KR920009496B1

KR920009496B1 - Csf의 취득방법

Info

Publication number: KR920009496B1
Application number: KR1019850005125A
Authority: KR
Inventors: 오노마사요시; 히또시 노무라
Original assignee: 쥬우가이세이야꾸 가부시끼가이샤; 우에노 기미오
Priority date: 1984-07-25
Filing date: 1985-07-18
Publication date: 1992-10-17
Also published as: AU4513185A; FI852903L; DK337885A; BG61494B2; SG41591G; ZA855478B; EP0169566A1; AU585518B2; HK50491A; NO852915L; ES8609365A1; EP0169566B2; FI852903A0; EP0169566B1; DK337885D0; NO168952C; DE3563444D1; US4833127A; JPH0144200B2; FI83881C

Abstract

내용 없음.

Description

CSF의 취득방법

제1도는 본 발명의 CSF의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 도면중 .가 본 발명의 CSF이다.

제2도는 4M 요소 존재하에 있어의 본 발명의 CSF의 등전 점전기 영동의 결과를 나타낸다.

제3도는 본 발명의 CSF의 UV 흡수 스펙트럼이다.

제4도는 CHU-1의 증식능을 나타낸다.

제5도는 제1도와 같이 본 발명의 CSF의 SDS-PAGE의 결과를 나타낸다. 도면중 .가 본 발명의 CSF이다.

본 발명은 골수세포의 분화증식을 촉진하는 인자(Colony Stimulating Factor) (이하「CSF」라 한다)에 관한여, 특히 사람 호중구에의 분화증식 촉진 작용을 갖는 신규한 CSF(본 명세서 중에서는 「인체 G-CSF」라 할 때도 있다)의 취득 방법에 관한 것이다.

본 발명의 CSF는 백혈구 감소증 등의 치료약으로서 그 효과가 기대될뿐 아니라, 임상검사용시약이나 연구용 시약으로서 사용할 수 있다.

종래 CSF는 동물의 골수세포에 작용하여 미이크로 파지 또는 과립구에의 분화증식을 촉진하는 물질로서 지금까지 수종의 것이 보고되어 있다. 예를 들면, Stanley E.R.등은 건강한 사람의 뇨로부터 분자량 45,000의 당단백질로서, 새앙쥐의 골수 세포에 대하여는 콜로니 형성촉진 활성을 나타내고, 사람골수 세포에 대하여는 콜로니형성 촉진 활성이 나타나지 않는 CSF를 순화시켰다고 보고하고 있다. (Fed. Proc. 35권. 2272∼2278페이지, 1975년). 또 Burgess A.W. 등은 사람 태반으로부터(Blood 49권 573∼583, 1977년) (Blood 54권 614∼627페이지, 1979년), Shah R.G.등은 사람 말초 혈단구, PHA 자극림 파구로부터 (Blood 50권 811페이지, 1977년), Fojo S.S. 등은 사람 폐의 배양상청으로부터 (Biochemistry 17권 3109∼3116페이지, 1978년) 각각 사람에게 유효한 CSF를 부분정제한 사실을 보고하고 있다. 이들 CSF는, 모두 분자량 25,000∼41,000의 범위의 당단백질로서, 사람 골수 비부착성세포에 직접 작용하여 호중구, 마이크로 파지, 호산구의 콜로니를 형성한다. 그러나, 어느 경우도 재료에 제약이 있으므로, 아직 완전히 순화된 CSF를 얻기에 이르지 못하고 있다. 이상은 사람 정상 조직 유래의 CSF인데, 근년에 어떤 종류의 사람 종양세포에서, CSF를 생산하는 것이 보고되어 있다. 예를 들면 Asano S.등은 누드 새앙쥐 이식 폐암세포로부터(Blood 49권 845∼852페이지, 1977년), Okabe T.등은 하턱부 편평상 피암 주화세포, 갑상선 암주화세포로부터(Cancer Res. 38권 3910∼3917페이지, 1978년) (JNCI 69권 1235∼1243페이지, 1982년) (J.Cell Physiol. 110권 43∼49페이지, 1982년), Wu M.C.등은 취장암 주화세포로부터 (J.Biol.Chem. 254권 6226∼6228페이지, 1979년) (J.Clin Invest. 65권 772∼775페이지, 1980년), Dipersio J.F.등은, Malignant Histiocytoma 환자로부터 수립한 GCT세포주로부터(Blood 51권 1068페이지, 1978년) (Blood 56권 717∼727페이지, 1980년), 또는 Golde D.W.등은 모발세포 백혈병(Hairy Cell Leukemia) 환자로부터 수립한 MO 세포주로부터 (Blood 52권 1068∼1072페이지, 1978년) (Blood 57권 13∼21페이지, 1981년), 각각 CSF을 얻은 사실을 보고하고 있다. 어느 경우도 사람에게 유효한 CSF는 분자량이 27,000∼34,000의 범위에 포함되는 당단백질로서, 등전점은 pI=4.5∼5.7의 사이의 값을 갖는 것이다. 이들중 GCT세포주의 배양상청으로부터 얻어지는 CSF는 비활성 1.12×10⁶U/mg, MO 세포주의 배양상청으로부터의 CSF는 3.5×10⁶U/mg의 순도까지 각각 정제가 진행되고 있는데, 기타의 상기 CSF도 포함하여 어느 것이나 완전 순화에는 이르지 못하고 있음이 사실이다. 또 골수 세포의 사람 호중구에의 분화증식을 특이적으로 촉진하는 작용을 갖는 CSF는 지금까지도 보고되어 있지 않다.

본 발명자들은 구강저암환자의 종양세포로부터 CSF의 극히 높은 생산능을 갖고, 그리고 양호한 증식능을 나타낸 세포주의 수립에 성공하였다. 이 세포주는 「CHU-1」이라 명명되고, 불란서국의 바스틀.인 스티튜트 콜렉션 나쇼날레 데 칼츠레스 미크로오르가니즘(COLLECTION NATIONAL DE CULTURES DE MICROORGANISMES) (C.N.C.M)에 1984년 7월 11일자로 수탁번호「I-315」로서 기탁되어 있다.

