KR100626157B1

KR100626157B1 - Ｇｓｔ-ａｌｓ 융합 단백질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR100626157B1
Application number: KR1020040044539A
Authority: KR
Inventors: 이철영; 이동희; 김상훈
Original assignee: 진주산업대학교 산학협력단
Priority date: 2004-06-16
Filing date: 2004-06-16
Publication date: 2006-09-20
Also published as: KR20050119441A

Abstract

본 발명은 GST-ALS 융합 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 (1) ALS 코딩 DNA 서열을 제조하는 단계, (2) 상기 DNA 서열을 GST(Glutathione-S-Transferase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (3) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (4) 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계 및 (5) 이의 배양물로부터 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 GST-ALS 융합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

아울러, 상기 제조방법으로 제조된 GST-ALS 융합 단백질을 절단하여 ALS 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 ALS 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

ALS, GST(Glutathione-S-Transferase), GST-ALS 융합 단백질

Description

ＧＳＴ-ＡＬＳ 융합 단백질 및 이의 제조방법{GST-ALS Fusion Protein and Method for Preparation Thereof}

도 1은 ALS 코딩 DNA　서열을 포함하는 pGEX-2T 재조합 발현 벡터를 제한 효소로 처리한 다음 전기영동한 결과를 나타낸 것이다(레인1-7: 콜로니, M: DNA 마커).

도 2는 본 발명에 따른 형질전환체에서 발현된 GST-ALS 융합 단백질을 GST-풀 다운 에세이(GST-pull down assay) 방법으로 침전하고 SDS-PAGE를 수행한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 상기 SDS-PAGE 겔로부터 전기 용출기(electro-eluter)를 이용해서 용출한 GST-ALS 융합 단백질에 대하여 다시 SDS-PAGE를 수행하고 이의 결과를 나타낸 것이다(M: 단백질 마커).

도 4는 본 발명에 따른 GST-ALS 융합 단백질을 절단하여 수득한 ALS에 대한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다(레인 1-5: GST-ALS 융합 단백질을 절단하여 수득한 ALS 및 GST).

도 5는 본 발명에서 제조된 pF_ASTB_ACHTb-ALS를 다양한 제한 효소로 처리한 다음, 전기영동한 결과를 나타낸 것이다(레인 1-3:EcoRI, 레인 4-5:XhoI, 레인 6:ALS 코딩 서열, 레인 7:선형화된 pF_ASTB_ACHTb 벡터).

도 6은 본 발명에서 제조된 재조합 벡터 DNA를 PCR한 다음 PCR 산물을 전기영동한 결과를 나타낸 것이다(B: 블루 콜로니, W: 화이트 콜로니).

도 7은 본 발명에 따른 형질감염체에서 발현된 재조합 GST-ALS 융합 단백질의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다(M: 단백질 마커, 레인 1-4: 3x샘플 완충용액, 레인 5-8: 2x샘플 완충용액, C: 대조군, S: Sf900II 배지, T1 및 T2: TNM-FH 배지).

도 8은 본 발명에 따른 형질감염체에서 발현된 재조합 GST-ALS 융합 단백질의 웨스턴 블로팅 결과를 나타낸 것이다(C: 대조군, 4차 바이러스 스톡의 용량별로 S1:0.1㎖, S2:0.25㎖, S3:0.5㎖).

도 9는 본 발명에 따른 형질감염체 배양물을 Ni-NTA 컬럼을 통하여 용출하면서 각 분획별로 GST-ALS 융합 단백질에 대한 쿠마시 스테이닝(Coomassie staining) 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 GST-ALS 융합 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로 보다 자세하게는 (1) ALS 코딩 DNA 서열을 제조하는 단계, (2) 상기 DNA 서열을 GST(Glutathione-S-Transferase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (3) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (4) 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계 및 (5) 이의 배양물로부터 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 GST-ALS 융합 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

