CN115746136A - 干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用。本发明通过杂交瘤筛选制备并获得了特异性针对EGFR的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够有效的干预紫外照射后细胞内c‑fos，c‑jun蛋白表达降低，使得成纤维细胞的胶原合成和分泌保持平衡状态，从而对成纤维细胞光老化起防护作用，达到抗光老化的目的。所述单克隆抗体与外泌体一起联用后，能够有效的促进紫外辐射后的成纤维细胞的增殖效率，二者具有协同增效的效果，用于治疗皮肤损伤修复前景较好。

Description

干细胞外泌体在制备皮肤光老化修复产品中的应用

技术领域

本申请涉及生物领域，更具体的涉及干细胞外泌体制备皮肤光老化药物中的用途。

背景技术

皮肤光老化(skin photoaging)是由于皮肤长期受到日光照射所引起的损害，是自然老化和紫外线辐射共同作用的结果。表现为皮肤曝光部位粗糙、增厚、干燥，皮肤松弛、皱纹加深加粗，局部有过度的色素沉着或毛细血管扩张，甚至可能出现各种良性或恶性肿瘤(如日光角化病、鳞状细胞癌、恶性黑素瘤等)。光老化多见于老年人，男性比女性多见，好发于面部、颈部、前胸、后背与两上肢前臂。皮肤干燥、粗糙，有明显的皱纹，皮肤色素较重生黑色，这是由于长期紫外线照晒发生的不规则色素沉着加上光化性紫癜致使发生含铁血黄素的沉积。同时也可以发生日光性雀斑样痣。皮肤皱纹明显，皱纹面积很大，沟纹较深，形成铺路石样。面部出现毛细血管扩张也是皮肤光老化的一种常见临床表现，长期野外工作、风吹日晒刺激是其形成的主要原因之一。此外，皮肤长期受到强烈的日光照射，甚至有可能会出现各种良性或恶性肿瘤，如日光性角化病、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤等。

干细胞是一类具有多向分化潜能并能够进行持续自我更新的未分化细胞，可分化为体内多种类型的成体细胞。在干细胞的研究中，干细胞培养基的上清液中可提取多种生长因子和细胞因子，因此，普遍的观点认为干细胞主要通过旁分泌途径分泌多种细胞因子参与组织修复。研究发现，对含有骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)的条件培养液进行分馏研究中，只有含有100～200nm囊泡培养液可对缺血再灌注损伤的小鼠模型进行心脏保护。目前研究者认为，通过分泌某些物质来实现修复作用是干细胞发挥生物学功能的重要方式。有研究表明外泌体在-80℃保存2年仍能保持其生物学功能。在体内实验中外泌体的脂质双分子膜结构能防止其内容物降解，保持内部蛋白及遗传物质的活性。而且与干细胞分泌的可溶性细胞因子不同，外泌体可直接进入靶细胞，通过向靶细胞转运特异性蛋白、脂质及RNA等生物活性物质，来诱导靶细胞的增殖、迁移、血管化等生物学变化，从而改变局部微环境，稳定而持久地发挥多种生物学功能。这种“载体式”信号转导方式使外泌体具备更高更稳定的信号转导效率，且在生物体内不会被细胞外介质稀释。研究发现，MSC外泌体可通过促进血管生成发挥组织修复作用。研究发现，MSC外泌体可促进热刺激后皮肤细胞的增殖，并抑制其凋亡，在大鼠皮肤烧伤模型中，外泌体能促进烧伤部位的再上皮化，加快伤口愈合。人脐带MSC外泌体所递送的Wnt4基因信号是皮肤伤口愈合所需的。在体外实验中,成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞的增殖及迁移依赖于MSC外泌体的剂量。同样，成纤维细胞分泌的I型、III型胶原、弹性蛋白量的提高和血管内皮细胞管状形成率的提高也与外泌体的浓度增加有关。皮肤光老化是人体衰老的最直接表现，主要是由于紫外线照射后导致基质金属蛋白酶MMP异常上调，致真皮基质合成与降解之间不平衡。用源自ADSCs的EV治疗后会显著抑制紫外线照射诱导的MMP-1、2、3、9的过表达，并增强I、Ⅱ、Ⅲ、V型胶原蛋白和弹性蛋白的表达。研究证明，富含ADSCs-EV的多种成分可以促进皮肤光老化恢复。研究发现，通过超声波制备的HUCMSCs衍生的外泌体，结果发现其可能用于增加皮肤细胞外基质并增强皮肤恢复活力。通过分离来自在三维培养系统中生长的外泌体，并探索它们调节HaCaT角质形成细胞光老化的能力，从而发现HUCMSCs衍生的外泌体能够增强正常的HaCaT细胞增殖和迁移，同时抑制UVB诱导的对这些细胞的损伤。这些外泌体还减少了光老化HaCaT细胞中的HaCaT细胞凋亡和衰老，增加了胶原I型表达并降低了基质金属蛋白酶(MMP1)的表达。胶原蛋白的增加是皮肤保持活力及年轻化的关键东西。这一研究证实人脐带间充质干细胞来源的外泌体在治疗皮肤衰老方面有很大的空间，为临床抗衰提供了一种新型的策略。为了进一步探究HUCMSCs-ex是否能防止紫外线辐射引起的急性皮肤光损伤，有研究者通过建立急性光损伤(连续三天的紫外线辐射诱导皮肤组织发红，脱屑和炎症细胞浸润)的大鼠模型，发现体内皮下注射的HUCMSCs-ex可保护皮肤细胞免受紫外线辐射诱导的DNA损伤、炎症和细胞凋亡，较为明显的减少了皮肤炎症并促进了皮肤细胞再生。其主要是由HUCMSCs-ex递送的14-3-3ζ蛋白通过调节SIRT1依赖性抗氧化途径发挥细胞保护功能。

