DK166731B1

DK166731B1 - Human granulocyt-kolonistimulerende faktor (hg-csf), fremgangsmaade til dens fremstilling samt farmaceutiske praeparater indeholdende faktoren

Info

Publication number: DK166731B1
Application number: DK337885A
Authority: DK
Inventors: Masayoshi Ono; Hitoshi Nomura
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1984-07-25
Filing date: 1985-07-24
Publication date: 1993-07-05
Also published as: EP0169566B1; AR242835A1; FI83881C; FI852903L; ATE35271T1; NL930141I2; HK50491A; ES8609365A1; SG41591G; EP0169566B2; DK337885A; NO168952B; CA1312569C; DE3563444D1; AU585518B2; JPH0144200B2; BG61494B2; FI83881B; ES545502A0; NO168952C

Description

DK 166731 B1

Opfindelsen angår en hidtil ukendt granulocyt-kolonistimulerende faktor (hG-CSF), en fremgangsmåde til fremstilling af denne faktor samt farmaceutiske præpara-5 ter indeholdende faktoren, især sådanne til stimulering af differentiering og proliferation af humane knoglemarvsceller til neutrofile granulocyter, eller til hjælp . . ved helbredelse af infektionssygdomme.

hG-CSF ifølge den foreliggende opfindelse' har 10 potentiel for anvendelse ikke blot som helbredende middel for leukopeni, men også som et reagens for klinisk forskning og afprøvning.

hG-CSF er et stof, der virker på animalske ben-marvceller, således at deres differentiering og proli-15 feration til makrofager og granulocyter fremmes. Der er rapporteret adskillige typer af hG-CSF. For eksempel har Stanley, E.R. et al. rapporteret, at de fra urin fra raske voksne rensede en hG-CSF, der bestod af glycoprotein med en molekylvægt på 45.000, og som udviste en 20 kolonistimulerende aktivitet på muse-berimarvceller, men ikke på humane benmarvceller (Fed.Proc., _3~>/ side 2272-2278, 1975). Burgess, A.W. et al. har rapporteret, at en hG-CSF, der ville være effektiv hos mennesker, blev renset partielt fra himan placenta (Blood, £9, 573-25 583, 1977, og ibid., 54, 614-627, 1979). Shah, R.G.

et al. har rapporteret om partiel rensning af en lignende hG-CSF fra monocyter i humant perifert blod og PHA-stimulerede lymfocyter (Blood, _50, side 811, 1977) .

Fojo, S.S. et al. har rapporteret om partiel rensning af 30 en lignende hG-CSF fra supernatanten fra en kultur af himane lunger (Biochemistry, 17, side 3109-3116, 1978).

Alle disse hG-CSF'er er glycoproteiner med molekylvægte inden for området 25.000 til 41.000, og de virker direkte på ikke-adhærente humane benmarvceller under dannelse 35 af kolonier af neutrofile, makrofager og eosinofile.

På grund af begrænsninger med hensyn til tilgængelige kilder er der imidlertid ikke tidligere vundet fuld- 2 DK 166731 B1 stændigt rensede hG-CSF'er. Foruden disse fra normale humane væv udvundne hG-CSF'er er det nyligt rapporteret, at nogle typer humane tumorceller har evnen til hG-CSF-produktion. For eksempel har Asano, S. et al. rapporteret om udvinding af hG-CSF fra lungecancerceller, der var 5 transplanteret ind i hårløse mus (Blood, £9, side 845-• ‘852, 1977). Okabe, T. et al. har rapporteret om hG-CSF-produktion fra en cellelinie af mandibular skælcelle-carcinoma og skjoldbruskkirtel-cancerceller (Cancer Res., 38/ side 3910-3917, 1978, JNCI, 69, side 1235-10 1243, 1982, og J.'Cell Physiol., 110, side 43-49, 1982).

Wu, M.C. et al. har rapporteret om hG-CSF-udvinding fra en pancreas-cancercellelinie (J.Biol.Chem., 254, side 6226-6228, J.Clin.Invest., 65, side 772-775, 1980).

Dispersio, J.F. et al. har rapporteret, at de har udvun-15 det hG-CSF fra en GCT-cellelinie etableret fra patienter med ondartet histiocytoma (Blood, 51, side 1068, 1978, og Blood, _56, side 717-727, 1980) . Golde, D.W. et al har rapporteret om deres udvinding af hG-CSF fra en MO-celle-linie etableret fra patienter med hårcelleleukæmi 20 (Blood, 52^ side 1068-1072, 1978 og Blood,~57, side 13-21, 1981). De hG-CSF'er, der er effektive på humane benmarvceller, er glycoproteiner med molekylvægte i området fra 27.000 til 34.000 og isoelektriske punkter (pi) på 4,5-5,7. Den hG-CSF, der vindes fra supernatanten 25 fra en kultur af GCF-cellelinie, er blevet renset til g en specifik aktivitet på 1,12 x 10 E/mg. Den specifikke aktivitet af hG-CSF vundet fra supernatanten fra en kultur g af MO-cellelinie er blevet forøget til 3,5 x 10 E/mg.

Ingen af disse hG-CSF'er er imidlertid blevet renset fuld-30 stændigt. Endvidere er der ikke hidtil rapporteret om hG-CSF, der har den evne specifikt at fremme differentieringen og pro1iferationen af humane benmarvceller til neutrofile granulocyter.

Det er opfindelsens formål at tilvejebringe en 35 hG-CSF med højere specifik aktivitet end tidligere kendte sådanne faktorer og oprenset i betydelig højere grad end tidligere.

3 DK 166731 B1

Til dette formål lykkedes det at etablere en hidtil ukendt cellelinie ud fra tumorceller i patienter med oral cancer. Cellelinien havde stor evne til at frem bringe hG-CSF og udviste stærkt proliferative evner.

5 Denne cellelinie er, betegnet ved CHU-1, deponeret hos Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, - (-C.N.C.M.) Pasteur Institute, Frankrig, den 11. juli 1984 under deponeringsnummeret 1-315.

De foreliggende opfindere dyrkede denne CHU-1 10 in vitro og var derefter i stand til fra supernatanten fra kulturen at isolere en meget ren CSF, der udviste en human neutrofil kolonistimulerende aktivitet, og som havde en molekylvægt på ca. 18.000 (bestemt ved natrium-dodecylsulfat-polyarcylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE)) 15 og en specifik aktivitet på 3,94 x 10 E/mg eller højere.

I overensstemmelse hermed er den humane hG-CSF ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at den har en specifik aktivitet på mindst 3,94x107 E/mg og evnen til at fremme differentiering og proliferation af humane benmarvceller 20 til neutrofile granulocyter, men ikke til eosinofile, og at den har følgende fysisk-kemiske egenskaber: i) molekylvægt: 19.000 + 1.000, som bestemt ved natriumdodecyl-sulfatpolyacrylamidgel-elektroforese, 25 ii) isoelektrisk punkt: udviser i det mindste ét af de tre isoelektriske punkter A, B og C i følgende Tabel I:

Tabel I

30 _Isoelektrisk punkt (pi)_____ I nærværelse af I fraværelse af 4M urinstof__urinstof___ A 5,7 + 0,1 5,5 + 0,1 B 6,0 + 0,1 5,8 + 0,1 35 C 6,3 + 0,1 6,1 + 0,1 4 DK 166731 B1 iii) UV-absorption: maksimum-absorption ved 280 nm og minimum-absorption ved 250 nm, 5 iv) de N-terminale 21 aminosyrer er: (10) (H9N)-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln- (20)

Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val-j,. hvori X er en naturligt forekommende uidentificeret ami- 10 nosyre.