동물의 성장은 다수의 호르몬 작용에 의하여 제어된다 (Etherton, T.D. et al. J. Anim. Sci. 1984, vol.59, p.511). 성장 제어 호르몬 중 성장 호르몬(Growth Hormone; GH)이 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 사실상 GH의 성장 촉진 효과는 대부분 GH의 자극에 의해 간을 비롯한 많은 조직에서 발현 분비되는 7.5kDa 인슐린 유사 성장 인자-I(Insulin-like Growth Factor-I; IGF-I)에 의하여 매개된다(Jones, J.I. et al. Endocr. Rev. 1995, vol.16, p.3). IGF는 모든 체액 중 혈액 중에 가장 많은 양이 존재하고, 혈중 2/3 이상의 IGF는 40~45kDa의 IGF-결합 단백질-3(IGF-binding protein-3; IGFBP-3)과 제2의 IGFBP 역할을 하는 ~85kDa의 산 분해성 서브유니트(acid-labile subunit; ALS)에 결합되어 ~150kDa 삼원 복합체(ternary complex) 형태로 저장 · 운반된다.

생리학적으로 ALS는 IGFBP-3과 함께 혈중 대부분의 IGF를 혈관 내에 국한시킨 다음 서서히 IGF 리간드를 방출시켜 IGF가 지속적으로 말초 조직에 공급되게 함으로써 유리 IGF 또는 40~50kDa IGF:IGFBP 이원 복합체(binary complex)의 과다한 포도당 흡수 촉진 작용에 의해 야기될 수 있는 저혈당의 위험으로부터 생체를 보호해주고, IGF의 혈장 반감기(plasma half-life)를 높여 IGF의 생물학적 이용능(bioavailability)을 극대화하는 기능이 있다. ALS의 이와 같은 기능은 비-섬세포(non-islet cell) 암환자 중에는 미지의 원인에 의해 혈중 150kDa 삼원 IGF 복합체의 형성이 저해된 결과로 생명을 위협하는 저혈당증(hypoglycemia)이 관찰되었다(Zarf J. Intern. Med. 1993, vol.234, p.543). 또한, 상동성 재조합 기술에 의해 ALS 유전자가 파괴된 마우스는 IGF-I의 혈장 반감기(plasma half-life)가 짧아져 혈중 IGF-I 농도가 감소하고 성장률도 저하되는 것이 확인되었다(Ueki, I. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2000, vol.97, p.6868). 이 같은 보고는 ALS가 동물의 성장에 있어서 매우 중요한 역할을 한다는 사실을 시사한다.

이상과 같이 ALS는 생체 내에서 상당히 중요한 기능을 갖고 있음에도 불구하고 혈중에서 주로 삼원 복합체 형태로 존재할 뿐만 아니라 이들 분자간 인력이 강하기 때문에 유리형 ALS를 얻는데 어려움이 있었다. 이로 인하여 당업계에는 ALS의 분자 및 생리학적 특성에 대해서 알려진 바가 거의 없다.

이에 본 발명자들은 순수한 형태의 ALS 단백질을 제조하기 위하여 유전자 재조합 기술을 이용하였다. 특히, 배양물로부터 단백질을 분리하는데 있어서, 용이하고 수율을 높이기 위하여 ALS를 GST와 융합된 형태로 제조하고 GST-ALS 융합 단백질을 글루타치온 친화 크로마토그래피를 이용하여 분리함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명은 한 관점으로서 ALS의 N-말단에 GST의 C-말단이 결합되어 형성된 GST-ALS 융합 단백질을 제공한다.

다른 관점으로서 (1) ALS 코딩 DNA 서열을 제조하는 단계, (2) 상기 DNA 서열을 GST(Glutathione-S-Transferase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (3) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (4) 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계 및 (5) 이의 배양물로부터 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 GST-ALS 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.

또 다른 관점으로서, 상기 제조방법으로 제조된 GST-ALS 융합 단백질을 절단하여 ALS 단백질을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 ALS 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 ALS의 N-말단에 GST의 C-말단이 결합되어 형성된 GST-ALS 융합 단백질을 제공한다. 본 발명에 따른 융합 단백질에 있어서, GST와 ALS 사이에는 His 태그[Tag: 7개의 히스티딘(His) 아미노산으로 이루어진 펩타이드의 코딩 서열] 및/또는 단백질 분해효소 인식위치(protease cleavage site)가 배열되는 것이 바람직하다.

