KR20170089404A - 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 함유하는 베이지 지방세포 분화 유도용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 약학적 조성물, 건강기능식품, 분화 배지 조성물 및 이를 이용한 베이지 지방세포로의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 본 발명의 실시예에 따른 엑소좀은 줄기세포 또는 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도 효과가 우수하다. 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화하는 과정에서 분비된 엑소좀은 분화와 관련된 유전자, 단백질 및 성장인자들을 많이 함유하고 있기 때문에 베이지 지방세포로의 분화유도 능력이 뛰어나다. 또한, 기존 분화유도제에 비해 체내 안전성이 뛰어나기 때문에 분화와 관련된 인자들을 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있다.
따라서 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도 및 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 전환분화 유도용 조성물로서 향후 비만 및 당뇨 치료제로서의 응용이 가능할 것으로 기대된다.
따라서 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도 및 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 전환분화 유도용 조성물로서 향후 비만 및 당뇨 치료제로서의 응용이 가능할 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 약제학적 조성물, 건강기능식품, 분화 배지 조성물 및 이를 이용한 베이지 지방세포로의 분화유도 방법에 관한 것이다.
지방세포는 크게 백색 지방세포, 갈색 지방세포 및 베이지 지방세포로 분류된다. 백색 지방세포(white adipocytes)는 주로 중성지방(triglyceride) 형태로 에너지를 저장하며, 백색 지방세포가 과도하게 많아지거나 제대로 기능을 하지 못하면 바로 비만이나 다른 신진대사와 관련있는 질병을 일으킬 수 있다. 갈색 지방세포(brown adipocytes)는 열을 발생시켜 에너지를 소모하고 비만이 되지 않도록 보호하는 역할을 수행한다. 베이지 지방세포(beige adipocytes 또는 brite adipocytes)는 백색 지방세포에 함께 섞여 있어 백색 지방과 같은 기능을 하지만, 운동 등으로 베이지색 지방세포를 활성화 시키면 갈색 지방세포에 유사한 기능을 하게 된다. 즉, 베이지 지방세포는 백색 지방세포와 달리 미토콘드리아를 풍부하게 함유하고 있어 체내에서 열을 발생시키는 지방세포이다. 우리 몸에서 좋은 역할을 하는 갈색 지방세포는 신생아에게 주로 많이 나타나며, 성인에게도 존재하나 그 양이 비교적 적은 것으로 알려져 있다. 따라서, 베이지 또는 갈색 지방세포를 증가시키기 위한 노력이 계속되어 오고 있다.
종래에는 베이지 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 화학약물이나 유전자 재조합 단백질을 사용하였다. 예를 들어, 일반적으로 줄기세포를 베이지 지방세포로 분화 유도하기 위해서는 당뇨병 치료제인 로지글리타존(rosiglitazone)이나 베타-아드레너직 아고니스트(beta-adrenergic agonist)가 함유된 배양 배지를 사용한다(특허문헌 1). 이러한 약물은 갈색 또는 베이지 지방세포의 분화에는 효과적이지만 물에 잘 녹지 않아 다루기가 어렵고, 심혈관질환이나 신경질환 등의 부작용이 알려져 있어 체내 적용이 어렵다.
또한, 단백질 티로신 탈인산화 효소(protein tyrosine phosphatase receptor type E, PTP-RE)의 발현을 억제시킴으로써 갈색 지방세포의 분화를 촉진하는 방법이 개시되어 있으나, 이는 유전자 재조합 방법을 이용하는 것으로서 체내 적용 시 안전성이 확보되지 않는다는 문제점이 있다(특허문헌 2).
뼈 형성 단백질(BMP4 및 BMP7)이나 아아리신(irisin)이라는 단백질은 체내에서 갈색지방의 활성화를 촉진시키는 물질로 알려져 있다. 최근 체내에 존재하는 아이리신(irisin)이 백색지방을 베이지 지방세포로 변환시킨다는 연구 결과가 발표되었다(비특허문헌 1). 아이리신은 운동할 때 근육에서 발생되는 단백질로 이는 백색지방을 베이지 지방세포로의 변환을 유도하여 체내 열 발생을 촉진시킨다. 하지만 판매되고 있는 아이리신 역시 유전자 재조합을 통해 제작되기 때문에 체내 적용 시 안전성에 대한 문제점이 발생한다. 즉, 상기와 같은 유전자 재조합 단백질의 경우 안전성이 확보되지 않아 실제 체내 적용이 어렵다.
