WO2020071663A1 - 유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물 - Google Patents

유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물

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WO2020071663A1
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cells
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medium
skin regeneration
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    • C12N2521/10—Sound, e.g. ultrasounds

Definitions

  • the present invention relates to an exosome having a skin regeneration and wound healing effect, a method for manufacturing the same, and a composition comprising the exosome.
  • Skin the largest tissue in the human body, accepts sensations, synthesizes vitamin D, has various functions involved in body temperature regulation and immune monitoring, and has an important function as a primary defense line that basically provides a protective film against disease and evaporation of water.
  • Wound healing of the skin is a complex step involving four stages: hemostasis, inflammation, proliferation and remodeling. Clotting and provisional wound matrix are formed in the first stage, which occurs from immediately after wound formation to within a few hours, and the activated inflammatory stage through the first stage is neutrophil recruitment and monocytes. Infection and necrosis are removed through participation and denaturation. In the proliferation stage, granulation tissue formation, vascular network recovery, migration to the surface of fibroblasts, repithelization, angiogenesis, etc.
  • the remodeling phase which continues until the process of actively progressing in the proliferation phase, such as granulation tissue formation stops through apoptosis, the collagen III produced in large quantities in the proliferation phase is replaced with tougher collagen I, and muscle fibers
  • the blast cells are multi-linked to collagen and the scar area is reduced. If one of the above processes does not work properly, the wound may be delayed or chronic, and in this case, a serious problem may occur in the role of the primary defense line. There may be cosmetic problems.
  • Skin appendages include hair follicles, sebaceous glands, nails and sweat glands.
  • the healing progress of large wounds varies from species to species.
  • the regeneration of the skin including skin substructures such as scales and glands, occurs completely.
  • skin regeneration is not complete in mammals except the embryonic stage, resulting in scar tissue without skin appendages, which prevents the function of the skin appendages related to additional protection, warming and sensation from being properly performed, and It lowers the quality of life from a psychological point of view.
  • Biologics which are medicines derived from organism-derived proteins, genes, and cells, are low toxicity because they do not have metabolites generated in the body like synthetic medicines, and have a good effect and have few side effects by selectively acting on the pathogenesis of disease. Has an advantage. In recent years, while these advantages have been spotlighted, methods for using biologics, especially stem cells, for the purpose of skin regeneration and wound healing have been developed, and methods of using stem cells themselves, extracts or cultures thereof, and the like have been disclosed.
  • compositions using stem cells have a problem of efficiency and economic efficiency of the separation and amplification of commonly difficult stem cells, and in the case of stem cell therapeutics, there is a risk for metastasis to cancer, etc., and in the case of stem cell extracts from cells There is a disadvantage that it is not easy to purify the active ingredient, and it takes a lot of time and cost.
  • stem cell culture the risk of using human body such as antibiotics and serum added to prevent contamination or waste products secreted from cells in addition to the active ingredient is not verified. There is a problem that the substances are not included.
  • exosomes are naturally occurring secreted nano-vesicles with a diameter of 30 to 200 nm, and can act as an important nano-media that transports various substances from a derived cell. Since the discovery that exosomes can change the phenotype of target cells through mRNA delivery, several studies have revealed that exosomes are involved in cell differentiation and the like. Recently, the possibility of using exosomes directly for the human body for therapeutic purposes has been variously sought. In particular, exosomes contain a variety of proteins and nucleic acids compared to biopharmaceuticals such as small molecules, peptides, growth factors, antibodies, and nucleic acids in the biopharmaceutical sector, and thus can have a more complex and long-lasting effect.
  • biopharmaceuticals such as small molecules, peptides, growth factors, antibodies, and nucleic acids
  • the present invention has been devised to solve the above-described problems, and an embodiment of the present invention includes providing ultrasonic stimulation directly or indirectly to a cell; Culturing the mixture of cells and media for a certain period of time; And separating the exosomes from the mixture; wherein, providing the stimulus directly applies ultrasonic stimulation to the medium containing the cells, and providing the stimulation indirectly to the medium not containing the cells.
  • a method of mixing the medium and the cells after applying ultrasonic stimulation and providing a method for obtaining exosomes having a skin regeneration and wound healing effect with high yield in a short time from easily obtainable cells.
  • an embodiment of the present invention is prepared by the above manufacturing method, to provide an exosome with increased RNA of a gene that promotes skin regeneration and wound healing.
  • an embodiment of the present invention provides a composition for skin regeneration and wound healing that is safe, including the exosome, and can have a higher durability than synthetic drugs.
  • a method of manufacturing an exosome having a skin regeneration and wound healing effect includes providing ultrasound stimulation directly or indirectly to a cell; Culturing the mixture of cells and media for a certain period of time; And separating the exosomes from the mixture; wherein, providing the stimulus directly applies ultrasonic stimulation to the medium containing the cells, and providing the stimulation indirectly to the medium not containing the cells. After the ultrasonic stimulation is applied, the medium is mixed with the cells.
  • the process of directly or indirectly providing ultrasonic stimulation to the cells is to provide ultrasonic stimulation to the mixture after mixing cells and media, or to provide ultrasonic stimulation to the media, to mix the medium and cells, or to ultrasonic waves to the cells.
  • the cells and medium are mixed, or after providing the cells with ultrasonic stimulation, the cells and medium are mixed and then the mixture is provided with ultrasonic stimulation, or after the medium is provided with ultrasonic stimulation, the medium and cells
  • Mixing and then proceeding in any one of the ways to provide ultrasonic stimulation to the mixture It can be characterized.
  • the direct ultrasonic stimulation is characterized in that the intensity is 0.1 to 3 W / cm2, the frequency is 20 kHz to 20 MHz, the duration is 0.1 seconds to 20 minutes, the indirect ultrasonic stimulation, the intensity is 1 to 20 W / cm2, the frequency is 20 kHz to 20 MHz, it may be characterized in that the duration is 0.1 seconds to 20 minutes.
  • the cell may be characterized in that the cell is selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells, fibroblasts, keratinocytes, or tissue cells in an organ, respectively.
  • the culture medium may be any of epithelial stem cell medium, dermal stem cell medium, adipose stem cell medium, mesenchymal stem cell medium, or embryonic stem cell medium.
  • Incubation of the mixture may be characterized in that it proceeds for 1 hour to 10 days.
  • the step of separating the exosomes may be characterized by using at least one of ultracentrifugation, density gradient, filtration, size exclusion chromatography, immunoaffinity separation, precipitation, and separation by microfluid.
  • the step of separating the exosomes comprises: centrifuging the mixture after the culture to obtain a supernatant; Filtering the supernatant with a filter to obtain a filtrate; And concentrating the filtrate; It may include.
  • the step of separating the exosomes may further include storing the supernatant at 4 ° C. or lower for 7 days to 1 month before filtering the supernatant.
  • the isolated exosome may be characterized in that the diameter is 50 to 200 nm.
  • Another aspect of the present invention characterized in that produced by the above manufacturing method, provides an exosome having a skin regeneration and wound healing effect.
  • the exosomes have increased RNA of a gene that promotes skin regeneration and wound healing compared to exosomes secreted from cells not subjected to the method of claim 1, and the gene that promotes skin regeneration and wound healing is EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF, miR-210, miR-31, Col1 ⁇ 1, ELN, PCNA, N-cadherin and Cyclin- It may be characterized by any one or more of D1.