"GST(Glutathione-S-Transferase)"는 생체 내에서 다양한 유해독성 물질의 해독작용에 관여하는 효소로서 지질, 빌리루빈(bilirubin), 헴, 스테로이드 및 담즙염류 등 여러 소수성 및 양극성(amphipathic) 물질의 운반에 관여한다. 또한, 각종 암세포 또는 약제내성세포 등에서 발견되고, 화학요법에서 표적분자 또는 종 양 마커(cancer marker) 분자로도 알려져 있으며, 질병의 진단에 이용되고 있다.

본 발명에서 GST는 목적 단백질(즉, ALS)의 분리 및 정제를 용이하게 하기 위한 수단으로서 이용된다. "GST"는 유전 공학 기술을 이용하여 단백질을 발현할 때 일반적으로 사용되는 융합 파트너이다. GST는 융합 단백질의 생산량 및 용해성(solubility)을 증가시키기도 하며, 고정화(immobilized) 글루타치온(예를 들면, 글루타치온 친화 크로마토그래피) 또는 상업적으로 가용한 GST 항체를 이용하여 정제 및 검출이 용이해지는 장점을 갖고 있다. 또한 트랜스퍼라제 활성을 측정함으로써 GST 융합 단백질의 정량도 가능하다.

한편, 본 발명에 따른 GST-ALS 융합 단백질은 (1) ALS 코딩 DNA 서열을 제조하는 단계, (2) 상기 DNA 서열을 GST(Glutathione-S-Transferase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (3) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (4) 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계 및 (5) 이의 배양물로부터 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 거쳐 제조할 수 있다.

상기 제조방법에 있어서, ALS 코딩 DNA 서열은 화학적 합성법, RT-PCR 등 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조할 수 있으나, 본 발명에서는 돼지의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 ALS 유전자를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR을 통하여 제조하는 것이 바람직하다. 상기 ALS 유전자 증폭용 프라이머는 예를 들면, 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해, 나랭(Narang) 등의 포스포트리에스테르 방법, 보카지(Beaucage) 등의 디에틸포스포라미다이트 방법 및 미국 특허 제4,458,066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 다양한 방법으로 제조할 수 있다.

이렇게 수득한 ALS 코딩 DNA 서열로부터 GST와 융합된 형태의 ALS 단백질을 제조하기 위해서는 GST 코딩 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 당업계에 일반적으로 사용되는 GST 유전자를 포함하는 발현 벡터라면 모두 제한 없이 사용할 수 있다. 한 양태로서 대장균이 숙주 세포로 이용되는 경우에는 pGEX 벡터(예, pGEX-2T, Amersham) 또는 pET 벡터(Novagen)가 이용될 수 있다. 다른 양태로서 진핵 숙주 세포가 이용되는 경우에는 pESP 벡터(Stratagen)를 이용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 GST-ALS 융합 단백질의 코딩 DNA 서열을 발현시키는 데에는 매우 다양한 단핵세포성 숙주세포가 이용될 수 있다. 이들 숙주에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다. 바람직한 숙주 생명체로는 이. 콜라이 및 곤충 세포가 포함된다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터는 Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, 1986과 같은 기본적인 실험 지침서에 기술된 방법에 의해 상기 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 이를 위한 바람직한 방법은 예를 들어, 칼슘 포 스페이트 형질전환(calcium phosphate transfection), DEAE-덱스트란 매개 형질전환(DEAE-dextran mediated transfection), 이환(transvection), 미세주입(microinjection), 양이온 지질-매개 형질전환(cationic lipid-mediated transfection), 전기천공(electroporation), 형질도입(transduction), 스크래프 로딩(scrape loading), 총알식 도입(ballistic introduction) 및 감염(infection) 등을 포함한다.

본 발명에 따라 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포들은 공지된 기술을 이용하여 융합 단백질의 생산에 적합한 영양 배지에서 배양된다. 예를 들어서, 세포들은 적당한 배지와 폴리펩타이드가 발현 및/또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효, 쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지된 기술을 사용해서 탄소, 질소 공급원 및 무기염을 포함하는 적절한 영양배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적인 공급자로부터 입수하거나 예를 들면, American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다. 융합 단백질이 배지로 직접 분비된다면 배지로부터 직접 분리할 수 있으며, 분비되지 않는다면 세포의 여액(lysate)으로부터 분리할 수 있다.