본 발명자들은 이 CHU-1을 시험관내에서 배양하고, 이 배양상청으로부터, 사람 호중구의 콜로니 형성 촉진 활성을 나타내고, 분자량 약 18,000(도데실 황산 나트륨-폴리아크릴 아미드 겔 전기 영동법에 의한 정량), 비활성이3.94×10⁷U/mg

의 극히 순도가 높은 CSF를 얻는 데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 사람 G-CSF 생산능을 갖는 세포주를 혈청 무첨가 배양액으로 배양하고, 그 배양상청을 다음과 같은 ①∼③처리에 행하고, 또한 필요에 따라서 ④ 또는 ⑤의 처리를 행하여서된 하기 이화학적성질을 갖는 CSF의 취득방법에 관한 것이다.

① 배양상청을 5,000∼7,000 딜톤 실행 분획 범위를 갖는 겔을 사용한 겔 여과시키고, 호중구 우위의 콜로니 형성 촉진활성(이하 「CSA」라 한다)을 갖는 획분을 회수한다.

② ①의 획분을 역상계 고속액체 크로마토그래피 담체에 흡착시키고, 물과 유기용매의 혼합액의 농도 구배에 의하여 용출하여 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한다.

③ ②의 획분을 고속분자체 크로마토그래피하여 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한다.

④ ③의 획분을 등전점전기영동하고, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한다.

⑤ ③의 획분에 시알산제거 조작을 실시한 후, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한다.

「이화학적 성질」

(ⅰ) 분자량 : 도데실 황산나트룸-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법에 의한 측정에 의하여 19,000±1,000.

(ⅱ) 등전점 : 다음의 표 1에 나타낸 3개의 등전점(A,B,C)중에서 적어도 하나를 갖는다.

[표 1]

(ⅲ) 자외선흡수 : 280nm로 극대흡수를 갖고, 250nm로 극소치를 갖는다.

(ⅳ) N말단으로부터 21잔기째까지의 아미노산 배열이 다음과 같다.

다음에 상술한 CSF 취득방법의 개요를 「CHU-1」을 예로들어서 구제적으로 설명한다.

「CHU-1」을 소태아혈청을 10% 포함하는 F-10 배양액에 부유시켜서 유리 로울러 병중에서 일정속도로 회전배양을 행한다. 「CHU-1」이 로울러 병의 내벽에 완전히 조밀하게 증식한 시점에서 배양액을 소태아혈청을 포함하지 않은 RPMI 1640으로 교환하고, 4일간 배양한후, 배양상청을 회수하고 이어서 재차 소태아혈청을 포함하는 F-10 배양액을 가하고 3일간 배양한다. 재차 소태아혈청을 포함하지 않은 RPMI 1640 배양액으로 교환하여 4일간 배양한 후 배양상청을 회수한다. 이와 같은 스케줄에 의하여 「배양-무혈청 배양의 상청의 회수」를 반복 행함으로써, 「CHU-1」의 배양상청을 얻다. 이와 같이하여서 얻은 배양상청을 한외 여과기에 의하여 약 1,000∼2,000 배위로 농축한 후 여과하고, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한다. 이어서 이 획분을 다시 고속 액체 크로마토그래피에 의해 반복 정제하고, 호중구 우위의 CSA를 갖는 부분을 회수하여 동결 건조한다.

그리고, 본 발명에 있어 사용한 CSA의 측정방법은 다음과 같다.

「CSA의 측정방법」

(a) 사람 골수세포를 사용하는 경우 :

Bradley T.R., Metcalf D. 등의 방법(Aust. J. exp. Biol. med. Sci. 44권 287∼300페이지, 1966년)에 준하여 단층 연한천 배양법에 의하여 행하였다. 즉 소태아 혈청 0.2ml, 피검검체 0.1ml, 사람골수 비부착성세포 부유액 0.1ml(1∼2×10⁵유핵세포), 개변 McCoy's 5A 배양액 0.2ml, 한천을 0.75% 함유하는 개변 McCoy's 5A 배양액 0.4ml을 혼합하여서 직경 35mm의 조직 배양 플라스틱 접시에 넣고 굳힌 다음, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기, 100% 습도의 조건에서 배양을 행하고, 10일후에 형성된 콜로니수(50개 이상의 세포로써된 집락을 1콜로니로 한다)를 세어, 1개의 콜로니를 형성하는 활성을 1단위(Unit)로 하여 CSA를 구하였다.

(b) 새앙쥐 골수세포를 사용하는 경우 :

새앙쥐 혈청 0.4ml, 피검검체 0.1ml, C3H/He(암컷) 새앙쥐의 골수세포 부유액 0.1ml(0.5∼1×10⁵유핵세포), 한천을 0.75% 함유하는 개변 McCoy's 5A 배양액 0.4ml을 혼합하고 직경 35mm의 조직 배양용 플라스틱 접시에 넣고 굳힌 다음, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기, 100% 습도의 조건하에서 5일간 배양하고, 형성된 콜로니수(50개 이상의 세포로써된 집락을 1콜로니로 한다)를 세어, 1개의 콜로니를 형성하는 활성을 1단위(Unit)로 하여 CSA을 구하였다. 그리고, 상기 (a), (b)의 방법에 있어 사용한 개변 McCoy's 5A 배양액과 (a)에서 사용한 사람 골수비부착성 세포 부유액은 다음과 같이하여 제작하였다.

「개변 McCoy's 5A 배양액」

McCoy's 5A 배양액(GIBCO 사제) 12g, MEM 아미노산 비타민 배지(일수 제약사제) 2.55g, 중탄산 나트륨 2.18g, 페니실린 G 칼륨 5,000단위를 2회 증류수 500ml에 용해시킨후, 0.22μm의 밀리포아필터에 의하여 여과 멸균을 행하였다.