  • the exosomes further increase the RNA expression of genes that promote skin regeneration and wound healing in the skin when applied to the skin compared to exosomes secreted from cells that have not undergone the method of claim 1, and the skin regeneration and wound healing.
  • the facilitating gene may be any one or more of Col1 ⁇ 1, Col3 ⁇ 1, ELN, PCNA, N-cadherin and Cyclin-D1.
  • compositions comprising an exosome having the skin regeneration and wound healing effect.
  • the composition may include the exosomes at a concentration of 10 6 / ml or more.
  • the method of manufacturing an exosome according to an embodiment of the present invention has a skin regeneration and wound healing effect through a simple process called ultrasound treatment from stem cells and progenitor cells, which are difficult to separate and amplify, as well as somatic cells that can be easily obtained. It can induce a large amount of exosome secretion.
  • the exosomes derived in this way have higher yields than conventional methods, and the amount and number of various factors included in the exosomes are also high.
  • Exosomes and compositions comprising the same according to an embodiment of the present invention may contain a large amount of various factors that can induce skin regeneration and wound healing.
  • the exosome since the exosome has a phospholipid-based membrane structure, and pore penetration is easy, so the efficiency of material delivery is high, the exosome according to an embodiment of the present invention can effectively induce skin regeneration and wound healing, and use synthetic drugs It has the advantage that there are no side effects.
  • the exosome according to an embodiment of the present invention induces wound healing that is generally incomplete in mammals to be more intact, so that scars are not left or formed small, and skin substructures such as the roots of the wound can also be regenerated. can do.
  • Example 1 is an immunofluorescence staining image showing induction of exosome marker CD63 as data for generating exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention.
  • Figure 2 is a gene expression data of exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, RNA onto the exosomes (iExo) only in the exosome (iExo) gene overlogy analysis results of genes counted 12 or more .
  • Example 3 is gene expression data of exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, RNA-seq result data related to wound healing.
  • Figure 4 is a gene expression data of exosomes with skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, angiogenesis, cell growth, cell migration, cell proliferation, inflammatory response, regeneration, secretion, tissue regeneration and tissue RNA-seq result data related to remodeling.
  • Example 5 is gene expression data of exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, qRT-PCR data analyzing RNA of skin regeneration and wound healing related genes in the exosomes.
  • Example 6 is an in vitro effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, the cell proliferation analysis data in HDF treated with the exosomes at various concentrations.
  • Example 7 is an in vitro effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, time-shifted mobility data for each exosome treatment concentration of HDF measured by scratch assay.
  • Example 8 is in vitro effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, the tube formation analysis data of HUVECs by concentration of the exosome treatment.
  • Example 9 is an in vitro effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, qRT analyzing RNA of skin regeneration and wound healing related genes in cells treated with the exosomes -PCR data.
  • Example 10 is an in vivo effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, the wound healing progress image over time in mice treated with the exosomes at various concentrations.
  • Figure 11 is an in vivo effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, H & E staining image of wound tissue cross section in mice treated with various concentrations of the exosomes.
  • Example 12 is an in vivo effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, analysis of cell proliferation markers by concentration of wound sites in mice treated with exosomes at various concentrations data.
  • Example 13 is in vivo effect data by exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, skin penetration analysis data of the exosomes.
  • Figure 14 is in vivo effect data by exosomes with skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, RT at the wound site by exosome treatment concentration in mice treated with exosomes at various concentrations -PCR result data.
  • Figure 15 is an in vivo effect data by exosomes with skin regeneration and wound healing effects according to Example 1 of the present invention, a comparison image of subcutaneous vascular development of the wound site 3 weeks after the wound in mice treated with the exosomes .
  • a method for producing an exosome having a skin regeneration and wound healing effect is a method for producing an exosome having a skin regeneration and wound healing effect, directly or indirectly ultrasound to a cell.
  • the process of directly or indirectly providing ultrasonic stimulation to the cells is to provide ultrasonic stimulation to the mixture after mixing cells and media, or to provide ultrasonic stimulation to the media, to mix the medium and cells, or to ultrasonic waves to the cells.
  • the cells and medium are mixed, or after providing the cells with ultrasonic stimulation, the cells and medium are mixed and then the mixture is provided with ultrasonic stimulation, or after the medium is provided with ultrasonic stimulation, the medium and cells
  • the provision of such ultrasonic stimulation may be performed one or more times in a direct or indirect manner to a cell or a combination of one or more of the above methods, and as the number of times increases, the skin regeneration and wound healing effects of exosomes may increase proportionally. have.
  • the direct ultrasonic stimulation is characterized in that the intensity is 0.1 to 3 W / cm 2 , the frequency is 20 kHz to 20 MHz, the duration is 0.1 seconds to 20 minutes, the indirect ultrasonic stimulation, the intensity is 1 to 20 W / cm 2 , a frequency of 20 kHz to 20 MHz, and a duration of 0.1 seconds to 20 minutes. More preferably, the direct ultrasonic stimulation is characterized in that the intensity is 0.5 to 2 W / cm 2 , the frequency is 20 kHz to 2 MHz, the duration is 0.1 seconds to 10 minutes, the indirect ultrasonic stimulation, the intensity It may be characterized in that 2 to 10 W / cm 2 , the frequency is 20 kHz to 2 MHz, and the duration is 1 second to 15 minutes.
  • Each of the cells may be selected from cells other than mammalian-derived germ cells, and is preferably selected from the group consisting of stem cells, progenitor cells, fibroblasts, keratinocytes, or tissue cells in organs, respectively. It may be, and more preferably, it may be any one of mammalian-derived fibroblasts or tissue cells in an organ.
  • the exosome can be obtained using any cell, it is difficult to obtain and difficult to amplify stem cells or bulbs This is because cells that are easy to obtain, maintain, and amplify, such as fibroblasts or tissue cells in organs, are easier and more efficient than cells.
  • the cells may be any one of autologous, allogeneic, or heterologous, depending on future use of the exosomes for a living body to be described later, and may be obtained from mammals when they are heterologous. .
  • allogeneic most preferably autologous, can be used.
  • the step of applying the ultrasonic stimulation to the cells may be performed in a state in which only a minimal amount is included so that the cells are directly sonicated or the cells are barely covered in the initial culture medium.
  • the initial culture medium is a general medium used to maintain the cells in a healthy state, and may be a medium suitable for normal culture of the cells, for example, the cells are fibroblasts, DMEM medium containing antibiotics and serum. .
  • the culture medium may be selected from epithelial stem cell medium, dermal stem cell medium, adipose stem cell medium, mesenchymal stem cell medium, or embryonic stem cell medium, but is not limited thereto.
  • skin stem cell medium bone marrow stem cell medium, vascular endothelial progenitor cell medium, vascular progenitor cell medium, mesenchymal progenitor cell medium, epithelial stem cell medium, dermal stem cell medium, hematopoietic stem cell medium, adipose stem cell medium, mesenchymal cell Stem cell medium or embryonic stem cell medium and various adult stem cell medium.
  • a second cell medium treated with ultrasound (a medium capable of culturing the second cell or inducing differentiation into the second cell) And exosomes obtained by culturing a mixture of sonicated first cells can be reprogrammed into second cells, and stem cells or their extracts, cultures, etc. can all be used for skin regeneration and wound healing. It is known to exhibit an effect.
