CN114948929A - 一种槲皮素的用途 - Google Patents

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刘孟敏
何麒
樊天佑
薛纯纯
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丁超
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Abstract

本发明涉及一种槲皮素的用途。具体地，本发明提供一种。具体地，本发明提供一种槲皮素的用途，用于(1)预防和/或治疗雄激素缺乏症；(2)预防和/或治疗羧化不全骨钙素缺乏症；(3)改善雄激素缺乏的骨微结构；(4)改善雄激素缺乏的生物力学；(5)改善雄激素缺乏的平衡运动能力；(6)改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化；(7)减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成；(8)改善雄激素缺乏的脂质代谢；(9)改善雄激素缺乏的糖代谢；(10)升高骨组织中的GPRC6A表达；(11)升高骨组织中的p‑AMPK/AMPK比率；和/或(12)降低p‑mTOR/mTOR比率。

Description

一种槲皮素的用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及一种槲皮素的用途。
背景技术
雄激素对肌肉骨骼和内分泌生殖系统至关重要，其中睾酮是体内的主要雄激素。在30-90岁的男性中，睾酮水平每年缓慢下降1％。机体内的低睾酮水平一般称为“睾酮缺乏症”，其可导致包括勃起功能障碍、精力不足或疲倦、抑郁和焦虑、骨矿物质密度(BMD)和肌肉治质量等多种症状，这些症状会严重影响中老年男性的生活。肌肉骨骼系统在机体内负责支撑、运动，与雌激素缺乏相似，睾酮在维持老年男性的BMD和肌肉骨骼健康方面发挥着核心作用。现有的临床上缺乏一种有效治疗雄激素如睾酮缺乏症的药物，如何开发一种睾酮缺乏及其并发症的药物成为当今研究的热点。
因此，本领域需要开发一种有效治疗睾酮缺乏及其并发症的药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种槲皮素在治疗睾酮缺乏及其并发症方面中用途。
本发明第一方面，提供一种槲皮素的用途，用于选自下组的一种或多种用途：(1)制备预防和/或治疗雄激素缺乏症的组合物；(2)制备预防和/或治疗羧化不全骨钙素缺乏症的组合物；(3)制备改善雄激素缺乏的骨微结构的组合物；(4)制备改善雄激素缺乏的生物力学的组合物；(5)制备改善雄激素缺乏的平衡运动能力的组合物；(6)制备改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化的组合物；(7)制备减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成的组合物；(8)制备改善雄激素缺乏的脂质代谢的组合物；(9)制备改善雄激素缺乏的糖代谢的组合物；(10)制备升高骨组织中的GPRC6A表达的组合物；(11)制备升高骨组织中的p-AMPK/AMPK比率的组合物；和/或(12)制备降低p-mTOR/mTOR比率的组合物。
优选地，所述的雄激素包括睾酮。
优选地，所述的睾酮包括血液、血清或血浆中的睾酮。
优选地，所述的羧化不全骨钙素包括血液、血清或血浆中的羧化不全骨钙素。
优选地，所述的(3)改善雄激素缺乏导致的骨微结构包括：
(3-1)提高骨小梁体积/组织体积(BV/TV)；
(3-2)提高骨小梁厚度(Tb.Th)；
(3-3)降低骨小梁分离(Tb.Sp)；
(3-4)提高骨密度；
(3-5)提高骨小梁数量；
(3-6)增强骨小梁间连接性；和/或
(3-7)降低骨质流失。
优选地，所述的(4)改善雄激素缺乏的生物力学包括：
(4-1)增加骨的载荷、挠度、断裂能量和/或刚度。
优选地，所述的骨包括皮质骨。
优选地，所述的(5)改善雄激素缺乏的平衡运动能力包括：
(5-1)提高步幅和/或步频率；
(5-2)降低步长变异性和/或步态对称性；
(5-3)防止跌倒；和/或
(5-4)降低骨质疏松症骨折风险。
优选地，所述肌肉包括腓肠肌。
优选地，所述(6)改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化包括：
(6-1)提高纤维横截面积；
(6-2)改善肌纤维萎缩；
(6-3)提高肌肉中胶原纤维面积；
(6-4)增加肌纤维体积；
(6-5)降低肌肉胶原纤维化和/或脂肪浸润。
优选地，所述(7)减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成包括：
(7-1)降低β-CTX和/或IL-6含量；
(7-2)提高OCN含量；和/或
(7-3)降低B-ALP含量。
优选地，所述β-CTX包括血液、血清或血浆中的β-CTX。
优选地，所述IL-6包括血液、血清或血浆中IL-6。
优选地，所述OCN包括血液、血清或血浆中的OCN。
优选地，所述B-ALP包括血液、血清或血浆中的B-ALP。
优选地，所述(8)改善雄激素缺乏的脂质代谢包括：
(8-1)降低甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和/或脂肪酸含量；和/或
