FI84275B - Kolonistimulerande faktor csf. - Google Patents

Description

84275

Pesäkkeitä stimuloiva tekijä CSF

Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 852 903 5 Tämä keksintö koskee pesäkkeitä stimuloivaa tekijää (tästedes käytetään lyhennettä CSF), jolla on kyky edistää luuydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö koskee uutta CSFrää, jolla on kyky edistää ihmisen luuydinsolujen erilaistumista ja lisään-10 tyrnistä neutrofiileiksi (tästä nimenomaisesta CSF:stä voidaan tästedes joskus käyttää lyhennettä ihmisen G-CSF).

Tämän keksinnön mukaisen CSF:n mahdollisia käyttötarkoituksia on käyttö reagenssina kliinisessä testauksessa ja tutkimustyössä.

15 CSF on aine, joka vaikuttaa eläimen luuydinsoluihin edistäen niiden erilaistumista ja lisääntymistä makrofaa-geiksi tai granulosyyteiksi. Kirjallisuudessa on kuvattu muutamia CSF-tyyppejä. Esimerkiksi E.R. Stanley et ai. ovat ilmoittaneet, että he ovat eristäneet terveiden ai-20 kuisten virtsasta CSF:ää, joka koostui glykoproteiineista, jonka molekyylipaino oli 45 000 ja jolla oli pesäkkeitä stimuloiva vaikutus hiiren luuydinsoluihin muttei ihmisen luuydinsoluihin [Fed. Proce. 35 (1975) 2272 - 2278]. A.W. Burgess et ai. ovat kuvanneet CSF:n, joka saattaa olla 25 ihmisissä vaikuttavaa, eristämistä osittain puhtaana ihmisen istukasta [Blood 49 ( 1977) 573 - 583 ja ibid. 54 (1979) 614 - 627]. R.G. Shah et ai. ovat kuvanneet samanlaisen CSF:n eristämistä osittain puhtaana ihmisen ääreis-veren monosyyteistä ja PHA-stimuloiduista lymfosyyteistä 30 [Blood 50 (1977) 811]. S.S. Fojo et ai. ovat kuvanneet samanlaisen CSF:n eristämistä osittain puhtaana ihmisen keuhkoviljelmän supernatantista [Biochemistry 17 (1978) 3109 - 3116]. Kaikki nämä CSF:t ovat glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on alueella 25 000 - 41 000, ja ne 35 vaikuttavat suoraan ihmisen tarttumattomiin luuydinsolui- 2 84275 hin saaden ne muodostamaan neutrofiili-, makrofaagi ja eosinofiilipesäkkeitä. Käytettävissä olevien lähteiden niukkuuden vuoksi ei kuitenkaan ole vielä saatu täydellisesti puhdistettuja CSFriä. Näiden normaaleista ihmisku-5 doksista talteen otettujen CSF:ien lisäksi on äskettäin ilmoitettu, että joillakin ihmisen kasvainsolutyypeillä on kyky tuottaa CSF:ää. Esimerkiksi S. Asano et ai. ovat kuvanneet CSF:n talteenottoa karvattomiin hiiriin istutetuista keuhkosyöpäsoluista [Blood 49 (1977) 845 - 852]. 10 T. Okabe et ai. ovat kuvanneet CSF:n tuottamista alaleuan levysolusyöpäsolulinjasta ja kilpirauhassyöpäsoluista [Cancer Res. 38 (1978) 3910 - 3917; JNCI 69 (1982) 1235-1243; J. Cell. Physiol. 110 (1982) 43 - 49]. M.C. Wu et ai. ovat kuvanneet CSF:n ottamista talteen haimasyöpäso-15 lulinjasta [J. Biol. Chem. 254 (1979) 6226 - 6228; J. Clin. Invest. 65 (1980) 772 - 775] J.F. Dipersio et ai. ovat ilmoittaneet ottaneensa talteen CSFrää GCT-solulin-jasta, joka oli perustettu pahalaatuista histiosytoomaa sairastavien potilaiden soluista [Blood 51 (1978) 1068; 20 Blood 56 (1980) 717 - 727]. D.W. Golde et ai. ilmoittavat ottaneensa talteen CSFrää karvasoluleukemiapotilaista saadusta M0-solulinjasta [Blood 52 (1978) 1068 - 1072; Blood 57 (1981) 13 - 21], Ihmisen luuydinsoluihin vaikuttavat CSFrt ovat glykoproteiineja, joiden molekyylipaino on 27 25 000 - 34 000 ja isoelektrinen piste (pl) 4,5 - 5,7. GCT- solulinjaviljelmän supernatantista saatu CSF on puhdistettu ominaisaktiivisuuteen 1,12 x 106 yksikköä/mg. MO-solu-linjaviljelmän supernatantista saadun CSF:n ominaisaktii-visuus on kohonnut arvoon 3,5 x 106 yksikköä/mg. Mitään 30 näistä CSFristä ei kuitenkaan ole puhdistettu täydellisesti. CSFrää, jolla on kyky spesifisesti edistää ihmisen luuydinsolujen erilaistumista neutrofiileiksi ja lisääntymistä, ei ole myöskään tähän mennessä kuvattu.

Tämän keksinnön tekijät ovat onnistuneet perusta-35 maan uuden solulinjan suusyöpäpotilaiden kasvainsoluista. Tällä solulinjalla on suuri kyky tuottaa CSFrää ja voima- 3 84275 kas lisääntymiskyky. Tämä solulinja, jolle on annettu nimeksi CHU-1, on talletettu kokoelmaan Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (C N C M), Pasteur Institute, Ranska, 11. heinäkuuta 1984 tallennenumerolla 1-135.

5 Tämän keksinnön tekijät viljelivät tätä CHU-1:ä in vitro ja eristivät menestyksellisesti viljelmän superna-tantista hyvin puhdasta CSF:ää, jolla oli ihmisen neutro-fiilipesäkkeitä stimuloiva vaikutus ja molekyylipaino noin 18 000 [määritettynä natriumdodekyylisulfaatti-polyakryy-10 liamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE)] ja ominaisaktii-visuus 3,94 x 107 yksikköä/mg tai suurempi. Keksinnön mukaiselle CSF:lle on tunnusomaista, että sillä on seuraa-vat, kirjallisuudessa aiemmin esittämättömät, fysikoke-mialliset ominaisuudet, jotka tekevät tästä CSF:stä uuden 15 aineen.

i) Molekyylipaino: 19 000 ± 1000 määritettynä natriumdodekyylisulfaat-ti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla; ii) Isoelektinen piste: 20 Vähintään yksi taulukossa 1 esitetyistä kolmesta isoelektrisestä pisteestä A, B ja C:

Taulukko 1 25 Isoelektrinen piste (pl)

Urean (4 mol/1) läs- Ilman ureaa näollessa A 5,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1 30 B 6,0 ± 0,1 5,8 ± 0,1 C 6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,1 iii) UV-absorptio:

Absorptiomaksimi aallonpituudella 280 nm ja absorp-35 tiominimi aallonpituudella 250 nm; 4 84275 iv) Seuraavat 21 aminohapon sekvenssi N-päästä lukien: (10) 5 H2 N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln- (Ser) -Phe- (20)

Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val, jossa X on luonnossa esiintyvä aminohappo.

10 CSF saadaan menetelmällä, jossa viljellään solulin- jaa, jolla on kyky tuottaa fysikokemiallisilta ominaisuuksiltaan edellä esitettyä ihmisen G-CSF:ää, käsitellään viljelmän supernatantti alla esitetyissä vaiheissa (1)-(3) ja käsitellään saadut fraktiot mahdollisesti joko vai- 15 heessa (4) tai (5): (1) tehdään viljelmän supernatant!Ile geelisuodatus käyttämällä geeliä, jonka tehokas fraktioalue on 5 000 -70 000 daltonia, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus 20 (CSA); (2) adsorboidaan kerätyt fraktiot käänteisfaasi-HPLC:ssä (RP-HPLC:ssä) käytettävälle kantajalle ja eluoi-daan tiheysgradienttimenentelmällä veden ja orgaanisen liuottimen seoksella siten, että saadaan talteen fraktiot, 25 joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (3) tehdään täten kerätyille fraktioille suurteho-molekyyliseulakromatografia siten, että saadaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimu- 30 loiva aktiivisuus; (4) tehdään täten kerätyille fraktioille isoelek-trinen piste -elektroforeesi siten, että otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; tai 35 (5) tehdään vaiheessa (3) kerätyille fraktioille siaalihapon poisto siten, että otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus .

5 84275

Kuvio 1 esittää tämän keksinnön mukaiselle CSF:lle, joka esitetään pisteellä käyrässä, tehdyn SDS-PAGE:n tuloksia;

Kuvio 2 esittää tämän keksinnön mukaiselle CSF:lle 5 urean (4 M) läsnä ollessa tehdyn isoelektrisen elektroforeesin tuloksia;

Kuviossa 3 on tämän keksinnön mukaisen CSF:n UV-absorptiospektri;

Kuviossa 4 on CHU-l:n lisääntymiskäyrä; 10 Kuviossa 5 on toinen käyrä, joka esittää tämän kek sinnön mukaiselle CSFrlle, joka osoitetaan pisteellä, tehdyn SDS-PAGE:n tuloksia.

Menetelmää tämän keksinnön mukaisen CSF:n saamiseksi kuvataan seuraavassa yleisesti CHU-l:n avulla.

15 CHU-1 -näyte suspendoidaan F-10 -kasvualustaan, joka sisältää 10 % naudan sikiöseerumia (FCS) ja inkuboi-daan lasisessa pyörityspullossa tasaisella nopeudella pyörittäen. Kun pyörityspullon sisäpinta on kokonaan peittynyt CHU-1:llä, vaihdetaan kasvualusta FCS-vapaaseen RPMI 20 1640 -alustaan ja jatketaan inkubointia 4 vrk. Viljelmästä talteen otettuun supernatanttiin lisätään FCS-pitoista F-10 -kasvatusliuosta, ja inkuboidaan 3 vrk. Kasvatusliuos korvataan jälleen FCS-vapaalla RPMI 1640:llä, ja kun on inkuboitu vielä 4 vrk, otetaan talteen viljelmän superna-25 tantti. "Inkubointi ja seerumittoman viljelmän supernatan-tin talteenotto" -syklejä toistetaan tämän ohjelman mukaisesti CHU-1 -viljelmän lopullisen supernatantin saamiseksi. Täten saadulle supernatantille tehdään ultrasuodatus, jolloin saadaan noin 1 000 - 2 000 kertaisesti väkevöity 30 konsentraatti, joka geelisuodatetaan ja otetaan talteen fraktiot, jotka sisältävät neutrofiilivaltäisiä pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Nämä fraktiot puhdistetaan useaan kertaan HPLC:llä, jossa kerätään fraktioita, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus. 35 Nämä fraktiot kylmäkuivataan.

6 84275 Tämän keksinnön yhteydessä CSA (pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus) mitataan jollakin seuraavista menetelmistä .

CSA-mittaukset 5 (a) Ihmisen luuydinsoluja käyttämällä:

Pehmytagaryksisolukerrosviljelmiä inkuboitiin T.R. Bradleyn ja D. Metcalfin menetelmällä [Aust. J. Exp. Biol. Med. Sei. 44 (1966) 287 -300]. Naudan sikiöseerumi (FCS, 0,2 ml), tutkittava näyte (0,1 ml), tarttumattomia ihmi-10 sen luuydinsoluja sisältävä suspensio (0,1 ml, sisältää 1 - 2 x 105 tumallista solua), muunnettu McCoyn 5A -kasva-tusliemi (0,2 ml) ja 0,75 % agaria sisältävä muunnettu McCoyn 5A -kasvatusliemi (0,4 ml) sekoitettiin ja kaadettiin muoviseen kudosviljelymaljaan (0 35 mm). Alustan hyy-15 dyttyä inkuboitiin 37°C:ssa atmosfäärissä, jossa suhteellinen kosteus oli 100 % ja joka sisälsi 5 % C02:a ja 95 % ilmaa. Muodostuneet pesäkkeet (yksi pesäke koostuu 50 tai useammasta solusta) laskettiin 10 vrk:n inkuboinnin jälkeen, ja katsottiin, että aktiivisuus, joka saa aikaan 20 yhden pesäkkeen muodostumisen, on yksi CSA-yksikkö.

(b) Hiiren luuydinsoluja käyttämällä:

Hevosen seerumi (0,4 ml), tutkittava näyte (0,1 ml), suspensio, joka sisälsi (naaras)hiiren luuydinsoluja C3H/He (0,1 ml, sisältää 0,5 - 1 x 105 tumallista solua) 25 ja 0,75 % agaria sisältävä muunnettu McCoyn 5A -kasvatus-liemi (0,4 ml) sekoitettiin ja kaadettiin muovisiin kudos-viljelmämaljoihin (0 35 mm). Alustan hyydyttyä inkuboitiin 5 vrk 37°C:ssa 100 %:isessa suhteellisessa kosteudessa atmosfäärissä, jonka koostumus oli 5 % C02:a ja 95 % il-30 maa. Muodostuneet pesäkkeet (yksi pesäke koostuu 50 tai useammasta solusta) laskettiin, ja katsottiin, että aktiivisuus, joka saa aikaan yhden pesäkkeen muodostumisen, on yksi CSA-yksikkö.

Sekä menetelmässä (a) että (b) käytetty muunnettu 35 McCoyn 5A -kasvatusliemi ja menetelmässä (a) käytetty 7 84275 tarttumattomia ihmisen luuydinsoluja sisältävä suspensio valmistettiin seuraavasti.

Muunnettu McCoyn 5A -kasvatusliemi 12 g McCoyn 5A -kasvatuslientä (Gibco Co.), 2,55 g 5 MEM-aminohappo/vitamiinialustaa (Nissui Seiyaku Co-, Ltd.), 2,18 g natriumbikarbonaattia ja 5000 yksikköä ka-liumpenisilliini G:tä liuotettiin 500 ml:aan kahdesti tislattua vettä, ja liuos steriloitiin suodattamalla millipo-re-suodattimella (0,22 pm).

10 Tarttumattomia ihmisen luuydinsoluja sisältävä sus pensio

Luuydinsolut, jotka saatiin terveeltä aikuiselta rintalastapunktiolla, laimennettiin 5-kertaiseen tilavuuteen RPMI-1640 -liemellä. Tämä laimennos laitettiin Ficol-15 Paque -liuoksen (Pharmacia Fine Chemicals) päälle, ja seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 400 x g 25°C:ssa 30 min, ja otettiin talteen rajapinnalla oleva solukerros (ominaispaino < 1 077). Tämä kerros pestiin RPMI 1640-liuoksella, ja solutiheys säädettiin arvoon 5 x 106 so-20 lua/ml RPMI-1640 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 20 % FCS:ää. Liuos kaadettiin 25 cm2:n muoviseen kudosviljely-pulloon. Inkuboitiin C02-inkubaattorissa 30 min, otettiin talteen tarttumattomat solut supernatantista ja pantiin ne muovipulloon (25 cm2). Inkuboitiin 2,5 tuntia, ja ke-25 rättiin supernatantista tarttumattomat solut.

Kun tämän keksinnön mukaisen CSF:n annettiin vaikuttaa hiiren luuydinsoluihin ja ihmisen luuydinsoluihin, havaittiin stimuloitunut neutrofiilipesäkkeiden muodostuminen, kuten osoitetaan jäljempänä esimerkissä 6. Tämä 30 viittaa selvästi siihen, että tämän keksinnön mukainen CSF on tyyppiä, joka edistää luuydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä neutrofiileiksi.

Seuraavan referenssiesimerkin tarkoituksena on kuvata menetelmää CHU-1 -solulinjan perustamiseksi.