  • Incubation of the mixture may be characterized by proceeding for 1 to 10 days, preferably for 1 to 6 days, most preferably for 1 to 2 days. This is because exosomes are most often secreted on the first day after sonication, and the secretion amount decreases over time, because there is a possibility that there may be a change in the components due to the decrease in the secretion amount.
  • the step of separating the exosomes may be characterized by using at least one of ultracentrifugation, density gradient, filtration, size exclusion chromatography, immunoaffinity separation, precipitation, and separation by microfluid.
  • the step of separating the exosomes comprises: centrifuging the mixture after the culture to obtain a supernatant; Filtering the supernatant with a filter to obtain a filtrate; And concentrating the filtrate.
  • the centrifugation proceeds to remove cell debris and dead cells, and preferably may be performed at 1000 to 5000 g for 10 to 60 minutes.
  • the step of filtering the supernatant with a filter is performed to further remove the cell debris and obtain particles of a specific size or less, and the filter used here may be a syringe filter.
  • the step of concentrating the filtrate may preferably be performed using a centrifugal filter. By using a centrifugal filter, the filtrate can be concentrated while removing particles below a certain size.
  • the step of separating the exosomes may further include storing the supernatant at 4 ° C. or less for 7 days to 3 months before filtering the supernatant.
  • the storage may be preferably within 4 days at 4 ° C or less, more preferably within 1 month at -20 ° C or less, and most preferably within 3 months at -80 ° C or less.
  • the effective components of exosomes are mRNA and protein, and the like, these components can be easily denatured or decomposed as the temperature is higher or the enzyme activity is closer to the higher temperature.
  • the isolated exosomes may be characterized by having a diameter of 50 to 200 nm, and preferably by having a diameter of 100 to 150 nm.
  • Exosomes having skin regeneration and wound healing effects according to another aspect of the present invention are characterized by being prepared by the above-described manufacturing method.
  • skin regeneration and wound healing may include one or more of anti-aging, anti-wrinkle, wrinkle improvement, wound healing, scar healing and tissue regeneration.
  • RNA of a gene that promotes skin regeneration and wound healing is increased compared to exosome secreted from cells that have not been subjected to the manufacturing method, and the gene that promotes skin regeneration and wound healing is EGFR (Epidermal growth factor).
  • EGFR Epidermal growth factor
  • Fibronectin 1 FN1, Matrix Metallopeptidase 9 (MMP9), Matrix Metallopeptidase 2 (MMP2), Mitogen-activated protein kinase 1 (MAPK1), Fibroblast growth factor 2 (FGF2), Connective tissue growth factor (CTGF), AKT1 (AKT Serine / Threonine kinase 1), ALB (Albumin), TGFB1 (Transforming growth factor beta 1), MAPK3 (Mitogen-activated protein kinase 3), VEGFA (Vascular endothelial growth factor A), FGF7 (Fibroblast growth factor 7), Hepatocyte growth factor (HGF), Interleukin 6 (IL6), Epidermal growth factor (EGF), miR-210 (MicroRNA 210), miR-31 (MicroRNA 31), Col1 ⁇ 1 (Collagen 1 alpha 1), ELN (Elastin), PCNA (Proliferatin cell nuclear antigen), characterized by at least one of N
  • the exosomes increase the RNA expression of genes that promote skin regeneration and wound healing in the skin when applied to the skin compared to exosomes secreted from cells that have not been subjected to the preparation method, and promote the skin regeneration and wound healing.
  • the gene may be any one or more of Col1 ⁇ 1, Col3 ⁇ 1 (Collagen 3 alpha 1), ELN, PCNA, N-cadherin and Cyclin-D1.
  • Another aspect of the present invention provides a composition comprising exosomes having the skin regeneration and wound healing effects.
  • the composition may be that the composition contains the exosomes at least 10 6 pieces / ml or more, preferably the exosomes may be contained at a concentration of 10 6 pieces / ml to 10 14 pieces / ml, More preferably, it may be contained in a concentration of 10 11 pieces / ml to 10 12 pieces / ml. This is because if the concentration of the exosomes contained is less than 10 6 / ml or more than 10 14 / ml, the skin regeneration and wound healing effects may be deteriorated, especially when the concentration is too high, the economic efficiency is also lowered.
  • additives such as pharmaceutically acceptable carriers and / or other additives capable of further enhancing the absorption and regeneration and healing reactions of the active ingredients may be added to the composition. As it is self-evident, detailed description of this will be excluded.
  • Example 1 Preparation of exosomes with skin regeneration and wound healing effects.
  • the exosomes were separated from the culture medium in which the sonicated HDF (UHDF) was cultured, and the exosomes were separated from the culture medium in which the UHDF was cultured as follows:
  • the culture medium was centrifuged at 3,000 X g for 20 minutes, and the cell debris and After removing the dead cells, the supernatant was passed through a 0.22-mm filter (Minisart® Syringe Filter, Sartorius, Goettingen, Germany).
  • the medium that was passed through was placed in an Amicon® Ultra-15 100,000 kDa device (Millipore, Billerica, MA, USA) and centrifuged at 14,000 X g for 20 minutes to concentrate exosomes (iExo).
  • Example 1 Cells cultured according to the method for preparing exosomes having skin regeneration and wound healing effects of Example 1 (UHDF) were analyzed through immunofluorescence staining for a CD63 exosome marker (at this time, the control staining was a nuclear staining agent DAPI ), The CD63 signal intensity was significantly higher than that of the control group, and it was confirmed that a large amount of exosomes was generated (FIG. 1).
  • RNA-seq for the prepared exosomes in the exosomes prepared according to Example 1 (iExo), in particular, wound healing, angiogenesis, cell growth, compared to exosomes (nExo) isolated from cells cultured without ultrasonic stimulation, Gene expression related to cell migration, cell proliferation, inflammatory response, regeneration, secretion, tissue regeneration, and tissue remodeling was shown to be high (FIGS. 2-4), typically EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF , AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF and protein-encoding genes and microRNAs such as miR-210 and miR-31 were included (Fig. 3).
  • the extracellular matrix related genes Col1 ⁇ 1, Col3 ⁇ 1 and ELN related to tissue regeneration and wound healing
  • the expressions of PCNA, N-Cadherin, and Cyclin-D1 which are genes related to cell proliferation, were higher than those of exosomes (nExo) isolated from the control group (FIG. 5).
  • the exosomes prepared according to the method for preparing the exosomes having the skin regeneration and wound healing effects of Example 1 were added to the medium to culture HDF, and the effect according to the concentration of the exosomes was confirmed.
  • the test group I was higher further, the expression of the marker in comparison to the control group, especially 5X10 11 gae / ml and 10X10 11 gae / ml of exo the concentration It was found that the effect was more excellent when the bit was treated, and it was confirmed that the number of cells increased more (FIG. 6).
  • tissue regeneration and wound healing related genes Col1 ⁇ 1, Col3 ⁇ 1, ELN, PCNA, N-cadherin and Cyclin-D1 in cells treated with exosomes were analyzed by qRT-PCR.
  • the expression of the wound healing-related gene was higher than that of the control group (FIG. 9).
  • exosomes (iExo) prepared in accordance with the method for preparing exosomes having skin regeneration and wound healing effects of Example 1 in vivo , a 6 mm wound was punched into the skin of a 6-week-old C57 mouse , iExo were diluted in PBS at concentrations of 0, 5, 10, 20 X10 11 pcs / ml, respectively, and applied twice a week to the wound site.