본 발명에 따라 발현된 융합 단백질(즉, GST-ALS 융합 단백질)은 GST를 함유하고 있기 때문에 용이하게 분리 및 정제할 수 있다. 이때 사용될 수 있는 분리 및 정제 방법으로는 상기 GST와 특이적으로 결합할 수 있는 물질(예, GST에 대한 항체)을 이용한 친화 크로마토그래피가 포함되며, 글루타치온 친화 크로마토그래피 를 이용하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에서 회수한 배양물을 글루타치온 친화 레진이 충진된 컬럼에 넣어서 상기 글루타치온 친화 레진에 GST-ALS 융합 단백질이 흡착되도록 한다. 세척용 완충용액(예를 들면, 200mM 염화 칼륨이 함유된 20mM 인산칼륨 완충용액)으로 수차례 세척하여 컬럼 내에 잔류하는 불순물들을 제거한 후 용출용 완충용액(예를 들면, 10mM GSH가 포함된 50mM 트리스/염산 완충용액)을 컬럼 내에 통과시켜 줌으로써 앞서 레진에 흡착된 GST-ALS 융합 단백질을 용출한다. 상기 용출액을 투석 및/또는 SDS-PAGE 전기영동하여 추가로 GST-ALS를 정제할 수도 있다.

이렇게 제조된 GST-ALS 융합 단백질은 그 자체로 이용될 수 있고, 경우에 따라 GST를 절단하여 ALS 단백질만을 분리하여 이용할 수도 있다. ALS와 GST의 절단에는 다양한 단백질 분해효소(protease)들이 이용될 수 있으며 상기 GST 코딩 서열을 포함하는 벡터에 따라 달라진다. 통상적으로 트롬빈(thrombin), 인자 Xa(Factor Xa) 및 엔테로키나제(Enterokinase) 등이 이용되지만 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 한 양태로서 대장균을 숙주 세포로 이용하여 GST-ALS 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 돼지의 게놈 DNA를 주형으로 하고 ALS 유전자를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR 방법을 통하여 ALS 코딩 DNA 서열을 제조하고, 상기 ALS 코딩 DNA 서열을 pGEX-2T 발현 벡터의 조절 서열에 작동 가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하고, 상기 제조된 재조합 발현 벡터로 대장균 숙주 세포를 형질전환시키며, 형성된 형질전환체를 IPTG로 유도하고 배양한 다음 이의 배양물로부터 글루타치온 친화 크로마토그래피를 이용하여 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 통하여 GST-ALS 융합 단백질을 제조할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로서 곤충 세포를 숙주 세포로 이용하여 GST-ALS 융합 단백질을 제조하는 방법을 제공한다. 돼지의 게놈 DNA를 주형으로 하고 ALS를 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR 방법을 통하여 ALS 코딩 DNA 서열을 제조하고, 트랜스퍼 벡터(pF_ASTB_ACHTb 벡터)에 삽입한 다음 상기 트랜스퍼 벡터를 이미 박스미드(bacmid)를 포함하고 있는 DH10_Bac 컴페턴트 세포(competent cell) 내로 형질전환하여 ALS 코딩 DNA 서열이 상기 박스미드 내부로 통합되도록 하여 재조합 박스미드를 제조한 후, 이렇게 형성된 재조합 박스미드로 곤충 세포를 형질감염하고 상기 형질감염체를 배양한 다음 이의 배양물로부터 글루타치온 친화 크로마토그래피(glutathione affinity chromatography)를 이용하여 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 회수하는 단계를 통하여 GST-ALS 융합 단백질을 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것을 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예 1>

원핵 숙주세포에서의 GST-ALS 융합 단백질의 제조

A. ALS의 코딩 서열 및 이를 포함하는 재조합 발현 벡터의 제조

돼지의 게놈 DNA를 주형으로 하고 ALS를 증폭할 수 있는 하기 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 이용하는 PCR을 통하여 전장(full-length) ALS 코딩 서열을 제조하였다.