在研究中也发现，皮肤受到外界刺激条件时会导致细胞表面受体的激活，进而激活细胞内信号转导级联反应，调节细胞的表型变化。根据RNA-Seq的数据分析结果，检测了细胞表面受体表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白磷酸化变化，结果发现蓝光可通过激活EGFR蛋白磷酸化，进而诱导MMP1的表达。在此基础上，丁香提取物以及鞣花酸等可抑制EGFR通路激活的抗皮肤老化衰老成分，如PAL-12等。因此，含有EGFR抑制剂的化妆品制备的防晒霜或者防嗮药物，在一定程度上可降低蓝光对皮肤的损伤作用。但是目前，针对皮肤光损伤的修复药物种类还不够多，还有进一步提高的空间。

发明内容

基于EGFR抑制剂可以有效的治疗皮肤老化衰老，本发明开发了特异性的广谱的EGFR抑制剂-EGFR单克隆抗体。

由于皮肤光老化的信号转导机制是UVB和UVA激活细胞表皮细胞生长因子受体(EGFR)和细胞因子受体。因此，EGFR单克隆抗体能够抑制EGFR表达从而治疗皮肤光老化。

一方面，本发明提供一种特异性针对EGFR的单克隆抗体4F6，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的一些实施例中，所述单克隆抗体包括下列至少之一：(a)具有SEQ IDNO:2所示重链可变区和SEQ ID NO:1所示轻链可变区；(b)与(a)相比，具有至少一个保守氨基酸取代。本发明所提供的单克隆抗体的重链可变区可以为SEQ ID NO:2所示序列，轻链可变区可以为SEQ ID NO:1所示序列；也可以在SEQ ID NO:2所示序列或者SEQ ID NO:1所示序列的基础上，进行至少一个保守氨基酸取代，例如可以是1个保守氨基酸取代，2个保守氨基酸序列，3个保守氨基酸取代，4个保守氨基酸取代等等。这些保守氨基酸取代优选发生在重链可变区和轻链可变区的非高变区域。由此所提供的单克隆抗体具有对高保真DNA聚合酶具有高的亲和力，应用于PCR反应中，特异性强，准确性高。

本文中，“保守氨基酸取代”指的是在生物学上、化学上或者结构上，氨基酸被另一相似氨基酸所取代。生物学上相似的氨基酸指的是通过氨基酸的取代不会破坏所提供的单克隆抗体的生物学活性。结构上相似的氨基酸指的是氨基酸具有相似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸，或具有相似大小的侧链。化学上相似的氨基酸指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的，例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代，或者用极性氨基酸例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺，丝氨酸取代苏氨酸等等。本领域技术人员可以根据所提供的单克隆抗体的重链高变区和轻链高变区氨基酸序列进行一个氨基酸的取代，两个氨基酸的取代或者三个氨基酸的取代，所进行的取代和变换也包含在本发明所要求保护的范围之内。

本文中，术语“抗体”是能够与特异性抗原结合的免疫球蛋白分子。包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子。其中，肽链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)。L链和H链的V区分别称为VL和VH。

本发明进一步的，提供了EGFR单克隆抗体能够使得UV辐射后细胞内c-fos，c-jun蛋白表达降低，使得成纤维细胞的胶原合成和分泌保持平衡状态，从而对成纤维细胞光老化起防护作用，达到抗光老化的目的。

