcgtta cgaatcaggc ggactaa 1137

<210> 7

<211> 1122

<212> DNA

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 7

atggttgcac caacctcgaa ccccggagtg cctgacgaac tggacggcgt ccccgccgtt 60

gtggactgcg acgtgcatgc cgtcctcccg tcgccccact cactgattcc gtatctcgat 120

gagtactggg ctgatcagct cgttgcacag ctcgcaccga cgtacgagcc gaactaccac 180

ccccgtggct cagcgattgc gcagcactcg gacgcgtcgg tcgatgagaa cggacgcgcg 240

gcgacgacgg ccgaaaatct ggtcaaagat gtattcgccg acggatttac tgatttcgcc 300

gttgttaact gcctctatgg cgtgcagcag attcatcagc ctcgacgcga gatggctcat 360

gcgcgcgctc tcaaccactg gatcgcgaac gagtggctcg acaaagacga ccggcttcgt 420

gcctcgattg tcgttcccca gggatcgccc cgtgctgcgg ccgaggaaat cgacttctgg 480

tccggcgata aacgattcgt ccaggttctc ctgctcgggc agtccgagct gctgtatggg 540

cgcgaaatca actggccgat ctgggaagcg gcggaggccg ccgggttgcc tgtcaccctt 600

cacatcggag gtgtctttcg gcaagccccg acgtcggttg gttggcctgc atcgcacctg 660

gagtggtatg tcggtcagca gtcgaacatc gaggcgcagc tgaactccat catctctgag 720

ggaatcctcc agaagtttcc gaagactaag attctgctca gcgaactcgg attcaactgg 780

cttcccccgt ttatgtggaa gttcgacaag ctatggaaga gctaccgccc ggacatcccc 840

tgggtacagg aatcaccgtt ggagctcatt cgggaacacg tccgggtgac gacgagccca 900

tcggatggcg ccgaggaagc gggacgactc gattcgatcg tggacaggtt ggggtcggac 960

cggatgctcg tgtactcgag cgactatccc cacaaacacc actccggacc ccgcgacatc 1020

gagaacggaa cgcacagtcc ggaacttcta gaccgcatct atcgacgtaa tgcattcgac 1080

ctctacaacc tcgttgtccc gagcccagga aaggttggtt aa 1122

<210> 8

<211> 969

<212> DNA

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 8

atgaccaatt cagatagttc ggacgccgtc gccgaggttg atgtgatcat cgatggaatc 60

accaacgagg cagatggaat tatttctctc acctttgcct cgttgaccgg agacaagatg 120

ccgcggtggg aacccggagc tcacatcgac gtgctattgg gccccgaact ggaacgacag 180

tactctctgt gtggtgatgt gaacgatgag cgcacgctac gcgtcgctgt tctgcgcgaa 240

ccggatagcc gaggcggctc tcagtgggtt cacgagcgcc tgagcgtcgg agacaagatc 300

cgtatcagag gaccacgcaa ccattttcgt ctggttgagg cccaagagta tctcttcatc 360

gccggcggaa tcggtatcac gccaatactg ccgatgatcg ctgactgcga ggcaagaggc 420

agccggtggt cgctcgtcta cggcggccga agtaccgatt ccatggcgtt caccacccaa 480

ctcgcaaagc atcaggaccg tgtcagattt tggccccagg acgagaacgg ccatatcgat 540

atccggggat ttctgggaga tcccagaccg ggaaccgcga tctactgttg cgggccagga 600

ccactcctcg atgcggtcga ggatgtgtgt agccaatggc caacggatgc actacatctc 660

gaacgattcc gtcccagagc gggcgcgatg gaaggcccgg agagtccgtt cgaggtcgaa 720

ctcgagcagt cgaatatggt ggtgactgtt gccgtcggtc agacgatcgt ggatgcatgc 780

aaatctgcgg gggtgcacat tccaacatct tgcggcgaag gtacctgtgg gacgtgtgaa 840

acggtcgtgt tagaaggtgt tcccgaacac cgggattcct accttacggc gcaagaaagg 900

gaatccaatg aggtagtcat gccgtgctgc tcgcgatcgc gaacgagtcg gctcgtcctc 960

gatctctag 969

<210> 9

<211> 510

<212> DNA

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 9

atgtccaagt ttgtaatcgg tagcgtaaac gacattccac caggatcccg gaagatcgta 60

accctcgatg gacggtccgt gggaatcttc aacctcgatg gtgactactt cgcgctcctc 120

aatcagtgtc cgcacaaggg cgcggaagtg tgctcgaccg gaaccatctt cggtatctcg 180

cacgcggaca agccaaatga gccgatcgcc tacgagcgag agcggtccat ccgttgtccc 240

tggcaccagt gggaattcga catccgtacg ggccagtcat tctatgaccc gaagggcgag 300

cggatccgca agtacaacgt gtcggttgtc gcgggcgccg aggtggccgg tgattccgaa 360

gaaggcgtga agaacggtcc gtatgtcatg gagggctacg aggtgtcggt cgaggatgac 420

ctggttgtcg tcgacacgag ccgacggcgc gcaggcgtgg gcaacaacat gcccaccgct 480

gatgccgcgc aaacggacct gacggtctga 510

<210> 10

<211> 1443

<212> DNA

<213> 罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)