  • the skin tissue was completely restored in the second week, and the epidermis, dermal layer, fat layer, and muscle layer constituting the skin tissue were regenerated to clearly distinguish them.
  • the hair follicle which is a skin appendage, was located without any difference between the wound and the surrounding area.
  • the exosomes at concentrations of 10 and 20 X10 11 / ml were treated, the scar disappeared even after 2 weeks (Fig. 11). .
  • Ki67 was widely observed in the treated group compared to the group not treated with exosomes (FIG. 12), and the cells at the damaged site It was found that proliferation was actively progressing.
  • iExo was stained with Vybrant TM DiD Cell-Labeling Solution and treated to the wound site, and after 2 weeks, the iExo-treated area was analyzed with a fluorescence microscope. As a result, iExo penetrated the entire wound area, and was described above by effective penetration. It was confirmed that regenerating and healing effects may be exhibited (FIG. 13).
  • tissue regeneration and wound healing related genes Col1 ⁇ 1, Col3 ⁇ 1, ELN, N-cadherin and Cyclin-D1 at the wound site treated with exosomes were analyzed by qRT-PCR, and as a result, of the experimental group treated with iExo.
  • the expression of one or more of the genes was higher than that of the control group (FIG. 14).
  • the gene with the highest increase in each concentration was different, and it was difficult to confirm the correlation between concentration and expression increase and decrease.
  • the exosomes prepared according to Example 1 can improve tissue wound healing and regeneration by promoting cell proliferation, migration, and vascular development.
  • the effect of the exosomes can also be seen in vivo to speed up skin regeneration and wound healing, while inducing more complete skin regeneration and wound healing where skin sub-tissues can be regenerated with or without scarring.
  • Fibroblast media (10%) containing 2 mM GlutaMAX TM -I Supplement (Gibco), 6 U / mL heparin (Sigma-Aldrich) and 200 ⁇ M ascorbic acid (Sigma-Aldrich) for HDF (NHDF) not stimulated by ultrasound It was cultured in DMEM (Gibco) containing fetal bovine serum (Gibco) and 1% penicillin / streptomycin (Gibco)). When exosomes (nExo) were separated from the culture medium in which the NHDF was cultured, the same procedure as in the exosome separation method of Example 1 was performed.
  • the medium was changed to a medium containing exosomes obtained according to Comparative Example 1 and cultured for 5 days.
  • the medium containing exosomes was used as embryonic stem cell culture medium, and the culture medium was changed every 2 days.
  • PBS an iExo dilution solvent
  • the exosome having a skin regeneration and wound healing effect according to the present invention and a composition comprising the same contain a large amount of various gene products that can induce skin regeneration and wound healing, especially genes that promote skin regeneration and wound healing. Since it has a phospholipid-based membrane structure, it is easy to penetrate the scalp and has a high material transfer efficiency, so it can effectively induce skin regeneration and wound healing, and has no side effects caused by the use of synthetic drugs, and the effect is more consistently including skin It can be used as a drug that can induce regeneration and healing in case of tissue damage.
  • the method for producing exosomes having the effect of skin regeneration and wound healing according to the present invention includes various factors having the above effects, and exo containing high concentrations of active ingredients through an easy process of processing ultrasonic stimulation on cells. Some can be obtained in high yield.

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Abstract

세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 초음파 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 초음파 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법을 개시한다. 이러한 엑소좀의 제조방법은, 다루기 어려운 줄기세포뿐 아니라 손쉽게 얻고 유지할 수 있는 체세포로부터도 초음파 처리라는 간단한 과정을 통해 단시간 안에 높은 수율로 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 수득할 수 있다. 이렇게 수득한 엑소좀은 포함된 각종 인자의 양 및 수 역시 높고, 상기 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있는 다양한 인자가 증가되어 있으며, 엑소좀은 인지질 기반의 막구조를 가져 피부 침투가 용이하여 물질의 전달 효율이 높아 피부 재생 및 상처 치유를 효과적으로 유도할 수 있고, 안전하고 합성의약품의 사용으로 나타나는 부작용이 없다는 장점이 있다.

Description

유도된 엑소좀을 포함하는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물
본 발명은 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀과 그 제조방법, 그리고 상기 엑소좀을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
인체에서 가장 큰 조직인 피부는 감각을 수용하며 비타민D를 합성하고 체온 조절 및 면역 감시에 관여하는 다양한 기능 외에 기본적으로 질병 및 수분 증발에 대한 보호막을 제공하는 1차 방어선으로서의 중요한 기능을 가진다. 피부의 상처 치유는 지혈(hemostasis), 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 재형성(remodeling)의 네 단계를 수반하는 복잡한 단계이다. 상처 형성 직후부터 몇 시간 이내까지 일어나는 첫번째 단계에는 혈액응고(clotting) 및 임시적인 상처기질(provisional wound matrix)이 형성되고, 첫번째 단계를 거치며 활성화된 염증 단계는 호중구(neutrophil) 모집과 단핵구(monocyte)의 참여 및 변성을 통해 감염체 및 괴사조직을 제거하게 된다. 증식 단계에서는 육아조직(granulation tissue) 형성, 혈관 네트워크 회복, 섬유아세포(fibroblast)의 표면으로의 이동, 재상피화(reepithelization), 신생혈관생성(angiongenesis) 등이 일어나며, 상처 형성 21일부터 1년 후까지 이어지는 성숙(remodeling) 단계에서는 세포사멸(apoptosis)을 통해 육아조직 형성이 멈추는 등 증식 단계에서 활발히 진행되던 과정들이 서서히 멈추고, 증식 단계에서 다량 생산된 콜라겐III이 더 질긴 콜라겐I으로 대체되며, 근섬유아세포가 콜라겐에 다중연결되며 흉터면적을 줄이게 된다. 상기 과정 중에서 한 가지라도 적절히 작용하지 않을 경우 상처는 그 치유가 지연되거나 만성화될 수 있는데, 이러한 경우 특히 1차 방어선으로서의 역할에 심각한 문제가 생기게 될 수 있으며, 반대로 치유는 이루어지더라도 흉터 과형성 등에 의해 외형적인 문제가 생길 수 있다.
피부 부속구조(skin appendages)는 모근, 피지샘, 손톱 및 땀샘을 포함한다. 큰 상처의 치유 경과는 종마다 차이가 있다. 어류 및 양서류 등 하등 척추동물의 경우, 비늘, 분비샘 등 피부 부속구조를 포함한 피부의 재생이 온전히 일어나게 된다. 반면, 배아 단계를 제외하고 포유류에서는 피부재생이 온전하지 않아 피부 부속구조가 없는 흉터 조직이 생성되고, 이는 추가적인 보호, 보온 및 감각과 관련된 피부 부속구조의 기능이 제대로 수행될 수 없도록 하며, 미용 및 심리적인 면에서 삶의 질을 낮추게 된다.