5'프라이머: 5'-CGC-GGA-TCC-ATG-ACG-GAG-CCC-GGG-GCG-CCA-TCG-3'

(서열번호: 1)

3'프라이머: 5`-CGC-GGA-TCC-TCA-CAG-GTC-CAG-GCC-AGA-CAC-AGC-3'

(서열번호: 2)

상기 PCR로부터 수득한 산물을 Bam HI으로 처리하여 소화시킨 후 pGEX-2T 발현 벡터의 Bam HI 인식 부위에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하였으며, 상기 재조합 발현 벡터를 Bam HI으로 처리하고 아가로스 겔에서 전기 영동하여 목적한 ALS(약 1700bp)가 벡터에 삽입되었음을 확인하였다(도 1).

B. GST-ALS 융합 단백질의 발현 및 이의 확인

상기 pGEX-2T 발현 벡터를 BL21(DE3)E. Coli에 형질전환시킨 후 IPTG로 유도(induction)하고 발현 정도를 확인하였다.

접종(innoculation) 과정을 통해 얻어진 재조합 ALS를 보유한 E.Coli. 현탁액 200㎖을 LB 브로스 2ℓ에 넣고 37℃ 쉐이킹 배양기에서 3시간 동안 배양한 후 1㎖을 취해 13,000rpm에서 2분간 스핀 다운(spin down)하여 얻어진 펠리트(pellet)를 -80℃ 에 보관하였다(IPTG -). 한편, 0.5M IPTG 1600㎕를 넣고 3시간 동안 배양한 후 1㎖을 취해 13,000rpm에서 2분간 스핀 다운(spin down)하여 얻은 펠리트를 -80℃에 보관하고(IPTG +), 나머지는 4,000rpm에서 10분간 스핀 다운(spin down)하여 펠리트를 취하였다.

상기 과정에서 수집한 펠리트에 10ㅧ PBS를 넣어 현탁시킨 다음 초음파처리기(Ultra sonicatior)를 이용하여 음파처리(sonication)하고 트리톤-X100을 첨가하여 교반기(rotater)에서 30분간 배양하고, 4,000rpm에서 10분간 스핀 다운(spin down)한 뒤 상층액만을 취하였다.

이와 같이 수집된 E. Coli 여액(lysate)의 상층액을 바이오-래드 프로테인 에세이 키트(Bio-Rad Protein assay kit)를 이용하여 단백질 농도를 측정한 다음 글루타치온-세파로스 비드(glutathione-Sepharose bead)에 단백질 추출물을 넣어준 후 30분간 교반기에서 배양시켰다. 이들 GSH-비드 샘플을 4,500rpm에서 5분간 스핀 다운시켜 펠레트를 취한 뒤 10ㅧ PBS로 세척하고 단백질용 염료와 10ㅧ PBS를 넣고 끓인 다음 SDS-PAGE로 확인하였다(도 2).

C. GST-ALS 융합 단백질 분리 및 정제

폴리아크릴아미드 젤(Polyacrylamide gel)상의 레인 중에서 단백질 마커와 IPTG -, + 그리고 GSH-비드 샘플 중 한 레인만을 절단하여 쿠마시 블루(Coomassie blue)로 염색하고 나머지 샘플들의 젤 부위는 랩으로 감싼 후 냉장 보관하였다. 염색을 통해 GSH-비드에 콘쥬게이트된 ALS-GST 유합 단백질의 크기를 확인한 다음 앞서 염색시키지 않고 냉장 보관 중인 나머지 부분의 젤과 잘 맞추어 원하는 사이즈(92 kDa)의 밴드 부위만을 젤에서 절단하였다. 이들 샘플들을 전기 용출기(electro-eluter)(Biorad Model 422)를 이용하여 약 5시간 동안 용출시켰다. 이렇게 용출된 ALS-GST 융합 단백질을 다시 SDS-PAGE시킨 후 쿠마시 블루 염색 방법으로 확인하였다(도 3).

앞서 SDS-PAGE와 전기 용출기로 2차 정제된 융합단백질을 Factor Xa로 처리하여 ALS-GST 융합단백질을 절단하고 다시 SDS-PAGE 및 전기 용출기를 이용하여 ALS 단백질만을 정제하였다(도 4).