35 Vertailu-esimerkki 84275 (i) Kasvain:

Potilaasta, joka sairasti suusyöpää, johon liittyi huomattava neutrofiilimäärän lisääntyminen, peräisin olevia kasvainkudospaloja istutettiin nu/nu-hiireen. Noin 10 5 päivän kuluttua istutuksesta havaittiin huomattava kasvaimen koon ja neutrofiililuvun kasvaminen. 12 päivän kuluttua istutuksesta kasvain irrotettiin aseptisesti hiirestä ja jaettiin pieniin paloihin (1-2 mm3), joita inkuboi-tiin seuraavasti.

10 (ii) Primaariviljelmä: 10 - 15 kasvainpalaa laitettiin muoviseen 50 ml:n sentrifugiputkeen. Lisättiin 5 ml trypsiiniliuosta (0,25 % trypsiiniä ja 0,02 % EDTAra), seosta ravisteltiin lämpöhauteessa (37°C) 10 min. Supernatantti heitettiin 15 pois, lisättiin 5 ml koostumukseltaan edellä käytetyn kaltaista trypsiiniliuosta, ja trypsiinipilkkoutumisen annettiin edetä 15 min 37°C:ssa sekoittaen. Solususpensio otettiin talteen ja sekoitettiin 1 ml:aan FCS:ää trypsiinin vaikutuksen estämiseksi. Solususpensiota säilytettiin jää-20 hauteessa.

Sama menettely toistettiin solususpension talteen ottamiseksi, joka yhdistettiin aiemmin saatuun suspensioon, ja sentrifugoitiin seosta kierrosnopeudella 1500 min"1 10 min, jolloin saatiin solupellettejä. Pelletit pes-25 tiin kahdesti F-10 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja siirrostettiin muoviseen inkubointipulloon (25 cm2) pitoisuudeksi 5 x 106 solua/pullo. Inkuboitiin F-10 -viljelyliuoksen, joka sisälsi 10 % FCS:ää, kanssa yön yli C02-inkubaattorissa (5 % C02:a, suhteellinen kosteus 100 30 %). Supernatantti poistettiin yhdessä tarttumattomien so lujen kanssa, lisättiin tuoretta kasvatusliuosta, ja jatkettiin inkubointia. 6. inkubointipäivänä solukerros oli yhtenäinen, ja kasvualusta vaihdettiin tuoreeseen. Kasva-tusliuos heitettiin pois seuraavana päivänä, lisättiin 2 35 ml anti-hiiri -punasoluja (Oappel Corporation), jotka oli 9 84275 laimennettu 5-kertaiseen tilavuuteen RPMI 1640:llä, ja 2 ml marsun komplementtia (Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), joka oli laimennettu 2,5-kertaiseen tilavuuteen RPMI 1640:llä, ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa 20 min. Kun inkubointi oli 5 saatettu loppuun, viljelmä pestiin kahdesti 10 % FCS:ää sisältävällä F-10:llä, ja nu/nu-hiiristä peräisin olevat fibroblastit poistettiin. Sitten lisättiin F-10 -kasvatus-liuosta, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja jatkettiin inkuboin-tia.

10 (iii) Jatkoviljely:

Kun alkuperäinen viljelmä oli täynnä kasvaneita soluja, se korvattiin F-10 -kasvatusliuoksella, joka sisälsi 10 % FCS:ää, ja tehtiin jatkoviljely seuraavana päivänä. Kun kasvatusliuos oli poistettu Komagomen pipetillä, 15 pulloon lisättiin 2 ml fysiologista suolaliuosta, joka sisälsi 0,02 % esilämmitettyä (37°C) EDTA:a, ja viljemää lämmitettiin lämpölevyllä (37°C) 2 min. Sen jälkeen irrotettiin solut pipetoimalla. Lisättiin 0,5 ml FCS:ää, siirrettiin solususpensio 15 ml:n sentrifugiputkeen ja sentri-20 fugoitiin kierrosnopeudella 1500 min-1 10 min, solujen pel-letoimiseksi. Pelletit suspendoitiin 1 ml:aan F-10 -kasva-tusliuosta, ja jaettiin seos kymmeneen osaan jatkoviljelyä varten. Sama menettely toistettiin jatkoviljelyn tekemiseksi 4 tai 5 päivän välein. Täten saatujen solujen li-25 sääntymiskykyä tutkittiin seuraavalla menetelmällä. Valmistettiin suspensio, joka sisälsi 5 x 104 solua/ml ja siirrostettiin kaksikymmentä 1 ml:n kerrosta suspensiota muovimaljaan 0/ 35 mm). C02-inkubaattorissa tapahtuvan in-kuboinnin aikana malja otettiin esiin ennalta määrätyin 30 väliajoin, otettiin talteen tarttuvat solut ja laskettiin ne. Tulokset esitetään kuviossa 4. Noin 20 - 24 tunnin kuluttua solujen siirrostuksesta solut alkoivat lisääntyä keskimääräisen kahdentumisajan ollessa noin 20 h.

Täten saatua CHU-l:ä voidaan käyttää solulinjana, 35 jolla on kyky tuottaa tämän keksinnön mukaista CSF:ää, 10 84275 jota jäljempänä kuvataan CHU-l:een viitaten. Mikro-orga-nismikantaa tai solulinjaa, joka on tehty yhdistelmä-DNA-menetelmin, voidaan myös soveltaa tähän keksintöön.

Esimerkki 1 5 CSF:n eristäminen

Kun kaksi inkubointipulloa (150 cm2 ) oli täydellisesti täyttynyt CHU-l:llä, otettiin solut talteen ja sus-pendoitiin ne 500 ml:aan F-10 -kasvatusliuosta, joka sisälsi 10 % FCS:ää. Solususpensio siirrettiin 1580 cm2 :n 10 lasiseen pyörityspulloon (Belco Corporation) ja inkuboi-tiin pyörittäen kierrosnopeudella 0,5 min"1. Kun pullon sisäseinä oli kokonaan peittynyt kasvaneilla soluilla, kasvatusliuos vaihdettiin seerumittomaan RPMI 1640reen. Inkuboitiin 4 vrk, otettiin talteen viljelmän supernatant-15 ti ja se sekoitettiin F-10reen, joka sisälsi 10 % FCSrää, inkuboinnin jatkamista varten. Inkuboitiin 3 vrk, korvattiin kasvatusliuos jälleen seerumittomalla RPMI 1640:llä, inkuboitiin 4 vrk, ja otettiin talteen viljelmän superna-tantti. Toistamalla tätä menettelyä saatiin 500 ml seeru-20 mitonta, haluttuun tilaan saatettua alustaa pulloa kohden viikossa. Tämä menetelmä tekee mahdolliseksi melko pitkään kestävän solujen ylläpidon ja haluttuun tilaan saatetun alustan keräämisen.

Yhteen erään, joka sisälsi 5000 ml kerättyä, halut-25 tuun tilaan saatettua alustaa, lisättiin Tween 20:ä pitoisuudeksi 0,01 %, ja seos väkevöitiin noin 1000-kertaiseen pitoisuuteen ultrasuodattamalla Hollow Fiber DC-4:n ja Amicon PM-10:n (Amicon Corporation) avulla. Väkevöity, haluttuun tilaan saatettu alusta puhdistettiin seuraavin 30 vaihein.

(i) Osalle (5 ml) tiivistettä tehtiin geelisuodatus Ultrogel AcA 54 -pylväällä (läpimitta 4,6 cm, pituus 90 cm, LKB Corporation) virtausnopeudella noin 50 ml/h käyttäen 0,01 M Tris-HCl -puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 35 0,15 mol/1 NaClra ja 0,01 % Tween 20 :ä (Nakai Kagaku 11 84275 K.K.)· Pylväs oli kalibroitu naudan seerumialbumiinilla (M = 67 000), ovalbumiinilla (M = 45 000) ja sytokromi C:llä (M * 12 400). Geelisuodatuksen jälkeen otettiin 0,1 ml:n näyte kustakin fraktiosta ja laimennettiin se 10-5 kertaiseen tilavuuteen. Kunkin fraktion aktiivisuus mitattiin "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Fraktiot, joissa Ve = 400 - 700 ml, esiintyi makrofaagivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta, kun taas fraktioissa, joissa Ve = 800 - 1200 ml, esiintyi granulosyyttivaltaisia pesäk-10 keitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi toisen ryhmän fraktiot yhdistettiin ja väkevöitiin noin 5 mlrksi ultrasuo-dattamalla PM-10:llä (Amicon Corporation).