「사람 골수 비부척성 세포 부유액」

건강한 사람의 흉골첨자에 의하여 얻은 골수액을 RPMI 1640 배양액에 의하여 5배로 희석하고, Ficol-Paque액(파마시아사제)에 중층하고, 400×g, 30분, 25℃로써 원심분리를 행하고, 계면의 세포층(비중＜1.077)을 회수한다. 이 세포를 세척후, 20% 소태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배양액에 의하여 5×10⁶세포/ml의 농도로 조정하고, 25cm²의 조직 배양용 플라스틱 플라스크에 넣고, 탄산가스 배양기에 의하여 30분간 인큐베이트한 후, 상청의 비부착성세포를 회수하고, 재차 25cm²플라스틱 플라스크에 넣고, 2시간 30분 인큐베이트한 후, 상청의 비부착성 세포를 모아서 사용하였다.

본 발명의 CSF를 후술의 실시예(6)과 같이 하여서 새앙쥐의 골수세포와 사람의 골수세포에 각각 작용시킨 결과 어느 경우도 호중구 콜로니의 형성촉진이 나타났다. 이로써 본 발명의 CSF는 골수세포의 호중구에의 분화증식을 촉진하는 타입의 CSF임이 분명하다.

다음에 참고예에 의하여 「CFU-1」의 수립방법을 설명한다.

[참고예]

(ⅰ) 종양

저명한 호중구의 증식이 나타난 구강저암환자의 종양을 nu/nu 새앙쥐에 이식하였다. 이 종양은 이식 양 10일 후에 저명한 종양의 증대와 호중구의 증대가 나타났다. 이 종양 이식 12일 후에 무균적으로 적출하여, 1∼2mm³각으로 세절하고, 이를 다음과 같이 배양하였다.

(ⅱ) 초대배양

상기 세절한 종양괴 10∼15편을 50ml의 플라스틱 원심관에 넣고, 5ml의 트립신 용액(트립신 0.25%, EDTA 0.02% 함유)를 가하고, 37℃의 온조중에서 10분간 진탕한후 상청을 버리고, 재차 같은 트립신 용액 5ml을 가하고, 37℃에서 15분간 교반하면서 트립신 소화를 행하였다. 상청의 세포 부유액을 회수하여, 소태아혈청을 1m 가하고 트립신의 작용을 멈춘 후, 얼음중에 보존하였다.

이상의 조작을 재차 행하여 세포 부유액을 회수하고, 전회의 분과합쳐서 1,500r.p.m에서 10분간 원심분리에 의하여 세포펠렛을 얻었다. 이 세포 펠렛을 소태아 혈청을 10% 함유하는 F-10에 의하여 2회 세척한 후 25cm²의 플라스틱 배양 플라스크에 세포농도 5×10⁶개/플라스크가 되도록 하여서 심었다. 소태아 혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액을 사용하여, 탄산가스 인큐베이터(탄산가스 농도 5%, 습도 100%)중에서 밤새 인큐베이트 한후, 상청을 비부착 세포와 함께 제거하고, 새로운 배양액을 가하여서 배양을 계속하였다. 배양 개시후 6일째에 세포가 가득 증식하였으므로, 이시점에서 배양액을 새로운것으로 바꾸었다. 다음날, 이 배양액을 버리고, RPMI 1640으로 5배 희석한 항 새앙쥐 적혈구(Capple 사제) 2ml와 동일한 RPMI 1640으로 2.5배 희석한 모르모트보체(극동제약사제) 2ml을 가하고 37℃에서 20분간 인큐베이트 하였다. 인큐베이션 종료 후 소태아 혈청을 10% 함유한 F-10으로 2회 세척하고 nu/nu 새앙쥐 유래의 피브로블라스트를 제거하고 계속하여 소태아 혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액을 가하여서 배양을 행하였다.

(ⅲ) 계대배양

초대 배양에 있어 세포가 완전히 조밀하게 증식한 시점에서 재차 소태아 혈청 10%을 함유하는 F-10 배양액으로 바꾸어서 행하여, 다음날 계대를 행하였다. 구입(駒입)피펫으로 배양액을 제거한 후, 미리 37℃로 가온한 EDTA 0.02%를 함유하는 생리식염수 2ml를 가하고, 핫플레이트 상에서 37℃로 2분간 가온 후, 피페팅에 의하여 세포를 박리시켰다. 소태아 혈청 0.5ml을 첨가후, 15ml의 원심관에 세포 부유액을 옮기고, 1,500r.p.m 및 10분간의 원심에 의하여 세포 펠렛을 얻었다. 1ml의 F-10 배양액에 세포를 부유시키고, 1/10으로 분할하여 계대를 행하였다. 이후, 같은 조작에 의하여 4∼5일간격으로 계대를 행하였다. 이와 같이하여서 얻은 세포의 증식능을 조사하기 위하여, 5×10⁴세포/ml의 세포 부유액을 작성하고, 직경 35mm의 플라스틱 접시에 1ml씩 심고(20매), 탄산가스 인큐베이터에 의하여 배양하고, 일정시간의 경과마다 접시를 인출하여, 접착 세포를 회수하여 세포수를 산정하였다. 이 결과를 제4도에 나타냈다. 세포를 심은 후, 약 20∼24시간후에 증식을 시작하여, 평균 배화시간(PDT)은 약 20시간 이었다.

다음에 상기와 같이하여서 얻은 본 발명의 CSF을 생산하는 세포주의 하나인 「CHU-1」을 사용하는 실시예에 의하여 본 발명을 설명하는데, 본 발명은 당해 「CHU-1」에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

CSF의 단리

「CHU-1」이 완전히 조밀하게 증식한 150m²의 배양 플라스크 2개로부터 세포를 회수하고, 이를 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액 500ml에 부유시킨 후, 1580cm²의 유리제로울러병(Belco 사제)에 옮기고, 0.5r.p.m의 속도로 회전 배양을 행하였다. 세포가 로울러 병의 내벽에 완전히 조밀하게 증식한 시점에서 배양액을 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640으로 교환하고, 4일간 배양한후 배양상청을 회수하고 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10을 가하여서 배양을 속행한다. 3일간 배양한후 재차 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640으로 액을 바꾸고, 4일후에 배양상청을 회수하였다. 이하 같은 조작을 반복함으로써, 매주 1병으로부터 500ml씩의 혈청을 함유하지 않은 배양상청이 얻어졌으며, 그리고 이 방법에 의하여 상당히 장기간에 걸쳐서 세포를 유지하여, 배양상청을 회수할 수가 있었다.