因此，进一步的，本发明提供了EGFR单克隆抗体在制备治疗紫外线导致的皮肤光老化的药物中的用途。

进一步的，本发明还提供了脐带间充质外泌体以及所述外泌体在促进成纤维细胞增殖中的用途。

进一步的，本发明还提供了EGFR单克隆抗体和脐带间充质外泌体在制备用于皮肤光老化的药物组合物中的用途。

可以将单克隆抗体和外泌体配制成药物组合物并且以各种适合于选择的给药途径的形式对哺乳动物宿主，诸如人体患者给药，例如通过口服、非肠道、静脉内、肌内、局部或皮下途径。因此，可以将本发明的抗体和外泌体与药学上可接受的媒介物，诸如惰性稀释剂或可同化的可食用载体一起通过全身，例如通过口服给药。可以将它们包封在硬或软壳胶囊中，可以将它们压制成片剂或将其直接掺入患者膳食的食物。为了进行口服治疗给药，可以将活性化合物与一种或多种赋形剂互补并且以可摄取的片剂、含片、药片、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。这类组合物和制剂应包含至少0.1％的活性药物。

还可以通过静脉内或腹膜内，经输注或注射给予活性单抗和外泌体。可以制备在水中的任选与无毒性表面活性剂混合的单抗和外泌体的溶液。还可以制备在甘油、液体聚乙二醇类、三醋精及其混合物和油中的分散体。在一般储存和使用条件下，这些制剂包含防止微生物生长的防腐剂。适合于注射或输注的药物剂型可以包括无菌水溶液或分散液或包含适合于临时制备无菌可注射或可输注溶液或分散液的任选包囊在脂质体中的无菌粉末。在所有情况中，最终的剂型在制备和储存条件下应为无菌的、流体的和稳定的。液体载体或媒介物可以为溶剂或液体分散介质，其包含：例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇类等)、植物油、无毒性的甘油酯类及其合适的混合物。例如，可以通过维持分散液的所需颗粒大小或通过使用表面活性剂维持适当的流动性。可以用各种抗菌剂和抗真菌剂预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况中，优选包括等渗剂，例如糖类、缓冲剂或氯化钠。可以通过在组合物中使用延缓吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶延长可注射组合物的吸收。

有益效果

本发明通过杂交瘤筛选制备并获得了特异性针对EGFR的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够有效的干预紫外照射后细胞内c-fos，c-jun蛋白表达降低，使得成纤维细胞的胶原合成和分泌保持平衡状态，从而对成纤维细胞光老化起防护作用，达到抗光老化的目的。所述单克隆抗体与外泌体一起联用后，能够有效的促进紫外辐射后的成纤维细胞的增殖效率，二者具有协同增效的效果，用于治疗皮肤损伤修复前景较好。

附图说明

图1单抗纯化后的SDS-PAGE图

图2单克隆抗体对成纤维细胞辐照后增殖效率的影响

图3外泌体和/或EGFR单克隆抗体对皮肤细胞增殖的影响

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1EGFR单克隆抗体的制备

以重组人EGFR蛋白作为免疫原，所述免疫原购买自同立海源，货号是GMP-TL670。所述重组蛋白表达带有His标签在C末端。

选用7周龄雌性Balb/c小鼠，按照如下的免疫方案进行三次免疫注射。首次免疫：重组蛋白EGFR+完全弗氏佐剂，120μg/只，颈背部皮下多点注射；二次免疫(间隔两周)。重组蛋白EGFR+不完全弗氏佐剂，120μg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫(间隔两周)。重组蛋白EGFR+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；三次免疫后10天采血，用ELISA法检测效价，选择效价最高的1号小鼠用于细胞融合。将1号小鼠加强免疫(融合前3天)，用重组蛋白80μg腹腔注射。3天后，采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合(1∶10)，并加入促融合剂聚乙二醇，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以EGFR重组蛋白(10μg/ml)包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5％的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl(阴性对照为PBS100μl)，37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗(羊抗鼠IgG-HRP)，37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性，其中获得阳性反应较强的15株杂交瘤细胞株。将选出的阳性杂交瘤细胞株进行克隆化培养(有限稀释法)，获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性反应最强的杂交瘤细胞为抗人EGFR杂交瘤细胞系4F6和6G9。

将细胞株4F6和6G9分别单独接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。采用ProteinA亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗EGFR的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液(PH)洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在98％以上(参见图1)。