<실시예 2>

진핵 숙주세포에서의 GST-ALS 융합 단백질의 제조

전술한 실시예 1에서 이용된 ALS 코딩 서열을 Eco RI으로 잘라내어 pF_ASTB_ACHTb(트랜스퍼 벡터)에 삽입하였다. 이렇게 생성된 "pF_ASTB _ACHTb-ALS 벡터"에 ALS 코딩 서열이 올바른 방향으로(orientation) 삽입되었는지 확인하기 위하여 ALS 코딩 서열 및 상기 트랜스퍼 벡터(transfer vector) 내부에 Xho I 인식 부위가 있기 때문에 Xho I으로 처리한 다음 아가로스 겔에서 전기 영동하였다. 그 결과, Eco RI으로 처리하였을 때는 pF_ASTB_ACHTb 벡터(4.9kb)와 ALS(1.8kb)의 두 밴드가 나타났고, Xho I으로 처리하였을 때는 방향이 정확하여 약 6kb 와 650bp의 두 밴드가 나타났다(도 5).

상기 pF_ASTB_ACHTb-ALS 벡터를 DH10_Bac컴페턴트 세포(competent cell) 안으로 CaCl₂방법을 이용하여 형질전환시킨 후 항생제(Tet, Gm, Kan)와 X-gal 및 IPTG가 들어있는 루리아-아가 플레이트(Luria-agar plate)에 플레이팅(plating)하여 블루/화이트 스크리닝(blue/white screening)을 하였다.

화이트 콜로니(White colony)를 LB 브로스(Kan, Tet, Gm을 함유함)에 배양하여 Quiagen Large-Construction kit을 사용하여 재조합 박스미드(>150kb)를 추출한 다음 PCR로 재조합 박스미드 DNA가 제대로 만들어졌는지 여부를 확인하였다(도 6). 도 6에 나타낸 바와 같이 ALS 코딩 서열을 포함하지 않는 블루 콜로니들은 모두 PCR이 되지 않았으며, 화이트 콜로니만이 약 1.5kb에서 밴드가 나타났다. 이를 통해 재조합 ALS가 벡터에 제대로 통합(integration)된 것을 확인 할 수 있었다.

B. GST-ALS 융합 단백질의 발현 및 이의 확인

a. 바이러스 스톡의 제조

1.5 x 10⁶ Sf9 세포를 T25 플라스크에서 27℃에서 18시간 동안 배양하고 FBS 및 항생제가 들어있지 않은 Sf900II SFM 배지로 앞서 배양된 세포를 세정한 다음 여기에 재조합 박스미드 DNA 12㎍을 형질감염(transfection)시켜 27℃에서 5시간 동안 배양하고 FBS 및 항생제가 첨가된 Sf900II SFM으로 교환하여 27℃에서 72시간 동안 배양하고 바이러스가 들어있는 상등액을 수거하여 -80℃에 보관하였다.

상기 과정으로 수득한 바이러스 스톡(제1차 바이러스 스톡이라 함)을 새로운 Sf9 세포 배양액에 접종하여 배양한 뒤 상등액을 수거하였다. 이 과정으로 수득한 바이러스 스톡을 제2차 바이러스 스톡이라고 하였다. 제3차 및 제 4차 바이러스 스톡 각각의 제조 방법 또한 상기 과정과 동일하였다. 이 과정에서 Sf9 세포 배양 및 바이러스 스톡의 제조는 TNF-FH 곤충용 배지를 사용하였다.

상기 재조합 바이러스가 제대로 생성되었는지 확인하기 위해서 2 x 10⁶개의 Sf9 세포가 존재하는 T25 플라스크에 3차 바이러스를 0.25㎖ 감염시키고, 2일간 27℃에서 배양한 뒤 수집하였다. 이 때 혈청과 항체가 첨가되지 않은 TNM-FH 배지 또는 Sf900II SFM 곤충용 배지를 사용하였다. 배양 후 펠리트를 용해용 완충용액(lysis buffer)[50mM Tris-HCl(pH8.0), 5mM 2-mercaptoethanol, 100mM KCl, 1mM PMSF, 1% IGEPAL CA-630]으로 용해(lysis)시킨 뒤, ALS를 포함하고 있는 상등액을 취하여 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다(도 7).