얻어진 배양상청 5ℓ을 1배치로 하고, 이에 0.01% 트윈 20을 첨가후 Hollow Fiber DG-4와 Amicon PM-10(아민콘 사제)을 사용한 한외 여과법에 의하여 약 1000배로 농축한후, 이를 다음의 순서로 정제하였다.

(ⅰ) 직경 4.6cm, 길이 90cm의 울트로겔 AcA 54칼럼(LKB 사제)을 사용하여, 0.15M NaCI와 0.01% 트윈 20(반정화학사제)을 함유하는 0.01M 트리스 염산 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 전기 농축한 배양상청 5ml을 유속 약 50ml/시간으로 여과하였다. 그리고 칼럼은 미리 소혈청 알부민(분자량 67,000), 오브 알부민(분자량 45,000), 치토크롬 C(분자량 12,400)로써 캬리브레이션을 행하였다. 겔여과 종료후 각 획분으로부터 0.1ml씩을 채취하고, 10배로 희석한 후, 전술한 「CSA의 측정방법(b)」에 의하여 활성을 나타내는 획분을 조사하였다. 이 결과, 먼저 Ve=400∼700ml의 획분이 마이크로 파지 우위의 CSA를 나타내고, Ve=800∼1200ml의 획분이 과립구 우위의 CSA를 나타냄을 알았으므로, 후자의 획분을 모아서 PM-10(아미콘 사제)을 사용하는 한외여과기에 의하여 약 5ml로 농축하였다.

(ⅱ) 상기 농축획분에 n-프로판올(도꾜가세이사제, 아미노산 배열결정용)을 30% 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 수용액을 첨가하고, 얼음중에 15분 정도 방치한 후, 15,000r.p.m., 10분의 원심에 의하여 침전을 제거하였다. 이어서 앞서의 n-프로판올과 트리플루오르초산을 함유하는 수용액으로 평형화한 μBondapak C18컬럼(Waters 사제, 세미분취용, 8mm×30cm)에 흡착후, 30∼60%의 직선농도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 수용액으로 순차 용출하였다. 고속 액체 크로마토그래피장치는 하다찌 685-50행을, 검출은 히다찌 638-41형 검출기(모두 히다찌제작소재)를 사용하고, 220nm와 280nm의 흡수를 동시에 측정하였다. 용출후, 각 획분으로부터 10μl을 분취 100배 희석한 후, 전술의 「CSA의 측정방법(b)」에 의하여 활성을 나타내는 획분을 조사하였다. 이 결과, n-프로판올 40%에 의하여 용출되는 피크에 활성이 나타났으므로, 이 피크를 모아서 재차 같은 조건으로 재 크로마토그래피를 행하여 상기와 같이 하여서 CSA를 조사한 결과, 역시 n-프로판올 40%의 위치의 피크에 활성이 나타났으므로, 이 피크를 모아서 (4획분=4ml)동결 건조하였다.

(ⅲ) 상기 동결 건조 분말을 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 수용액 200μl에 용해하여 TSK-G3000SW 칼럼(동양소다사제, 2.5mm×60cm)을 사용한 고속 액체크로마토그래피하였다. 용출은 동수용액에 의하여 0.4ml/분의 유속으로 행하여, 플럭션 콜렉터-FRAC-100(파마시아사제)에 의하여 0.4ml씩 분취하였다. 분취한 각 획분에 대아여 CSA을 전기와 같이하여서 조사한 결과, 유지시간이 37∼38분의 획분(분자량 약 2만에 상당)에 활성이 나타났으므로, 이 획분을 회수하고, 다시 분석용 μBondapak C18 컬럼(4.6mm×30cm)에 의한 정제를 실시한 후, 메인피크를 회수하여 동결건조하였다.

[실시예 2]

이화학적 성질

실시예 1에서 얻은 본 발명의 CSF의 이화학적 성질을 조사하기 위하여 다음의 분석, 시험을 행하였다.

(ⅰ) 분자량

① 도데실 황산 나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의하여 행하였다. 전기 영동장치는 GE-2/4(파마시아사제), 겔은 T=15%, C=2.6%의 폴리아크릴아미드 슬러브겔(70mm×70mm×3mm)와 농축겔(T=3%, C=20%)을 사영하였다. 시료는 미리 0.64M2-메르캅토메탄올에 도데실 황산나트륨을 농도가 2%가 되도록 가한 용액중에 3분간 비등시킨 후, 요소를 4M이 되도록 첨가함으로써 변경 시켜둔 것을 2μg 사용하였다. 120V에서 3시간 영동한후, 겔을 인출하고, 메탄올 : 초산 : 물(4 : 1 : 5)에 의하여 고정하고, 은염색(Silver Stain : 바이오렛사제)에 의하여 밴드를 검출하였다. 분자량 마커로서 소형철 알부민(BSA, 분자량 67,000), 오브 알부민(OVA, 45,000), 치토크롬 C(Cyt. C, 12,000), 인슐린(Ins, A쇄 : 3,300, B쇄 : 2,400)을 같이 처리하여 사용하였다. 이 결과, 분자량 약 18,000의 단일 밴드가 나타났다. 측정 결과는 제1도에 나타낸다.

② 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의하여 행하였다. 전기영동장치는 PROTEAM^TM16cm(바이오렛사제), 겔은 T=15%, C=2.6%의 폴리아크릴아미드슬러브겔(140mm×160mm×1.5mm)과 농축겔(T=3%, C=20%)을 사용하였다. 시료는 미리 0.64M2-메르캅토에탄올에 도데실 황산나트륨을 농도가 2%가 되도록 가한 용액중에서 3분간 비등시켜 변성시켜서 둔것을 4μg 사용하였다. 30mA 정전류로 4시간 영동한 후 겔을 인출하여 0.25% 코마시 브릴리언트블루 R 250(시그마사제)에 의한 염색으로 하여서 밴드를 검출하였다. 분자량 마커로서 포스포릴라제 B(Phosphorylase B, 분자량 92,500), 소혈청 알부민(BSA, 67,000), 오브알부민(OVA, 45,000), 카보닉안히드라제(Carbonic Anhydrase, 31,000), 대두 트립신 억제제(Soybean Trypsin Inhibitor, 21,500), 라이소자임(Lysozyme, 14,400)을 같이 처리하여 사용하였다. 이 결과, 분자량 약 19,000의 단일 밴드가 나타났다. 측정 결과는 제5도에 나타낸다.