생물체 유래 단백질, 유전자, 세포 등을 원료로 한 의약품인 생물의약품(biologics)은 합성의약품처럼 체내에서 발생되는 대사 산물이 없어 독성이 낮고, 질환의 발병기전에 선택적으로 작용하여 효과가 좋고 부작용이 적다는 장점을 가진다. 최근 이러한 장점이 각광받으면서 피부 재생 및 상처 치유를 목적으로 생물의약품, 특히 줄기세포를 이용하는 방법이 개발되고 있으며, 줄기세포 자체, 그 추출물 또는 배양액을 이용하는 방법 등이 개시되어 있다. 하지만, 줄기세포를 이용하는 상기 조성물들은 공통적으로 까다로운 줄기세포의 분리 및 증폭이라는 효율성 및 경제성의 문제를 가지고, 줄기세포 치료제의 경우 암으로의 전이 등에 대한 위험성이 존재하며, 줄기세포 추출물의 경우 세포로부터 유효성분을 정제하는 것이 쉽지 않아 비용과 시간이 많이 소요된다는 단점이 있고, 줄기세포 배양액의 경우 유효성분 외에도 세포로부터 분비된 노폐물이나 오염방지를 위해 첨가된 항생제 및 혈청 등 인체 사용시의 위험이 검증되지 않은 물질들이 포함되어 있다는 문제점이 있다.
엑소좀은 자연적으로 분비되는 30 내지 200 nm 직경의 나노소낭으로, 유래 세포로부터 다양한 물질을 운반하는 중요한 나노매개체로 작용할 수 있음이 알려져 있다. 엑소좀이 mRNA 전달을 통해 목표 세포의 표현형을 변화시킬 수 있다는 발견 이래로, 여러 연구에 의해 엑소좀이 세포 분화 등에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 최근 엑소좀을 치료 목적으로 인체에 직접 사용하는 가능성이 다양하게 모색되고 있다. 특히 엑소좀은 이러한 생물의약품 부문에서 작은 분자, 펩타이드, 성장인자, 항체, 핵산 등의 생물약제(biopharmaceuticals)에 비해 다양한 단백질 및 핵산을 함유하고 있어 좀더 복잡하고 오래 가는 효과를 낼 수 있고, 세포와 같이 큰 의약품에 비해 전이 등의 위험이 없으며 세포의 주입시에 일어나는 소포체 형태로의 분해가 필요 없으므로 세포와는 다른 시공간적 효과를 가질 수 있다는 장점을 가진다. 최근, 특히 여러 증상 개선 및 치유 효과를 가지는 것으로 알려진 줄기세포로부터 얻은 엑소좀을 치료 조성물로 사용하는 기술이 개발되고 있다. 대한민국 공개특허 10-2017-0044999(2015.10.16.)에서는 성체줄기세포 또는 그 배양액 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물에 대해 개시하고 있다. 그러나, 상기 공개특허의 기술을 포함하여 엑소좀을 사용하는 치료 조성물 관련 기술들은 엑소좀 수득 수율이 낮고, 대부분 분리 및 증폭이 까다로운 줄기세포를 사용한다. 따라서 엑소좀을 임상적으로 사용하기 위해서는, 줄기세포가 아니라 쉽게 얻고 증폭·유지할 수 있는 세포로부터 엑소좀을 얻으면서도, 그 수율을 높일 수 있는 기술이 요구된다.
본 발명은 전술한 문제를 해결하고자 안출된 것으로서, 본 발명의 일 실시예는 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 초음파 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 초음파 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을, 손쉽게 얻을 수 있는 세포로부터 단시간에 높은 수율로 얻을 수 있는 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 제조방법으로 제조되어, 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가된 엑소좀을 제공한다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 상기 엑소좀을 포함하여, 안전하고, 합성의약품에 비해 높은 지속력을 가질 수 있는 피부 재생 및 상처 치유용 조성물을 제공한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 한정되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 기술적 과제를 달성하기 위한 기술적 수단으로서, 본 발명의 일 측면에 따른, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 초음파 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 초음파 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것이다.
여기서, 상기 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 세포는 상기 세포는 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 배양 배지는 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나일 수 있다.
상기 혼합물의 배양은 1시간 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 초원심분리, 밀도구배, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성분리, 침전, 미세유체에 의한 분리방법 중 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계; 를 포함할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃이하에서 7일 내지 1달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 제공한다.
여기서 상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF, miR-210, miR-31, Col1α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 측면은, 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
여기서 상기 조성물은 상기 엑소좀이 106 개/ml 이상의 농도로 포함된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀의 제조방법은 분리 및 증폭 과정이 까다로운 줄기세포 및 전구세포는 물론 쉽게 얻을 수 있는 체세포로부터도, 초음파 처리라는 간단한 과정을 통해 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가지는 엑소좀 분비를 다량 유도할 수 있다. 이렇게 유도된 엑소좀은 그 수득 수율이 기존의 방법에 비해 높으며, 상기 엑소좀 내에 포함된 각종 인자의 양 및 수 역시 높다.
본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있는 다양한 인자를 다량 함유할 수 있다. 또한 엑소좀은 인지질 기반의 막구조를 가져 모공 침투가 용이하여 물질의 전달 효율이 높으므로 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀은 피부 재생 및 상처 치유를 효과적으로 유도할 수 있고, 합성의약품의 사용으로 나타나는 부작용이 없다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 엑소좀은 포유류에서는 일반적으로 불완전하게 일어나는 상처 치유가 좀더 온전하도록 유도하여 흉터가 남지 않거나 작게 형성되도록 하고, 상처 부위의 모근 등 피부 부속구조도 재생될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 생성 데이터로, 엑소좀 마커인 CD63의 유도를 나타낸 면역형광염색 이미지
도 2는 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 유전자 발현 데이터로, RNA-seq으로 상기 엑소좀(iExo)에서만 에서만 12 이상 read count된 유전자들의 Gene ontology 분석 결과.
도 3은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 유전자 발현 데이터로, 상처 치유와 관련된 RNA-seq 결과 데이터.
도 4는 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 유전자 발현 데이터로, 혈관신생, 세포성장, 세포이동, 세포증식, 염증반응, 재생, 분비, 조직재생 및 조직 리모델링과 관련된 RNA-seq 결과 데이터.
도 5는 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 유전자 발현 데이터로, 상기 엑소좀 내의 피부 재생 및 상처 치유 관련 유전자의 RNA를 분석한 qRT-PCR 데이터.
도 6은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vitro 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 HDF에서의 세포증식 분석 데이터.
도 7은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vitro 효과 데이터로, scratch assay로 측정한 HDF의 각 엑소좀 처리농도별 시간별 이동능 데이터.
도 8은 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vitro 효과 데이터로, 상기 엑소좀 처리 농도별 HUVEC의 tube 형성 분석 데이터.
도9는 본 발명의 실시예1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vitro 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 처리한 세포 내 피부 재생 및 상처 치유 관련 유전자의 RNA를 분석한 qRT-PCR 데이터.
도10은 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 마우스에서의 시간에 따른 상처 치유 경과 이미지.
도11은 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 마우스에서의 상처 부위 조직 단면 H&E 염색 이미지.
도12는 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 마우스에서의 상처 부위의 농도별 세포 증식 마커 분석 데이터.
도13은 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀의 피부 침투 분석 데이터.
도14는 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 여러 농도로 처리한 마우스에서 엑소좀 처리 농도별 상처 부위에서의 RT-PCR 결과 데이터.
도15는 본 발명의 실시예 1에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀에 의한 in vivo 효과 데이터로, 상기 엑소좀을 처리한 마우스에서 상처 경과 3주 후 상처부위의 피하 혈관발달 비교 이미지.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 않으며 본 발명은 후술할 청구범위의 의해 정의될 뿐이다.