Endvidere er fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af den omhandlede hG-CSF ejendommelig ved, at en cellelinie med en human hG-CSF-producerende evne dyrkes i en serum-fri dyrkningsopløs-15 nmg, supernatanten fra kulturen underkastes trin (1) til (3) anført nedenfor, og de resulterende fraktioner underkastes valgfrit enten trin (4) eller (5): (1) supernatanten fra kulturen underkastes gelfiltrering under anvendelse af en gel med et effektivt fraktions- 20 område på 5.000-70.000 dalton, og fraktioner med den neutrofil-dominerende koloni-stimulerende aktivitet (CSA) udvindes, (2) de udvundne fraktioner adsorberes i en 0,1% vandig opløsning af trifluoreddikesyre indeholdende' 30% n-pro-25 panol på en bærer til omvendt-fase-HPLC, og der foretages eluering med en lineær gradient af 30-60% n-pro-panol indeholdende 0,1% vandig trifluoreddikesyre, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil- dominerende CSA, 30 (2) de udvundne fraktioner adsorberes pa en bærer til omvendt-fase-HPLC, og der foretages eluering ved vægt- fyldegradient-teknik med en blanding af vand og et organisk opløsningsmiddel, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, 35 (3) de således udvundne fraktioner underkastes højtydende molekularsigte-chromatografi, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, 5 DK 166731 B1 (4) de således udvundne fraktioner underkastes isoelek-trisk punkt-elektroforese, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, eller 5 (5) fraktionerne udvundet i trin (3) underkastes et trin med fjernelse af sialsyre, således der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA.

. ... Som nævnt kan den omhandlede hG-CSF indgå i far maceutiske præparater ifølge opfindelsen; "~sådann'e er 10 ejendommelige ved det i krav 8-10's kendetegnende del angivne.

Fig. 1 på tegningerne viser resultaterne fra SDS-PAGE gennemført på hG-CSF ifølge den foreliggende opfindelse, der er angivet ved prikken på kurven, 15 Fig. 2'viser resultaterne fra isoelektrisk- punkt-elektroforese gennemført på hG-CSF ifølge den foreliggende opfindelse i nærværelse af 4M urinstof,

Fig. 3 viser et UV-absorptionsspektrums-diagram for hG-CSF ifølge opfindelsen, 20 Fig. 4 viser proliferations-profilen for CHU-1, og

Fig. 5 er et andet kurvediagram, der viser resultaterne fra SDS-PAGE gennemført på hG-CSF ifølge opfindelsen.

Hovedtrækkene ved fremgangsmåden ifølge opfindel-25 sen til udvinding af hG-CSF er i det følgende beskrevet med henvisning til CHU-1.

6 DK 166731 B1

En prøve af CHU-1 suspenderes i en F-lO-dyrknings-opløsning indeholdende 10% foetalt kalveserum (PCS) og underkastes rotations-inkubation i en glas-rulleflaske ved konstant hastighed. Når den indre væg af rulle-5 flasken er fuldstændigt dækket med CHU-1, udskiftes dyrkningsopløsningen med FCS-fri RPMI 1640, der underkastes inkubation i 4 dage. Til den udvundne supernatant fra’kulturen sættes igen FCS-holdig F-10-dyrkningsopløsning, og inkubation gennemføres i 3 dage. Dyrknings-10 opløsningen udskiftes igen med FCS-fri RPMI 1640, og efter inkubation i 4 dage udvindes supernatanten fra kulturen. Ifølge denne forskrift bliver cycler med "inkubation og udvinding af supernatant af serum-fri kultur" gentaget, hvorved vindes den endelige super-15 natant fra dyrkning af CHU-1. Den således vundne supernatant underkastes ultracentrifugering, hvorved vindes et omtrent 1.000-2.000 ganges koncentrat, der underkastes gelfiltrering for at udvinde fraktioner med den neutrofil -dominerende CSA. Fraktionerne underkastes gen-20 tagen rensning ved HPLC, hvorved udvindes portioner med den neutrofil-dominerende CSA. Portionerne,frysetørres derefter.

Til formålet ifølge opfindelsen blev CSA målt ved en af de følgende to metoder.

25 Målinger af CSA

(a) Anvendelse af humane benmarvceller:

Inkubation på en blød agar-monolagskultur gennemførtes ved metoden ifølge Bradley, T.R. og Metcalf, D.

(Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci., 44, side 287-300, 1966).

30 Foetalt kalveserum (FCS, 0,2 ml), en analyseprøve (0,1 ml), en suspension af ikke-adhærente humane benmarvceller (0,1 ml, indeholdende 1-2 x 10^ nuclear-celler), modificeret McCoy's 5A-dyrkningsopløsning (0,2 ml) og 0,75% agarholdig modificeret McCoy's 5A-dyrkningsopløsning 7 DK 166731 B1 (0,4 ml) blev blandet og hældt i en formstofskål (diameter 35 mm) til vævdyrkning. Efter koagulation af mediet gennemførtes inkubation ved 37°C og 100% fugtighed med 5% CO^/9^% atm.luft. Antallet af dannede 5 kolonier (én koloni.bestående af 50 eller flere celler) blev talt efter ti dages inkubation, og den aktivitet, der vår- i stand til at danne én koloni, blev taget som én enhed af CSA.

(b) Anvendelse af muse-benmarvceller: 10 Hesteserum (0,4 ml), en analyseprøve (0,1 ml), en suspension af C3H/He (hun)musebenmarvceller (0,1 ml, 5 indeholdende 0,5-1 x 10 nuclearceller) og 0,75% agar-holdig modificeret McCoy's 5A-dyrkningsopløsning (0,4 ml) blev blandet og hældt i en formstofskål (diameter 35 mm) 15 til vævdyrkning. Efter koagulation af mediet blev inkubation gennemført ved 37°C og 100% fugtighed med 5% 00^/95% atm.luft i 5 dage. De dannede kolonier blev talt (én koloni bestående af 50 eller flere celler), og den aktivitet, der var i stand til at danne én koloni, 20 blev taget som én enhed af CSA.

Den modificerede McCoy's 5A-dyrkningsopløsning, der anvendes ved hver af metoderne (a) og (b), og den ved metode (a) anvendte suspension af ikke-adhærente benmarvceller blev fremstillet ved følgende metoder.

25 Modificeret McCoy's 5A-dyrkningsopløsning.

12 g McCoy's 5A-dyrkningsopløsning (produkt fra Gibco Co.), 2,55 g MEM aminosyre/vitamin-medium (produkt fra Nissui Seiyaku Co., Ltd), 2,18 g natrium-bicarbonat og 5.000 enheder kaliumpenicillin G blev 30 opløst i 500 ml to gange destilleret vand, og opløsningen blev steriliseret ved passage gennem et millipore-filter (0,22 ym).

Suspension af ikke-adhærente humane benmarvceller.

Benmarvceller vundet fra en rask voksen ved 35 sternal punktur blev fortyndet 5 gange med RPMI 1640- dyrkningsopløsning. Fortyndingen blev anbragt over R)

Ficoll Paque - opløsning (produkt fra Pharmacia Fine Chemicals), og blandingen blev centrifugeret ved 400 x DK 166731 B1 8 g og 25°C i 30 minutter for at udvinde det mellemliggende cellelag (specifik vægtfylde <1,077). Laget, blev vasket med RPMI 164O-opløsning, og celleantallet blev ind- g stillet til en koncentration på 5 x 10 celler/ml med 5 RPMI 1640-dyrkningsopløsning indeholdende 20% FCS. Op- 2 løsningen blev hældt i en 25 cm .formstofkolbe til vævdyrkning. Efter inkubation i en CO^-inkubator .i 30 minutter udvandtes ikke-adhærente celler fra super- 2 natanten og blev anbragt i en formstofkolbe (25 cm ).