(ii) Väkevöityihin fraktioihin lisättiin 0,1 %:ista trifluorietikkahapon vesiliuosta, joka sisälsi 30 % n-pro-15 panolia (aminohapposekventointilaatu, Tokyo Kasei K.K.), ja seoksen annettiin seistä jäissä noin 15 min. Sen jälkeen seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 15 000 min-1 10 min sakan poistamiseksi. Sitten supernatantti johdettiin läpi Micro Bondapak C18 -pylvään (puoliprepara-20 tiivinen pylväs, Waters Associates, Inc.), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi aminohapposekven-tointilaatua olevaa n-propanolia ja trifluorietikkahappoa. Pylväs kehitettiin eluoimalla lineaarisella gradientilla 30 -> 60 % n-propanolia 0,1 %:isessa trifluorietikkahappo-25 liuoksessa. HPLC-laitetta (malli 685-50, Hitachi, Ltd.), johon oli kytketty detektori (malli 638-41, Hitachi, Ltd.), käytettiin absorptioiden mittaamiseksi samanaikaisesti aallonpituuksilla 220 nm ja 280 nm. Eluoinnin jälkeen erotettiin kustakin fraktiosta 10 ml:n näyte, joka 30 laimennettiin 100-kertaiseen tilavuuteen. Kunkin fraktion aktiivisuus mitattiin "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Fraktiot, jotka eluoituvat n-propanolipitoisuudella 40 %, sisälsivät neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta, joten kerättiin nämä fraktiot, ja tehtiin 35 niille HPLC samoissa olosuhteissa kuin edellä. Määritet- 12 84275 täessä fraktioiden CSA samalla menetelmällä kuin edellä varmistuttiin jälleen siitä, että fraktiot, jotka vastasivat n-propanolipitoisuutta 40 %, sisälsivät neutrofiili-valtaisia pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi ke-5 rättiin nämä 4 fraktiota (4 ml) ja kylmäkuivattiin ne.

(iii) Kylmäkuivattu jauhe liuotettiin 200 pl:aan 40 %:ista n-propanolia, joka sisälsi 0,1 % trifluorietik-kahappoa, ja liuokselle tehtiin HPLC-käsittely TSK-G-3000 SW -pylväällä (2,5 mm x 60 cm, Toyo Soda Manufacturing 10 Co., Ltd.). Eluointi tehtiin virtausnopeudella 0,4 ml/min 40 %:isella n-propanolilla, joka sisälsi 0,1 % trifluori-etikkahappoa. Fraktionkerääjän (FRAC-100, Pharmacia Fine Chemicals) avulla kerättiin 0,4 ml:n fraktioita. Kerätyistä fraktioista mitattiin CSA samalla menetelmällä kuin 15 edellä, ja fraktioiden, joiden viipymäaika oli 37 - 38 min (vastaa molekyylipainoa noin 20 000), havaittiin sisältävän neutrofiilivaltäisiä pesäkkeitä stimuloivaa aktiivisuutta. Siksi nämä fraktiot yhdistettiin ja puhdistettiin analyyttisellä Micro Bondapak C18 -pylväällä (4,6 mm x 30 20 cm). Sen jälkeen otettiin talteen pääpiikit ja kylmäkuivattiin ne.

Esimerkki 2

Fysikokemialliset ominaisuudet

Esimerkin 1 mukaisesti valmistetun CSF:n fysikoke-25 mialliset ominaisuudet määritettiin seuraavin analyysein ja testein.

(i) Molekyylipaino (a) CSF:n molekyylipaino määritettiin natriumdode-kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-30 PAGE). Elektroforeesilaite oli mallia GE-2/4 (Pharmacia Fine Chemicals), ja geelin kokoonpano oli polyakryyliami-dialageeli (T = 15 % ja C = 2,6 %), jonka mitat olivat 70 x 70 x 3 mm, ja konsentrointigeeli (ylägeeli) (T = 3 %, C = 20 %). Muunnettu CSF-näyte preparoitiin seuraa-35 vasti: CSF:ää keitettiin 3 min liuoksessa, joka sisälsi 2 i3 84275 % natriumdodekyylisulfaattia 0,64 M 2-merkaptoetanolissa, ja sitten liuokseen lisättiinureaa loppupitoisuuteen 4 mol/1. Kun oli tehty elektroforeesi 2 pg:lie näytettä jännitteellä 120 V 3 tuntia, geeli poistettiin ja kiinnitet-5 tiin metanoli-etikkahappo-vesiseoksella (4:1:5) ja värjättiin vyöhykkeiden detektointia varten Silver Stain:ilia (Bio-Rad Corporation). Naudan seerumialbumiinia (BSA, M = 67 000), ovalbumiinia (OVA, M = 45 000), sytokromi C:tä (Cyt. C, M = 12 000) ja insuliinia (Ins., A-ketjun M = 3 10 300, B-ketjun M = 2 400) käytettiin molekyylipainomarkke- reina samanlaisten käsittelyjen jälkeen. Havaittiin yksi vyöhyke, joka vastasi molekyylipainoa noin 18 000. Mole-kyylipainomittausten tulokset esitetään kuviossa 1.

(b) CSF:n molekyylipaino määritettiin natriumdode-15 kyylisulfaattipolyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE), mutta tällä kertaa elektroforeesilaitteisto oli PROTEAN* (16 cm, Bio-Rad Corporation), jossa käytettiin geeliä, jossa oli polyakryyliamidialageeli (T = 15 %, C = 2,6 %), jonka mitat olivat 140 x 160 x 1,5 mm, ja kon-20 sentrointigeeli (ylägeeli) (T = 3 %, C = 20 %). Denaturoitu CSF-näyte preparoitiin seuraavasti: CSF:ää keitettiin liuoksessa, joka sisälsi 2 % natriumdodekyylisulfaattia 0,46 M 2-merkaptoetanolissa, 3 min. Kun oli tehty elektroforeesi 4 pg:lle näytettä vakiovirralla 30 mA 4 tuntia, 25 geelilevy poistettiin ja värjättiin 0,25 %:isella Coumasy Brilliant Blue R 250:llä (Sigma Chemical Co.) vyöhykkeiden havaitsemiseksi. Seuraavia aineita käytettiin molekyyli-painomarkkereina samanlaisten käsittelyjen jälkeen: fos-forylaasi B (M = 92 500), naudan seerumialbumiini (BSA, 30 M = 67 000), ovalbumiini (OVA, M = 45 000), karbonianhyd-raasi (M = 31 000), soijapaputrypsiini-inhibiittori (M = 21 500) ja lysotsyymi (M = 14 400). Havaittiin yksi vyöhyke, joka vastasi molekyylipainoa noin 19 000. Mole-kyylipainomittausten tulokset esitetään kuviossa 5.

35 (c) Tulosten (a) ja (b) valossa tämän keksinnön i4 84275 mukaisesti saadun CSF:n molekyylipaino näyttää olevan 19 000 ± 1 000 SDS-PAGE:11a määritettynä.

(ii) Isoelektrinen piste Tässä saadun CSF:n isoelektrinen piste määritettiin 5 horisontaalisella isoelektrisellä elektroforeesilaitteel-la FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals). Kun näytettä oli käsitelty 2 tuntia elektroforeettisesti 30 W:n vakioteholla (Umax = 2000 V) polyakryyliamidigeelillä (T = 5 %, C = 3 %, 115 x 230 mm), joka sisälsi Pharmalyteä (pH =

10 4-6,5, Pharmacia Fine Chemicals) ja 4 mol/1 ureaa, CSF

kiinnitettiin liuoksella, jonka koostumus oli 30 % metano-lia, 10 % trikloorietikkahappoa ja 35 % sulfosalisyylihap-poa, ja värjättiin Coumasy Brilliant Blue R-250:llä. Low pl -testipakkausta (pH 2,5 - 6,5, Pharmacia Fine Chemi-15 cals) käytettiin pl-markkerina.

