FI83881C

FI83881C - Foerfarande foer erhaollande av en terapeutiskt anvaendbar kolonistimulerande faktor csf.

Info

Publication number: FI83881C
Application number: FI852903A
Authority: FI
Inventors: Masayoshi Ono; Hitoshi Nomura
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-07-25
Filing date: 1985-07-25
Publication date: 1991-09-10
Also published as: JPS61227526A; DK337885A; KR920009496B1; EP0169566A1; NO852915L; NL930141I1; FI852903A0; NO168952C; AU4513185A; JPH0144200B2; FI852903L; EP0169566B2; KR860001185A; ZA855478B; NL930141I2; BG61494B2; ES545502A0; AU585518B2; DE3563444D1; FI83881B

Description

! 83881

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen pesäkkeitä stimuloivan tekijän CSF:n saamiseksi

Keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttö-5 kelpoisten pesäkkeitä stimuloivan tekijän CSF:n saamisek si, jolla on seuraavat fysikokemialliset ominaisuudet i) Molekyylipaino: 19 000 ± 1000 määritettynä natriumdodekyylisulfaat-ti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla; 10 ii) Isoelektinen piste: Vähintään yksi taulukossa 1 esitetyistä kolmesta isoelektrisestä pisteestä A, B ja C:

Taulukko 1 15

Isoelektrinen piste (pl)

Urean (4 mol/1) läs- Ilman ureaa näollessa 20 A 5,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1 B 6,0 ± 0,1 5,8 ± 0,1 C 6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,1 iii) UV-absorptio: 25 Absorptiomaksimi aallonpituudella 280 nm ja -minimi aallonpituudella 250 nm; iv) Seuraava 21 aminohapon sekvenssi N-päästä lukien: 30 (10) H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln- (Ser) -Phe- (20)

Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val-, jossa X on luonnossa 35 esiintyvä aminohappo. Pesäkkeitä stimuloivalla tekijällä (tästedes käytetään lyhennettä CSF) on kyky edistää luu-ydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä. Tarkemmin 2 83881

Ilmaistuna uudella CSF:llä on kyky edistää ihmisen luu-ydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä neutrofiileik-si (tästä nimenomaisesta CSF:stä voidaan tästedes joskus käyttää lyhennettä ihmisen G-CSF).

5 Tämän keksinnön mukaisesti saadun CSF:n mahdollisia käyttötarkoituksia on leukopenian hoidon lisäksi myös käyttö reagenssina kliinisessä testauksessa ja tutkimustyössä.

CSF on aine, joka vaikuttaa eläimen luuydinsolulhin 10 edistäen niiden erilaistumista ja lisääntymistä makrofaa-geiksi tai granulosyyteiksi. Kirjallisuudessa on kuvattu muutamia CSF-tyyppejä. Esimerkiksi E.R. Stanley et ai. ovat ilmoittaneet, että he ovat eristäneet terveiden aikuisten virtsasta CSF:ää, joka koostui glykoproteiineista, 15 jonka molekyylipaino oli 45 000 ja jolla oli pesäkkeitä stimuloiva vaikutus hiiren luuydinsoluihin muttei ihmisen luuydinsoluihin [Fed. Proce: 35 (1975) 2272 - 2278], A.W. Burgess et ai. ovat kuvanneet CSF:n, joka saattaa olla ihmisissä vaikuttavaa, eristämistä osittain puhtaana ih-20 misen istukasta [Blood 49 (1977) 573 - 583 ja ibid. 54 (1979) 614 - 627]. R.G. Shah et ai. ovat kuvanneet samanlaisen CSF:n eristämistä osittain puhtaana ihmisen ääreis-veren monosyyteistä ja PHA-stimuloiduista lymfosyyteistä [Blood 50 (1977) 811]. S.S. Fojo et ai. ovat kuvanneet sa-25 manlaisen CSF:neristämistä osittain puhtaana ihmisen keuh-koviljelmän supernatantista [Biochemistry 17 (1978) 3109-311]. Kaikki nämä CSF:t ovat glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on alueella 25 000 - 41 000, ja ne vaikuttavat suoraan ihmisen tarttumattorniin luuydinsoluihin saa-30 den ne muodostamaan neutrofiili-, makrofaagi ja eosinofii-lipesäkkeitä. Käytettävissä olevien lähteiden niukkuuden vuoksi ei kuitenkaan ole vielä saatu täydellisesti puhdistettuja CSF:iä. Näiden normaaleista ihmiskudoksista talteen otettujen CSF:ien lisäksi on äskettäin ilmoitettu, 35 että joillakin ihmisen kasvainsolutyypeillä on kyky tuot- 3 83881 taa CSF:ää. Esimerkiksi S. Asano et ai. ovat kuvanneet CSF:n talteenottoa karvattomiin hiiriin istutetuista keuh-kosyöpäsoluista [Blood 49 (1977) 845 - 852]. T. Okabe et ai. ovat kuvanneet CSF:n tuottamista alaleuan levysolusyö-5 päsolulinjasta ja kilpirauhassyöpäsoluista [Cancer Res. 38 (1978) 3910 - 3917; JNCI 69 (1982) 1235 - 1243; J. Cell. Physiol. 110 (1982) 43 - 49]. M.C. Wu et ai. ovat kuvanneet CSF:n ottamista talteen haimasyöpäsolulinjasta [J. Biol. Chem. 254 (1979) 6226 - 6228; J. Clin. Invest. 65 10 (1980) 772 - 775]. J.F. Dipersio et ai. ovat ilmoittaneet ottaneensa talteen CSFrää GCT-solulinjasta, joka oli perustettu pahalaatuista histiosytoomaa sairastavien potilaiden soluista [Blood 51 (1978) 1068; Blood 56 (1980) 717 - 727]. D.W. Golde et ai. ilmoittavat ottaneensa tal-15 teen CSF:ää karvasoluleukemiapotilaista saadusta MO-solu-linjasta [Blood 52 (1978) 1068 - 1072; Blood 57 (1981) 13 - 21]. Ihmisen luuydinsoluihin vaikuttavat CSF:t ovat glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on 27 000 - 34 000 ja isoelektrinen piste (pl) 4,5 - 5,7. GCT-solulinjavil-20 jelmän supernatantista saatu CSF on puhdistettu ominaisak-tiivisuuteen 1,12 x 106 yksikköä/mg. MO-solulinjaviljelmän supernatantista saadun CSF:n ominaisaktiivisuus on kohonnut arvoon 3,5 x 106 yksikköä/mg. Mitään näistä CSF:istä ei kuitenkaan ole puhdistettu täydellisesti. CSF:ää, jolla 25 on kyky spesifisesti edistää ihmisen luuydinsolujen erilaistumista neutrofiileiksi ja lisääntymistä, ei ole myöskään tähän mennessä kuvattu.

Tämän keksinnön tekijät ovat onnistuneet perustamaan uuden solulinjan suusyöpäpotilaiden kasvainsoluista. 30 Tällä solulinjalla on suuri kyky tuottaa CSF:ää ja voimakas lisääntymiskyky. Tämä solulinja, jolle on annettu nimeksi CHU-1, on talletettu kokoelmaan Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C N C M), Pasteur Institute, Ranska, 11. heinäkuuta 1984 talletusnumerolla 1-135. 35 Tämän keksinnön tekijät viljelivät tätä CHU-1:ä in vitro ja eristivät menestyksellisesti viljelmän supernan- 4 83881 tantista hyvin puhdasta CSF:ää, jolla oli ihmisen neutro-fiilipesäkkeitä stimuloiva vaikutus ja molekyylipaino noin 18 000 [määritettynä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryy-liamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE)] ja ominaisaktii-5 visuus 3,94 x 107 yksikköä/mg tai suurempi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että viljellään solulinjaa, jolla on kyky tuottaa ihmisen G-CSF:ää, seerumittomassa kasvatusliuoksessa, käsitellään viljelmän supernatantti alla mainittujen vaiheiden (1) - 10 (3) mukaisesti ja saadut fraktiot käsitellään mahdollises ti joko vaiheen (4) tai (5) mukaisesti: (1) Viljelmän supernatantti geelisuodatetaan käyttämällä geeliä, jonka tehokas fraktioalue on 5000 - 70 000 daltöniä, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutro- 15 fiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus (CSA); (2) adsorboidaan talteen otetut fraktiot kantajalle käänteisfaasi-HPLC:tä (RP-HPLC:tä) varten ja eluoidaan ti-heysgradienttimentelmällä veden ja orgaanisen liuottimen seosta käyttäen, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on 20 neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (3) siten talteen otetut fraktiot käsitellään mole-kyyliseula-HPLC:llä ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (4) siten talteen otetuille fraktioille suoritetaan 25 isoelektrinen piste-elektroforeesi ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; tai (5) vaiheessa (3) talteen otetuista fraktioista poistetaan siaalihappo ja otetaan talteen fraktiot, joilla 30 on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva ak tiivisuus.