10 Efter 2,5 timers inkubation blev ikke-adhærente celler indsamlet fra supernatanten.

Når hG-CSF ifølge den foreliggende opfindelse fik lov at indvirke på muse-benmarvceller og humane benmarvceller blev der, som vist nedenfor i Eksempel 6, 15 observeret stimuleret dannelse af neutrofile granulocyt-kolonier. Dette viser klart, at hG-CSF ifølge opfindelsen er af den type, der fremmer differentiering og proliferation af benmarvceller til neutrofile granulocyter.

Følgende Reference-eksempel er tilvejebragt for 20 at beskrive fremgangsmåden til etablering af CHU-1.

Ref er ene e-eksempel (i) Tumor:

Stykker af tumorvæv fra en patient med oral 25 cancer ledsagende en bemærkelsesværdig forøgelse af antallet af neutrofile blev transplanteret ind i en nu/nu mus. Ca. 10 dage efter transplantationen blev der observeret en bemærkelsesværdig forøgelse af størrelsen af tumoren og antallet af neutrofile. 12 30 Dage efter transplantationen blev tumoren udtaget 3 aseptisk fra musen og opdelt i små stykker (1-2 mm ), der blev underkastet følgende inkubationer.

(ii) Primær kultur:

Ti til femten tumorstykker blev anbragt i et 50 ml 35 formstof-centrifugerør. Efter tilsætning af 5 ml af en trypsinopløsning (0,25% trypsin og 0,02% EDTA) blev blandingen rystet i et varmt bad (37°C) i 10 minutter. Supernatanten blev bortkastet, og 5 ml af en trypsin- 9 DK 166731 B1 opløsning med samme sammensætning som anvendt ovenfor blev tilsat, og trypsindigerering gennemførtes under omrøring ved 37°C i 15 minutter. En cellesuspension blev udvundet og blandet med 1 ml PCS for at hindre 5 indvirkning af trypsin. Cellesuspensionen blev lagret i isbad.

Samme fremgangsmåde blev gentaget fon at udvinde en cellesuspension, der blev kombineret med den ovenfor vundne suspension og centrifugeret ved 1500 rpm i 10 10 minutter, hvorved vandtes celle-pellets. Disse pellets blev vasket to gange med F-10-dyrkningsopløsning indeholdende 10% FCS og transplanteret i en 2 formstof-inkubationskolbe (25 cm ) til opnåelse af en r koncentration på 5 x 10 celler/kolbe. Kolben blev in-15 kuberet med F-10-dyrkningsopløsning indeholdende 10% FCS natten over i en CC^-inkubator (5% CC^ og 100% fugtighed). Supernatanten blev fjernet sammen med ikke-adhærente celler, og efter tilsætning af·en frisk dyrkningsopløsning blev inkubation forsat. På den 6. dag 20 af inkubationen var cellerne groet sammen, og dyrkningsmediet blev udvekslet med et frisk. På den næste dag blev dyrkningsopløsningen bortkastet, og efter tilsætning af 2 ml "anti-mouse red blood cells" (produkt fra Oappel Corporation), der var fortyndet 5 gange med RPMI 1640, 25 og 2 ml af et marsvin-komplement (produkt fra Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), der var fortyndet 2,5 gange med RPMI 1640, blev blandingen inkuberet ved 37°C i 20 minutter. Efter endt inkubation blev kulturen vasket to gange med 10% FCS-holdig F-10,og de fra nu/nu muse-30 stammende fibroblaster blev fjernet. Derefter blev der tilsat en F-10-dyrkningsopløsning indeholdende 10% FCS, og inkubation blev fortsat.

(iii) Subkultur: Når den indledende kultur var fuldstændigt fyldt 35 med dyrkede celler, blev den erstattet med F-10- dyrkningsopløsning indeholdende 10% FCS, og subdyrkning gennemførtes på den følgende dag. Efter at dyrkningsopløsningen var fjernet med en Komagome's pipette, blev 10 DK 166731 B1 der tilsat 2 ml fysiologisk salt-opløsning indeholdende 0,02% forvarmet (37°C) EDTA, og der blev opvarmet på en varm plade ved 37°C i 2 minutter. Derefter blev cellerne løsgjort ved pipettering. Efter tilsætning af 5 0,5 ml FCS blev cellesuspensionen overført til et 15 ml centrifugerør og centrifugeret ved 1500 rpm i 10 minutter, hvorved vandtes celle-pellets. Disse pellets-blev suspenderet i 1 ml F-10-dyrkningsopløsning og opdelt i ti portioner til subdyrkning. Samme fremgangsmåde blev 10 gentaget til gennemførelse af subdyrkning med intervaller på 4 eller 5 dage. Reproduktionsevnen hos de således vundne celler blev undersøgt ved følgende metode. En suspension indeholdende 5 x 104 celler/ml blev fremstillet, og tyve 1 ml's suspensionslag blev 15 transplanteret i en formstofskål (diameter 35 mm).

Under inkubation i en C02~inkubator blev skålen udtaget med bestemte intervaller, og adhærente celler blev udvundet og deres antal bestemt. Resultaterne er vist i Fig. 4. Ca. 20-24 timer efter celle-implantationen 20 startede celle-multiplikation med en gennemsnitlig fordoblingstid på ca. 20 timer.

Den således vundne CHU-1 kan anvendes som den cellelinie, der er i stand til at producere hG-CSF i-følge opfindelsen, hvilket nedenfor er beskrevet gennem 25 eksempler med reference til CHU-1. Det vil imidlertid forstås, at opfindelsens område ikke er begrænset til denne CHU-1. For eksempel kan der til den foreliggende opfindelse også anvendes en mikroorganisme-stamme eller cellelinie, der er skabt ved en rekombinant DNA-metode.

30

Eksempel 1 Isolering af hG-CSF.

2

Da to inkubations-kolber (150 cm ) var fuldstændigt fyldt med CHU-1, blev cellerne udvundet og 35 suspenderet i 500 ml F-10-dyrkningsopløsning indeholdende 2 10% FCS. Cellesuspensionen blev overført til en 1580 cm glas-rulleflaske (produkt fra Belco Corporation) og underkastet rotations-inkubation ved 0,5 rpm. Da den 11 DK 166731 B1 iijdre væg af flasken var fuldstændigt dækket med dyrkede celler, blev dyrkningsopløsningen erstattet, med serumfri RPMI 1640. Efter 4 dages inkubation blev super-natanten fra kulturen udvundet og blandet med F-10 inde-5 holdende 10% FCS til genemførelse af forsat inkubation.

Efter 3 dages inkubation blev dyrkningsopløsningen igen eirstattet med serumfri RPMI 1640 og underkastet- 4 dages inkubation efterfulgt af udvinding af supernatanten fra kulturen. Ved at gentage samme fremgangsmåder vandtes 10 hver uge pr. flaske 500 ml serumfrit konditioneret medium. Denne metode muliggør en temmeligt langvarig celle-bevaring og udvinding af det konditionerede medium.