Tarkasteltaessa vyöhykkeiden erottumista pH-alueel-la 4 - 6,5 havaittiin kolme erillistä vyöhykettä, jotka vastasivat pl-arvoja 5,73, 6,03 ja 6,37 ja joista kaksi vyöhykettä, pl = 5,73 ja 6,03, olivat vallitsevia. Tämän 20 mittauksen tulokset esitetään kuviossa 2, jossa CSF0, CSFj ja CSF2 tarkoittavat tämän keksinnön mukaisesti saatuja CSF:iä, joilla on erilaiset isoelektriset pisteet. Isoelektrinen elektroforeesi urean poissa ollessa antoi tulokseksi kolme vyöhykettä, jotka vastasivat pl-arvoja 25 5,52, 5,80 ja 6,13.

Edellä kuvatulla menetelmällä tehtiin kymmenen iso-elektrisen pisteen mittausta, joiden tulokset esitetään taulukossa 1, jossa on kolme isoelektristä pistettä, A, B ja C, jotka eroavat toisistaan noin 0,3 yksikön verran.

30 Jotta nähtäisiin, onko olemassa korrelaatiota näi den kolmen eri isoelektrisiä pisteitä vastaavien vyöhykkeiden ja CSA-arvojen välillä, tehtiin CSF:lie, joka oli juuri puhdistettu TSK-G 3000 SW -pylväällä esimerkin l(iii) mukaisesti, vyöhykkeiden erotus preparatiivisella „ 84275 isoelektrisellä elektroforeesilaitteella, malli FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals). Vyöhykkeiden erotusolosuhteet olivat seuraavat.

Näyte: Kylmäkuivattu CSF-näyte (500 pg) liuotettiin 5 1 ml:aan 0,05 N fosforihappoa, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa.

Alusta: 15 g:aan Sephadex-IEF:ää (Pharmacia Fine

Chemicals) lisättiin 225 ml kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa ja 0,1 % Tween 20:ä. Lisättiin 12 ml Pharmalyteä (pH 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals), 10 ja annettiin seoksen seistä yön yli, kunnes se turposi. Sen jälkeen seoksesta poistettiin ilma perusteellisesti imupullossa, ja seos kaadettiin lasilevylle (230 mm x 230 mm) tasaiseksi 5 mm:n paksuiseksi geelikerrokseksi. Geelikerros poistettiin levyltä lukuun ottamatta tasaisin-15 ta osaa, jonka mitat olivat 50 mm x 230 mm.

Elektrodiliuokset:

Elektrodiliuskat (6 x 10 mm, Pharmacia Fine Chemicals) kyllästettiin 0,1 M fosforihapolla (anodi) ja 0,1 M NaOH:lla (katodi). Toinen liuska sijoitettiin yhdensuun-20 taisesti geelin toisen pään kanssa ja toinen samalla tavalla samansuuntaisesti geelin toisen pään kanssa. Elektrodit kytkettiin vakiovirtalähteeseen ECPS 2000/300 (Pharmacia Fine Chemicals).

Alustava elektroforeesi: 25 45 min 8 W:n teholla.

Näytteen lisäys: 1 cm:n levyinen geelipala raaputettiin irti 5 cm:n etäisyydeltä anodista ja pantiin takaisin paikalleen, kun siihen oli sekoitettu näyteliuos.

30 Elektroforeesi: 4 tuntia 50 W:n teholla, joka saatiin vakiovirta-lähteestä ECPS 2000/300.

Kun elektroforeesi oli lopussa, geelilevy otettiin pois astiasta ja jaettiin 26 osaan fraktiointiverkolla. 35 Kun kunkin fraktion pH oli mitattu, siirrettiin kustakin fraktiosta irrotettu geeli polypropyleenipienoispylvääseen 16 84275

(Muromac, Muromachi Kagaku K.K.) ja uutettiin 4 ml:lla 4 M guanidiinihydrokloridia, joka sisälsi 0,1 % trifluori-etikkahappoa. Osa (5 μΐ) kustakin uutetusta fraktiosta laimennettiin 2 ml :11a RPMI 1640 -kasvualustaa, joka si-5 sälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, ja mitattiin CSA

"CSAtn määritysmenetelmällä (b)". Kukin eluoiduista fraktioista sisälsi kolme aktiivisuuspiikkiä, jotka sopivat hyvin yhteen edellä mainittujen kolmen isoelektrisen pisteen, pl = 5,73, 6,03 ja 6,37 kanssa.

10 Jotta saataisiin tarkistetuksi, johtuvatko erot isoelektrisissä pisteissä CSF:n peptidiosasta vai sokeri-ketjusta (erityisesti siaalihapporyhmien lukumäärästä), tehtiin elektroforeesi kahdelle CSF-näytteelle, joista toinen käsiteltiin neuraminidaasilla ja toinen oli käsit-15 telemätön. Käsittelemättömässä näytteessä havaittiin kolme vyöhykettä, mutta neuramidaasikäsitellyssä näytteessä vain yksi vyöhyke, joka vastasi pl-arvoa 6,37. Tehtiin iso-elektrinen elektroforeesi myös CSF-näytteelle, joka oli liuotettu 6 M guanidiinihydrokloridin vesiliuokseen, minkä 20 jälkeen pH oli säädetty arvoon 1,5 1 N HCl:lla ja annettu seistä 80°C:ssa 120 min. Vyöhykkeet, jotka havaittiin täten käsitellyssä näytteessä olivat samat kuin neuramidaa-silla käsitellyssä näytteessä. Neuramidaasikäsittely ei vaurioittanut CSA:ta millään tavalla. Nämä tulokset näyt-25 tävät viittaavan siihen, että erot CSF:n isoelektrisissä pisteissä johtuvat todennäköisesti eroista siaalihapporyhmien lukumäärässä.

(iii) UV-absorptio Näytteen UV-absorptio mitattiin spektrofotometrillä 30 käyttäen referenssiaineena 0,1 %:ista trifluorietikkahap-poa, joka sisälsi 40 % n-propanolia. Kuten kuviosta 3 ilmenee, absorptiomaksimi oli aallonpituudella 280 nm ja -minimi aallonpituudella 250 nm.

(iv) Proteiiniosan aminohapot 35 Näyte hydrolysoitiin tavanomaisella menetelmällä, ja proteiiniosan aminohappokoostumus analysoitiin auto- 17 84275 maattisella aminohappoanalysaattorilla, malli 835 (Hitachi, Ltd.). Tulokset esitetään taulukossa 2. Hydrolyysi tehtiin seuraavissa olosuhteissa.

(a) 6 N HC1, 110°C, 24 tuntia alipaineessa, 5 (b) 4 N metaanisulfonihappo + 0,2 % 3-(2-aminoetyyli )indo- lia, 110°C, 24, 48 tai 72 tuntia alipaineessa.

Kukin näyte liuotettiin liuokseen (1,5 ml), joka sisälsi 40 % n-propanolia ja 0,1 % trifluorietikkahappoa. Osa (0,1 ml) kustakin liuoksesta kuivattiin kuivalla N2-10 kaasulla ja sekoitettiin reagenssiin (1) tai (2) kiinni sulatetuissa putkissa alipaineessa tehtävää hydrolyysiä varten.

Kukin "mitattu arvo" taulukossa 2 oli neljän arvon keskiarvo, ts. 24 tunnin arvon reagenssilla (1) ja 24, 48 15 ja 72 tunnin arvojen reagenssilla (2) keskiarvo. Thr-, Ser-, l/2Cys-, Met-, Vai-, Ile- ja Trp-määrät laskettiin seuraavin menetelmin (katso Seikagaku Jikken Koga, Tanpa-kushitsu Kagaku II, julkaisija Tokyo Kagaku Dojin): a) Mitattiin ajasta riippuvat muutokset Thr-, 20 Ser-, l/2Cys- ja Met-arvoissa 24, 48 ja 72 tunnin hydro-lyysin jälkeen reagenssilla 2, ja tulokset ekstrapoloitiin ajanhetkeen 0.

b) Mitattiin Vai- ja Ile-arvot 72 tunnin hydrolyy-sin jälkeen reagenssilla (2).