Kuvio 1 esittää tämän keksinnön mukaisesti saadulle CSF:lle, joka esitetään pisteellä käyrässä, tehdyn SDS-PAGE: n tuloksia; 35 Kuvio 2 esittää kuvatulle CSF:lle urean (4 M) läsnä ollessa tehdyn isoelektrisen elektroforeesin tuloksia;

Kuviossa 3 on kuvatun CSF:n UV-absorptiospektri; 5 83881

Kuviossa 4 on CHU-l:n lisääntyrniskäyrä;

Kuviossa 5 on toinen käyrä, joka esittää keksinnön mukaisesti saadulle CSF:lle, joka osoitetaan pisteellä, tehdyn SDS-PAGE:n tuloksia.

5 Keksinnön mukaista menetelmää CSF:n saamiseksi ku vataan seuraavassa yleisesti CHU-l:n avulla.

CHU-1 -näyte suspendoidaan F-10 -kasvualustaan, joka sisältää 10 % naudan sikiöseerumia (FCS) ja inkuboi-daan lasisessa pyörityspullossa tasaisella nopeudella pyö-10 rittäen. Kun pyörityspullon sisäpinta on kokonaan peittynyt CHU-1:llä, vaihdetaan kasvualusta FCS-vapaaseen RPMI 1640 -alustaan ja jatketaan inkubointia 4 vrk. Viljelmästä talteen otettuun supernatanttiin lisätään FCS-pitoista F-10 -kasvatusliuosta, ja inkuboidaan 3 vrk. Kasvatusliuos 15 korvataan jälleen FCS-vapaalla RPMI 1640:llä, ja kun on inkuboitu vielä 4 vrk, otetaan talteen viljelmän superna-tantti. "Inkubointi ja seerumittoman viljelmän supematan-tin talteenotto" -syklejä toistetaan tämän ohjelman mukaisesti CHU-1 -viljelmän lopullisen supernatantin saarni sek-20 si. Täten saadulle supernatantille tehdään ultrasuodatus, jolloin saadaan noin 1 000 - 2 000 kertaisesti väkevöity konsentraatti, joka geelisuodatetaan ja otetaan talteen fraktiot, jotka sisältävät neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Nämä fraktiot puhdistetaan 25 useaan kertaan HPLC:llä, jossa kerätään fraktioita, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus. Nämä fraktiot kylmäkuivataan.

Tämän keksinnön yhteydessä CSA (pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus) mitataan jollakin seuraavista menetel-30 mistä.

CSA-mittaukset (a) Ihmisen luuydinsoluja käyttämällä:

Pehmytagaryksisolukerrosviljelmiä inkuboitiin T.R. Bradleyn ja D. Metcalf in menetelmällä [Aust. J. Exp. Biol. 35 Med. Sei. 44 (1966) 287 -300]. Naudan sikiöseerumi (FCS, 0,2 ml), tutkittava näyte (0,1 ml), tarttumattomia ihmi- 6 83881 sen luuydinsoluja sisältävä suspensio (0,1 ml, sisältää 1 - 2 x 105 tumallista solua), muunnettu McCoyn 5A -kasva-tusliemi (0,2 ml) ja 0,75 % agaria sisältävä muunnettu McCoyn 5A -kasvatusliemi (0,4 ml) sekoitettiin ja kaadet-5 tiin muoviseen kudosviljelymaljaan (0 35 mm). Alustan hyydyttyä inkuboitiin 37°C:ssa atmosfäärissä, jossa suhteellinen kosteus oli 100 % ja joka sisälsi 5 % C02:a ja 95 % ilmaa. Muodostuneet pesäkkeet (yksi pesäke koostuu 50 tai useammasta solusta) laskettiin 10 vrk:n inkuboinnin jäl-10 keen, ja katsottiin, että aktiivisuus, joka saa aikaan yhden pesäkkeen muodostumisen, on yksi CSA-yksikkö.

(b) Hiiren luuydinsoluja käyttämällä:

Hevosen seerumi (0,4 ml), tutkittava näyte (0,1 ml), suspensio, joka sisälsi (naaras)hiiren luuydinsoluja 15 C3H/He (0,1 ml, sisältää 0,5 - 1 x 105 tumallista solua) ja 0,75 % agaria sisältävä muunnettu McCoyn 5A -kasvatus-liemi (0,4 ml) sekoitettiin ja kaadettiin muovisiin kudos-viljelmämaljoihin (0 35 mm). Alustan hyydyttyä inkuboitiin 5 vrk 37°C:ssa 100 %:isessa suhteellisessa kosteudessa 20 atmosfäärissä, jonka koostumus oli 5 % C02 :a ja 95 % ilmaa. Muodostuneet pesäkkeet (yksi pesäke koostuu 50 tai useammasta solusta) laskettiin, ja katsottiin, että aktiivisuus, joka saa aikaan yhden pesäkkeen muodostumisen, on yksi CSA-yksikkö.

25 Sekä menetelmässä (a) että (b) käytetty muunnettu

McCoyn 5A -kasvatusliemi ja menetelmässä (a) käytetty tarttumattomia ihmisen luuydinsoluja sisältävä suspensio valmistettiin seuraavasti.

Muunnettu McCoyn 5A -kasvatusliemi 30 12 g McCoyn 5A -kasvatuslientä (Gibco Co.), 2,55 g MEM-aminohappo/vitamiinialustaa (Nissui Seiyaku Co., Ltd.), 2,18 g natriumbikarbonaattia ja 5000 yksikköä ka-liumpenisilliini G:tä liuotettiin 500 ml:aan kahdesti tislattua vettä, ja liuos steriloitiin suodattamalla millipo-35 re-suodattimella (0,22 pm).

Tarttumattornia ihmisen luuydinsoluja sisältävä sus pensio 7 83881

Luuydinsolut, jota saatiin terveeltä aikuiselta rintalastapunktiolla, laimennettiin 5-kertaiseen tilavuu-5 teen RPMI-1640 -liemellä. Tämä laimennos laitettiin Ficol-Paque -liuoksen (Pharmacia Fine Chemicals) päälle, ja seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 400 x g 25°C:ssa 30 min, ja otettiin talteen rajapinnalla oleva solukerros (ominaispaino < 1 077). Tämä kerros pestiin RPMI 1640-10 liuoksella, ja solutiheys säädettiin arvoon 5 x 106 so-lua/ml RPMI-1640 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 20 % FCS:ää. Liuos kaadettiin 25 cm2:n muoviseen kudosviljely-pulloon. Inkuboitiin C02-inkubaattorissa 30 min, otettiin talteen tarttumattomat solut supernatantista ja pantiin 15 ne muovipulloon (25 cm2). Inkuboitiin 2,5 tuntia, ja kerättiin supernatantista tarttumattomat solut.

Kun tämän keksinnön mukaisen CSF:n annettiin vaikuttaa hiiren luuydinsoluihin ja ihmisen luuydinsoluihin, havaittiin stimuloitunut neutrofiilipesäkkeiden muodos-20 tuminen, kuten osoitetaan jäljempänä esimerkissä 6. Tämä viittaa selvästi siihen, että tämän keksinnön mukainen CSF on tyyppiä, joka edistää luuydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä neutrofiileiksi.