이와 같이 종래에 사용되었던 화학 약물이나 유전자 재조합 단백질의 사용은 베이지 지방세포로의 분화는 가능한 반면, 비만 및 심장질환 등을 유발할 수 있고 안전성이 확보되지 않았기 때문에 직접 체내에 투여할 경우 각종 질환 발생의 위험에 노출될 가능성이 높다.
한편, 인간을 포함한 다세포 생명체 내에 존재하는 다양한 세포에서 분비되는 생체나노입자는 그 크기와 분비 기작의 차이에 따라 엑소좀(exosome)과 마이크로베지클(microvesicle)로 구분할 수 있다. 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
Yuan Zhang et al., 2014, Diabetes, 63: 514-525.
이에, 본 발명자들은 체내 안전성이 우수한 베이지 지방세포 분화 유도방법에 대한 연구를 계속하여, 베이지 지방세포로의 분화와 관련된 유전정보, 단백질, 성장인자를 포함하는 엑소좀의 베이지 지방세포로의 분화 유도 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 약제학적 조성물, 건강기능식품 또는 분화 배지 조성물을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 이용한 베이지 지방세포로의 분화유도 방법을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 구체예는 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는, 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "베이지 지방세포(beige adipocytes, brite adipocytes)"란 지방세포 중 베이지색의 지방세포로서, 평소에는 백색 지방과 유사한 기능을 하나, 운동 등 특정 자극에 의해 갈색 지방과 유사한 역할을 수행할 수 있는 세포를 의미한다. 백색 지방세포와 달리 미토콘드리아를 풍부하게 함유하고 있어 체내에서 열을 발생시키는 지방세포이다.
상기 "베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포"란 줄기세포가 베이지 지방 조직 기원의 줄기세포(beige adipose tissue-derived stem cells)로부터 베이지 지방세포로 분화하는 중에 있는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "엑소좀(exosome)"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 제조할 수 있다.
상기 베이지 지방세포로의 분화 유도는 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화(differentiation) 유도이거나, 또는 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 전환분화(transdifferentiation) 유도일 수 있다.
상기 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포는 인체, 동물 또는 식물 유래 줄기세포일 수 있다.
상기 베이지 지방세포로의 분화가 유도되는 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 조성물은 대사 질환의 치료 또는 예방용일 수 있다.
상기 대사 질환은 비만 또는 당뇨병일 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으나 바람직하게는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 줄기세포 또는 백색 지방세포를 베이지 지방세포로 분화시키기 위하여 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 히스타민(histamine) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품은 대사 질환의 치료 또는 예방용일 수 있다.
상기 대사 질환은 비만 또는 당뇨병일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 포함하는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 배지 조성물을 제공한다.
상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 배지 줄기세포 또는 백색 지방세포를 베이지 지방세포로 분화시키기 위하여 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 히스타민(histamine) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구체예는 상기 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 베이지 줄기세포로의 분화 유도방법을 제공한다.
상기 줄기세포는 성체 줄기세포일 수 있다.
본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 이용하여 줄기세포를 베이지 지방세포(beige adipocyte)로 분화 및 백색 지방세포를 베이지 지방세포로 변환분화(trans-differentiation)시키는 분화유도용 조성물을 포함할 수 있다.
상기 발명은 성체 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화하는 과정에서 분비된 엑소좀을 추출·정제하는 단계와 추출된 엑소좀을 이용하여 성체 줄기세포를 베이지 지방세포로 분화시키는 단계로 나눌 수 있다. 베이지 지방세포는 갈색 지방세포(brown adipocyte)와 비슷한 기능을 하는 세포로서, 백색 지방세포(white adipocyte)와 달리 미토콘드리아를 풍부하게 함유하고 있어 체내에서 열을 발생시키는 지방세포이다. 본 기술에서 추출된 엑소좀은 베이지 세포로의 분화에 중요한 역할을 하는 다양한 유전 정보 및 성장인자를 함유하고 있기 때문에 줄기세포의 베이지 지방세포 분화 및 백색 지방세포의 베이지 지방세포 변환분화에 효과적으로 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 베이지 지방세포 분화 유도용 엑소좀에는 분화와 관련된 유전정보, 단백질, 성장인자를 포함한다. 약 50-150 nm의 크기의 지질 이중막으로 구성된 엑소좀은 세포 유래 물질이기 때문에 체내 안전성이 우수하고, 세포에 흡수되는 효율 또한 매우 뛰어나다. 따라서 종래의 기술과 같이 화학약물이나 유전자 재조합 단백질을 사용하는 경우보다 효과뿐 아니라 체내 안전성이 우수하다는 장점이 있다.