③이상 ①과 ②의 결과로부터, 본 발명의 CSF의 분자량은 SDS-PAGE에 의한 측정으로 19,000±1,000이라고 생각된다.

(ⅱ) 등전점

플렛베드(flatbed)형 등전점전기 영동장치 FBE-3000(파마시아사제)을 사용하였다. pH 4∼6.5의 파마라이트(Pharmalyte, 파마시아사제)와 4M 요소를 함유하는 폴리아크릴 아미드겔(T=5%, C=3%, 115mm×230mm)로써 30W 정전력(최대전압 2000V)에 의하여 2시간 영동을 행한 후, 30% 메탄올/10% 트리클로로초산/35% 술포살리실산에 의하여 고정하고, 이어서 코마시 브릴리언트블루-R-250 염색을 행하였다. 등전점 마커로서 Low pI Kit pH 2.5∼6.5(파마시아사제)을 사용하였다.

pH 4∼6.5의 사이에서 분리를 검토한 결과 pI=5.73,6.03,6.37의 3개의 밴드가 나타났다. 이중 pI=5.73과 6.03의 2개의 밴드가 주된 성분이었다. 이 결과는 제2도에 나타낸다. 도면중 CSF₀,CSF₁,CSF₂은 등전점이 다른 본 발명의 CSF를 나타낸다. 그리고, 요소부존재하에서 같이 등전점전기 영동을 행한 결과, pI=5.52,5.08과 6.13의 3개의 밴드가 나타났다.

상술의 방법에 의한 등전점 측정을 10회 반복 행한 결과, 그 값은 표 1에 나타낸 바와 같으며, 등전점 A,B,C는 서로 거의 0.3씩 상위가 항상 나타났다.

이 3개의 밴드와 CSA와의 상관을 보면 목적하는 실시예 1-(ⅲ)에 있어의 TSK-G3000SW컬럼에 의하여 정제한 단계의 CSF를, 조제용 등전점전기 영동장치(FBE-3000, 파마시아사제)를 사용하여서 분리하였다. 그리고, 분리 조건은 다음과 같다.

시료 : 동결조건 분말 500μg을 4M 요소를 함유하는 0.05N 인산 1ml에 용해.

지지체 : 15g의 Sephadex-IEF(파마시아사제)에, 4M 요소, 0.1% 트윈 20을 함유하는 2회 증류수 225ml을 가한 후, 또한 12ml의 파마라이트 4∼6.5(파마시아사제)을 가하고, 실온에서 밤새 방치하여서 팽윤시켰다. 팽윤후, 흡인병을 사용하여 충분 탈기를 행한후 230mm×230mm의 유리 플레이트상에 5mm 두께의 균일한 겔층을 작성하였다. 플레이트상 가장 균일한 부위를 선택하여 50mm×230mm의 겔을 남기고, 다른 부분의 겔은 제거하였다.

전극액 : (양극) 0.1M 인산, (음극) 0.1M NaOH을 전극 스트립(6×10mm, 파마시아사제)에 함유 시키고, 겔의 양단에 접하여서 평행으로 둔다. 파워서플라이(ECPS 2000/300, 파마시아사제)을 사용하여 정전력.

전영동 : 8W 45분간 영동을 행하였다.

시료첨가 : 양극으로 부터 5cm의 위치에서, 1cm폭으로 겔을 박리하여, 시료액과 혼합한 후 원위치로 뒤돌렸다.

본영동 : 전술의 파워서플라이를 사용하여 50W 정전력 4시간 영동을 행하였다.

영동 종료후, 겔 플레이트를 인출하여, 분획격자를 사용하여 26분획으로 나누고, 각 분획의 pH를 측정 후, 각 분획의 겔을 박리하여 폴리프로필렌제 미니컬럼(무로막, 무로마찌화학사제)중에 옮기고 4ml의 4M염산 구아니딘을 함유하는 0.1% 트리플루오르초산-수용액에 의하여 추출을 행하였다. 각 추축분획분으로부터 5μl을 취하고 2ml의 1% 소혈청 알부민을 함유하는 RPMI 1640배양액으로 희석한 후, 전술한 「CSA의 측정방법(b)」에 따라서 CSA를 조사하였다. 이 결과 용출전 획분중에 3개의 활성 피크가 존재하고, 각활성 피크의 위치는 전술의 등전점 pI=5.73, 6.03, 6.37과 잘 일치하였다. 여기서 나타난 동전점의 상위가, 펩타이드 부분에 기안하는지, 아니면 당쇄(특히 시알산의 부가수)에 기인하는지를 명백히할 목적으로, 뉴라미니다제 처리한 시료와 미처리의 시료에 대하여 등전 점전기영동을 행한 결과, 후자에는 3개의 밴드가 나타난데 비하여, 전자는 pI=6.37의 밴드만이 관찰 되었다. 또 뉴라미니다제 처리 대신에 6M 구아니딘 염산 수용액에 시료를 용해하고, 1N 염산으로 pH을 1.5로 한후, 80℃, 120분의 처리를 행한 시료에 대하여 같이 등전점 전기 영동을 행한 결과, 같은 밴드의 이동이 나타났다. 그리고, 뉴라미니다제 처리를 행하여도 CSA는 전혀 손상되지 않았다. 이 결과로부터 등전점의 상위는 시알산의 부가수의 상위에 의한 것으로 추정된다.

(ⅲ) 자외선 흡수

시료를 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오르 초산을 대조로 하고, 분광 광도계를 사용하여 자외선 흡수를 조사한 결과, 제3도에 나타낸 바와 같이 280nm에서 극대흡수, 250nm에 극소치를 나타냈다.