Seuraavan referenssiesimerkin tarkoituksena on 25 kuvata menetelmää CHU-1 -solulinjan perustamiseksi.

Vertailu-esimerkki (i) Kasvain:

Potilaasta, joka sairasti suusyöpää, johon liittyi huomattava neutrofiilimäärän lisääntyminen, peräisin ole-30 via kasvainkudospaloja istutettiin nu/nu-hiireen. Noin 10 päivän kuluttua istutuksesta havaittiin huomattava kasvaimen koon ja neutrofiililuvun kasvaminen. 12 päivän kuluttua istutuksesta kasvain irrotettiin aseptisesti hiirestä ja jaettiin pieniin paloihin (1-2 mm3), joita inkuboi-35 tiin seuraavasti.

8 83881 (ii) Primaariviljelmä: 10 - 15 kasvainpalaa laitettiin muoviseen 50 ml:n sentrifugiputkeen. Lisättiin 5 ml trypsiiniliuosta (0,25 % trypsiiniä ja 0,02 % EDTA:a), seosta ravisteltiin 5 lämpöhauteessä (37°C) 10 min. Supernatantti heitettiin pois, lisättiin 5 ml koostumukseltaan edellä käytetyn kaltaista trypsiiniliuosta, ja trypsiinipilkkoutumisen annettiin edetä 15 min 37°C:ssa sekoittaen. Solususpensio otettiin talteen ja sekoitettiin 1 ml:aan FCS:ää trypsiinin 10 vaikutuksen estämiseksi. Solususpensiota säilytettiin jää-hauteessa.

Sama menettely toistettiin solususpension talteen ottamiseksi, joka yhdistettiin aiemmin saatuun suspensioon, ja sentrifugoitiin seosta kierrosnopeudella 1500 15 min'1 10 min, jolloin saatiin solupellettejä. Pelletit pestiin kahdesti F-10 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja siirrostettiin muoviseen inkubointipulloon (25 cm2) pitoisuudeksi 5 x 106 solua/pullo. Inkuboitiin F-10 -viljelyliuoksen, joka sisälsi 10 % FCS:ää, kanssa 20 yön yli C02-inkubaattorissa (5 % C02:a, suhteellinen kosteus 100 %). Supernatantti poistettiin yhdessä tarttumat-tomien solujen kanssa, lisättiin tuoretta kasvatusliuosta, ja jatkettiin inkubointia. 6. inkubointipäivänä soluker-ros oli yhtenäinen, ja kasvualusta vaihdettiin tuoreeseen. 25 Kasvatusliuos heitettiin pois seuraavana päivänä, lisättiin 2 ml anti-hiiri -punasoluja (Oappel Corporation), jotka oli laimennettu 5-kertaiseen tilavuuteen RPMI 1640:llä, ja 2 ml marsun komplementtia (Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), joka oli laimennettu 2,5-kertaiseen tilavuu-30 teen RPMI 1640:llä, ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa 20 min. Kun inkubointi oli saatettu loppuun, viljelmä pestiin kahdesti 10 % FCS:ää sisältävällä F-10:llä, ja nu/nu-hiiris-tä peräisin olevat fibroblastit poistettiin. Sitten lisättiin F-10 -kasvatusliuosta, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja 35 jatkettiin inkubointia.

9 83881 (lii) Jatkoviljely:

Kun alkuperäinen viljelmä oli täynnä kasvaneita soluja, se korvattiin F-10 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja tehtiin jatkoviljely seuraavana päi-5 vänä. Kun kasvatusliuos oli poistettu Komagomen pipetillä, pulloon lisättiin 2 ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 0,02 % esilämmitettyä (37°C) EDTA:a, ja viljemää lämmitettiin lämpölevyllä (37°C) 2 min. Sen jälkeen irrotettiin solut pipetoimalla. Lisättiin 0,5 ml FCS:ää, siir-10 rettiin solususpensio 15 ml:n sentrifugiputkeen ja sentri-fugoitiin kierrosnopeudella 1500 min'1 10 min, solujen pelletoimiseksi. Pelletit suspendoitiin 1 ml:aan F-10-kasvatusliuosta, ja jaettiin seos kymmeneen osaan jatko-viljelyä varten. Sama menettely toistettiin jatkoviljelyn 15 tekemiseksi 4 tai 5 päivän välein. Täten saatujen solujen lisääntymiskykyä tutkittiin seuraavalla menetelmällä. Valmistettiin suspensio, joka sisälsi 5 x 10* solua/ml ja siirrostettiin kaksikymmentä 1 ml:n kerrosta suspensiota muovimaljaan 0 35 mm). C02-inkubaattorissa tapahtuvan in-20 kuboinnin aikana malja otettiin esiin ennalta määrätyin väliajoin, otettiin talteen tarttuvat solut ja laskettiin ne. Tulokset esitetään kuviossa 4. Noin 20 - 24 tunnin kuluttua solujen siirrostuksesta solut alkoivat lisääntyä keskimääräisen kahdentumisajan ollessa noin 20 h.

25 Täten saatua CHU-l:ä voidaan käyttää solulinjana, jolla on kyky tuottaa CSF:ää tämän keksinnön mukaisesti ja, jota jäljempänä kuvataan CHU-l:een viitaten. Tulisi kuitenkin ymmärtää, ettei tämän keksinnön piiri millään tavoin rajoitu tähän CHU-l:een. Esimerkiksi mikro-organis-30 mikantaa tai solulinjaa, joka on tehty yhdistelmä-DNA-me-netelmin, voidaan myös soveltaa tähän keksintöön.

Esimerkki 1 CSF:n eristäminen

Kun kaksi inkubointipulloa (150 cm2 ) oli täydelli-35 sesti täyttynyt CHU-l:llä, otettiin solut talteen ja sus- ίο 83 881 pendoltlln ne 500 ml:aan F-10 -kasvatusliuosta, joka sisälsi 10 % FCS:ää. Solususpensio siirrettiin 1580 cm2 :n lasiseen pyörityspulloon (Belco Corporation) ja inkuboi-tiin pyörittäen kierrosnopeudella 0,5 min-1. Kun pullon 5 sisäseinä oli kokonaan peittynyt kasvaneilla soluilla, kasvatusliuos vaihdettiin seerumittomaan RPMI 1640:een. Inkuboitiin 4 vrk, otettiin talteen viljelmän supernatant-ti ja se sekoitettiin F-10:een, joka sisälsi 10 % FCS:ää, inkuboinnin jatkamista varten. Inkuboitiin 3 vrk, korvat-10 tiin kasvatusliuos jälleen seerumittomalla RPMI 1640:llä, inkuboitiin 4 vrk, ja otettiin talteen viljelmän superna-tantti. Toistamalla tätä menettelyä saatiin 500 ml seeru-mitonta, haluttuun tilaan saatettua alustaa pulloa kohden viikossa. Tämä menetelmä tekee mahdolliseksi melko pitkään 15 kestävän solujen ylläpidon ja haluttuun tilaan saatetun alustan keräämisen.

Yhteen erään, joka sisälsi 5000 ml kerättyä, haluttuun tilaan saatettua alustaa, lisättiin Tween 20:ä pitoisuudeksi 0,01 %, ja seos väkevöitiin noin 1000-kertaiseen 20 pitoisuuteen ultrasuodattamalla Hollow Fiber DC-4:n ja Amicon PM-10:n (Amicon Corporation) avulla. Väkevöity, haluttuun tilaan saatettu alusta puhdistettiin seuraavin vaihein.