<400> 10

atgacagtga atcattccca cgagcagttg aatgaggatg gcctagcgca gggccttaac 60

aagcgacata tccggatgat cgcgatcggc ggtgctatcg gtgtaggact tttcctcgga 120

tccggaaagg gaatctccta tgcgggcccc gcggtgatcg gtgtctacgc ggttaccgga 180

gtgttcattt tcatcatcat gagggctctc ggcgagctcc tgatgtaccg cccagtgacg 240

ggaagttttg ccgagtatgc gcgagaattt ctggggccat tcgtcgggtt cgtaaccggc 300

tggggatatt ggtttacctg gacaatcatt ggcatggcgg agatcaccgc agctgggatt 360

tttgccaaat tctggtttcc tgaaatgccg cagtacctca ctgcgctgat cgcgctgatt 420

gcgatcgtta tccttaatct ggctaaagtc ggcttcttcg gagaagccga gttctggttt 480

gcctcgatta aagtgattgc gatcgtgtct ctgatcggca gcggaatatt catgctcgta 540

ttccgggttg ggtcggccgg caaggaaggc agcattacga atctctggga tcacggtggc 600

atggcaccgc acggcctcct cgctgtgttg ttggctttcc agattgtggt cttctcgtac 660

cagggcgtcg agctgattgg catgactgca gcagaagcca aggaccggga gaacgttctc 720

ccgaaggcga tcaactctat cccgtggcga attggtgtct tctacgtcgg gactctgatc 780

gtgttgctct cgctttttcc ctggacccaa tttggaccca ctgaaagccc gttcgtgaag 840

ggattcacac agatcgggtt gccggctgcc gcgagtatca tgaacttcgt cgtcctggcc 900

tcggcgcttt cgtcctgcag cgccggcctc tacagcaacg gacggcttct caagaagttg 960

gcctccgatg gtctcgcgcc gaagcgattt gagaagacca atcgcgggca cgttcccgcg 1020

gccgccatca tcgcttcggg cgcgctgatg ctggttggtg tcgcaatcaa tgcagttgtt 1080

ccggagaagg cgttctcata catttcctcc gtcgccaccc tgggcgcaat ctggagttgg 1140

ggagtaattc tggtgtgcca cctccgctat cgacggcgcg tcgaacaagg cgaagtcacc 1200

gaaagctcct tcaagcttcc atacgccaag ccgctttgct ggagcaccct cgccttcctc 1260

ggcggtgtcc ttgtgctcct tgccttcgac gaaagccagc gcatcgccct ttacgccttg 1320

ccggtatggg cagtactttt cgccggcggc tactactttt cgtcgcggag taaccggtcc 1380

ggcaatcagg ctgatgatcg cgctccacga gatgaccagc ctgttctgca gcccagaatc 1440

tga 1443

<210> 11

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 11

tgtttaactt taagaaggag atataccatg gttgcaccaa cctcgaa 47

<210> 12

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 12

tggtgatggt gatgctcgag agatctacta gagatcgagg acgagcc 47

<210> 13

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 13

tgtttaactt taagaaggag atataccatg accatcatcg aacacgg 47

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 14

cgctaccgat tacaaacttg gacattctta accaaccttt cctgggc 47

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 15

cccgagccca ggaaaggttg gttaagaatg tccaagtttg taatcgg 47

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 16

gaattcatta aagaggagaa attaaccatg gttgcaccaa cctcgaa 47

<210> 17

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 17

caacaggagt ccaagctcag ctaattacta gagatcgagg acgagcc 47

<210> 18

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 18