(ⅳ) 단백질 부분의 아미노산 조성

시료를 상법에 의하여 가수분해하고, 그 단백부분의 아미노산 조성을 히다찌 835 아미노산 자동분석장치(히다찌 제작소사제)를 사용하여 특수 아미노산 분석법에 의하여 분석하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 그리고 가수분해 조건은 다음과 같다.

① 6N HCI, 110℃, 24시간, 진공중

② 4N 메탄술폰산+0.2% 3-(2-아미노에틸)인돌, 110℃, 24시간, 48시간, 72시간 진공중

시료는 40% n-프로판올과 0.1% 트리플루오르초산을 함유하는 용액(1.5ml)에 용해한 후, 각각 0.1ml을 취하고. 건조질소가스에 의하여 건조시킨후, ① 또는 ②의 시약을 가하고 진공봉관하고, 가수분해하였다. 표중, 실측치는 ①의 24시간치와 ②의 24, 48, 72시간치의 합계 4회의 평균치이다. 단 Thr, Ser, 1/2Cys, Met, Val, Ile와 Trp은 다음의 방법에 의하여 산출 하였다.(생화학 실험강좌, 단백질 화학 Ⅱ(동경화학동인 출판)을 참조).

ㅇ Thr, Ser, 1/2Cys, Met은 ②의 24, 48, 72시간치의 경시변화를 취하고, 영시간에 외삽 한다.

ㅇ Val, Il은 ②의 72시간치

ㅇ Trp은 ②의 24, 48, 72시간치의 평균치.

표중의 아미노산 잔기수는 Leu을 33개로 가정하여 산출한 예측치이다. 일반적으로 상기와 같은 보정이 필요한 아미노산은 가수분해시에 일부 또는 상당한 부분이 파괴되든지 아니면 가수분해를 받기 어려운것이며 또한 Pro은 발색율이 낮은등으로 인하여, 이들 아미노산의 실측지(n mol), 따라서 이로부터 산출되는 잔기수는 실제보다도 낮은 값을 나타내는 경향이 있다(예를 들면 전술의 생화학 실험강좌 참조).

[표 2]

(ⅴ) 온도 안정성

시료(동결 건조분말) 1mg을 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 4ml로써 용해하고, 그 1ml을 분취하고, 1% 소혈청 알부민을 함유하는 0.01M 트리스 염산 완충액(pH 7.4) 10ml로써 희석하여 CSF 농도를 25ng/ml로 하였다. 이 시료를 0℃, 37℃, 45℃, 56℃, 65℃와 100℃로써 각각 40분간 처리한 후, 잔존하는 CSA를 검토 하였다. 이 결과, 0∼45℃에서 안정하며, 56℃에서 활성을 잃었다.

(ⅵ) pH 안정성

시료(동결건조 분말) 1mg을 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 4ml에 용해하고, 그 1ml를 분취하여, 1% 소혈청 알부민을 함유하는 pH 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13의 각 완충액 10ml로써 희석하고, CSF 농도를 25ng/ml로 하고 각각 얼음중에서 24시간 처리 하였다. 처리 종료후, 각각 2ml을 0.01M 트리스 염산 완충액 (pH 7.4)로써 투석하여서 pH를 되돌린 후, 잔존하는 CSA를 검토하였다. 이 결과, pH 1∼11의 넓은 범위에서 안정하였다.

(ⅶ) 효소에 대한 안정성

시료(동결건조분말)을 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오르초산에 용해하고, 0.67μg을 0.05 M 트리 염산 완충액(pH 8.0)을 가하고, 전량을 1ml로 한 검체를 4개와 같이 0.67μg을 0.05M 초산 완충액(pH 5.0)을 가하여서 전량을 1ml로한 검체를 하나 준비하고, 전자에는 각각 RNase, 트립신, 프로나제(Pronase)를 1μg 첨가하고, 남은 하나는 대조로 하였다. 후자에는 뉴라미니다제(Neuraminidase) 1μg을 첨가하고, 각각 37℃에서 2시간 반응 시켰다. 반응 종료 후, 각각 0.1ml을 취하고 1% 소혈청 알부민을 함유하는 RPMI 1640 배양액 1ml로써 희석후, 각각 CSA를 검토 하였다. 이 결과, 본 발명의 CSF는 RNase, 뉴라미니다제에서는 활성을 잃지 않으나, 트립신과 트로나제에서 활성을 잃었다.

(ⅷ) 당조성

시료 11n mol에 내부 표준으로서 이노시톨 25n mol을 가하고, 질소가스로 치환한 밀봉된 관 중에서 90℃로 4시간 반응 시켰다. 개관후 탄산은(Ag₂CO₃)을 가하여서 중화한 후, 무수초산 50μl을 가하고 진탕 후, 실온의 암소에서 하룻밤 방치 하였다. 상층을 샘플 튜브에 취하고, 질소가스로써 건조하였다. 침전에 메틴올을 가하고 세정 후 가볍게 원심하고, 상층을 같은 샘플 튜브에 가하여 건조하였다. 이에 50μl의 TMS화 시약(피리딘 : 헥사메틸디실라잔 : 트리메틸클로로실란=5 : 1 : 1로 혼합한 것)을 가하고, 40℃로 20분 반응 시킨 후, 디프프리저에 보존하였다. 그리고 스탠다드로서 갈락토스(Gal), N-아세틸 갈락토사민(Gal NAc), 시일산 등, 각종 당 각 50n mol과 이노시톨 25n mol을 합쳐서 같은 조작을 행하였다.

이 샘플에 대하여는 다음에 나타낸 조건에 의하여 가스크로마토분석을 행하였다.

(분석조건)

컬럼 : 2% OV-17Vinport H P60∼80매시, 3m, 유리,

온도 : 110℃∼250℃까지 4℃/분의 승온

담체기체 : 최초는 1.2∼1.6kg/cm³(질소압)

종료시는 2∼2.5kg/cm²

감도 : 10³M Ω 렌지 0.1∼0.4V

압 : 수소가스 0.8kg/cm², 공기 0.8kg/cm²

샘플량 : 2.5∼3.0μl

분석의 결과, 본 발명의 CSF의 구성당은 갈락토스, N-아세틸 갈락코사민과 시알산의 3종류임이 확인되었다.