(i) Osalle (5 ml) tiivistettä tehtiin geelisuodatus 25 Ultrogel AcA 54 -pylväällä (läpimitta 4,6 cm, pituus 90 cm, LKB Corporation) virtausnopeudella noin 50 ml/h käyttäen 0,01 M Tris-HCl -puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCl:a ja 0,01 % Tween 20:ä (Nakai Kagaku K.K.). Pylväs oli kalibroitu naudan seerumialbumiinilla 30 (M * 67 000), ovalbumiinilla (M = 45 000) ja sytokromi C:llä (M - 12 400). Geelisuodatuksen jälkeen otettiin 0,1 ml:n näyte kustakin fraktiosta ja laimennettiin se 10-kertaiseen tilavuuteen. Kunkin fraktion aktiivisuus mitattiin "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Fraktiot, joissa 35 Ve * 400 - 700 ml, esiintyi makrofaagivaltaisia pesäkkeitä 11 83881 stimuloivaa aktiivisuutta, kun taas fraktioissa, joissa Ve = 800 - 1200 ml, esiintyi granulosyyttivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi toisen ryhmän fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin noin 5 ml:ksi ultrasuo-5 dattamalla PM-10:llä (Amicon Corporation).

(ii) Väkevöityihin fraktioihin lisättiin 0,1 %:ista trifluorietikkahapon vesiliuosta, joka sisälsi 30 % n-pro-panolia (aminohapposekventointilaatu, Tokyo Kasei K.K.), ja seoksen annettiin seistä jäissä noin 15 min. Sen jäl- 10 keen seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 15 000 min'1 10 min sakan poistamiseksi. Sitten supernatantti johdettiin läpi Micro Bondapak C18 -pylvään (puoliprepara-tiivinen pylväs, Waters Associates, Inc.), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi aminohapposekven-15 tointilaatua olevaa n-propanolia ja trifluorietikkahappoa. Kolonni kehitettiin eluoimalla lineaarisella gradientilla 30 -♦ 60 % n-propanolia 0,1 %:isessa trifluorietikkahappo-liuoksessa. HPLC-laitetta (malli 685-50, Hitachi, Ltd.), johon oli kytketty detektori (malli 638-41, Hitachi, 20 Ltd.), käytettiin absorptioiden mittaamiseksi samanaikaisesti aallonpituuksilla 220 nm ja 280 nm. Eluoinnin jälkeen erotettiin kustakin fraktiosta 10 ml:n näyte, joka laimennettiin 100-kertaiseen tilavuuteen. Kunkin fraktion aktiivisuus mitattiin ”CSA:n määritysmenetelmällä (b)". 25 Fraktiot, jotka eluoituvat n-propanolipitoisuudella 40 %, sisälsivät neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta, joten kerättiin nämä fraktiot, ja tehtiin niille HPLC samoissa olosuhteissa kuin edellä. Määritettäessä fraktioiden CSA samalla menetelmällä kuin edellä 30 varmistuttiin jälleen siitä, että fraktiot, jotka vastasivat n-propanolipitoisuutta 40 %, sisälsivät neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi kerättiin nämä 4 fraktiota (4 ml) ja kylmäkuivattiin ne.

(iii) Kylmäkuivattu jauhe liuotettiin 200 pl:aan 35 40 %:ista n-propanolia, joka sisälsi 0,1 % trifluorietik- 12 83881 happoa, ja liuokselle tehtiin HPLC-käsittely TSK-G-3000 SW -pylväällä (2,5 mm x 60 cm, Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Eluointi tehtiin virtausnopeudella 0,4 ml/min 40 %:isella n-propanoli11a, joka sisälsi 0,1 % trifluorietik-5 kahappoa. Fraktionkerääjän (FRAC-100, Pharmacia Fine Chemicals) avulla kerättiin 0,4 ml:n fraktioita. Kerätyistä fraktioista mitattiin CSA samalla menetelmällä kuin edellä, ja fraktioiden, joiden viipymäaika oli 37 - 38 min (vastaa molekyylipainoa noin 20 000), havaittiin sisältä-10 vän neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi nämä fraktiot yhdistettiin ja puhdistettiin analyyttisellä Micro Bondapak C18 -pylväällä (4,6 mm x 30 cm). Sen jälkeen otettiin talteen pääpiikit ja kylmäkuivatuin ne.

15 Esimerkki 2

Fysikokemialliset ominaisuudet

Esimerkin 1 mukaisesti valmistetun CSF:n fysikokemialliset ominaisuudet määritettiin seuraavin analyysein ja testein.

20 (i) Molekyylipaino (a) CSF:n molekyylipaino määritettiin natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla(SDS-PAGE). Elektroforeesilaite oli mallia GE-2/4 (Pharmacia Fine Chemicals), ja geelin kokoonpano oli polyakryyliami-25 dialageeli (T * 15 % jaC - 2,6 %), jonka mitat olivat 70 x 70 x 3 mm, ja konsentrointigeeli (ylägeeli) (T = 3 %, C * 20 %). Muunnettu CSF-näyte preparoitiin seuraavasti: CSF:ää keitettiin 3 min liuoksessa, joka sisälsi 2 % natriumdodekyylisulfaattia 0,64 M 2-merkaptoetanolissa, 30 ja sitten liuokseen lisättiin ureaa loppupitoisuuteen 4 mol/1. Kun oli tehty elektroforeesi 2 pg:lle näytettä jännitteellä 120 V 3 tuntia, geeli poistettiin ja kiinnitettiin metanoli-etikkahappo-vesiseoksella (4:1:5) ja värjättiin vyöhykkeiden detektointia varten Silver Stain:ilia 35 (Bio-Rad Corporation). Naudan seerumialbumiinia (BSA, M = 13 83881 67 000), ovalbumiinia (OVA, M = 45 000), sytokromi C:tä (Cyt. C, M = 12 000) ja insuliinia (Ins., A-ketjun M * 3 300, B-ketjun M = 2 400) käytettiin molekyylipainomarkke-reina samanlaisten käsittelyjen jälkeen. Havaittiin yksi 5 vyöhyke, joka vastasi molekyylipainoa noin 18 000. Mole-kyylipainomittausten tulokset esitetään kuviossa 1.

(b) CSF:n molekyylipaino määritettiin natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), mutta tällä kertaa elektroforeesilaitteisto oli 10 PROTEAN11 (16 cm, Bio-Rad Corporation), jossa käytettiin geeliä, jossa oli polyakryyliamidialageeli (T = 15 %, C = 2,6 %), jonka mitat olivat 140 x 160 x 1,5 mm, ja kon-sentrointigeeli (ylägeeli) (T = 3 %, C = 20 %). Denaturoitu CSF-näyte preparoitiin seuraavasti: CSF:ää keitettiin 15 liuoksessa, joka sisälsi 2 % natriumdodekyylisulfaattia 0,46 M 2-merkaptoetanolissa, 3 min. Kun oli tehty elektroforeesi 4 pg:lle näytettä vakiovirralla 30 mA 4 tuntia, geelilevy poistettiin ja värjättiin 0,25 %:isella Coumasy Brilliant Blue R 250:llä (Sigma Chemical Co.) vyöhykkeiden 20 havaitsemiseksi. Seuraavia aineita käytettiin molekyyli-painomarkkereina samanlaisten käsittelyjen jälkeen: fos-forylaasi B (M = 92 500), naudan seerumialbumiini (BSA, M = 67 000), ovalbumiini (0VA, M = 45 000), karbonianhyd-raasi (M = 31 000), soijapaputrypsiini-inhibiittori 25 (M = 21 500) ja lysotsyymi (M = 14 400). Havaittiin yksi vyöhyke, joka vastasi molekyylipainoa noin 19 000. Mole-kyylipainomittausten tulokset esitetään kuviossa 5.

(c) Tulosten (a) ja (b) valossa tämän keksinnön mukaisesti saadun CSF:n molekyylipaino näyttää olevan 30 19 000 ± 1 000 SDS-PAGE:11a määritettynä.

(ii) Isoelektrinen piste Tässä saadun CSF:n isoelektrinen piste määritettiin horisontaalisella isoelektrisellä elektroforeesilaitteel-la FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals). Kun näytettä oli 35 käsitelty 2 tuntia elektroforeettisesti 30 W:n vakiotehol- 14 83881 la (Umax = 2000 V) polyakryyliamidigeelillä (T = 5 %, C=3%, 115 x 230 mm), joka sisälsi Pharmalyteä (pH = 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals) ja 4 mol/1 ureaa, CSF kiinnitettiin liuoksella, jonka koostumus oli 30 % metano-5 lia, 10 % trikloorietikkahappoa ja 35 % sulfosalisyylihap-poa, ja värjättiin Coumasy Brilliant Blue R-250:llä. Low pl -testipakkausta (pH 2,5 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals) käytettiin pl-markkerina.