实施例24F6单克隆抗体亚型鉴定

用100mmol/LPBS(pH7.4)稀释包被抗体至0.5μg/mL，每孔加0.1mL，4℃过夜后PBS-T洗2次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育2h。PBS-T洗3次后每孔加入100μL杂交瘤上清，37℃孵育1h。PBS-T洗3次后加入用封闭液1:2000稀释的HRP标记的抗体(SBAClonotypingSystem-HRP,SouthernBiotech)，每孔0.1mL，37℃孵育1h。PBS-T洗3次；每孔加50μL底物溶液，10-20min内于双波长(450nm，630nm)测吸光值。

表1单克隆抗体亚型鉴定

细胞株名称	针对免疫原的OD值	亚型
			4F6单克隆抗体	0.936	IgG2a

从表1的亚类鉴定结果可以看出，4F6单克隆抗体的亚型为为IgG2a。

实施例34F6单克隆抗体特异性鉴定

取EGFR、VEGF、PD-1、His、BSA蛋白进行Western Blotting实验。采用电转法(25V，25mA，7min)将各组蛋白样品转至PVDF膜上，用5％脱脂牛奶4℃下封闭PVDF膜2h后，经一抗隔夜4℃孵育(4F6单抗1:1000稀释)、IRDye-800CW羊抗鼠作为二抗(1:10000稀释)4℃孵育1h后，用TBS-T缓冲液清洗3次，每次5min。将PVDF膜置于Odyssey CLx Imaging System拍照分析。结果显示，5个样品中，只有EGFR蛋白与单抗形成一条清晰单一的条带，其余样品未出现条带，这表明本发明的单抗具有较好的特异性。

实施例4 4F6单克隆抗体亲和常数测定

采用生物薄膜干涉技术(BLI)对纯化的4F6单克隆抗体与EGFR蛋白的结合亲和力常数进行测定。使用PALL公司ForteBio Octet RED&QK平台进行测定，方法参照平台使用说明书。首先，将生物素化的EGFR蛋白固定在SA传感器表面，用上述4F6单克隆抗体作为分析物。处理数据，并用分析软件1:1结合的模型进行拟合，拟合数据与实验数据基本重叠，得到结合和解离速率常数Ka和Kd，用Kd除Ka得到平衡解离常数KD(见表2)。

表2单克隆抗体亲和力测定结果

单抗名称	平衡解离常数
		4F6单克隆抗体	8.43×10<sup>-11</sup>M

结果显示，鼠单抗4F6亲和力最高，KD值为8.43×10^-11M，亲和力较好。

实施例54F6单克隆抗体序列的鉴定

对4F6单克隆抗体的杂交瘤细胞，提取RNA，进行逆转录，得到杂交瘤细胞的cDNA。根据已知的鼠源抗体重轻链恒定区设计兼并引物，利用设计的兼并引物对cDNA进行PCR获得单克隆抗体重链及轻链可变区序列。再将可变区序列克隆进入T载体，导入大肠杆菌DH5α中进行扩增，挑选克隆。扩大培养，提取重组载体，进行测序，进而获得该单克隆抗体的重链可变区序列和轻链可变区序列。结果显示，4F6单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

实施例64F6单克隆抗体保护作用实验

将人皮肤成纤维细胞(伊莱瑞生物科技，货号YX-10040)接种在6孔板上，浓度为1x10⁵/m1，以UVA 15J/cm²照射成纤维细胞。

细胞分为5组，即正常对照组(对照组不照射也不加入EGFR抑制剂，只加入等量PBS)、UVA照射组(UVA 15J/cm²照射，不加EGFR单克隆抗体)、小剂量组(uvA+4F6单克隆抗体0.lμg/ml)、中剂量组(UVA+4F6单克隆抗体lμg/ml)、大剂量组(UVA+4F6单克隆抗体10μg/ml)，阳性对照组(UVA+C225西妥昔单抗10μg/ml)。照射前2h加入含不同浓度EGFR单克隆抗体PBS液各3ml，培养板置入照射后置换含10％小牛血清的DMEM置入培养箱中继续培养，24h后收样。

培养1天后，每孔加5mg/ml MTT溶液20μl，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。MTT结果如图2所示，

选择UVA 15J/cm²照射前给予不同剂量EGFR单克隆抗体干预后，结果显示:正常组成纤维细胞OD值明显高于UVA照射组，有显著性差异(P<0.01)；EGFR单克隆抗体处理后，随着EGFR单克隆抗体的剂量增加，OD值有所升高，大剂量组的促进效果也略高于阳性对照组，但是整体上，促进增殖的效果不是很明显。

表3各组细胞中c-fos和c-jun的表达量(以正常组为相对检测值)