25 c) Mitattiin Trp-arvot 24, 48 ja 72 tunnin hydro- lyysin jälkeen reagenssilla (2), ja laskettiin näiden tulosten keskiarvo.

Arvot, jotka esitetään sarakkeessa "Aminohapporyh-mien otaksuttu lukumäärä", perustuvat siihen oletukseen, 30 että Leu-ryhmien lukumäärä on 33. Aminohapot, jotka vaativat yllä kuvatun kaltaista korjausta, yleensä joko hajoavat osittain tai huomattavasti hydrolyysin aikana tai eivät hydrolysoidu. Erityisesti Pro:n kohdalla saanto on alhainen. Pääasiallisesti näistä syistä mielenkiinnon koh-35 teenä olevien aminohappojen todellisilla mitatuilla mää- 84275 19

Taulukko 2 [Aminohapporyhmien las-

Mitatut arvot Kettu lukumäärä (pyö- c [ristetty suluissa ole- b Aminohapot > (nmol) .. . . 1. . ^ .. .v viksi kokonaisluvuiksi) - j ——

Asp (Asp + Asn) 3,54 4,3 (4)

Thr 4,58 5;5 (6)

Ser j 10,64 12,9 (13) 10 Glu (Glu + Gin)· 22,31 27,0 (27)

Pro i 8,30 10,1 (10)

Gly 10,60 12,8 (13)

Ala 14,85 18,0 (18) I 1/2Cys 2,59 3,1 (3) 15 Vai 6,16 7,5 (7)

Met 2,26 2,7 (3)

Ile 3,29 4,0 (4)

Leu 27,24 33,0 (33)

Tyr 2,60 3,1 (3) 20 Phe 5,08 6,1 (6)

Lys 3,68 4,5 (4)

His 3,93 4,8 (5)

Trp 1,61 1,9 (2)

Arg 4,29 5,2 (5) 25 ---— -

Kaikkiaan (166)

Laskettu molekyylipaino 17961 (sokeria ei ole laskettu mukaan 166 ryhmään) j 30 (v) Lämpötilastabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte (1 mg) liuotettiin 4 ml:aan 0,1 %:ista trifluorietikkahappoa, joka sisälsi 40 % n-pro-panolia. Osa (1 ml) liuoksesta laimennettiin 10 ml :11a 0,01 M Tris-HCl -puskuria (pH 7,4), joka sisälsi 1 % nau-35 dan seerumialbumiinia, jolloin CSF-pitoisuudeksi tuli 25 ng/ml. Tehtiin vielä viisi näytelaimennosta edellä kuva- 20 84275 tulla tavalla, ja nämä kaikkiaan kuusi laimennosta käsiteltiin 40 min vaihtelevissa lämpötiloissa 0, 37, 45, 56, 65 ja 100°C. Jäännös-CSA:n määrittäminen kustakin näytteestä osoitti, että keksinnön mukainen CSF oli stabiili 5 lämpötiloissa 0-45°C ja inaktivoitu! 56°C:ssa.

(vi) pH-stabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte (1 mg) liuotettiin 4 mitään 0,1 %:ista trifluorietikkahappoa, joka sisälsi 40 % n-pro-panolia. Osat (1 ml) liuoksesta laimennettiin kukin 10 10 ml:11a liuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia ja oli puskuroitu pH-arvoon 1, 3, 5, 7, 9, 11 tai 13. Kun CSF-pitoisuudeksi oli säädetty 25 ng/ml, annettiin näytteiden seistä jäähauteessa 24 tuntia. Sen jälkeen 2 ml kutakin laimennosta dialysoitiin 0,01 M Tris-HCl-puskuria 15 (pH 7,4) vastaan ja mitattiin jäännös-CSA. CSFtn havaittiin olevan stabiili laajalla pH-alueella 1-11.

(vii) Entsyymistabiilisuus

Kylmäkuivattu CSF-näyte liuotettiin 0,1 %:iseen trifluorietikkahappoon, joka sisälsi 40 % n-propanolia, 20 ja valmistettiin neljä näytettä sekoittamalla 0,67 pg liuosta 0,05 M Tris-HCl -puskuriin (pH 8,0) siten, että lopputilavuus oli 1 ml. Toinen näyte valmistettiin sekoittamalla 0,67 pg trifluorietikkahappoliuosta 0,05 M ase-taattipuskuriin (pH 5,0) siten, että kokonaistilavuus oli 25 1 ml. Kolmeen neljästä ensimmäisestä näytteestä lisättiin 1 pg RNaasia, trypsiiniä tai pronaasia, kun taas neljättä näytettä käytettiin vertailunäytteenä. Viidenteen näytteeseen lisättiin 1 pg neuraminidaasia. Näiden viiden näytteen annettiin reagoida 2 tuntia 37°C:ssa. Kun reaktio oli 30 mennyt loppuun, otettiin näytteistä 0,1 mltn osat, jotka laimennettiin 1 ml:11a RPMI 1640 -kasvualustaa, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia. CSA-mittaus osoitti, että RNaasi ja neuraminidaasi eivät inaktivoineet tämän keksinnön mukaista CSF:ää, kun taas trypsiinillä ja pro-35 naasilla oli siihen inaktivoiva vaikutus.

21 84275 (viii) Sokerikoostumus Näyte (11 nmol) sekoitettiin 25 nmol:iin inosito-lia, joka toimi sisäisenä standardina, ja 500 pl:aan 1,5 N HCl-metanolia, ja annettiin reagoida 90°C:ssa 4 tuntia 5 N02:lla huuhdotussa kiinni sulatetussa putkessa. Kun reaktio oli lopussa, putki avattiin päästä ja siihen lisättiin hopeakarbonaattia (Ag2C03) sisällön neutraloimiseksi. Lisättiin etikkahappoanhydridiä (50 μΐ), ravistettiin, ja seoksen annettiin seistä huoneen lämpötilassa pimeässä yön 10 yli- Ylempi kerros laitettiin koeputkeen ja kuivattiin N2-kaasulla. Sakka pestiin metanolilla ja sentrifugoitiin varovasti. Ylempi kerros kaadettiin koeputkeen, joka oli kuivattu N2-kaasulla, ja kuivattiin uudelleen. Kuivattuun sisältöön lisättiin 50 μΐ TMS-reagenssia (pyridiinin, hek-15 sametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos suhteessa 5:1:1), annettiin reagoida 20 min 40°C:ssa, minkä jälkeen seosta säilytettiin pakastimessa. Toistettiin muuten sama menettely, mutta käytettiin sisäisenä standardina inositolin (25 nmol) ja muun sokerin, kuten galaktoo-20 sin (Gal), N-asetyyligalaktosamiinin (Gal Nac) tai siaali-hapon, (50 nmol) yhdistelmää.

Näytteille tehtiin kaasukromatografia seuraavissa olosuhteissa.

Analysointiolosuhteet 25 Pylväs: 2 % OV - 17 Vinport HP (60 - 80 mesh), 3m, lasi Lämpötila: Kohotettiin 110 - 250°C:seen nopeudella 4°C/min.

Kantajakaasun paine: 1,2 - 1,6 kg/cm2 N2 alkuvai- 30 heessa ja 2 - 2,5 kg/cm2 N2 mittauksen loppua kohden

Herkkyys: 103 megaohmia alueella 0,1 - 0,4 V.

Paine: 0,8 kg/cm2 H2 ja 0,8 kg/cm2 ilmaa.

Näytteen koko: 2,5 - 3,0 μΐ

Analyysi osoitti, että keksinnön mukainen CSF koos-35 tui kolmesta sokerista, galaktoosista, N-asetyyligalak-toosista ja siaalihaposta.