Tarkasteltaessa vyöhykkeiden erottumista pH-alueel-10 la 4 - 6,5 havaittiin kolme erillistä vyöhykettä, jotka vastasivat pl-arvoja 5,73, 6,03 ja 6,37 ja joista kaksi vyöhykettä, pl = 5,73 ja 6,03, olivat vallitsevia. Tämän mittauksen tulokset esitetään kuviossa 2, jossa CSF0, CSFj ja CSF2 tarkoittavat tämän keksinnön mukaisesti saatuja 15 CSF:iä, joilla on erilaiset isoelektriset pisteet. Iso-elektrinen elektroforeesi urean poissa ollessa antoi tulokseksi kolme vyöhykettä, jotka vastasivat pl-arvoja 5,52, 5,80 ja 6,13.

Edellä kuvatulla menetelmällä tehtiin kymmenen iso-20 elektrisen pisteen mittausta, joiden tulokset esitetään taulukossa 1, jossa on kolme isoelektristä pistettä, A, B ja C, jotka eroavat toisistaan noin 0,3 yksikön verran.

Jotta nähtäisiin, onko olemassa korrelaatiota näiden kolmen eri isoelektrisiä pisteitä vastaavien vyöhyk-25 keiden ja CSA-arvojen välillä, tehtiin CSF:lie, joka oli juuri puhdistettu TSK-G 3000 SW -pylväällä esimerkin l(iii) mukaisesti, vyöhykkeiden erotus preparatiivisella isoelektrisellä elektroforeesilaitteella, malli FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals). Vyöhykkeiden erotusolosuhteet 30 olivat seuraavat.

Näyte: Kylmäkuivattu CSF-näyte (500 pg) liuotettiin 1 ml:aan 0,05 N fosforihappoa, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa.

Alusta: 15 g:aan Sephadex-IEF:ää (Pharmacia Fine

Chemicals) lisättiin 225 ml kahdesti tislattua vettä, joka 35 sisälsi 4 mol/1 ureaa ja 0,1 % Tween 20:ä. Lisättiin 12 ml Pharmalyteä (pH 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals), 15 83881 ja annettiin seoksen seistä yön yli, kunnes se turposi. Sen jälkeen seoksesta poistettiin ilma perusteellisesti imupullossa, ja seos kaadettiin lasilevylle (230 mm x 230 mm) tasaiseksi 5 mm:n paksuiseksi geelikerrokseksi.

5 Geelikerros poistettiin levyltä lukuun ottamatta tasaisin-ta osaa, jonka mitat olivat 50 mm x 230 mm.

Elektrodiliuokset:

Elektrodiliuskat (6 x 10 mm, Pharmacia Fine Chemicals) kyllästettiin 0,1 M fosforihapolla (anodi) ja 0,1 M 10 NaOH:lla (katodi). Toinen liuska sijoitettiin yhdensuuntaisesti geelin toisen pään kanssa ja toinen samalla tavalla samansuuntaisesti geelin toisen pään kanssa. Elektrodit kytkettiin vakiovirtalähteeseen ECPS 2000/300 (Pharmacia Fine Chemicals).

15 Alustava elektroforeesi: 45 min 8 W:n teholla.

Näytteen lisäys: 1 cm:n levyinen geelipala raaputettiin irti 5 cm:n etäisyydeltä anodista ja pantiin takaisin paikalleen, kun 20 siihen oli sekoitettu näyteliuos.

Elektroforeesi: 4 tuntia 50 W:n teholla, joka saatiin vakiovirta-lähteestä ECPS 2000/300.

Kun elektroforeesi oli lopussa, geelilevy otettiin 25 pois astiasta ja jaettiin 26 osaan fraktiointiverkolla. Kun kunkin fraktion pH oli mitattu, siirrettiin kustakin fraktiosta irrotettu geeli polypropyleenipienoiskolonniin (Muromac, Muromachi Kagaku K.K.) ja uutettiin 4 ml:11a 4 M guanidiinihydrokloridia, joka sisälsi 0,1 % trifluori-30 etikkahappoa. Osa (5 μΐ) kustakin uutetusta fraktiosta laimennettiin 2 ml:11a RPMI 1640 -kasvualustaa, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, ja mitattiin CSA "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Kukin eluoiduista fraktioista sisälsi kolme aktiivisuuspiikkiä, jotka sopivat 35 hyvin yhteen edellä mainittujen kolmen isoelektrisen pisteen, pl = 5,73, 6,03 ja 6,37 kanssa.

16 83881 si kolme aktiivisuuspiikkiä, jotka sopivat hyvin yhteen edellä mainittujen kolmen isoelektrisen pisteen, pl = 5,7-3, 6,03 ja 6,37 kanssa.

Jotta saataisiin tarkistetuksi, johtuvatko erot 5 isoelektrisissä pisteissä CSF:n peptidiosasta vai sokeri-ketjusta (erityisesti siaalihapporyhmien lukumäärästä), tehtiin elektroforeesi kahdelle CSF-näytteelle, joista toinen käsiteltiin neuraminidaasilla ja toinen oli käsittelemätön. Käsittelemättömässä näytteessä havaittiin kolme 10 vyöhykettä, mutta neuramidaasikäsitellyssä näytteessä vain yksi vyöhyke, joka vastasi pl-arvoa 6,37. Tehtiin iso-elektrinen elektroforeesi myös CSF-näytteelle, joka oli liuotettu 6 M guanidiinihydrokloridin vesiliuokseen, minkä jälkeen pH oli säädetty arvoon 1,5 1 N HCl:lla ja annettu 15 seistä 80°C:ssa 120 min. Vyöhykkeet, jotka havaittiin täten käsitellyssä näytteessä olivat samat kuin neuramidaa-silla käsitellyssä näytteessä. Neuramidaasikäsittely ei vaurioittanut CSA:ta millään tavalla. Nämä tulokset näyttävät viittaavan siihen, että erot CSF:n isoelektrisissä 20 pisteissä johtuvat todennäköisesti eroista siaalihapporyhmien lukumäärässä.

(lii) UV-absorptio Näytteen UV-absorptio mitattiin spektrofotometrillä käyttäen referenssiaineena 0,1 %:ista trifluorietikkahap-25 poa, joka sisälsi 40 % n-propanolia. Kuten kuviosta 3 ilmenee, absorptiomaksimi oli aallonpituudella 280 nm ja -minimi aallonpituudella 250 nm.

(iv) Proteiiniosan aminohapot Näyte hydrolysoitiin tavanomaisella menetelmällä, 30 ja proteiiniosan aminohappokoostumus analysoitiin automaattisella aminohappoanalysaattorilla, malli 835 (Hitachi, Ltd.). Tulokset esitetään taulukossa 2. Hydrolyysi tehtiin seuraavissa olosuhteissa.

(a) 6 N HC1, 110°C, 24 tuntia alipaineessa, 35 (b) 4 N metaanisulfonihappo + 0,2 % 3-(2-aminoetyyli)ind- lia, 110°C, 24, 48 tai 72 tuntia alipaineessa.

Kukin näyte liuotettiin liuokseen (1,5 ml), joka 17 83881

Osa (0,1 ml) kustakin liuoksesta kuivattiin kuivalla N2 -kaasulla ja sekoitettiin reagenssiin (1) tai (2) kiinni sulatetuissa putkissa alipaineessa tehtävää hydrolyysiä varten.