Til en enkelt portion bestående af 5000 ml af det udvundne konditionerede medium blev der sat Twee^20 ved 15 en koncentration på 0,01%, og blandingen blev koncentreret ca. 1000 gange ved ultrafiltrering under anvendelse af Hollow Fiber DC-4 og AmicoiPpM-10 (produkt fra Amicon Corporation). Det koncentrerede konditionerede medium blev renset ved følgende trinrække 20 (i) En portion (5 ml) af koncentratet blev underkastet gelfiltrering på en UltrogeipAcA 54-søjle (4,6 cm diameter og 90 cm lang, produkt fra LKB Corporation) ved en strømningshastighed på ca. 50 ml/time under anvendelse af 0,01M Tris-HCl-puffer (pH 7,4) indeholdende 25 0,15M NaCl og 0,01% Tween^20 (produkt fra Nakai

Kagaku K.K.). Søjlen var kalibreret med okseserumal-bumin (mol. vægt 67.000), ovalbumin (mol. vægt 45.000) og cytochrom C (mol.vægt 12.400). Efter gelfiltreringen blev der udtaget en prøveportion på 0,1 ml fra hver af 30 fraktionerne og fortyndet 10 gange. Aktiviteten af hver fraktion blev checket ved ovennævnte metode (b) til bestemmelse af CSA. Fraktioner med Ve = 400 - 700 ml viste makrophag-dominerende CSA, mens fraktioner med Ve = 800-1200 ml udviste granulocyt-dominerende CSA. Fraktionerne 35 fra den anden gruppe blev derfor samlet og koncentreret til et volumen på ca. 5 ml ved ultrafiltrering under anvendelse af PM-10 (produkt fra Amicon Corporation).

(ii) Til de koncentrerede fraktioner blev der sat en 12 DK 166731 B1 0/1% vandig opløsning af trifluoreddikesyre indeholdende 30% n-propanol (aminosyre-sekvensbestemmel-seskvalitet, produkt fra Tokyo Kasei K.K.), og blandingen blev henstillet i is i ca. 15 minutter. Derefter blev blandingen 5 centrifugeret ved 15000 rpm i 10 minutter for at fjerne . .bundfaldet. Derefter blev supernatanten ledt gennem en mikro-Bondapak C18-søjle (semi-præparatorisk: søjle fremstillet af Waters Associates, Inc.), der var ækvili-breret med en vandig opløsning indeholdende n-propanol 10 af aminosyre-sekvensbestemmelseskvalitet og trifluoreddikesyre. Søjlen blev fremkaldt ved lineær gradient-eluering med 30-60% n-propanol indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre. Et HPLC-apparat (Model 685-50 fra Hitachi, Ltd.) sammen med en detektor (Model 638-41 fra 15 Hitachi, Ltd.) anvendtes til samtidig måling af absorptioner ved 220 nm og 280 nm. Efter eluering blev en 10 ml portion fraskilt fra hver af fraktionerne og fortyndet 100 gange. Aktiviteten af hver fraktion blev checket ved ovennævnte metode (b) til bestemmelse af 20 CSA. Spidserne elueret med 40% n-propanol fandtes at have den neutrofil-dominerende CSA, hvorfor disse spidso: blev samlet og underkastet HPLC under de samme betingelser som anvendt ovenfor. Når fraktionerne blev checket for CSA ved samme metode som ovenfor, blev det 25 igen bekræftet, at spidserne svarende til 40% n-propanol havde den neutrofil-dominerende CSA. Fire fraktioner (4 ml) fra sådanne spidser blev derfor samlet og frysetørret.

(iii) Det frysetørrede pulver blev opløst i 200 yl af 30 en 40% n-propanol indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre, og opløsningen blev underkastet HPLC på en TSK-G-3000 SW-søjle (2,5 mm x 60 cm, produkt fra Toyo Soda Manufacturing Co., Ltd.). Eluering gennemførtes ved 0,4 ml/min. med 40% n-propanol indeholdende 0,1% trifluor-35 eddikesyre. Ved hjælp af en fraktions-opsamler (FRAC-100 fra Pharmacia Fine Chemicals) blev der opsamlet 0,4 ml's fraktioner. De udvundne fraktioner blev checket for deres CSA ved samme metode som anvendt oven- 13 DK 166731 B1 fpr, og fraktioner med retentionstider på 37-38 minutter (svarende til en molekylvægt på ca. 20.000). fandtes at have den neutrofil-dominerende CSA. Disse fraktioner blev derfor samlet og renset med en analytisk mikro-5 Bondapak C 18-søjle (4,6 mm x 30 cm). Derefter blev hovedspidserne udvundet og frysetørret.

Eksempel 2

Fysisk-kemiske egenskaber.

10 De fysisk-kemiske egenskaber af hG-CSF ifølge op findelsen, der var fremstillet i Eksempel 1, blev bestemt ved følgende analyser og teste.

(i) Molekylvægt.

(a) Molekylvægten af hG-CSF blev bestemt ved 15 natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE). Elektroforese-udstyret var Model GE-2/4 (Pharmacia Fine Chemicals), og gelen var lavet af en polyacrylamid-pladegel (T = 15% og C = 2,6%) med målet 70 mm x 70 mm x 3 mm og en koncentrerende gel 20 (T =3%, C = 20%). En modificeret hG-CSF-prøve blev fremstillet ved følgende proces: hG-CSF blev kogt i 3 minutter i en opløsning indeholdende 2% natriumdodecylsulfat i 0,64M 2-mercaptoethanol, og urinstof blev derefter sat til opløsningen til en slutkoncentration på 4M.

25 Efter gennemførelse af elektroforese på 2 yg af prøven ved 120 volt i 3 timer, blev gelen fjernet og fikseret med methanol:eddikesyre:vand (4:1:5) og farvet til bånd-detektion ved anvendelse af Silver Stain (produkt fra Bio-Rad Corporation). Okseserumalbumin (BSA, 30 mol.vægt 67.000), ovalbumin (OVA, mol.vægt 45.000), cytrochrom C (Cyt.C, mol.vægt 12.000) og insulin (Ins., mol.vægt af A-kæde: 3.300, mol.vægt af B-kæde: 2.400) anvendtes som molekylvægt-markører efter lignende behandlinger. Et enkelt bånd svarende til en molekylvægt 35 på ca. 18.000 blev påvist. Resultaterne fra molekylvægt-måling er vist i Fig. 1.

(b) Molekylvægten af hG-CSF blev bestemt ved natrium-dodecylsulfat-polyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE), 14 DK 166731 B1 men denne gang var elektroforese-udstyret PROTEAN (16 cm, Produkt fra Bio-Rad Corporation) under anvendelse af en gel fremstillet af en polyacrylamid-pladegel (T = 15%, C = 2,6%) med målene 140 mm x 5 160 mm x 1,5 mm, og en koncentrerende gel (T = 3%, C =

20%). En denatureret hG-CSF-prøve blev fremstillet ved følgende proces; hG-CSF blev kogt i 3 minutter i .en opløsning indeholdende 2% natriumdodecylsulfat i 0,46M

2-mercaptoethanol. Efter gennemførelse af elektro-10 forese på 4 yg af prøven med en konstant strøm på 30 mA i 4 timer blev gelpladen fjernet og farvet med 0,25% Coumasy Brilliant Blue R 250 (produkt fra Sigma Chemical Co.) til bånd-detektion. De følgende stoffer anvendtes som molekylvægt-markører efter lignende 15 behandlinger: phosphorylase B (mol.vægt 92.500), okse-serumalbumin (BSA, mol.vægt 67.000), ovalbumin (OVA, mol.vægt 45.000), kulsyreanhydrase (mol.vægt 31.000), sojabønne-trypsininhibitor (mol.vægt 21.500) og lyso-zym (mol.vægt 14.400). Et enkelt bånd svarende til en 20 molekylvægt på omtrent 19.000 blev påvist. Resultaterne fra molekylvægtmåling er vist i Fig. 5.

(c) I betragtning af resultaterne (a) og (b) blev hG-CSF ifølge opfindelsen vurderet til at have en molekylvægt på 19.000 + 1.000 bestemt ved SDS-PAGE.

25 (ii) Isoelektrisk punkt.