22 8 4 2 7 5 (ix) Aminohapposekvenssin määrittäminen Näytteelle tehtiin Edman-hajotus kaasufaasisekven-toijassa (Applied Biosystem. Inc.), ja saatu PTH-aminohap-po tutkittiin tavanomaisin menetelmin HPLC:llä (Beckman 5 Instruments, Inc.) käyttäen Ultrophere-ODS -pylvästä (Beckman Instruments, Inc.). Pylväs (5 pm, 0 4,6 mm, pituus 250 mm) tasapainotettiin ensin aloituspuskurilla (15 mM natriumasetaattipuskuri, pH 4,5, vesiliuos, joka sisälsi 40 % asetonitriiliä). Sitten näyte liuotettiin 20 10 pl:aan aloituspuskuria ja erotettiin aminohapot eluoimalla isokraattisesti aloituspuskurilla. Virtausnopeus oli 1,4 ml/min ja pylvään lämpötila pidettiin 40°C:ssa. PTH-amino-happo detektoitiin käyttämällä hyväksi UV-absorptiota aallonpituuksilla 269 ja 320 nm. Standardi-PTH-aminohappo-15 näytteitä (2 nmol, Sigma Chemical Co.), joille oli tehty samanlainen aminohappoerotus retentioaikojen määrittämiseksi, käytettiin referensseinä, joihin näytteen retentio-aikoja verrattiin aminohapposekvenssin identifioimiseksi. N-pään 21 aminohapon järjestys oli seuraava: 20 (10) H2 N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln-( Ser )-Phe- (20) 25 Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val.

Esimerkki 3

Spesifisen aktiivisuuden määrittäminen

Esimerkin 1 mukaisten CSFrien spesifiset aktiivisuudet ihmisen luuydinsolujen suhteen määritettiin "CSA:n 30 määritysmenetelmällä (a)". Tulos oli 3,94 x 107 yksikköä/-mg tai suurempi.

Esimerkki 4

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu kylmäkuivattu CSF-jauhe jaettiin erillisiin CSF-komponentteihin määri-35 tettyjen isoelektristen pisteiden mukaisesti preparatiivi-sella isoelektrisellä elektroforeesilla seuraavissa olosuhteissa.

23 84275

Laitteisto: FBE-3000 (Pharmacia Fine Chemicals) Näyte: 10 mg kylmäkuivattua jauhetta liuotettiin 2 ml:aan 0,05 N fosforihappoa, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa.

Alusta: 15 g:aan Sephadex-IEF:ää (Pharmacia Fine 5 Chemicals) lisättiin 225 ml kahdesti tislattua vettä, joka sisälsi 4 mol/1 ureaa ja 0,1 % Tweeniä. Lisättiin 12 ml Pharmalyteä (pH 4 - 6,5, Pharmacia Fine Chemicals) ja seos jätettiin seisomaan yön yli, kunnes se turposi. Sen jälkeen seoksesta poistettiin perusteellisesti ilma imupul-10 lossa, ja se kaadettiin lasilevylle (230 mm x 230 mm) tasaiseksi 5 mm:n paksuiseksi kerrokseksi.

Elektrodiliuokset:

Elektrodiliuskat (6 x 10 mm, Pharmacia Fine Chemicals) kyllästettiin 0,1 M fosforihapolla (anodi) ja 0,1 M 15 NaOHrlla (katodi). Toinen liuska sijoitettiin yhdensuuntaisesti geelin toisen pään kanssa ja toinen samalla tavalla samansuuntaisesti geelin toisen pään kanssa. Elektrodit kytkettiin vakiovirtalähteeseen ESPS 2000/300 (Pharmacia Fine Chemicals).

20 Alustava elektroforeesi: 45 min teholla 8 W.

Näytteen lisäys: 1 cm:n levyinen geelipala raaputettiin irti 5 cm:n etäisyydeltä anodista ja laitettiin takaisin paikalleen, 25 kun siihen oli sekoitettu näyteliuos.

Elektroforeesi: 4 tuntia 50 W:n teholla, joka otettiin vakiovirta-lähteestä ECPS 2000/300.

Elektroforeesin lopettamisen jälkeen geelilevy 30 otettiin pois astiasta ja jaettiin 26 fraktioon fraktioin-tiverkon avulla. Kun kunkin fraktion pH oli mitattu, siirrettiin kustakin fraktiosta raaputettu geeli polypropylee-niseen pienoiskolonniin (Muromac, valmistaja Muromachi Kagaku K.K.) ja uutettiin vesiliuoksella, joka sisälsi 35 0,1 % trifluorietikkahappoa ja 4 mol/1 guanidiinihydro- 24 84275 kloridia, (10 ml). Osa (5 μΐ) kustakin uutetusta fraktiosta laimennettiin 16 ml:11a RPMI 1640 -kasvatusliuosta, joka sisälsi 1 % naudan seerumialbumiinia, ja mitattiin CSA "CSA:n määritysmenetelmällä (b)". Kullekin fraktiolle 5 saatiin aktiivisuuspiikit, jotka sopivat suurin piirtein yhteen isoelektristen pisteiden pl = 5,73, 6,03 ja 6,37 kanssa.

Vastaavat aktiiviset fraktiot adsorboitiin Micro Bondapak C18 -pylvääseen (Waters Associates, Inc., puoli-10 preparatiivinen laatu, 8 mm x 30 cm), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi n-propanolia ja tri-fluorietikkahappoa. Fraktiot eluoitiin 0,1 %:isella tri-fluorietikkahappoliuoksella, joka sisälsi n-propanolia lineaarisena pitoisuusgradienttina 30 -» 60 %. 40 %:n n-15 propanolipitoisuudella eluoituneet piikit kerättiin ja kylmäkuivattiin.

Kerättyjen fraktioiden aminohapot ja niiden sekvenssi määritettiin esimerkin 2 (iv) ja (ix) mukaisesti. Tulokset sopivat yhteen esimerkissä 2 saatujen kanssa.

20 Esimerkki 5

Osa (10 mg) esimerkin 1 mukaisesti valmistetusta kylmäkuivatusta CSF-jauheesta liuotettiin 2 mitään liuosta, joka sisälsi 0,1 mol/1 natriumkarbonaatin ja natriumbikarbonaatin seosta, (pH 9,0). Liuoksen pH säädettiin 25 arvoon 5,0 IN HCltlla. Lisättiin 100 pg neuraminidaasia, annettiin reagoida 2 tuntia 37°C:ssa, ja adsorboitiin reaktioseos Micro Bondapak C18 -pylväälle (Waters Associates, Inc., puolipreparatiivinen laatu, 8 mm x 30 cm), joka oli tasapainotettu vesiliuoksella, joka sisälsi n-propano-30 lia ja trifluorietikkahappoa. Adsorboitu seos eluoitiin 0,1 %:isella trifluorietikkahapon vesiliuoksella, joka sisälsi n-propanolia lineaarisena pitoisuusgradienttina 30 -+ 60 %. n-propanolipitoisuudella 40 % eluoituneet piikit otettiin talteen ja kylmäkuivattiin. Osalle kylmäkuivatus-35 ta jauheesta tehtiin analyyttinen isoelektrinen elektrofo- 25 84275 reesi, jossa saatiin yksi vyöhyke, joka vastasi pl-arvoa 6,37.

Esimerkki 6 Pesäkkeiden luokitus 5 "CSA:n määritysmenetelmän (a)" mukaisesti muodos tetut pesäkkeet siirrettiin yhdessä agarkerroksen kanssa lasilevylle K. Kubotan et ai. [Exp. Hemat. 8 (1980) 339 -344] menetelmällä ja kuivattiin näytteen preparoimiseksi kalvon muotoon. Tälle näytteelle tehtiin pesäkkeiden luo-10 kitus sekä esteraasikaksoisvärjäyksellä että Bieblich -punavärjäyksellä G. Konwalinkan et ai. [Exp. Hemat. 8 (1980) 434 - 440] menetelmällä. G. Konwalinkan et ai. menetelmää kuvataan tarkemmin seuraavassa.