5 Kukin "mitattu arvo" taulukossa 2 oli neljän arvon keskiarvo, ts. 24 tunnin arvon reagenssilla (1) ja 24, 48 ja 72 tunnin arvojen reagenssilla (2) keskiarvo. Thr-, Ser-, l/2Cys-, Met-, Vai-, Ile- ja Trp-määrät laskettiin seuraavin menetelmin (katso Seikagaku Jikken Koga, Tanpa-10 kushitsu Kagaku II, julkaisija Tokyo Kagaku Dojin): a) Mitattiin ajasta riippuvat muutokset Thr-,

Ser-, l/2Cys- ja Met-arvoissa 24, 48 ja 72 tunnin hydro-lyysin jälkeen reagenssilla 2, ja tulokset ekstrapoloitiin ajanhetkeen 0.

15 b) Mitattiin Vai- ja Ile-arvot 72 tunnin hydrolyy- sin jälkeen reagenssilla (2).

c) Mitattiin Trp-arvot 24, 48 ja 72 tunnin hydro-lyysin jälkeen reagenssilla (2), ja laskettiin näiden tulosten keskiarvo.

20 Arvot, jotka esitetään sarakkeessa "Aminohapporyh- mien otaksuttu lukumäärä", perustuvat siihen oletukseen, että Leu-ryhmien lukumäärä on 33. Aminohapot, jotka vaativat yllä kuvatun kaltaista korjausta, yleensä joko hajoavat osittain tai huomattavasti hydrolyysin aikana tai ei-25 vät hydrolysoidu. Erityisesti Pro:n kohdalla saanto on alhainen. Pääasiallisesti näistä syistä mielenkiinnon kohteena olevien aminohappojen todellisilla mitatuilla määrillä (nmol) ja siten kunkin ryhmän lasketulla lukumäärällä on taipumus olla pienempiä kuin teoreettiset arvot 30 (katso Seikagaku Jikke Koza, ibid.).

ie 83881

Taulukko 2 lAminohapporyhmien las-Mitatut arvot- (kettu lukumäärä (pyö- 5 Aminohapot . (nmol)- K®t?tiY1,eul"1fsa-S1?." viksx kokonaisluvuiksi)

Asp (Asp + Asn) 3,54 4,3 (4)

Thr 4,58 5;5 (6)

Ser | 10,64 12,9 (13) 10 Glu (Glu + Gin)! 22,31 27,0 (27)

Pro j 8,30 10,1 (10)

Gly 10,60 12,8 (13)

Ala 14,85 18,0 (18) l/2Cys 2,59 3,1 (3) 15 Vai 6,16 7,5 (7)

Met 2,26 2,7 (3)

Ile 3,29 4,0 (4)

Leu 27,24 33,0 (33)

Tyr 2,60 3,1 (3) 20 Phe 5,08 6,1 (6)

Lys 3,68 4,5 (4)

His 3,93 4,8 (5)

Trp 1/61 1,9 (2)

Arg 4,29 5,2 (5) 25 -------

Kaikkiaan (166)

Laskettu molekyylipaino * 17961 (sokeria ei ole laskettu mukaan 166 ryhmään) : 30 (v) Lämpötilastabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte (1 mg) liuotettiin 4 ml:aan 0,1 %:ista trifluorietikkahappoa, joka sisälsi 40 % n-pro-panolia. Osa (1 ml) liuoksesta laimennettiin 10 ml:11a 0,01 M Tris-HCl -puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 1 % nau-35 dan seerumialbumiinia, jolloin CSF-pitoisuudeksi tuli 25 ng/ml. Tehtiin vielä viisi näytelaimennosta edellä kuva- 19 83881 tulla tavalla, ja nämä kaikkiaan kuusi laimennosta käsiteltiin 40 min vaihtelevissa lämpötiloissa 0, 37, 45, 56, 65 ja 100°C. Jäännös-CSAtn määrittäminen kustakin näytteestä osoitti, että keksinnön mukaisesti saatu CSF oli 5 stabiili lämpötiloissa 0-45°C ja inaktivoitui 56°C:ssa.

(vi) pH-stabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte (1 mg) liuotettiin 4 ml:aan 0,1 %:ista trifluorietikkahappoa, joka sisälsi 40 % n-pro-panolia. Osat (1 ml) liuoksesta laimennettiin kukin 10 10 ml:11a liuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia ja oli puskuroitu pH-arvoon 1, 3, 5, 7, 9, 11 tai 13. Kun CSF-pitoisuudeksi oli säädetty 25 ng/ml, annettiin näytteiden seistä jäähauteessa 24 tuntia. Sen jälkeen 2 ml kutakin laimennosta dialysoitiin 0,01 M Tris-HCl-puskuria 15 (pH 7,4) vastaan ja mitattiin jäännös-CSA. CSF:n havaittiin olevan stabiili laajalla pH-alueella 1-11.

(vii) Entsyymistabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte liuotettiin 0,1 %:iseen trifluorietikkahappoon, joka sisälsi 40 % n-propanolia, ja 20 valmistettiin neljä näytettä sekoittamalla 0,67 pg liuosta 0,05 M Tris-HCl -puskuriin (pH 8,0) siten, että lopputila-vuus oli 1 ml. Toinen näyte valmistettiin sekoittamalla 0,67 pg trifluorietikkahappoliuosta 0,05 M asetaattipusku-riin (pH 5,0) siten, että kokonaistilavuus oli 1 ml. Kol-25 meen neljästä ensimmäisestä näytteestä lisättiin 1 pg RNaasia, trypsiiniä tai pronaasia, kun taas neljättä näytettä käytettiin vertailunäytteenä. Viidenteen näytteeseen lisättiin 1 pg neuraminidaasia. Näiden viiden näytteen annettiin reagoida 2 tuntia 37°C:ssa. Kun reaktio oli 30 mennyt loppuun, otettiin näytteistä 0,1 ml:n osat, jotka laimennettiin 1 ml:11a RPMI 1640 -kasvualustaa, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia. CSA-mittaus osoitti, että RNaasi ja neuraminidaasi eivät inaktivoineet tämän keksinnön mukaista CSF:ää, kun taas trypsiinillä ja pro-:35 naasilla oli siihen inaktivoiva vaikutus.

20 8 3 8 81 (viii) Sokerikoostumus Näyte (11 nmol) sekoitettiin 25 nmol:iin inosito-lia, joka toimi sisäisenä standardina, ja 500 yl:aan 1,5 N HClmetanolia, ja annettiin reagoida 90°C:ssa 4 tuntia 5 N02:lla huuhdotussa kiinni sulatetussa putkessa. Kun reaktio oli lopussa, putki avattiin päästä ja siihen lisättiin hopeakarbonaattia (Ag2C03) sisällön neutraloimiseksi. Lisättiin etikkahappoanhydridiä (50 μΐ), ravistettiin, ja seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa pimeässä yön 10 yli. Ylempi kerros laitettiin koeputkeen ja kuivattiin N2-kaasulla. Sakka pestiin metanolilla ja sentrifugoitiin varovasti. Ylempi kerros kaadettiin koeputkeen, joka oli kuivattu N2-kaasulla, ja kuivattiin uudelleen. Kuivattuun sisältöön lisättiin 50 μΐ TMS-reagenssia (pyridiinin, hek-15 sametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos suhteessa 5:1:1), annettiin reagoida 20 min 40°C:ssa, minkä jälkeen seosta säilytettiin pakastimessa. Toistettiin muuten sama menettely, mutta käytettiin sisäisenä standardina inositolin (25 nmol) ja muun sokerin, kuten galaktoo-20 sin (Gal), N-asetyyligalaktosamiinin (Gal Nac) tai siaali-hapon, (50 nmol) yhdistelmää.

Näytteille tehtiin kaasukromatografia seuraavissa olosuhteissa.

Analysointiolosuhteet 25 Pylväs: 2 % OV - 17 Vinport HP (60 - 80 mesh), 3m, lasi Lämpötila: Kohotettiin 110 - 250°C:seen nopeudella 4°C/min.

Kantajakaasun paine: 1,2 - 1,6 kg/cm2 N2 alkuvai-30 heessa ja 2 - 2,5 kg/cm2 N2 mittauksen loppua kohden Herkkyys: 103 megaohmia alueella 0,1 - 0,4 V.