본 발명의 구체예에 따른 엑소좀은 줄기세포 또는 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도 효과가 우수하다. 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화하는 과정에서 분비된 엑소좀은 분화와 관련된 유전자, 단백질 및 성장인자들을 많이 함유하고 있기 때문에 베이지 지방세포로의 분화유도 능력이 뛰어나다. 또한, 기존 분화유도제에 비해 체내 안전성이 뛰어나기 때문에 분화와 관련된 인자들을 효과적으로 세포 내로 전달할 수 있다. 따라서 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도 및 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 전환분화 유도용 조성물로서 향후 비만 및 당뇨 치료제로서의 응용이 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 인간 지방유래 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화능에 대한 도이다[A; 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cell, HASC), 백색지방세포(white adipocyte, WA), 베이지 지방세포(beige adipocyte, BA)를 오일-레드 오 염색을 통해 확인. B; 베이지 지방세포의 주요 발현 인자인 UCP1의 mRNA 발현 여부를 RT-PCR을 통해 확인. 베이지 지방세포의 주요 발현 인자인 UCP1의 단백질 발현 여부를 ELISA kit을 통해 확인함].
도 4는 추출된 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀의 특성에 대한 도이다[A: 엑소좀의 구조 및 모양(투과전자현미경, transmission electron microscope), B: 엑소좀의 크기(나노입자분석기, dynamic light scattering), C: 엑소좀 막 표면 마커(western blot), D: 추출된 엑소좀의 수율 및 순도(나노입자추적분석기, nanoparticle tracking analysis). BA: 베이지 지방세포, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 5은 추출된 엑소좀이 인간 지방유래 줄기세포 내부로 흡수되는 정도를 공초점형광현미경 이미지로 나타낸 도이다[D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 6는 인간 지방 유래 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화유도된 줄기세포를 오일-레드 오 염색한 결과이다[GM: growth medium, 음성대조군, DM: differentiation medium, 양성대조군, P-EXO: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 7은 인간 지방 유래 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화 유도된 줄기세포 내부에 UCP-1 단백질의 발현여부를 확인한 ELISA 결과이다[GM: growth medium, 음성대조군, DM: differentiation medium, 양성대조군, P-EXO: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 8는 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스에 D-EXO를 투여한 실험에서 4주간 마우스의 외관상의 변화를 나타낸 사진이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
도 9은 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스의 복강 내에 PBS, P-EXO, D-EXO, Butein 을 2주 동안 이틀 간격으로 투여한 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
도 10은 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스의 복강 내에 PBS, P-EXO, D-EXO, Butein을 2주 동안 이틀 간격으로 투여한 마우스 혈액 내 혈당 수치를 나타낸 그래프이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
도 2는 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 인간 지방유래 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화능에 대한 도이다[A; 인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cell, HASC), 백색지방세포(white adipocyte, WA), 베이지 지방세포(beige adipocyte, BA)를 오일-레드 오 염색을 통해 확인. B; 베이지 지방세포의 주요 발현 인자인 UCP1의 mRNA 발현 여부를 RT-PCR을 통해 확인. 베이지 지방세포의 주요 발현 인자인 UCP1의 단백질 발현 여부를 ELISA kit을 통해 확인함].
도 4는 추출된 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀의 특성에 대한 도이다[A: 엑소좀의 구조 및 모양(투과전자현미경, transmission electron microscope), B: 엑소좀의 크기(나노입자분석기, dynamic light scattering), C: 엑소좀 막 표면 마커(western blot), D: 추출된 엑소좀의 수율 및 순도(나노입자추적분석기, nanoparticle tracking analysis). BA: 베이지 지방세포, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 5은 추출된 엑소좀이 인간 지방유래 줄기세포 내부로 흡수되는 정도를 공초점형광현미경 이미지로 나타낸 도이다[D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 6는 인간 지방 유래 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화유도된 줄기세포를 오일-레드 오 염색한 결과이다[GM: growth medium, 음성대조군, DM: differentiation medium, 양성대조군, P-EXO: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 7은 인간 지방 유래 줄기세포가 베이지 지방세포로 분화 유도된 줄기세포 내부에 UCP-1 단백질의 발현여부를 확인한 ELISA 결과이다[GM: growth medium, 음성대조군, DM: differentiation medium, 양성대조군, P-EXO: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀, D-EXO: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀].