Det isoelektriske punkt for hG-CSF ifølge opfindelsen blev bestemt med et isoelektrisk fladtlags-elektroforeseapparat, FBE-3000 (produkt fra Pharmacia Fina Chemicals). Efter 2 timers elektroforese med en 30 konstant effekt på 30 watt (Vmax = 2.000 volt) på en polyacrylamidgel (T = 5%, C = 3%, 115 mm x 230 mm) indeholdende Pharmalyte^ (pH = 4-6,5, Pharmacia Fine Chemicals) og 4M urinstof, blev hG-CSF fikseret med 30% methanol/10% trichloreddikesyre/35% sulfosali-35 cylsyre og farvet med Coumasy Brilliant Blue R-250.

Et Low pi-udstyr (pH: 2,5-6,5, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) anvendtes som en isoelektrisk punktmarkør.

15 DK 166731 B1

Observation af båndseparation i pH-området fra 4 til 6/5 gav tre tydelige bånd svarende til pi = 5,73, 6.03 og 6,37, blandt hvilke de to bånd for pi = 5,73 og 6.03 var dominerende komponenter. Måleresultaterne er 5 vist i Fig. 2, hvori CSFQ, CSF1 og CSF2 ahgiver hG-CSF ifølge opfindelsen med forskellige isoelektriske punkter. Iso-el-éktrisk elektroforese ved fravær af urinstof frembragte tre bånd svarende til pi = 5,52, 5,80 og 6,13.

Ti målinger af isoelektrisk punkt gennemførtes 10 ved metoden beskrevet ovenfor, og resultaterne er vist i Tabel I, der anfører tre isoelektriske punkter A, B og C, der afviger indbyrdes med ca. 0,3.

For at se, om der var nogen sammenhæng mellem de tre bånd af isoelektrisk punkt og værdierne af CSA, blev 15 den hG-CSF, der lige var renset med TSK-G 3000 SW-søjlen i Eksempel 1 (iii) underkastet båndseparation med et præparativt isoelektrisk elektroforese-apparat,

Model FBE-3000 fra Pharmacia Fine Chemicals. Båndseparationsbetingelserne var følgende.

20 Prøve: En frysetørret prøve af CSF (500 yg) blev opløst i 1 ml 0,05N phosphorsyre indeholdende 4M urinstof.

Bærer: Til 15 g Sephade^IEF (produkt fra Pharmacia Fine

Chemicals) blev der .sat 225 ml to gange destilleret 25 vand indeholdende 4M urinstof og 0,1% Tweerr20.

Efter tilsætning af 12 ml Pharmalyt<P}pH: 4-6,5, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) blev blandingen henstillet natten over, indtil den kvældede. Derefter blev blandingen afluftet grun-30 digt i en sugeflaske og hældt på en glasplade (230 mm x 230 mm) til dannelse af et ensartet gellag i en tykkelse på 5 mm. Gellaget blev fjernet fra pladen med undtagelse af den mest ensartede del dækkende et areal på 50 mm x 230 mm.

35 Elektrode-opløsninger:

Elektrodestrimler (6 x 10 mm, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) blev imprægneret med 0,1M phosphorsyre (anode) og 0,1M NaOH (katode).

16 DK 166731 B1

Den ene strimmel blev anbragt parallelt med den ene ende af gelen, og den anden strimmel blev anbragt parallelt med den anden ende af gelen. Elektroderne blev forbundet til en konstant 5 effektkilde ECPS 2000/300, produkt fra Pharmacia

Fine Chemicals.

Præliminær elektroforese: — .

45 minutter ved 8 watt.

Tilsætning af prøve: 10 En gel med en bredde på 1 cm blev afskrabet ved en position 5 cm fra anodeenden og genanbragt i den oprindelige position efter blanding med en prøveopløsning.

Elektrofores e: 15 4 timer ved 50 watt leveret fra den konstante effektkilde ECPS 2000/300.

Efter endt elektroforese blev gelpladen taget ud af tanken og opdelt i 26 fraktioner med et fraktioneringsgitter. Efter måling af pH for hver af 20 fraktionerne blev den fra hver fraktion skrabede gel overført til en polypropylen-minisøjle (Muromac fra Muromachi Kagaku K.K) og underkastet ekstraktion med 4 ml 4M guanidin-hydrochlorid indeholdende 0,1% trifluoreddikesyre. En portion (5 μΐ) af hver af de 25 ekstraherede fraktioner blev fortyndet med 2 ml RPMI 164O-dyrkningsmedium indeholdende 1% okseserumalbumin og checket for dens CSA ved ovennævnte metode (b) til CSA-bestemmelse. Hver af de eluerede fraktioner indeholdt tre aktive spidser, der stemte godt overens med 30 de ovennævnte tre isoelektriske punkter pI-5,73, 6,03 og 6,37.

For at checke, om forskellene i isoelektrisk punkt kunne tilskrives peptiddelen af hG-CSF eller sukkerkæden (navnlig antallet af sialsyre-additioner), blev to 35 hG-CSF-prøver, den ene behandlet med neuraminidase og den anden ubehandlet med neutraminidase, underkastet elektroforese. Tre bånd blev observeret i den ubehandlede prøve, men kun et enkelt bånd for pi = 6,37 blev 17 DK 166731 B1 observeret i den neuraminidase-behandlede prøve. Isoelektrisk elektroforese blev også gennemført for en hG-CSF-prøve, der var opløst i en vandig opløsning af 6M guanidin-saltsyre efterfulgt af pH-indstilling til 1,5 med IN 5 HC1 og henstand ved 80°C i 120 minutter. Båndskift, der forekom i denne behandlede prøve, var de samme som dem, der--forekom i den neuraminidase-behandlede-prøve_ Neuraminidase-behandlingen medførte ingen skade for CSA. Disse resultater synes at vise, at forskellene i 10 isoelektrisk punkt for hG-CSF formodentligt skyldes forskellen i antallet af sialsyre-additioner.

(iii) UV-absorption.

Prøven blev checket for dens UV-absorption med et spektrofotometer, idet der som reference anvendtes 15 0,1% trifluoreddikesyre indeholdende 40% n-propanol. Som vist i Fig. 3 forekom en maksium-spids ved 280 nm og en minimum-spids ved 250 nm.

(iv) Aminosyrer i proteindelen.

Prøven blev hydrolyseret på konventionel måde 20 og analyseret for aminosyresammensætning af proteindelen med en automatisk aminosyre-analysator, Model 835 fra Hitachi, Ltd. Resultaterne er vist i Tabel II. Hydrolysen gennemførtes under følgende betingelser.

(a) 6N HC1, 110°C x 24 timer i vakuum, 25 (b) 4N methansulfonsyre + 0,2% 3-(2-aminoethyl)indol, 110°C x 24, 48 eller 72 timer i vakuum.

Hver af prøverne blev opløst i en opløsning (1,5 ml) indeholdende 40% n-propanol og 0,1% trifluoreddikesyre. Portioner (0,1 ml) af opløsningerne blev 30 tørret med tør ^-gas og blandet med reagens (1) eller (2) til hydrolyse i tilsmeltede testrør i vakuum.

Hver af de "Målte værdier" i Tabel II var et gennemsnit af fire værdier, dvs. 24 timers-værdien for (1) og 24, 48 og 72 timers-værdierne for (2).

35 Mængderne af Thr, Ser, l/2Cys, Met, Val, Ile og Trp blev beregnet ved følgende metoder (se Seikagaku Jikken Koza, Tanpakushitsu Kagaku II, publiceret af Tokyo Kagaku Do~in): 18 DK 166731 B1 a). Målinger blev foretaget af de tids-afhængige ændringer af 24, 48 og 72 timers-værdierne for Thr, .Ser, l/2Cys og Met efter hydrolyse med (2), og disse data blev ekstrapoleret for nul time.

5 b) Målinger blev foretaget af 72 timers-værdierne for Val og Ile efter hydrolyse med (2). c )~'Målinger blev foretaget af 24, 48 og 72-timers-værdierne for Trp efter hydrolyse med (2), og af disse værdier blev taget gennemsnittet.