(ⅸ) 아미노산 배열의 결정

시료를 기상식 시쿼네이터(아브라이드바이오시스템사제)을 사용하여 에드만(Edman) 분해하고, 얻어진 PTH 아미노산을 고속액체 크로마토그래피 장치(베크만, 이스톨몬트사제)와 Ultrophere-ODS 컬럼(베크만, 인스톨런트사제)을 사용하여 상법에 의하여 분석 하였다. 컬럼(5μm, 직경 4.6mm, 길이 250mm)을 개시 완충액(15mM 초산나트륨 완충액 pH 4.5, 40% 아세토니트릴을 함유하는 수용액)로써 평형화한 후, 검체(20μl의 개시 완충액으로써 용해)를 주입하여 개시 완충액에 의한 이소크래틱 용출에 의하여 분리를 행하였다. 유속은 1.4ml/분, 컬럼 온도는 40℃로 유지 하였다. PTH 아미노산의 검출은 269nm와 320nm의 자외선 흡수를 이용하였다. 미리 표준 PTH 아미노산(시그마사제)각 2n mol을 동일의 계에 의하여 분리하여 유지시간을 결정하고, 피검 검체의 유지 시간으로 부터 동정을 행하였다. 이 결과, N 말단으로부터 21잔기째까지의 아미노산 배열은 다음과 같이 결정 되었다.

[실시예 3]

비활성치의 측정

실시예 1에서 얻은 본 발명의 CSF의 사람 골수세포에 대한 비활성치를 전술한 「CSA의 측정방법(a)」에 따라서 측정한 결과 3.94×10⁷U/mg

이었다.

[실시예 4]

실시예 1의 방법에서 얻은 CSF의 동결건조 분말을 다음의 조건에서 조제용 등점점전기 영동에 의하여 등전점의 상위에 의한 CSF의 분리를 행하였다.

장 치 : FBE-3000(파마시아사제)

시 료 : 동결건조 분말 10mg을 4M 요소를 함유하는 0.05N 인산 2ml에 용해.

지지체 : 15g의 세파덱스-IEF(파마시아사제)에, 4M요소, 0.1% 트윈 20을 함유하는 2회 증류수 225㎖을 가한 후, 또한 12㎖의 파마라이트 4∼6.5(파마시아사제)을 가하고 실온에서 하룻밤 방치하여서 팽윤시켰다. 팽윤 후, 흡인병을 사용하여 충분 탈기를 행한 후 203mm×230mm의 유리 플레이트상에 5mm 두께의 균일한 겔층을 작성하였다.

전극액 : (양극) 0.1M 인산, (음극) 0.1M NaOH을 전극 스트립(6×10mm, 파마시아사제)에 함유 시키고, 겔의 양단에 접하여 평행으로 둔다. 파워서플라이(ECPS 2000/300, 파마시아사제)를 사용하여 정전력.

전영동 : 8W 45분간 영동을 행하였다.

시료첨가 : 양극으로 부터 5cm의 위치에서, 1cm폭으로 겔을 박리하고, 시료액과 혼합한 후, 원위치로 되돌렸다.

본영동 : 전술의 파워서플라이를 사용하여, 50W 정전력, 4시간 영동을 행하였다.

영동 종료후, 겔 플레이트를 인출하고 분획격자를 사용하여 26분획으로 나누고, 각 분획의 pH을 측정후, 각 분획의 겔을 박리하여 폴리프로필렌제 미니컬럼(무로막.무로마찌화학사제)중에 옮기고 10ml의 4M 염산구아니딘을 함유하는 0.1% 트리플루오르초산-수용액에 의하여 추출을 행하였다. 각 추출획분으로 부터 5μl을 취하고 16ml의 1% 소혈청 알부민을 함유하는 RPMI 1640의 배양액으로 희석한 후, 전술한 「CSA의 측정방법(b)」에 따라서 CSA를 조사한 결과, 3개의 다른 등전점(pI=5.73, 6.03, 6.37)에 거의 일치하여 활성의 피크가 나타났다. 이어서 각각의 활성획분을 n-프로판올과 트리플루오르초산을 함유하는 수용액으로 평형화한 Bondapak C 18 컬럼(Waters 사재, 세미분취용, 8mm×30cm)에 흡착 시킨 후, 30∼60%의 직선 농도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오르초산 수용액으로 용출하고, n-프로판올 40%에 의하여 용출되는 피크를 각각 회수하여 동결건조 하였다.

이들에 대하여 실시예 2의 (ⅳ)와 동(ⅸ)에 기재의 방법에 따라서 아미노산 조성 및 아미노산 배열을 조사한 결과, 모두 실시예 2의 결과와 일치하였다.

[실시예 5]

실시예 1에서 얻은 CSF의 동결건조분말 10mg을 2ml의 0.1M 탄산나트륨-중탄산나트륨(pH 9.0)에 용해한 후, 1N 염산을 사용하여 pH을 5.0으로 조정하였다. 이에 뉴라미니다제 100μg을 첨가 후 37℃에서 2시간 반응 시킨 후, 반응액을 n-프로판올과 트리플루오르 초산을 함유하는 수용액으로 평형화한 μBondapak C 18 컬럼(Waters 사제, 세미분취용, 8mm×30cm)에 흡착후, 30∼60%의 직선 농도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오르 초산 수용액에 의하여 용출하고, n-프로판올 40%로써 용출되는 피크를 회수하여 동결 건조 하였다. 이 일부를 취하여 분석용 등전점기 영동 한 결과, 등전점 pI=6.37의 단일 밴드임을 확인 하였다.

[실시예 6]

콜로니의 분류

전술의 「CSA의 측정방법(a)」에 의하여 형성된 콜로니를 Kubota, K. 등의 방법(Exp.Hemat, 8권, 339∼344페이지, 1980년)에 따라서, 한천층마다 슬라이드 유리상에 인출하고 건조시켜서 필름상 표본을 작성 하였다. 다음에 이 표본을 콘왈링카, 쥐. 등의 방법(Exp.Hemat. 8권, 434∼440페이지. 1980년)에 따라서 에스테라제 2중 염색과 비브리히스카렛(Biebrich scarlet) 염색의 3중 염색을 행하여 콜로니의 분류를 행하였다. 방법의 상세에 대하여는 다음에 설명한다.