도 8는 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스에 D-EXO를 투여한 실험에서 4주간 마우스의 외관상의 변화를 나타낸 사진이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
도 9은 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스의 복강 내에 PBS, P-EXO, D-EXO, Butein 을 2주 동안 이틀 간격으로 투여한 마우스의 체중 변화를 나타낸 그래프이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
도 10은 비만 동물 모델인 C57BL6/J-ob/ob 마우스의 복강 내에 PBS, P-EXO, D-EXO, Butein을 2주 동안 이틀 간격으로 투여한 마우스 혈액 내 혈당 수치를 나타낸 그래프이다[PBS: phosphate buffer saline를 투여한 대조군 (N=3), P-EXO: P-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 대조군 (N=3), D-EXO: D-EXO를 3 X 108개의 입자를 이틀 간격으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3), Butein: butein을 이틀 간격으로 15 mg/kg 용량으로 복강 주사하여 투여한 그룹 (N=3)].
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명이 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예
1: 베이지 지방세포로 분화하는 줄기세포로부터
엑소좀
추출
베이지 지방세포로 분화하고 있는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위하여, 인간 지방유래 줄기세포를 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 80~90% 정도 증식시킨 후 베이지 세포 분화배지(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose, 5% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin, 1 μM dexamethasone, 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine, 10 μg/mL insulin, 2 μM rosiglitazone)로 교체하고 총 3주간 배양함으로써 베이지 지방세포로 분화를 유도하였다. 분화된 세포는 오일 레드 오 염색과 UCP-1 발현 정도를 통해 베이지 지방세포로 분화되었음을 확인하였다(도 3).
엑소좀을 추출하기 위해 줄기세포를 무혈청, 페놀 레드(phenol red)가 첨가되지 않은 배지로 교체하여 24시간 동안 유지한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포잔여물을 제거하고, 0.4 μm 포어 크기를 갖는 cell strainer를 이용하여 포어 크기 이상의 잔여물을 제거하였다. 이후, 0.22 μm 포어 크기를 갖는 filter를 이용하여 포어 크기 이상의 세포 잔여물을 제거하였다. 여과 후 회수한 용액을 4 mL/min의 유속을 가하여 500 kD MWCO(molecular weight cut off)를 갖는 filter를 이용한 TFF(tangential flow filtration) 과정을 통해 단백질을 제거하였다. 회수한 용액에 saline buffer를 추가하여 TFF 과정을 연속 반복한 후 최종적으로 엑소좀을 수득하였다(도 2).
실시예
2:
엑소좀의
특성 분석
실시예 1로부터 추출한 엑소좀을 투과전자현미경(transmission electron microscope)과 광산란분석기(dynamic light scattering)를 사용하여 크기 및 모양을 확인하고, 특정 단백질을 검출하는 웨스턴 블롯(western blot)을 이용하여 엑소좀의 표면 단백질을 확인하였으며, 세포배양액 400 mL로부터 추출된 엑소좀을 나노입자추적분석기(nanoparticle tracking analysis)를 통해 순도 및 수율을 확인하였다. 그 결과, 도 4의 A와 같이 추출된 엑소좀은 둥근 나노입자 모양이며, 크기는 B와 같이 평균 83.86 nm 인 것으로 확인하였다. 또한, C와 같이 엑소좀 막 표면에서 발현되는 엑소좀 특이적 마커인 CD9과 CD81도 발현되는 것으로 확인하였다. 다중필터시스템을 통해 추출된 엑소좀의 농도는 2 x 1010 particles/mL 이며, 단백질 농도는 1.59 mg/mL, 순도는 1.37 x 107 particles/μg으로 확인하였다.
실시예
3: 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된
엑소좀을
이용한 베이지 지방세포 분화 유도
줄기세포의 베이지 지방세포 분화를 유도하기 위하여, 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 엑소좀 0.5 x 108, 1 x 108, 2 x 108 particles/mL 농도를 줄기세포 배양 배지에 추가하여 사용하였다. 상기 배지 조성물을 각각 배양된 인간 지방 유래 줄기세포에 처리한 후 3일에 한 번씩 21일간 교체하였다. 음성대조군은 일반 배양배지(Dulbecco Modified Eagle Medium high glucose, 10% fetal bovine serum, 1% penicillin/streptomycin)에서 증식시킨 줄기세포를 사용하였고 양성대조군은 5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 10 μg/mL 인슐린 (insulin), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-methylxanthine), 2 μM 로지클리타존(rosiglitazone)이 포함된 베이지 세포 분화유도 배지(DM)에서 배양된 줄기세포를 사용하였다. 비교군으로는 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-EXO)을 처리한 줄기세포를 사용하였다. 14일 동안 베이지 지방세포로의 분화가 유도된 줄기세포는 오일-레드 오 염색을 통해 베이지 세포로 분화 여부를 확인하였다. 또한, UCP-1 ELISA kit를 이용하여 세포 내에 베이지 지방세포의 마커인 UCP-1의 발현 여부를 분석하였다.