덧붙여, 본 발명에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 발명의 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 '포함'한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면에 따른, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 본 발명의 일 측면에 따른, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 단계; 상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및 상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고, 상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 초음파 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 초음파 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 과정은 세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나, 세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나, 세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나, 세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나, 세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하는 방식 중에서 선택된 어느 하나의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 초음파 자극의 제공은 세포에 직간접적인 방법으로 1회 이상 또는 상기 방식 중에서 하나 이상을 선택한 조합으로 진행될 수 있고, 횟수가 증가함에 따라 엑소좀의 피부 재생 및 상처 치유 효과가 비례적으로 증가할 수 있다. 이렇게 1회 이상 초음파 자극을 제공할 때에는 각 회차 사이에 세포가 회복할 수 있도록 시간 간격을 두는 것이 바람직하며, 상기 시간 간격은 1일 이상, 좀더 바람직하게 2일 이상으로 둘 수 있다.
상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 할 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.5 내지 2 W/cm2이며, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이고, 지속시간이 0.1초 내지 10분인 것을 특징으로 하며, 상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 2내지 10 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 2 MHz이며, 지속시간이 1초 내지 15분인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 세포는 각각 포유류 유래의 생식 세포를 제외한 세포 중에서 선택될 수 있고, 바람직하게 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 더욱 바람직하게 포유류 유래의 섬유아세포 또는 기관 내 조직세포 중 어느 하나일 수 있다. 이는, 후술할 본 발명의 일 측면에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가지는 엑소좀의 제조방법에 따르면, 상기 엑소좀은 어떤 세포를 사용하더라도 수득이 가능하므로, 얻기 힘들고 증폭이 까다로운 줄기세포나 전구세포보다 섬유아세포나 기관 내 조직세포 등 수득, 유지 및 증폭이 쉬운 세포가 더 손쉽고 효율적이기 때문이다. 상기 세포는 상기 엑소좀의 후술할 생체에 대한 추후 용도에 따라 자가유래(autologous), 동종유래(allogeneic) 또는 이종유래(heterologous) 중 어느 하나일 수 있고, 이종유래인 경우 포유류로부터 얻어진 것일 수 있다. 면역거부반응에 대한 가능성을 줄이기 위해, 바람직하게는 동종유래, 가장 바람직하게는 자가유래의 것을 사용할 수 있다.
상기 세포에 초음파 자극을 가하는 단계는, 세포에 직접 초음파 처리를 하거나, 세포가 초기 배양 배지에 간신히 덮힐 정도로 최소한의 양만 포함된 상태에서 진행될 수 있다. 이때의 초기 배양 배지는 상기 세포를 건강한 상태로 유지할 때 사용하는 일반적인 배지로, 상기 세포의 통상적인 배양에 적합한 배지, 예컨대, 상기 세포가 섬유아세포이고, 항생제와 혈청이 포함된 DMEM 배지일 수 있다.
상기 배양 배지(세포가 없이 초음파 처리되는 배지)는 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 피부줄기세포 배지, 골수줄기세포 배지, 혈관내피전구세포 배지, 혈관전구세포 배지, 간엽성전구세포 배지, 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 조혈모세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 및 각종 성체줄기세포 배지 중 어느 하나일 수 있다. 이는, 본 발명의 발명자에 의해 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0060317호의 발명에 따르면, 초음파 처리된 제2세포 배지(제2세포를 배양하거나 제2세포로 분화를 유도할 수 있는 배지) 및 초음파 처리된 제1세포의 혼합물을 배양함으로써 얻은 엑소좀을 다른 세포에 처리하면 이 세포를 제2세포로 리프로그래밍할 수 있고, 줄기세포 또는 그 추출물, 배양액 등은 모두 피부 재생 및 상처 치유에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다.
상기 혼합물의 배양은 1 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 1 내지 6일 동안, 가장 바람직하게는 1 내지 2일 동안 진행되는 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 엑소좀이 초음파 처리 후 1일차 때 가장 많이 분비되며, 시간이 지남에 따라 그 분비량이 감소하는데, 이러한 분비량 감소로 미루어 보아 성분에도 변화가 있을 가능성이 존재하기 때문이다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 초원심분리, 밀도구배, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성분리, 침전, 미세유체에 의한 분리방법 중 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액을 농축하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 원심분리는 세포 데브리 및 죽은 세포들을 제거하기 위해 진행하며, 바람직하게 1000 내지 5000 g로 10분 내지 60분 동안 진행하는 것일 수 있다. 상기 상층액을 필터로 여과하는 단계는 세포 데브리를 좀더 제거하고 특정 사이즈 이하의 입자만을 얻기 위해 수행되는 것으로, 여기서 사용되는 필터는 바람직하게 주사기 필터(syringe filter)일 수 있다. 상기 여과액을 농축하는 단계는 바람직하게 원심분리 필터(centrifugal filter)를 이용하여 진행할 수 있다. 원심분리 필터를 이용하면 상기 여과액을 농축하는 동시에 특정 사이즈 이하의 입자를 제거할 수 있다. 상기 엑소좀을 분리하는 단계는 상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃ 이하에서 7일 내지 3달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보관은 바람직하게 4℃ 이하에서 7일 이내로, 보다 바람직하게 -20℃ 이하에서 1달 이내로 할 수 있으며, 가장 바람직하게 -80℃ 이하에서 3달 이내로 할 수 있다. 엑소좀의 유효성분은 mRNA와 단백질 등으로, 이들 성분이 온도가 높거나 효소활성이 높은 온도에 가까울 수록 쉽게 변성되거나 분해될 수 있다.
상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게 직경이 100 내지 150 nm인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀은, 상기 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 한다.
여기서, 피부 재생 및 상처 치유는 항노화, 주름 방지, 주름 개선, 상처 치유, 흉터 치유 및 조직 재생 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 EGFR(Epidermal growth factor receptor), FN1(Fibronectin 1), MMP9(Matrix Metallopeptidase 9), MMP2(Matrix Metallopeptidase 2), MAPK1(Mitogen-activated protein kinase 1), FGF2(Fibroblast growth factor 2), CTGF(Connective tissue growth factor), AKT1(AKT Serine/Threonine kinase 1), ALB(Albumin), TGFB1(Transforming growth factor beta 1), MAPK3(Mitogen-activated protein kinase 3), VEGFA(Vascular endothelial growth factor A), FGF7(Fibroblast growth factor 7), HGF(Hepatocyte growth factor), IL6(Interleukin 6), EGF(Epidermal growth factor), miR-210(MicroRNA 210), miR-31(MicroRNA 31), Col1α1(Collagen 1 alpha 1), ELN(Elastin), PCNA(Proliferatin cell nuclear antigen), N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 엑소좀은 상기 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고, 상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1(Collagen 3 alpha 1), ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은, 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다.
여기서, 상기 조성물은 상기 조성물은 상기 엑소좀이 최소한 106 개/ml 이상 포함된 것일 수 있고, 바람직하게 상기 엑소좀이 106 개/ml 내지 1014개/ml농도로 포함된 것일 수 있고, 더욱 바람직하게 1011 개/ml 내지 1012개/ml농도로 포함된 것일 수 있다. 이는 포함된 엑소좀의 농도가 106 개/ml 미만이거나 1014 개/ml을 초과할 경우 피부 재생 및 상처 치유 효과가 떨어질 수 있고, 특히 농도가 지나치게 높아질 경우, 경제성 역시 떨어지기 때문이다.