Paine: 0,8 kg/cm2 H2 ja 0,8 kg/cm2 ilmaa.

Näytteen koko: 2,5 - 3,0 μΐ

Analyysi osoitti, että kuvattu CSF koostui kolmesta 35 sokerista, galaktoosista, N-asetyyligalaktoosista ja siaa-lihaposta.

2i 83881 (ix) Aminohapposekvenssin määrittäminen Näytteelle tehtiin Edman-hajotus kaasufaasisekven-toijassa (Applied Biosystem. Inc.)/ ja saatu PTH-aminohap-po tutkittiin tavanomaisin menetelmin HPLC:llä (Beckman 5 Instruments, Inc.) käyttäen Ultrophere-ODS -pylvästä (Beckman Instruments, Inc.). Pylväs (5 pm, 0 4,6 mm, pituus 250 mm) tasapainotettiin ensin aloituspuskurilla (15 mM natriumasetaattlpuskuri, pH 4,5, vesiliuos, joka sisälsi 40 % asetonitriiliä). Sitten näyte liuotettiin 20 10 pltaan aloituspuskuria ja erotettiin aminohapot eluoimalla isokraattisesti aloituspuskurilla. Virtausnopeus oli 1,4 ml/min ja pylvään lämpötila pidettiin 40°C:ssa. PTH-amino-happo detektoitiin käyttämällä hyväksi UV-absorptiota aallonpituuksilla 269 ja 320 nm. Standardi-PTH-aminohappo-15 näytteitä (2 nmol, Sigma Chemical Co.), joille oli tehty samanlainen aminohappoerotus retentioaikojen määrittämiseksi, käytettiin referensseinä, joihin näytteen retentio-aikoja verrattiin aminohapposekvenssin identifioimiseksi. N-pään 21 aminohapon järjestys oli seuraava: 20 (10) H2 N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-(Ser )-Phe- (20) 25 Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val.

Esimerkki 3

Spesifisen aktiivisuuden määrittäminen

Esimerkin 1 mukaisten CSF:ien spesifiset aktiivisuudet ihmisen luuydinsolujen suhteen määritettiin "CSA:n 30 määritysmenetelmällä (a)". Tulos oli 3,94 x 107 yksikköä/-mg tai suurempi.

Esimerkki 4

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu kylmäkuivattu CSF-jauhe jaettiin erillisiin CSF-komponentteihin määri-35 tettyjen isoelektristen pisteiden mukaisesti preparatiivi-sella isoelektrisellä elektroforeesilla seuraavissa olosuhteissa.

22 83881

Laitteisto: FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals) Näyte: 10 mg kylmäkuivattua jauhetta liuotettiin 2 ml:aan 0,05 N fosforihappoa, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa.

Alusta: 15 g:aan Sephadex-IEF:ää (Pharmacia Fine 5 Chemicals) lisättiin 225 ml kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa ja 0,1 % Tweeniä. Lisättiin 12 ml Pharmalyteä (pH 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals) ja seos jätettiin seisomaan yön yli, kunnes se turposi. Sen jälkeen seoksesta poistettiin perusteellisesti ilma imupul-10 lossa, ja se kaadettiin lasilevylle (230 mm x 230 mm) tasaiseksi 5 mm:n paksuiseksi kerrokseksi.

Elektrodi1iuokset:

Elektrodiliuskat (6 x 10 mm, Pharmacia Fine Chemicals) kyllästettiin 0,1 M fosforihapolla (anodi) ja 0,1 M 15 NaOH:lla (katodi). Toinen liuska sijoitettiin yhdensuuntaisesti geelin toisen pään kanssa ja toinen samalla tavalla samansuuntaisesti geelin toisen pään kanssa. Elektrodit kytkettiin vakiovirtalähteeseen ESPS 2000/300 (Pharmacia Fine Chemicals).

20 Alustava elektroforeesi: 45 min teholla 8 W.

Näytteen lisäys: 1 cm:n levyinen geelipala raaputettiin irti 5 cm:n etäisyydeltä anodista ja laitettiin takaisin paikalleen, 25 kun siihen oli sekoitettu näyteliuos.

Elektroforeesi: 4 tuntia 50 W:n teholla, joka otettiin vakiovirta-lähteestä ECPS 2000/300.

Elektroforeesin lopettamisen jälkeen geelilevy 30 otettiin pois astiasta ja jaettiin 26 fraktioon fraktioin-tiverkon avulla. Kun kunkin fraktion pH oli mitattu, siirrettiin kustakin fraktiosta raaputettu geeli polypropylee-niseen pienoiskolonniin (Muromac, valmistaja Muromachi Kagaku K.K.) ja uutettiin vesiliuoksella, joka sisälsi 35 0,1 % trifluorietikkahappoa ja 4 mol/1 guanidiinihydrok- 23 83881 loridia, (10 ml). Osa (5 μΐ) kustakin uutetusta fraktiosta laimennettiin 16 ml:11a RPMI 1640 -kasvatusliuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, ja mitattiin CSA "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Kullekin fraktiolle saa-5 tiin aktiivisuuspiikit, jotka sopivat suurin piirtein yhteen isoelektristen pisteiden pl = 5,73, 6,03 ja 6,37 kanssa.

Vastaavat aktiiviset fraktiot adsorboitiin Micro Bondapak C18 -pylvääseen (Waters Associates, Inc., puoli-10 preparatiivinen laatu, 8 mm x 30 cm), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi n-propanolia ja tri-fluorietikkahappoa. Fraktiot eluoitiin 0,1 %:isella tri-fluorietikkahappoliuoksella, joka sisälsi n-propanolia lineaarisena pitoisuusgradienttina 30 -» 60 %. 40 %:n n-15 propanolipitoisuudella eluoituneet piikit kerättiin ja kylmäkuivattiin.

Kerättyjen fraktioiden aminohapot ja niiden sekvenssi määritettiin esimerkin 2 (iv) ja (ix) mukaisesti. Tulokset sopivat yhteen esimerkissä 2 saatujen kanssa.

20 Esimerkki 5

Osa (10 mg) esimerkin 1 mukaisesti valmistetusta kylmäkuivatusta CSF-jauheesta liuotettiin 2 ml:aan liuosta, joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumkarbonaatin ja natriumbikarbonaatin seosta, (pH 9,0). Liuoksen pH säädettiin 25 arvoon 5,0 1 N HCl:lla. Lisättiin 100 pg neuraminidaasia, annettiin reagoida 2 tuntia 37°C:ssa, ja adsorboitiin reaktioseos Micro Bondapak C18 -pylväälle (Waters Associates, Inc., puolipreparatiivinen laatu, 8 mm x 30 cm), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi n-propano-30 lia ja trifluorietikkahappoa. Adsorboitu seos eluoitiin 0,1 %:isella trifluorietikkahapon vesiliuoksella, joka sisälsi n-propanolia lineaarisena pitoisuusgradienttina 30 -» 60 %. n-propanolipitoisuudella 40 % eluoituneet piikit otettiin talteen ja kylmäkuivattiin. Osalle kylmäkui-35 vatusta jauheesta tehtiin analyyttinen isoelektrinen 24 83881 elektroforeesi, jossa saatiin yksi vyöhyke, joka vastasi pl-arvoa 6,37.

Esimerkki 6 Pesäkkeiden luokitus 5 "CSA:n määritysmenetelmän (a)" mukaisesti muodos tetut pesäkkeet siirrettiin yhdessä agarkerroksen kanssa lasilevylle K. Kubotan et ai. [Exp. Hemat. 8 (1980) 339-344] menetelmällä ja kuivattiin näytteen preparoimiseksi kalvon muotoon. Tälle näytteelle tehtiin pesäkkeiden luo-10 kitus sekä esteraasikaksoisvärjäyksellä että Bieblich-punavärjäyksellä 6. Konwalinkan et ai. [Exp. Hemat. 8 (1980) 434 - 440] menetelmällä. G. Konwalinkan et ai. menetelmää kuvataan tarkemmin seuraavassa.