(1) Kiinnitysliuos: puskuroitu formaliini-asetoni-15 liuos (pH 6,6)

Na2HP04 20 mg KH2P04 100 mg H20 30 ml

Asetonia 45 ml 20 Formaliinia__25 ml

Kaikkiaan 100 ml (säilytetään 4°C:ssa) (2) Epäspesifinen esteraasivärjäysliuos (valmistettiin juuri ennen käyttöä) koostui seuraavien komponenttien (A) ja (B) suodatetusta seoksesta: 25 (A) Fosfaattipuskuri (1/15 mol/1000 ml, pH 6,3) 9,5 ml

Fast Garnet BGC -suola 10 mg (B) a-naftyylibutyraatti 10 mg

Etyleeniglykolimonometyylieet-30 teri 0,5 ml (3) Klooriasetaattiesteraasivärjäysliuos (valmistettiin juuri ennen käyttöä) koostui seuraavien komponenttien (A) ja (B) suodatetusta seoksesta: (A) Fosfaattipuskuri (1/15 mol/1000 ml, 35 pH 7,4) 9,5 ml

Fast Blue RR -suola 5 mg 26 84275 (B) Naphthol AS-D -klooriase-taatti 1 mg N,N-dimetyyliformamidi 0,5 ml (4) Bieblich Scarlet -värjäysliuos koostui liuoksen 5 (A) (2 ml) ja liuoksen (B) (98 ml) seoksesta: (A) Bieblich Scarlet (MC/B Corporation) 5 g Dimetyylisulfoksidi 100 ml (B) 0,1 M Tris-Hcl -puskuri (pH 7,4) Käyttämällä täten valmistettuja kiinnitysliuosta ja 10 reaktioliuoksia tehtiin pesäkkeiden värjäys seuraavasti: (i) Pesäkkeitä kiinnitettiin 30 s kiinnitysliuok-sella (1) 4 - 10°C:ssa, pestiin tislatulla vedellä kolmesti ja kuivattiin huoneen lämpötilassa 10-30 min.

(ii) Kuivatut pesäkkeet upotettiin huoneen lämpöti-15 lassa reaktioliuokseen (2) 20 - 30 min:ksi ja pestiin kolmesti tislatulla vedellä.

(iii) Pesäkkeet upotettiin huoneen lämpötilassa reaktioliuokseen (3) 15 min:ksi ja pestiin kolmesti tislatulla vedellä.

20 (iv) Pesäkkeet upotettiin huoneen lämpötilassa reaktioliuokseen (4) 2 tunniksi ja pestiin virtaavalla vedellä.

(v) Pesäkkeet kuivattiin ja tutkittiin. Sinisiä jyväsiä sisältävät solut luokiteltiin neutrofiileiksi; rus-25 keitä jyväsiä sisältävät monosyytti-makrofaageiksi; ja punaisia jyväsiä sisältävät eosinofiileiksi.

Inkuboinnin 7. 10. ja 14. päivänä koostuivat pesäkkeet, joita muodostui käytettäessä keksinnön mukaista CSF:ää, kokonaan klooriasetaattiesteraasipositiivisista 30 neutrofiileista, eikä muita pesäketyyppejä havaittu.

Seuraavien, kokeiden (1) - (5), tulosten perusteella havaittiin keksinnön mukaisen CSF:n olevan oleellisilta osiltaan puhdasta: (1) Se antoi vain yhden piikin sekä RP-HPLC:ssä että molekyyliseula-HPLC:ssä, ja tämä piikki sopi 35 yhteen aktiivisuuspiikin kanssa; (2) tämä CSF muodosti yhden vyöhykkeen SDS-PAGE:ssa; (3) tämä CSF erottui koi- 27 84275 meksi komponentiksi, joilla oli erilaiset isoelektriset pisteet, isoelektrisessä elektroforeesissa, mutta kukin komponentti oli yksi ainoa komponentti, jolla oli pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; näyte, josta oli poistettu 5 päätesiaalihappo joko entsymaattisesti tai kemiallisesti, muodosti yhden vyöhykkeen isoelektrisessä elektroforeesissa; (4) vain yhtä PTH-aminohappotyyppiä esiintyi 21 N-ter-minaalisen aminohapporyhmän sekvenssianalyysin kussakin vaiheessa; (5) ominaisaktiivisuudella mitattuna tämä CSF 10 on noin 10 kertaa niin puhdasta kuin ne CSF:t, joiden on tähän mennessä ilmoitettu olevan tehokkaita ihmisessä.

Tällaista hyvin puhdasta CSF-muotoa, erityisesti sellaista, joka on hyvin puhdas ja jolla on kyky edistää luuydinsolujen erilaistumista ja lisääntymistä ihmisen 15 neutrofiileiksi, ei löydy saatavana olevasta kirjallisuu desta. Tämän keksinnön mukaista CSFrää on saatavissa geenitekniikalla aikaansaadusta ihmisen G-CSF:ää tuottavasta kannasta. Tämän keksinnön mukaista CSFrää voidaan käyttää reagenssina kliinisissä testeissä tai tutkimustyössä.

20

Claims (4)

2a 84275

1. Pesäkkeitä stimuloiva tekijä (CSF), tunnettu siitä, että sillä on seuraavat fysikokemialli-5 set ominaisuudet: i) Molekyylipaino: 19 000 ± 1000 määritettynä natriumdodekyylisulfaat-ti-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla; ii) Isoelektrinen piste:

10 Vähintään yksi taulukossa 1 esitetyistä kolmesta isoelektrisestä pisteestä A, B ja C: Taulukko 1

15 Isoelektrinen piste (pl) Urean (4 mol/1) läs- Ilman ureaa näollessa A 5,7 ± 0,1 5,5 ± 0,1

20 B 6,0 ± 0,1 5,8 ± 0,1 C 6,3 ± 0,1 6,1 ± 0,1 iii) UV-absorptio: Absorptiomaksimi aallonpituudella 280 nm ja -minimi 25 aallonpituudella 250 nm; iv) Seuraava 21 aminohapon sekvenssi N-päästä lukien: (10)

30 H2 N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-Gln- ( Ser) -Phe- (20) Leu-Leu-Lys-X-Leu-Glu-X-Val, jossa X on luonnossa esiintyvä aminohappo, ja että se on saatavissa viljelemällä 35 solulinjaa CHU-1, joka on talletettu talletuslaitokseen CNCM numerona 1-315, seerumivapaassa kasvatusliuoksessa, käsittelemällä viljelmän supernatantti alla esitettyjen vaiheiden (1) - (3) mukaisesti ja käsittelemällä saadut 29 84275 fraktiot mahdollisesti joko vaiheen (4) tai (5) mukaisesti : (1) viljelmän supernatantille tehdään geelisuodatus käyttämällä geeliä, jonka tehokas fraktioalue on 5 000 - 5 70 000 daltonia, ja otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus (CSA); (2) adsorboidaan kerätyt fraktiot käänteisfaasi-HPLC:ssä (RP-HPLC:ssä) käytettävälle kantajalle ja eluoi- 10 daan tiheysgradienttimenetelmällä veden ja orgaanisen liuottimen seoksella siten, että saadaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (3) tehdään täten kerätyille fraktioille suurteho- 15 molekyyliseulakromatografia siten, että saadaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva aktiivisuus; (4) tehdään täten kerätyille fraktioille isoelek-trinen piste -elektroforeesi siten, että otetaan talteen 20 fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimu loiva aktiivisuus; tai (5) tehdään vaiheessa (3) kerätyille fraktioille siaalihapon poisto siten, että otetaan talteen fraktiot, joilla on neutrofiilivaltaisia pesäkkeitä stimuloiva ak- 25 tiivisuus.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen CSF, tunnettu siitä, että sen isoelektrinen piste pl on A.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen CSF, tunnettu siitä, että sen isoelektrinen piste pi on B.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen CSF, tun nettu siitä, että sen isoelektrinen piste pi on C. 3o 84275