组别	c-fos的表达量	c-jun的表达量
			正常对照组	1	1
UVA对照组	1.235±0.045	1.091±0.029
			小剂量组	1.216±0.036	1.086±0.044
中剂量组	1.070±0.027	0.873±0.026
			大剂量组	1.052±0.018	0.826±0.031
阳性对照组	1.061±0.022	0.805±0.037

UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞，导致细胞衰老，增殖活性下降，细胞由原来的梭形变为圆形，同时激活细胞内AP-1蛋白(c-fos、c-jun)高表达，作为光老化关键信号路径中的的AP-1蛋白(c-fos、c-jun)的高表达，将会引起下游信号的基质金属蛋白酶表达增高，对胶原降解增加，加剧光老化的发生。在UVA照射前加入EGFR单克隆抗体，对于体外培养皮肤成纤维细胞增殖活性和细胞形态没有明显影响。通过干预细胞内信号转导，使得细胞内AP-1蛋白(c-fos、c-jun)的表达降低。与单纯照射组比较，干预后细胞内c-fos，c-jun蛋白表达降低，使得成纤维细胞的胶原合成和分泌保持平衡状态，从而对成纤维细胞光老化起防护作用，达到抗光老化的目的。

实施例7脐带间充质干细胞外泌体的制备

培养P3脐带间充质干细胞于10cm培养皿中，待细胞增殖融合至80％，按照1:5进行传代；P4细胞融合至对数生长期时，弃培养基，PBS漂洗两次，加入无FBS的DMEM/F12培养基6mL/皿，24h后4℃低温处理2h后，再培养12h，收取培养基于离新管中，300g，4℃离心10min，除细胞碎片；将离心后上清液移植超速离心管中，用PBS补齐；29500g，4℃离心20min，进一步去除细胞及碎片；0.22μm滤器过滤离心后上清，去除大于200nm的粒子；过滤后上清于另一超速离心管中，120000g，4℃离心90min；弃上清，无菌滤纸吸净管壁液体，管底为exosomes。将离心获得外泌体进行表面标志物检测发现高表达CD9和CD63，说明制备获得的是脐带间充质干细胞外泌体。

实施例8外泌体和/或EGFR单克隆抗体4F6对皮肤细胞的促进作用

将人皮肤成纤维细胞(伊莱瑞生物科技，货号YX-10040)贴壁生长至80％密度饱和，同步化处理后，照射前以PBS洗1次，然后加入各实验组的药物：

实验组A：实施例7制备的外泌体50μg/ml；

实验组B：4F6单克隆抗体10μg/ml；

实验组C：实施例8制备的外泌体50μg/ml+4F6单克隆抗体10μg/ml；

各组加入药物后置于CO₂培养箱中孵育60min后，在UVB辐射仪下照射，照射剂量为15J/cm²。照射后再以PBS洗1次，加入DMEM完全培养基继续孵育24h后经MTT比色法检测，同时同时设不加药的未照射正常组(正常对照组)和不加药的UVB照射组(照射空白组)。将96孔细胞板各孔加入5g/L的MTT溶液20μL，于CO₂培养箱内继续培养4h，吸弃培养液，加入150μLDMSO，充分振荡溶解后，在酶标仪570nm处读取吸光度(A)值。细胞活性以细胞增殖率表示，细胞增殖率为各处理组A值占对照组A值的百分率。每组均设有6个相同的孔，实验重复3次。结果如图3所示。

由图3可知，与正常对照组相比，UVB照射可使细胞24h后的增殖率显著下降(P＜0.01)。实验组A单独添加外泌体治疗后，能够大幅度的提高细胞增值率，但是实验组B单独使用对于细胞增值率的促进作用强度稍微弱一些。但是，将外泌体与EGFR抑制剂一起使用后，可使细胞增殖率恢复至(110.22±6.45)％，与空白组相比，有显著差异(P＜0.01)。从以上结果可以看出，虽然EGFR单克隆抗体4F6本身对于促进成纤维细胞的增殖作用不是特别显著，但是当EGFR单克隆抗体4F6通过使得细胞内AP-1蛋白(c-fos、c-jun)的表达降低进而防护UVB致人成纤维细胞损伤的作用，在保证细胞活性的基础上，通过外泌体作用后，能够显著的额提高UV照射后的细胞增殖率，具有较好的应用价值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (5)

1.一种特异性针对EGFR的单克隆抗体4F6，所述单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体4F6在制备修复皮肤成纤维细胞光损伤的药物中的用途。

3.如权利要求1所述的单克隆抗体4F6和脐带间充质干细胞外泌体在制备促进皮肤成纤维细胞光损伤后增殖的药物组合物中的用途。

4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于所述药物或者药物组合物中还含有药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述药物或者药物组合物含有表面活性剂。

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