도 7에 나타낸 바와 같이 두 종류의 배지(TNM-FH 배지와 Sf900II SFM 곤충용 배지)중 어떤 것을 사용하여도 단백질 발현에 영향을 주지 않는 것을 알 수 있었다. T2의 경우는 RIPA 완충용액을 사용하여 용해시킨 결과로서, RIPA 완충용액의 경우 단백질에 영향을 준 것 같으며, 3 x 샘플 완충용액을 사용한 샘플의 경우 이 완충용액이 단백질에 영향을 주어서 밴드가 나타나지 않은 것으로 사료된다.

b. 소규모 발현

ALS 단백질의 발현 규모를 증가시키기 위하여 우선 소규모로 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 4차 바이러스 스톡을 2 x 10⁶개의 Sf9 세포가 존재하는 T25 플라스크에 각각 0.1㎖, 0.25㎖, 0.5㎖의 양으로 감염시켰다. 2일 동안 배양한 후, 수집하여 용해시키고 웨스턴 블로팅을 실시하였다.

일차 항체는 1:200으로 이차 항체는 1:1000으로 희석하여 사용하였다. 5% 탈지분유를 블로킹 용액(blocking solution)으로 사용하였으며, TBS-T 완충용액으로 10분간 3번씩 세척하였다(도 8). 그 결과 4차 바이러스 스톡을 0.25㎖ 감염하였을 때 발현 정도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.

c. 대규모 발현

앞에서 최적의 ALS 발현을 위한 4차 바이러스 스톡의 양이 T25 플라스크에서 0.25㎖임을 확인하였기 때문에 대규모로 ALS 단백질을 발현시키기 위해서 6~7 x 10⁶ 개의 Sf9 세포를 T75 플라스크에 접종(seed)하였다. 18시간 후에 혈청과 항생제가 없는 10㎖의 TNM-FH 배지를 첨가하고 0.75㎖의 4차 재조합 바큘로바이러스로 감염시키고 2일 동안 27℃에서 배양시킨 후 수집하였다. 펠리트는 용해용 배지(lysis buffer)[50mM Tris-HCl(pH 8.5), 5mM 2-mercaptoethanol, 100mM KCl, 1mM PMSF, 1% IGEPAL CA-630, 10㎍/㎖ leupeptin, 10㎍/㎖ pepstatin, 10㎍/㎖ aprotinin at 4℃]로 용해한 다음, 10분 동안 12,000rpm에서 원심 분리하여 세포 잔여물(debris)을 제거하였다. Ni-NTA 레진 1㎖이 충진된 컬럼(Bio-Rad)에 위에서 얻은 시료를 부어준 다음 ALS 단백질을 정제하였다. 이때 완충용액 A[20mM Tris-HCl(pH8.5), 500mM KCl, 20mM imidazole, 5mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol, at 4℃]와 B[20mM Tris-HCl(pH8.5), 1M KCl, 5mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol at 4℃]로 세정한 다음 용출용 완충용액(elution buffer)[20mM Tris-HCl(pH8.5), 100mM KCl, 100mM imidazole, 5mM 2-mercaptoethanol, 10% glycerol at 4℃]으로 용출(elution)하여 분획(fraction)당 1.5ml씩 얻었다. 도 9는 용출된 단백질을 SDS-10% PAGE한 다음 쿠마시 블루 염색(Coomassie blue staining)시킨 결과이다. 분획 7-12에서 ALS 밴드가 검출되었다.

본 발명에 따른 GST-ALS 융합 단백질을 GST의 특성을 이용하여 단 1회의 정제과정을 통해서 고수율로 얻을 수 있다.

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(1) ALS(Acid Labile Subunit) 코딩 DNA 서열을 제조하는 단계, (2) 상기 DNA 서열을 GST(Glutathione-S-Transferase) 코딩 DNA 서열을 포함하는 벡터에 작동가능하게 연결하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계, (3) 상기 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는 단계, (4) 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하는 단계, (5) 이의 배양물로부터 목적한 GST-ALS 융합 단백질을 분리 및 정제하는 단계 및 (6) 상기 단계 (5)에서 얻은 GST-ALS 융합 단백질을 절단하여 ALS 단백질을 분리하는 단계를 포함한 ALS 단백질의 제조방법.