gtttaacttt aagaaggaga tatacatatg acagtgaatc attccca 47

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 19

tggtgatggt gatgctcgag agatctatca gattctgggc tgcagaa 47

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 20

tcgcatcacc atcaccatca cggatccatg gttgcaccaa cctcgaa 47

<210> 21

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 21

caacaggagt ccaagctcag ctaattatta gtccgcctga ttcgtaa 47

<210> 22

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 22

tcgcatcacc atcaccatca cggatccatg accaattcag atagttc 47

<210> 23

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物序列

<400> 23

caacaggagt ccaagctcag ctaattacta gagatcgagg acgagcc 47

PCT/RO/134表

Claims

1.一种单加氧酶，其由2种异源的亚基构成。

2.根据权利要求1所述的单加氧酶，其催化将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为β-羟基氨基酸的反应。

3.根据权利要求2所述的单加氧酶，其中，

所述α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸为下式(1)所示的化合物，

式(1)

式中，R¹及R²各自独立地为氢或CH₃，

所述β-羟基氨基酸为下式(2)所示的化合物，

式(2)

式中，R³及R⁴各自独立地为氢或CH₃。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的单加氧酶，其催化下式(3)～(7)所示的反应中的至少一种以上反应，所述反应为将α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸转化为β-羟基氨基酸的反应：

式(3)

式(4)

式(5)

式(6)

式(7)

5.根据权利要求1～4中任一项所述的单加氧酶，其中，将所述2种异源的亚基分别设为α亚基、β亚基时，

α亚基包含选自以下(a)～(d)中的任意蛋白质，

β亚基包含选自以下(e)～(h)中的任意蛋白质：

(a)由序列号1中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(d)由序列号6中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(e)由序列号2中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(h)由序列号7中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

6.一种用于制造β-羟基氨基酸的单加氧酶反应体系，其包含权利要求1～5中任一项所述的单加氧酶、和电子传递体系蛋白质。

7.根据权利要求6所述的单加氧酶反应体系，其中，

(i)由序列号3中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(l)由序列号8中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(m)由序列号4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(p)由序列号9中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

8.一种单加氧酶基因，其编码权利要求1～5中任一项所述的蛋白质。

9.一种重组载体，其包含权利要求8所述的基因。

10.一种转化体，其包含权利要求8所述的基因或权利要求9所述的重组载体。

11.根据权利要求10所述的转化体，其进一步包含以下所示的基因：

(1)编码电子传递体系蛋白质的基因、和/或

(2)编码转运蛋白的基因。

12.根据权利要求11所述的转化体，其中，

(i)由序列号3中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(l)由序列号8中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质；

(m)由序列号4中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(p)由序列号9中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

13.根据权利要求11或12所述的转化体，其中，所述转运蛋白为选自以下(q)～(t)中的任意蛋白质：

(q)由序列号5中记载的氨基酸序列构成的蛋白质；

(t)由序列号10中记载的碱基序列构成的基因编码的蛋白质。

14.根据权利要求10～13中任一项所述的转化体，其中，所述转化体为红球菌(Rhodococcus)属细菌。

15.一种β-羟基氨基酸的制造方法，该方法包括：

在包含α-氨基酸或α,α-二取代氨基酸的培养基中对权利要求10～14中任一项所述的转化体进行培养的工序。

16.根据权利要求15所述的制造方法，其中，所述转化体中含有的权利要求8所述的基因来自红球菌(Rhodococcus)属。

17.罗克劳红球菌(Rhodococcus wratislaviensis)C31-06株(保藏编号：NITE BP-02370)。