베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 14일 동안 처리 시 베이지 세포 분화유도 배지와 유사하게 오일이 생성되었고(도 6) UCP-1 단백질도 발현되어(도 7) 결과적으로 베이지 지방세포로 분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다. 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-EXO)을 처리한 줄기세포의 경우 지방세포로 분화되지 않고 증식만 이루어지는 것을 확인하였다.
실시예
4:
엑소좀의
세포 내 흡수 확인
엑소좀의 세포 내로 흡수되는 정도를 확인하기 위하여 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 각각 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 엑소좀은 형광 염색 시약(DiD)과 혼합하여 15분 동안 37도에 배양하여 엑소좀 표면에 표지하였다. 이후 exosome spin column을 이용하여 미반응된 염색 시약을 제거하였다. 표면에 형광이 표지된 엑소좀은 1 x 108, 2 x 108, 3 x 108 particles/mL 농도로 인간 지방유래 줄기세포에 처리하고 1시간 동안 배양한 후, 줄기세포의 핵은 DAPI로 염색하여 공초점 레이져 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용해 세포를 관찰하였다. 엑소좀 처리 농도에 따라 세포 내로 흡수되는 정도도 비례적으로 차이가 났으며, 엑소좀 처리 후 1시간 이내로 많은 양의 엑소좀이 줄기세포의 세포질뿐만 아니라 핵으로까지 전달된 것을 확인하였다(도 5).
실시예
5: ob/ob 마우스에서 비만 치료 효능 확인
엑소좀의 비만 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL6/J-ob/ob 마우스에 엑소좀을 복강 주사로 투여하였다. 6주된 마우스를 1주간의 순화과정을 거친 뒤, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-EXO) 및 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 각각 2주 동안 투여한 뒤, 4주 동안 체중 변화를 측정하였다.
구체적으로, 상기 엑소좀은 PBS에 3 x 109 particles/mL의 농도로 분산된 용액으로 제조하였다. 그리고 엑소좀을 C57BL6/J-ob/ob 마우스의 복강 내에 주입한 후, 4주 동안 관찰하였다. 음성대조군은 엑소좀이 포함되지 않은 PBS를 사용하였고, 양성대조군은 비만 예방 효과가 있다고 알려진 butein을 포함하는 용액을 사용하였다. 4주 후, 비만 효과를 확인하기 위하여 외관 모습과 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과, 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 처리한 동물의 체중이 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 8, 도 9).
실시예 6: ob/ob 마우스에서 당뇨 치료 효능 확인
엑소좀의 당뇨 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL6/J-ob/ob 마우스에 엑소좀을 복강 주사로 투여하였다. 6주된 마우스를 1주간의 순화 과정을 거친 뒤, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(P-EXO) 및 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 각각 2주 동안 투여하여 4주 동안 관찰한 뒤, 12시간의 공복 이후의 혈당 농도를 측정하였다. 베이지 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 투여한 마우스는 PBS나 P-EXO를 처리한 마우스에 비해 혈당이 줄어든 것으로 확인되었다(도 10).
Claims (11)
- 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는, 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 베이지 지방세포로의 분화 유도는 줄기세포로부터 베이지 지방세포로의 분화 유도이거나, 또는 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포로의 전환분화 유도인, 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1 항에 있어서,
상기 베이지 지방세포로 분화되고 있는 줄기세포는 골수줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포인, 베이지 지방세포로의 분화유도용 조성물.
- 제 3 항에 있어서,
상기 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포는 인체, 동물 또는 식물 유래 줄기세포인, 베이지 지방세포로의 분화 유도용 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
- 제 5 항에 있어서,
상기 약제학적 조성물은 대사 질환의 치료 또는 예방용인 약제학적 조성물.
- 제 6 항에 있어서,
상기 대사 질환은 비만 또는 당뇨병인 약제학적 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 건강기능식품.
- 제 8 항에 있어서,
상기 건강기능식품은 비만 또는 당뇨병의 개선 또는 예방용인 건강기능식품.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 베이지 지방세포로의 분화 유도용 배지 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항의 조성물을 줄기세포에 처리하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 베이지 줄기세포로의 분화 유도방법.
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