상기 조성물에는 상기 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 이외에도 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 유효성분의 흡수나 재생 및 치유 반응을 좀더 증진시킬 수 있는 기타 첨가제 등이 다양하게 첨가될 수 있음은 자명한 사항이므로, 이에 대한 구체적 설명은 제외하기로 한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 모든 실시예 및 실험예 상의 모든 세포 배양은 37℃, 5% CO2 조건에서 이루어졌다.
실시예1. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조.
피부 재생 및 상처 치유 효과를 갖는 엑소좀을 얻기 위하여, 1 Х106 개의 인간진피섬유아세포(HDF)에 UltraRepro 1001(STEMON Inc., Seoul, Republic of Korea)을 이용하여 20 KHz, 1.0 W/cm2의 초음파 자극을 5초간 직접 가하였다. 2 Х105 개의 UHDF를 35-mm 페트리 디쉬에 초음파 처리된(20 KHz, 5.0 W/cm2, 10분) 배아줄기세포 배양 배지 (DMEM/F12, 15% FBS, 2mM GlutaMAX, 0.1% NEAA, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신, 0.1mM β-메르캅토에탄올, 1000 unit/ml 백혈병억제인자(LIF))와 함께 하루 동안 배양하였다. 이렇게 초음파 처리한 HDF(UHDF)를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀을 상기 UHDF를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀을 다음과 같이 분리하였다: 배양 배지를 3,000 X g로 20분간 원심분리하여 세포 데브리 및 죽은 세포를 제거한 후, 상층액을 0.22-mm 필터(Minisart®Syringe Filter, Sartorius, Goettingen, Germany)에 통과시켰다. 통과하여 나온 배지를 Amicon®Ultra-15 100,000 kDa device (Millipore, Billerica, MA, USA)에 넣고 14,000 X g로 20분간 원심분리하여 엑소좀(iExo)을 농축시켰다.
실험예1. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 갖는 엑소좀의 제조방법에 따라 배양한 세포(UHDF)를 CD63 엑소좀 마커에 대한 면역형광염색을 통해 분석한 결과(이때, 대조염색은 핵염색제인 DAPI로 함), 대조군에 비해 CD63 신호 강도가 월등히 높아 다량의 엑소좀이 생성되고 있음을 확인할 수 있었다(도1). 제조된 엑소좀에 대한 RNA-seq 결과, 실시예 1에 따라 제조된 엑소좀(iExo)에서는 초음파 자극 없이 배양된 세포로부터 분리된 엑소좀(nExo)에 비해 특히 상처 치유, 혈관신생, 세포성장, 세포이동, 세포증식, 염증반응, 재생, 분비, 조직재생, 및 조직 리모델링 등과 관련된 유전자 발현이 높은 것으로 나타났는데(도2-4), 대표적으로 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF 등의 단백질 코딩 유전자와 miR-210, miR-31 등의 마이크로RNA가 포함되었다(도 3).
또한 상기 세포의 배양액으로부터 분리한 엑소좀(iExo)으로부터 RNA를 추출하여 qRT-PCR을 통해 분석한 결과, 조직 재생 및 상처 치유와 연관된 세포외 구성물질(extracellular matrix) 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1 및 ELN과, 세포 증식과 관련된 유전자인 PCNA, N-Cadherin 및 Cyclin-D1 등의 발현이 대조군으로부터 분리한 엑소좀(nExo)에 비해 높아진 것을 확인할 수 있었다(도5).
실험예2. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 처리에 따른 세포 표현형 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법에 따라 제조한 엑소좀을 배지에 추가하여 HDF를 배양하고, 이에 대해 엑소좀의 농도에 따른 효과를 확인해 보았다. 우선, 세포 증식 효과를 관련 마커인 Ki67에 대한 면역형광염색을 통해 분석한 결과, 실험군은 대조군에 비해 상기 마커의 발현이 더 높았는데, 특히 5X1011개/ml 및 10X1011개/ml 농도의 엑소좀을 처리하였을 때 그 효과가 더 뛰어났음을 알 수 있었고, 세포 수가 더 많이 증가하였음을 확인하였다(도6). 다음으로, 상기 HDF를 플레이트에 가득 차도록 배양 후 20 μl yellow tip으로 선을 그어 세포 간 거리를 떨어뜨린 후 엑소좀을 처리하여 배양하는 wound healing assay를 진행하였는데, 이 결과 엑소좀 처리군에서 빈 공간이 상대적으로 빠르게 채워지는 것으로 나타나(도 7), 실험군의 세포 이동률이 높은 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 실시예 1에 따라 제조된 엑소좀의 농도에 따른 조직 재생 과정 중 혈관 형성 효율을 분석하고자, 내피 세포인 HUVEC에 서로 다른 농도의 엑소좀을 처리하고, 10시간 후에 관(tube) 형성을 확인하였다. 그 결과, 엑소좀 처리군이 대조군에 비해 관을 잘 형성하였음을 육안으로도 확인할 수 있었고(도 8a) 관의 길이 및 교착점 수 역시 더 높게 나타났는데(도 8b-c), 특히 5X1011개/ml 및 10X1011개/ml 농도로 처리한 군에서 더 나은 효과가 있었던 것으로 나타났다.
마지막으로, 엑소좀을 처리한 세포 내 조직 재생 및 상처 치유 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1의 발현을 qRT-PCR로 분석하였다. 그 결과, 실험군의 경우 대조군에 비해 상처 치유 관련 유전자의 발현이 높게 나타났다(도 9).
실험예3. 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 처리의 in vivo 효과 분석 실험
실시예 1의 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법에 따라 제조한 엑소좀(iExo)의 효과를 in vivo에서 확인하기 위해 6주된 C57 마우스의 피부에 punch로 6 mm의 상처를 내고, iExo를 각각 0, 5, 10, 20 X1011개/ml 농도로 PBS에 희석하여 상처 부위에 주2회 발라주었다.
그 결과, 1주 후 엑소좀 처리 마우스의 경우 외부로 드러난 상처(opening)의 크기가 처리하지 않은 마우스에 비해 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 10; 이와 관련하여, 2주차에는 엑소좀 처리 마우스의 경우 상처가 완전히 닫히고 그 위로 모발이 자라 처리군간 비교사진을 찍을 수 없었다). 또한, 1주 및 2주 후 각각 상처부위 조직 단면을 H&E 염색으로 확인한 결과, 엑소좀을 처리하지 않은 마우스에 비해 처리한 경우 상처의 크기가 작아 빠르게 피부 재생 및 상처 치유가 일어난 것을 확인할 수 있었고, 특히 상처 부위에 10 및 20 X1011개/ml 농도의 엑소좀을 처리한 경우 2주차에 피부 조직이 완전히 회복되어 피부조직을 구성하는 표피와 진피층, 지방층, 근육층이 명확하게 구분할 수 있도록 재생되었고, 진피층과 지방층에 상처 부위와 주변 부위 간 차이 없이 피부 부속조직인 모낭이 자리잡았으며, 특히 10 및 20 X1011개/ml 농도의 엑소좀을 처리한 경우 2주차에 흉터까지 사라진 것으로 나타났다(도 11). 추가로, 면역형광염색을 통해 상처 회복 부위의 조직 단면에 세포 증식 마커인 Ki67을 확인한 결과, 엑소좀을 처리하지 않은 군에 비해 처리군에서 Ki67이 광범위하게 관찰되어(도 12) 손상부위에 세포 증식이 활발하게 진행되고 있음을 알 수 있었다. iExo를 Vybrant™DiD Cell-Labeling Solution을 이용하여 염색하여 상처 부위에 처리하고 2주 후 iExo 처리된 부위를 형광현미경으로 분석한 결과, iExo가 상처 부위 전반에 침투되었고, 이러한 효과적인 침투에 의해 전술한 재생 및 치유 효과가 나타날 수 있음을 확인할 수 있었다(도 13).