(1) Kiinnitysliuos: puskuroitu formaliini-asetoni-15 liuos (pH 6,6)

Na2 HP04 20 mg KH2P04 100 mg H20 30 ml

Asetonia 45 ml 20 Formaliinia_25 ml

Kaikkiaan 100 ml (säilytetään 4°C:ssa) (2) Epäspesifinen esteraasivärjäysliuos (valmistettiin juuri ennen käyttöä) koostui seuraavien komponenttien (A) ja (B) suodatetusta seoksesta: 25 (A) Fosfaattipuskuri (1/15 mol/1000 ml, pH 6,3) 9,5 ml

Fast Garnet BGC -suola 10 mg (B) a-naftyylibutyraatti 10 mg

Etyleeniglykolimonometyylieet-30 teri 0,5 ml (3) Klooriasetaattiesteraasivärjäysliuos (valmistettiin juuri ennen käyttöä) koostui seuraavien komponenttien (A) ja (B) suodatetusta seoksesta: (A) Fosfaattipuskuri (1/15 mol/1000 ml, 35 pH 7,4) 9,5 ml

Fast Blue RR -suola 5 mg 25 83881 (B) Naphthol AS-D -klooriase-taatti 1 mg N,N-dimetyyliformamidi 0,5 ml (4) Bieblich Scarlet -värjäysliuos koostui liuoksen 5 (A) (2 ml) ja liuoksen (B) (98 ml) seoksesta: (A) Bieblich Scarlet (MC/B Corporation) 5 g Dimetyylisulfoksidi 100 ml (B) 0,1 M Tris-Hcl -puskuri (pH 7,4) Käyttämällä täten valmistettuja kiinnitysliuosta ja 10 reaktioliuoksia tehtiin pesäkkeiden värjäys seuraavasti: (i) Pesäkkeitä kiinnitettiin 30 s kiinnitysliuok-sella (1)4- 10°C:ssa, pestiin tislatulla vedellä kolmesti ja kuivattiin huoneen lämpötilassa 10-30 min.

(ii) Kuivatut pesäkkeet upotettiin huoneen lämpöti-15 lassa reaktioliuokseen (2) 20 - 30 min:ksi ja pestiin kolmesti tislatulla vedellä.

(iii) Pesäkkeet upotettiin huoneen lämpötilassa reaktioliuokseen (3) 15 min:ksi ja pestiin kolmesti tislatulla vedellä.

20 (iv) Pesäkkeet upotettiin huoneen lämpötilassa reaktioliuokseen (4) 2 tunniksi ja pestiin virtaavalla vedellä.

(v) Pesäkkeet kuivattiin ja tutkittiin. Sinisiä jyväsiä sisältävät solut luokiteltiin neutrofiileiksi? rus-25 keitä jyväsiä sisältävät monosyytti-makrofaageiksi; ja punaisia jyväsiä sisältävät eosinofiileiksi.

Inkuboinnin 7. 10. ja 14. päivänä koostuivat pesäkkeet, joita muodostui käytettäessä keksinnön mukaisesti saatua CSF:ää, kokonaan klooriasetaattiesteraasipositii-30 visista neutrofiileista, eikä muita pesäketyyppejä havaittu.

Seuraavien, kokeiden (1) - (5), tulosten perusteella havaittiin saadun CSF:n olevan oleellisilta osiltaan puhdasta: (1) Se antoi vain yhden piikin sekä RP-HPLC:ssä 35 että molekyyliseula-HPLC:ssä, ja tämä piikki sopi yhteen aktiivisuuspiikin kanssa; (2) tämä CSF muodosti yhden vyö- 26 83881 hykkeen SDS-PAGE:ssa; (3) tämä CSF erottui kolmeksi komponentiksi, joilla oli erilaiset isoelektriset pisteet, isoelektrisessä elektroforeesissa, mutta kukin komponentti oli yksi ainoa komponentti, jolla oli pesäkkeitä stimuloi-5 va aktiivisuus; näyte, josta oli poistettu päätesiaalihap-po joko entsymaattisesti tai kemiallisesti, muodosti yhden vyöhykkeen isoelektrisessä elektroforeesissa; (4) vain yhtä PTH-aminohappotyyppiä esiintyi 21 N-terminaalisen aminohapporyhmän sekvenssianalyysin kussakin vaiheessa; 10 (5) ominaisaktiivisuudella mitattuna tämä CSF on noin 10 kertaa niin puhdasta kuin ne CSF:t, joiden on tähän mennessä ilmoitettu olevan tehokkaita ihmisessä.

Tällaista hyvin puhdasta CSF-muotoa, erityisesti sellaista, joka on hyvin puhdas ja jolla on kyky edistää 15 luuydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä ihmisen neutrofiileiksi, ei löydy saatavana olevasta kirjallisuudesta. Tämän keksinnön mukaisesti saatua CSF:ää on saatavissa geenitekniikalla aikaansaadusta ihmisen G-CSF:ää tuottavasta kannasta. Sen lisäksi, että tämän keksinnön 20 mukaista CSFtää voidaan käyttää reagenssina kliinisissä testeissä tai tutkimustyössä, voidaan sitä mahdollisesti käyttää vakavien infektiotautien, joita ei tähän mennessä ole voitu hoitaa antibiooteilla, hoitoon, koska sillä on erilaisia kykyjä, ts. siirretyn luuytimen solujen lisään-25 tymisen edistäminen, säteilylle altistettujen luuydinku-dosten toipumisen edistäminen, leukosyyttitason palautumisen edistäminen syöpälääkkeiden antamisen jälkeen ja luuydinsolujen erilaistumisen ja lisääntymisen neutrofiileiksi edistäminen.

30

Claims

27 83881

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten pesäkkeitä stimuloivan tekijän CSF:n saamiseksi, jolla on 5 seuraavat fysikokemialliset ominaisuudet i) Molekyylipaino: 19 000 ± 1000 määritettynä natriumdodekyylisulfaat-ti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla; ii) Isoelektrinen piste:

10 Vähintään yksi taulukossa 1 esitetyistä kolmesta isoelektrisestä pisteestä A, B ja C: Taulukko 1

15 Isoelektrinen piste (pl) Urean (4 mol/1) läs- Ilman ureaa näollessa A 5,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1

20 B 6,0 ± 0,1 5,8 ± 0,1 C 6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,1 iii) UV-absorptio: Absorptiomaksimi aallonpituudella 280 nm ja -minimi 25 aallonpituudella 250 nm; iv) Seuraava 21 aminohapon sekvenssi N-päästä lukien: (10)

30 H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln- (Ser)-Phe- (20) Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val-, jossa X on luonnossa esiintyvä aminohappo, tunnettu siitä, että viljellään 35 solulinjaa, jolla on kyky tuottaa ihmisen G-CSF:ää, seeru-mittomassa kasvatusliuoksessa, käsitellään viljelmän su-pernatantti alla mainittujen vaiheiden (1) - (3) mukai- 28 8 3 8 81 sesti ja saadut fraktiot käsitellään mahdollisesti joko vaiheen (4) tai (5) mukaisesti: (1) Viljelmän supernatantti geelisuodatetaan käyttämällä geeliä, jonka tehokas fraktioalue on 5000 - 70 000 5 daltonia, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutro-fiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus (CSA); (2) adsorboidaan talteen otetut fraktiot kantajalle käänteisfaasi-HPLC:tä (RP-HPLC:tä) varten ja eluoidaan ti-heysgradienttimenetelmällä veden ja orgaanisen liuottimen 10 seosta käyttäen, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (3) siten talteen otetut fraktiot käsitellään mole-kyyliseula-HPLC:llä ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; 15 (4) siten talteen otetuille fraktioille suoritetaan isoelektrinen piste-elektroforeesi ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; tai (5) vaiheessa (3) talteen otetuista fraktioista 20 poistetaan siaalihappo ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solulinja, jolla on kyky tuottaa ihmisen G-CSF:ää, on CHU-1, talletettu talletus-25 laitoksen CNCM numerolla 1-315. 29 8 3 8 81