10 Værdierne vist i kolonnen "Forudsagt antal af aminosyrerester" er baseret på formodningen om eksistens af 33 Leu'er. De aminosyrer, der kræver korrektion af den ovenfor beskrevne type, bliver i almindelighed ødelagt delvis eller i betydelig grad under hydrolyse, 15 eller de er modstandsdygtige over for hydrolyse. Navnlig frembringer Pro et lavt farveudbytte. Primært af disse grunde har de virkeligt målte indhold (nmol) af aminosyrer af interesse, og dermed det beregnede antal af hver af resterne, en tendens til at være lavere end de 20 teoretiske værdier (se Seikagaku Jikken Koza, ibid.).

25 30 35 DK Ί6673Ί bl 19

Tabel II

~: Forudsagt antal af aminosyrerester (af-

Aminosyrer Målte værdier rundet til det i 5 (nmol) parentes anførte integral)

Asp (Asp + Asn) 3,54 4,3 (4) . - Thr 4,58 5,5 (6)

Ser 10,64 12,5 (i'5)" 10 Glu (Glu + Gin) 22,31 27,0 (27)

Pro 8,30 10,1 (10)

Gly 10,60 12,8 (13)

Ala 14,85 18,9 (18) \ Cys 2,59 3,1 (3) 15 Val 6,16 7,15 (7)

Met 2,26 2,7 (3)

Ile 3,29 4,0 (4)

Leu 27,24 33,0 (33)

Tyr 2,60 3,1 (3) 20 Phe 5,08 6,1 (6)

Lys 3,68 4,5 (4)

His 3,93 4,8 (5)

Trp 1,61 1,9 (2)

Arg 4,29 5,2 (5) .

25 Total (166)

Beregnet molekylvægt (intet sukker talt i 166 rester) 17961 30 (v) Temperaturstabilitet.

En frysetørret CSF-prøve (1 mg) blev opløst i 4 ml 0,1% trifluoreddikesyre indeholdende 40% n-propanol. En portion (1 ml) af opløsningen blev fortyndet med 10 ml 0,01M Tris-HCl puffer (pH 7,4) inde-35 holdende II okseserumbumin, hvorved vandtes en CSF- koncentration på 25 ng/ml. Fem yderligere fortyndinger af prøven blev fremstillet på samme måde som ovenfor beskrevet, og de ialt seks fortyndinger blev behandlet i 40 minutter ved varierende temperaturer, nemlig 20 DK 166731 B1 0, 37, 45, 56 og 100°C. Bestemmelse af den resterende CSA i hver af prøverne viste, at hG-CSF ifølge opfindelsen var stabil ved 0-45°C og blev inaktiveret ved 56°C.

5 (vi) pH-Stabilitet.

En frysetørret hG-CSF-prøve (1 mg) blev opløst i 4 Ttrl 0,1% trifluoreddikesyre indeholdende--40.% n-propanol. Portioner (1 ml) af opløsningen blev fortyndet med 10 ml's opløsninger indeholdende 1% okseserumalbumin, der var 10 pufret ved pH-værdierne 1, 3, 5, 7, 9, 11 og 13. Efter indstilling af CSF-koncentrationen til 25 ng/ml blev fortyndingerne henstillet i is i 24 timer. Derefter blev 2 ml af hver fortynding dialyseret mod en 0,01M Tris-HCl-puffer (pH 7,4) og undersøgt for resterende 15 CSA. hG-CSF ifølge opfindelsen fandtes at være stabil over et bredt pH-område fra 1 til 11.

(vii) Enzym-stabilitet.

En frysetørret hG-CSF-prøve blev opløst i 0,1% trifluoreddikesyre indeholdende 40% n-propanol, og fire 20 prøver blev fremstillet ved at blande 0,67 yg af opløsningen med 0,05M Tris-HCl-puffer (pH 8,0) til ialt 1 ml. En anden prøve blev fremstillet ved at blande 0,67 yg af trifluoreddikesyre-opløsningen med 0,05M acetatpuffer (pH 5,0) til ialt 1 ml. Til tre af de første 25 fire prøver blev der sat RNase, trypsin og pronase i mængder på 1 yg, mens den fjerde prøve anvendtes som kontrol. Til den femte prøve blev der sat 1 yg neuraminidase. De fem prøver blev omsat ved 37°C i 2 timer. Efter endt reaktion blev 0,1 ml’s portioner udtaget af prøverne 30 og fortyndet med 1 ml RPMI 164O-dyrkningsopløsning indeholdende 1% okseserumalbumin. CSA-undersøgelse viste, at hG-CSF ifølge opfindelsen ikke blev inaktiveret af RNase eller neuraminidase, men blev inaktiveret af trypsin og pronase.

35 (viii) Sukker-sammensætning.

En prøve (linmol) blev blandet med 25 nmol inositol som en intern standard og 500 yl, 1,5N HC1-methanol og derefter underkastet omsætning ved 90°C i 21 DK 166731 Bl 4. timer i et NC^-renset tilsmeltet rør. Efter endt reaktion blev røret åbnet ved den ene ende.-og forsynet med sølvcarbonat (Ag2C0.j) til neutralisation. Efter tilsætning af eddikesyreanhydrid (50 yl) og rystning blev 5 blandingen henstillet på et mørkt sted natten over ved stuetemperatur. Det øvre lag blev . anbragt i et prøverør og tørret med ^-gas. På den anden side-blev-bundfaldet vasket med frisk tilsat methanol og centrifugeret let. Det øvre lag blev hældt i prøverøret, der 10 var tørret med K^-gas, og igen tørret. Til det tørrede indhold blev der sat 50 yl af et TMS-reagens (5:1:1-blanding af pyridin, hexamethyldisilazan og tromethyl-chlorsilan), og efter omsætning ved 40°C i 20 minutter blev blandingen lagret i en dybfryser. Samme processer 15 fulgtes med den undtagelse, at den interne standard var en kombination af 25 nmol inositol og 50 nmol af et andet sukker, såsom galactose (Gal), N-acetylgalactos-amin (Gal NAc) og sialsyre.

De fremstillede prøver blev underkastet gas-20 chromatografi under følgende betingelser. .

Prøvebetingelser.

Søjle: 2% OV - 17 Vinport HP (60-80 mesh), 3m, glas.

Temperatur: forhøjet til en temperatur mellem 110 og 250°C med en hastighed på 4°C/min.

2 25 Bæregastryk: 1,2-1,6 kg/cm KL· i det indledende trin 2 ^ og 2-2,5 kg/cm KL· mod prøvens afslutning.

3 ^

Sensibilitet: 10 megaohm for et område på 0,1 - 0,4 volt.

2 2

Tryk: 0,8 kg/cm og 0,8 kg/cm atm.luft.

30 Prøvetilførsel: 2,5-3,0 yl.

Analyse viste, at hG-CSF ifølge opfindelsen var sammensat af tre sukkerarter, galactose, N-acetyl-galactosamin og sialsyre. .

(ix) Bestemmelse af aminosyre-sekvens.