① 고정액 : 완충 포르말린, 아세톤액(pH 6.6)

Na₂HPO₄20mg

KH₂PO₄100mg

H₂O 30ml

아세톤 45ml

포르말린 25ml

전량 100ml 4℃로 보존

② 비특이적 에스테라제 염색 반응액(사용시 조제)

(A) 1/15mol/I, 인산완충액(pH 6.3) 9.5ml

퍼스트, 가넷 GBC염 10mg

(B) α-나프틸부틸레이트 10mg

에틸렌글리콜모노메틸에테르 0.5ml

(A)액과 (B)액을 혼화후 여과하여 사용.

③ 클로아세테이트 에스테라제 염색 반응액(사용시 조제)

(A) 1/15mol/I, 인산완충액(pH 7.4) 9.5ml

퍼스트불루 RR염 5mg

(b) 나트톨 AS-D 클로로아세테이트 1mg

N, N-디메틸포름아미드 0.5ml

(A)액과 (B)액을 혼화후, 여과하여 사용.

④ 비브리히스카렛 염색 반응액

(A) 비브리히스카렛(MC/B 사제) 5g

디메틸술폭시이드 100ml

(B) 0.1M 트리스-염산완충액(pH 7.4)

(A) 액 2ml을 (B)액 98ml에 혼화하여 사용.

상술과 같이 조제한 고정액과 반응액을 사용하여 다음과 같은 순서에 의하여 콜로니 염색을 행하였다.

(ⅰ) ①의 고정액(4∼10℃)로써 30초간 고정후 증류수에 의하여 3회 수세하고 실온에서 10∼30분간 건조.

(ⅱ) ②의 반응액에 침지하고 실온에 20∼30분간 방치후 증류수에 의하여 3회 수세.

(ⅲ) ③의 반응액에 침지하고 실온에 15분간 방치후 증류수에 의하여 3회 수세.

(ⅳ) ④의 반응액에 침지하고 실온에 2시간 방치후 유수에 의하여 수세.

(ⅴ) 건조후, 관찰, 청색의 과립을 함유하는 세포를 호중구, 다갈색의 과립을 함유하는 세포를 단구-마이크로파지, 적색의 과립을 함유하는 세포를 호산균으로 분류 하였다.

이결과, 본 발명의 CSF을 사용하여 형성된 콜로니는, 배양 7, 10, 14일째의 어느 시점에 있어도 모두 콜로로아세테이트에스테라제 양성의 호중구 콜로니로서, 타계통의 코롤니는 전혀 나타나지 않았다.

본 발명의 CSF는 다음의 ①∼⑤의 실험 결과로 부터 명백한 바와같이 거의 완전히 순화된 것이다. 즉 ① 역상계와 분자체에 의한 고속액체 크로마토그래피에 있어 단일의 피크를 나타내고, 활성피크도 이와 일치한다. ② SDS-PAGE로서 단일의 밴드를 부여한다. ③ 등전점전기영동법에 의하여 3개의 다른 등전점을 갖는 성분으로 분리되는데, 각 성분은 모두 CSA를 나타내는 단일성분이다. 또 효소적 또는 화학적으로 말단시알산의 제거를 행하면, 등전점전기 영동에 있어도 단일의 밴드로 된다. ④ N 말단 21잔기까지의 아미노산 배열 분석에 있어, 각 스텝에서 출현하는 PTH 아미노산은 항상 1종류이다. ⑤ 종래 보고되어 있는 사람에게 유효환 CSF의 순도와 비교하면, 비활성에 있어 약 10배 높은 값이 얻어지고 있다.

이와같이 순화된 형의 CSF로, 특히 사람 호중구에의 분화증식 촉진 작용을 갖는 CSF는 아직 예를 발견하지못한 것이다. 본 발명의 CSF는 유전자 공학 기술에 의하여 인위적으로 작성한 사람 G-CSF 생산주로부터도 취득할 수 있는 것으로서 임상 검사용 시약으로서, 또는 연구용시약으로서 사용할 수 있다. 또 골수이식시의 골수세포의 증식촉진, 방사선피폭시의 골수조직의 회복촉진, 제암제 사용후의 백혈구 레벨회복촉진 또는 본 발명의 CSF가 골수세포의 호중구에의 분화증식 촉진 작용을 가짐으로써, 항생 물질로 치료할 수 없는 중증감염증등의 치료약으로서의 효과 등도 기대된다.

Claims

사람 G-CSF 생산능을 갖는 세포주를 혈청 무첨가 배양액으로 배양하고, 그 배양상청을 ① 5,000∼70,000달톤 실행분획범위를 갖는 겔을 사용한 겔여과 시키고, 호중구 우위의 콜로니 형성촉진 활성(이하「CSA」라 한다)을 갖는 획분을 회수하고, ② ①의 획분을 역상계 고속액체 크로마토그래피 담체에 흡착시키고, 물과 유기용매의 혼액의 농도구배에 의하여 용출하고, 호중구 우위의 CSA을 갖는 획분을 회수하고 ③ ②의 획분을 고속분자체 크로마토그래피하고, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수한후, 필요에 따라서, ④ ③의 획분을 등전점기영동하고, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수 하거나, ⑤ ③의 획분에 시알산제거 조작을 실시한 후, 호중구 우위의 CSA를 갖는 획분을 회수함을 특징으로 하는, 다음의 이화학적 성질을 갖는 CSF의 취득방법

「이화학적 성질」

(ⅰ) 분자량 : 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기 영동법에 의한 측정에 의하여 19,000±1,000.

(ⅱ) 동전점 : 다음의 표-1에 나타내는 3개의 등전점(A,B,C)중, 적어도 하나를 갖는다.

[표-1]

(ⅲ) 자외선흡수 : 280nm에서 극대흡수를 갖고, 250nm에서 극소치를 갖는다.

(ⅳ) N말단으로부터 21잔기째까지의 아미노산 배열이 다음과 같다.
제1항에 있어서, 사람 G-CSF 생산능을 갖는 세포주가 CHU-1인 CSF의 취득방법.