다음으로, 엑소좀을 처리한 상처 부위에서 조직 재생 및 상처 치유 관련 유전자인 Col1α1, Col3α1, ELN, N-cadherin 및 Cyclin-D1의 발현을 qRT-PCR로 분석하였고, 그 결과 iExo를 처리한 실험군의 경우 대조군에 비해 상기 유전자 중 하나 이상의 발현이 대체로 높게 나타났다(도 14). 이때, 각 농도별로 증가량이 가장 많은 유전자는 달랐고, 농도와 발현 증감의 상관관계는 확인하기 어려웠다.
마지막으로, 상처 치유가 완료된 3주차에 상처 부위의 피하 혈관 발달 정도를 확인하였다. 그 결과, iExo를 처리한 조직의 혈관이 더 많이 발달된 것으로 나타났다(도 15).
종합하여 보면, 실시예 1에 따라 제조된 엑소좀은 세포 증식과 이동 및 혈관 발달 등을 촉진함으로써 조직의 상처 치유 및 재생 능력을 향상시켜줄 수 있다. 또한, 상기 엑소좀의 효과는 in vivo에서도 나타나 피부 재생 및 상처 치유 속도를 높이는 한편, 흉터가 더 작게 나거나 없이 피부 부속조직도 재생될 수 있는 좀더 온전한 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있다.
비교예1. 엑소좀에 대한 대조군(nExo)
초음파로 자극하지 않은 HDF(NHDF)를 2 mM GlutaMAXTM-I Supplement(Gibco), 6 U/mL heparin (Sigma-Aldrich) 및 200 μM ascorbic acid (Sigma-Aldrich)가 포함된 섬유아세포 배지(10% fetal bovine serum(Gibco) 및 1% penicillin/streptomycin(Gibco)가 포함된 DMEM(Gibco))에 배양하였다. 상기 NHDF를 배양한 배양 배지로부터 엑소좀(nExo)을 분리할 때에는 실시예1의 엑소좀 분리 방법과 동일한 과정을 거쳤다.
비교예2. 엑소좀에 의해 유도된 세포의 대조군
1 Х105 개의 HDF를 35-mm 페트리 디쉬에 시딩하여 하루 동안 배양한 후, 배지를 비교예1에 따라 수득한 엑소좀을 포함한 배지로 바꾸어 5일 동안 배양하였다. 이때, 엑소좀을 포함한 배지는 배아줄기세포 배양 배지를 사용하였으며, 배양 배지는 2일마다 교체되었다.
비교예3. 엑소좀에 의해 피부 재생 및 상처 치유 유도된 마우스의 대조군
iExo 희석 용매인 PBS를 직경 6mm의 punch 상처를 낸 마우스에 주2회 발라주었다.
전술한 본 발명에 대한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀 및 이를 포함하는 조성물은 피부 재생 및 상처 치유를 유도할 수 있는 다양한 인자, 특히 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 유전자 산물을 다량 함유하며, 인지질 기반의 막구조를 가져 두피 침투가 용이하여 물질의 전달 효율이 높으므로 피부 재생 및 상처 치유를 효과적으로 유도할 수 있고, 합성의약품의 사용으로 나타나는 부작용이 없으며, 효과가 좀더 지속적으로 피부를 포함한 조직의 손상 시 재생 및 치유를 유도할 수 있는 약물로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 피부 재생 및 상처 치유를 효과를 가진 엑소좀의 제조방법은 상기와 같은 효과를 가지는 다양한 인자를, 초음파 자극을 세포에 처리하는 손쉬운 과정을 통해 높은 농도의 유효성분을 담은 엑소좀을 고수율로 수득할 수 있다.

Claims (15)

  1. 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 단계;
    상기 세포 및 배지의 혼합물을 일정 시간 배양하는 단계; 및
    상기 혼합물로부터 엑소좀을 분리하는 단계;를 포함하고,
    상기 직접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함된 배지에 초음파 자극을 가하는 것이고, 상기 간접적으로 자극을 제공하는 것은 세포가 포함되지 않은 배지에 초음파 자극을 가한 후 상기 배지와 상기 세포를 혼합하는 것인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포에 직간접적으로 초음파 자극을 제공하는 과정은
    세포와 배지를 혼합한 후 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나,
    배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합하거나,
    세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합하거나,
    세포에 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포와 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나,
    배지에 초음파 자극을 제공한 후 상기 배지와 세포를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하거나,
    세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합하거나,
    세포와 배지에 각각 초음파 자극을 제공한 후 상기 세포 및 상기 배지를 혼합한 다음 상기 혼합물에 초음파 자극을 제공하는 방식
    중에서 선택된 어느 하나의 방식으로 진행되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 직접적인 초음파 자극은 강도가 0.1 내지 3 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하고,
    상기 간접적인 초음파 자극은, 강도가 1 내지 20 W/cm2이고, 주파수가 20 kHz 내지 20 MHz이며, 지속시간이 0.1초 내지 20분인 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포는 상기 세포는 각각 포유류 유래의 줄기세포, 전구세포, 섬유아세포, 각질세포 또는 기관 내 조직세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 배양 배지는 상피줄기세포 배지, 진피줄기세포 배지, 지방줄기세포 배지, 중간엽줄기세포 배지 또는 배아줄기세포 배지 중 어느 하나인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 혼합물의 배양은 1시간 내지 10일 동안 진행되는 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀을 분리하는 단계는 초원심분리, 밀도구배, 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 면역친화성분리, 침전, 미세유체에 의한 분리방법 중 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀을 분리하는 단계는
    상기 배양 후의 혼합물을 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
    상기 상층액을 필터로 여과하여 여과액을 수득하는 단계; 및
    상기 여과액을 농축하는 단계;
    를 포함하는 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 엑소좀을 분리하는 단계는
    상기 상층액을 필터로 여과하기 전에 4℃이하에서 7일 내지 1달 동안 보관하는 단계를 추가로 포함하는 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 분리된 엑소좀은 직경이 50 내지 200 nm인 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀의 제조방법.
  11. 제1항에 따른 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA가 증가되어 있으며,
    상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 EGFR, FN1, MMP9, MMP2, MAPK1, FGF2, CTGF, AKT1, ALB, TGFB1, MAPK3, VEGFA, FGF7, HGF, IL6, EGF, miR-210, miR-31, Col1α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 엑소좀은 제1항의 제조방법을 거치지 않은 세포로부터 분비된 엑소좀에 비해 피부에 도포 시 피부에서 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자의 RNA 발현을 더 증가시키고,
    상기 피부 재생 및 상처 치유를 촉진하는 유전자는 Col1α1, Col3α1, ELN, PCNA, N-cadherin 및 Cyclin-D1 중 어느 하나 이상인, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀.
  14. 제11항에 따른 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 엑소좀이 106 개/ml 이상의 농도로 포함된, 피부 재생 및 상처 치유 효과를 가진 엑소좀을 포함하는 조성물.
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