35 En prøve blev underkastet Edman's dekomponering i en gasfase-sekvensbestemmer (produkt fra Applied Biosystem, Inc.), og den vundne PTH-aminosyre blev prøvet ved konventionel teknik under anvendelse af en HPL- 22 DK 166731 B1 chromatograf (produkt fra Beckman Instruments, Inc.) og en Ultrophere-ODS-søjle (produkt fra Beckman Instruments, Inc.)· Søjlen (5 ym, 4,6 mm i diameter og 250 mm lang) blev først ækvilibreret med en start-puffer (15mM 5 natriumacetat-puffer, pH 4,5, en vandig opløsning indeholdende 40% acetonitril). Derefter blev en prøve, der _ var opløst i 20 yl af start-pufferen, underkastet aminosyre-separation ved isokratisk eluer'ing med- startpufferen. Strømningshastigheden var 1,4 ml/min, og 10 søjle-temperaturen holdtes ved 40°C. Påvisning af PTH-aminosyren foregik ved anvendelse af UV-absorption ved 269 nm og 320 nm. Prøver (2 nmol) af standard-PTH-aminosyre (Sigma Chemical Co.), der havde været underkastet aminosyre-separation i samme system til be-15 stemmelse af retentionstider, anvendtes som referencer, hvormed retentionstiderne for prøven blev sammenlignet for at identificere aminosyre-sekvensen. Anbringelsen af 21 aminosyrer fra N-terminalen var følcrende: 2 0 H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Lau- ^ro-Gln-(Ser)-Phe-Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu- 25 hvor X er en naturligt forekommende uidentificeret amino-syrerest.

30 35

UK lbt>/\5 l D I

23

Eksempel 3

Bestemmelse af specifik aktivitet De specifikke aktiviteter af hG-CSF fra Eksem-, pel 1 for humane benmarvceller blev målt ved ovennævnte metode (a) til CSA-bestemmelse. Resultatet var 3,94 x 7 5 10 E/mg eller højere.

*·»-_

Eksempel 4

Det frysetørrede pulver af hG-CSF fremstillet i Eksempel 1 blev opdelt i individuelle hG-CSF-komponenter 10 i henseende til forskelle i isoelektrisk punkt, som bestemt ved præparativ isoelektrisk elektroforese under følgende betingelser:

Udstyr: FBE-3000 (produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) ,

Prøve : 10 mg af det frysetørrede pulver blev opløst

15 i 2 ml 0,05N phosphorsyre indeholdende 4M

Fine Chemicals) blev der sat 225 ml to gange destilleret vand indeholdende 4M urinstof og (£) 20 0,1% Tweein Efter tilsætning af 12 ml Pharma- lyte^pH 4-6,5, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals) blev blandingen henstillet natten over, indtil den kvældede. Derefter blev blandingen grundigt afluftet i en sugeflaske og 25 hældt på en glasplade (230 mm x 230 mm) til dannelse af et ensartet lag med en tykkelse på 5 mm.

Elektrode-opløsninger:

Elektrodestrimler ( 6 x 10 mm, produkt fra Phar-30 macia Fine Chemicals) blev imprægneret med 0,1M

phosphorsyre (anode) og 0,1M NaOH (katode). Den ene strimmel blev anbragt parallelt med den ene ende af gelen, og den anden strimmel blev anbragt parallelt med den anden ende af gelen. Elektro-35 derne blev forbundet til en konstant effektkilde ECPS 2000/300, produkt fra Pharmacia Fine Chemicals.

24 DK 166731 B1

Præliminær elektroforese: 45 minutter ved 8 watt.

Tilsætning af prøve:

En gel med en bredde på 1 cm blev skrabet ved 5 en position 5 cm fra anoden og genanbragt i den oprindelige position efter blanding med en prøveopløsning. -

Elektroforese: 4 timer ved 50 watt leveret fra den konstante 10 effektkilde, ECPS 2000/300.

Efter endt elektroforese blev gelpladen udtaget af tanken og opdelt i 26 fraktioner med et fraktioneringsgitter. Efter måling af pH for hver af fraktionerne blev den fra hver fraktion skrabede gel overført 15 til en polypropylen-minisøjle (Muromac fra Muromachi Kagaku K.K.) og underkastet ekstraktion med en 0,1% vandig trifluoreddikesyreopløsning (10 ml) indeholdende 4M guanidin-hydrochlorid. En portion ( '5 yl) af hver af de ekstraherede fraktioner blev fortyndet med 20 16 ml RPMI 164O-dyrkningsopløsning indeholdende 1% okseserumalbumin og checket for CSA ved ovennævnte metode (b) til CSA-bestemmelse. Hver af fraktionerne udviste aktivitetsspidser i det væsentlige i overensstemmelse med tre forskellige isoelektriske punkt-25 spidser pi = 5,73, 6,03 og 6,37.

De respektive aktive fraktioner blev absorberet på en mikro-Bondapak C 18-søjle (Waters Associates,

Inc., semi-præparativ kvalitet, 8 mm x 30 cm), der var ækvilibreret med en vandig opløsning indeholdende 30 n-propanol og trifluoreddikesyre. Fraktionerne blev derefter elueret med en 0,1% vandig trifluoreddikesyreopløsning indeholdende n-propanol og med en lineær koncentrationsgradient på 30-60%. De med 40% n-propanol eluerede spidser blev udvundet og frysetørret.

35 Aminosyrerne i de udvundne fraktioner og deres sekvens blev undersøgt ved metoderne anvendt i Eksempel 2(iv) og (ix). Resultaterne var i overensstemmelse med dem i Eksempel 2 opnåede.

DK 166731 61 25

Eksempel 5

En portion (10 mg) af det frysetørrede hG-CSF-pulver fremstillet i Eksempel 1 blev opløst i 2 ml af en blanding (pH 9,0) og 0,1M natriumcarbonat og natriumbi-5 carbonat. Opløsningens pH blev indstillet på 5,0 med IN HC1. Efter tilsætning af neuraminidase blev blandingen underkastet reaktion ved 37°C i 2-4;imer,_ og reaktionsblandingen blev adsorberet på en mikro-Bondapak C 18-søjle (Waters Associates, Inc., semi-præparativ 10 kvalitet, 8 mm x 30 cm), der var ækvilibreret med en vandig opløsning indeholdende n-propanol og trifluor-eddikesyre. Den adsorberede blanding blev elueret med en 0,1% vandig opløsning af trifluoreddikesyre indeholdende n-propanol og med en lineær koncentrations-15 gradient på 30-60%. De med 40% n-propanol eluerede spidser blev udvundet og frysetørret. En del af det frysetørrede pulver blev underkastet analytisk iso-elektrisk elektroforese, hvorved frembragtes et enkelt bånd svarende til pi = 6,37.

20

Eksempel 6

Koloniklassificering

Kolonier dannet ifølge ovennævnte metode (a) til CSA-bestemmelse blev, sammen med et agar-lag, overført 25 på en glasplade ved metoden ifølge Kubota, K. et al.

(Exp. Hemat., 8_r side 339-344, 1980) og tørret til dannelse af en prøve i filmform. Denne prøve blev underkastet koloni-klassificering ved både esterase-dobbeltfarvning og Bieblich scarlet-farvning ved 30 metoden ifølge Konwalinka, G. et al. (Exp. Hemat., £, side 434-440, 1980). Detaljer ved metoden ifølge Konwalinka, G. et al. er angivet nedenfor.

(1) Fikserings-opløsning: Pufret formalin/acetone-op-løsning (pH 6,6) 26 DK 166731 B1

Na2HP04 20 mg KH2P04 100 mg H20 30 ml

Acetone 45 ml 5 Formalin_25 ml

Total 100 ml (lagret ved 4°C) (2) Ikke-specifik esterasefarvnings-reaktionsopløsning (fremstillet lige før brug) bestående af en filtreret blanding af følgende komponenter (A) og (B): 10 (A) Phosphat-puffer (1/15 mol/1.000 ml, pH 6,3) 9,5 ml

Fast Garnet BGC-salt 10 mg (B) a-Naphthyl-butyrat 10 mg

Ethylenglycol-monomethylether 0,5 ml (3) Chloracetat-esterasefarvnings-reaktionsopløsning 15 (fremstillet lige før brug) bestående af en filtre ret blanding af følgende komponenter (A) og (B): (A) Phosphat-puffer (1/15 mol/1.000 ml, pH 7,4) 9,5 ml

Fast Blue RR-salt 5 mg (B) Naphthol AS-D-chloracetat 1 mg 20 Ν,Ν-dimethylformamid ' 0,5 ml (4) Bieblich Scarlet-farvnings-reaktionsopløsning bestående af en blanding af 2 ml af opløsning (A) og 98 ml af opløsning (B): (A) Bieblich Scarlet (produkt fra MC/B Corporation) 5 g 25 Dimethylsulfoxid 100 ml (B) 0,1M Tris-HCl-puffer (pH 7,4)

Ved anvendelse af nævnte fikseringsopløsning og reaktionsopløsninger blev der foretaget kolonifarvning i følgende rækkefølge.

30 (i) Kolonierne blev fikseret i 30 sekunder med fikseringsopløsningen (1) ved 4-10°C, vasket med destilleret vand tre gange og tørret ved stuetemperatur i 10-30 minutter .

(ii) De tørrede kolonier blev neddyppet i reaktions-35 opløsning (2) ved stuetemperatur i 20-30 minutter og vasket med destilleret vand tre gange.

DK 166731 Bl 27 (iii) Kolonierne blev neddyppet i reaktionsopløsningen (3) ved stuetemperatur i 15 minutter og vasket med destilleret vand tre gange.

(iv) Kolonierne blev neddyppet i reaktionsopløsning (4) 5 ved stuetemperatur i 2 timer og vasket under rindende ..vand.

(v) ’"" Kolonierne blev tørret og observeretC-eller indeholdende blå granuler blev klassificeret som neutrofi-ler, dem der indeholdt brune granuler blev klassificeret 10 som monocyt-makrophager, og dem der indeholdt røde granuler, blev klassificeret som eosinofiler.

På dag 7, 10 og 14 af inkubationen var de kolonier, der var dannet under anvendelse af hG-CSF ifølge opfindelsen, fuldstændigt sammensat af chloracetateste-15 rase-positive neutrofiler, og der fandtes ingen andre kolonityper.

Fordele ved opfindelsen

Ud fra følgende forsøgsresultater (1) til (5) fandtes hG-CSF ifølge opfindelsen at være blevet i det 20 væsentlige renset: (1) den udviste en enkelt spids både ved omvendt-fase- og molekularsigte-HPLC-analyse, og spidsen var i overensstemmelse med aktivitetsspidsen, (2) hG-CSF gav et enkelt bånd ved SDS-PAGE, (3) hG-CSF blev separeret i komponenter med tre forskellige iso-25 elektriske punkter ved isoelektrisk elektroforese, men hver komponent var en enkelt komponent udvisende CSA, og en prøve, der var befriet for en terminal sialsyre enten ved enzymatisk eller kemisk teknik, gav et enkelt bånd ved isoelektrisk elektroforese, (4) kun en enkelt 30 type af PTH-aminosyre fremkom ved hvert af trinnene involveret i analysen af sekvensen af 21 aminosyrerester fra N-terminalen, og (5) udtrykt som specifik aktivitet er hG-CSF ca. 10 gange så ren som de hG-CSF, der hidtil er rapporteret som værende effektive til mennesker.

35 En sådan stærkt renset form af hG-CSF, navnlig en, der er stærkt renset og har evnen til at fremme differentieringen og proliferationen af benmarvceller til humane neutrofile granulocyter, findes ikke omtalt i 28 DK 166731 B1 tilgængelig litteratur. hG-CSF ifølge opfindelsen kan vindes ud fra en ved genteknik vundet hG-CSF-produceren-de stamme. Foruden til anvendelse som et reagens ved kli-5 niske forsøg eller forskning kan hG-CSF ifølge opfindelsen anvendes som et helbredende middel for alvorlige infektionssygdomme, der hidtil ikke har kunnet kureres ..med antibiotica, hvilket skyldes, at den har forskellige evner, dvs. fremme af proliferation af celler af" en 10 transplanteret benmarv, fremme af rekonstitution af for stråling udsat benmarwæv, fremme af rekonstitution af leukocyt-niveauet efter anvendelse af cancer-bekæmpelsesmidler og fremme af differentiering og proliferation af benmarvceller til neutrofile granulocyter.

Claims

1. Human granulocyt-kolonistimulerende faktor (hG-CSF), kendetegnet ved, at den har en spe-5 cifik aktivitet på mindst 3,94 x 107 E/mg og evnen til at fremme differentiering og proliferation af humane benmarvceller til neutrofile granulocyter, men ikke til . - epsinofile, og at den har følgende fysisk-kemiske egenskaber: _ 10 i) molekylvægt: 19.000 + 1.000, som bestemt ved natriumdodecyl-sulfat-polyacrylamidgel-elektroforese, ii)isoelektrisk punkt: udviser i det mindste ét af de tre isoelektriske 15 punkter A, B og C i følgende Tabel I: Tabel I _Isoelektrisk punkt (pi)_ I nærværelse af I fraværelse af 4M urinstof urinstof 20 -7-1- A 5,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1 B 6,0 ± 0,1 5,8 ± 0,1 C 6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,1 25 iii) UV-absorption: maksimum-absorption ved 280 nm og minimum-absorption ved 250 nm, iv) de N-terminale 21 aminosyrer er: (10) (H_N)-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro- 30 ,20> ° Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val-, hvori X er en naturligt forekommende uidentificeret aminosyre. 2. hG-CSF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det isoelektriske punkt pi er A. 3. hG-CSF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det isoelektriske punkt pi er B. 4. hG-CSF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det isoelektriske punkt pi er C. DK 166731 B1 5. hG-CSF ifølge krav 1, kendetegnet ved, at molekylet er glycosyleret.

6. Fremgangsmåde til fremstilling a'f hG-CSF 5 ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en cellelinie med en human hG-CSF-producerende evne dyrkes i en serum-fri dyrkningsopløsning, supernatanten fra kultu-. ren underkastes trin (1) til (3) anført nedenfor, og de resulterende fraktioner underkastes valg'frit' enten 10 trin (4) eller (5): (1) supernatanten fra kulturen underkastes gelfiltrering under anvendelse af en gel med et effektivt fraktionsområde på 5.000-70.000 dalton, og fraktioner med den neutrofil-dominerende koloni-stimulerende aktivitet 15 (CSA) udvindes, (2) de udvundne fraktioner adsorberes i en 0,1% vandig opløsning af trifluoreddikesyre indeholdende 30% n-propanol på en bærer til omvendt-fase HPLC, og der foretages eluering med en lineær gradient af 30-60% n-propa- 20 nol indeholdende 0,1% vandig trifluoreddikesyre, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, (3) de således udvundne fraktioner underkastes højtydende molekularsigte-chromatografi, således at der ud- 25 vindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, (4) de således udvundne fraktioner underkastes isoelek-trisk punkt-elektroforese, således at der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA, eller (5) fraktionerne udvundet i trin (3) underkastes et trin 30 med fjernelse af sialsyre, således der udvindes fraktioner med den neutrofil-dominerende CSA.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at cellelinien med den human G-CSF-produce-rende evne er C.N.C.M. deponeringsnummer 1-315.

8. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter en hG-CSF ifølge krav 1-5 og en farmakologisk acceptabel bærer. Ulv I Oo / «3 I D I

9. Farmaceutisk præparat til stimulering af differentiering og proliferation af humane knoglemarvsceller til neutrofile granulocyter, k e n_.d e t e g - 5 net ved, at det indeholder en effektiv mængde af en hG-CSF ifølge krav 1-5 og en farmakologisk acceptabel bærer.

10. Farmaceutisk præparat til hjælp ved helbredelse af infektionssygdomme, kendetegnet ved, 10 at det indeholder en effektiv mængde af en hG-CSF ifølge krav 1-5 og en farmakologisk acceptabel bærer.