(8-1)升高高密度脂蛋白。
优选地，所述甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、脂肪酸和/或高密度脂蛋白包括血液、血清或血浆中的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、脂肪酸和/或高密度脂蛋白。
优选地，所述(9)改善雄激素缺乏的糖代谢包括：
(9-1)降低胰岛素含量；
(9-2)升高胰岛素样生长因子-1含量；和/或
(9-3)降低血糖水平。
优选地，所述糖包括葡萄糖。
在另一优选例中，所述的组合物的施用对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述的非人哺乳动物为猴、猩猩、牛、猪、狗、羊、鼠或兔。
在另一优选例中，所述的组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述的组合物还包括药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物的剂型为口服制剂、外用制剂或注射制剂。
在另一优选例中，所述的注射制剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
在另一优选例中，所述组合物的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、酊剂、口服液、片剂或含片。
在另一优选例中，在所述组合物中，所述槲皮素的重量百分比为0.01-99.9wt％，较佳地0.1-99wt％，更佳地10-90wt％，更佳地20-80wt％，以组合物的总重量计。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为去势后小鼠血清睾酮和未羧化骨钙素(uOCN)水平的变化。(A)假手术(sham)、模型(model)、低剂量(QL)和高剂量槲皮素组(QH)的血清睾酮水平。(B)所有治疗组和对照组的血清uOCN水平。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图2为槲皮素可改善去势后小鼠的骨微结构。(A)通过微型计算机断层扫描对股骨远端进行2D平扫和3D重建。(B)股骨远端的骨矿物质密度(BMD)。(C-F)骨特征的变化，包括骨体积分数(BV/TV)、小梁数量(Tb.N)、小梁厚度(Tb.Th)和小梁分离(Tb.Sp)。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图3为槲皮素对去势后小鼠的生物力学特征和骨吸收能力的影响。(A-D)股骨生物力学特性的变化：包括最大载荷和挠度、断裂能量和刚度。(E)HE染色观察槲皮素对股骨远端骨微观结构的影响。(F)TRAP染色观察槲皮素对去势后小鼠骨吸收的影响。(G)破骨细胞表面/骨表面(OC.s/BS)(H)去势后小鼠血清TRAP水平的变化。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图4为去势后小鼠的步态分析。(A)完整的步态被记录并分割成独立的步态周期。步态特征的变化包括：(B)步幅长度、(C)步幅长度CV、(D)步幅频率和(E)步态对称性。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图5为槲皮素对去势后小鼠腓肠肌质量变化的影响。(A)HE染色观察腓肠肌的形态变化和(B)肌纤维(CSA)平均横截面积的变化。(C)腓肠肌的马松(Masson)染色观察纤维化程度和(D)胶原纤维区域的比例。(E)油红O染色观察腓肠肌的脂肪浸润程度和(F)脂滴面积的比例。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图6为槲皮素对去势后小鼠骨代谢的影响。骨吸收标志物的水平，包括(A)β-异构化C末端端肽(β-CTX)、(B)白细胞介素6(IL-6)、(C)骨碱性磷酸酶(B-ALP)和(D)骨钙素(OCN)。(E)骨形成蛋白的表达，包括OCN、RUNX2和Osterix。(F)ImageJ软件对OCN、RUNX2和Osterix的半定量分析。(G)OCN、RUNX2和Osterix在骨组织中的mRNA表达。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图7为脂质代谢标志物的水平，包括(A)总胆固醇、(B)甘油三酯、(C)高密度脂蛋白(HDL)、(D)低密度脂蛋白(LDL)和(E)游离脂肪酸(FFA)。葡萄糖代谢标志物的水平，包括(F)胰岛素和(G)胰岛素样生长因子-1(IGF-1)。#p<0.05,##p<0.01vs.sham组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图8为槲皮素治疗去势后小鼠脂质和葡萄糖代谢的变化。(A)脂质和葡萄糖代谢蛋白的表达，包括Glut4、ACO、PPAR和C/EBP。(B)用ImageJ软件对Glut4、ACO、PPAR和C/EBP进行半定量分析。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
图9为槲皮素对去势后小鼠AMPK-mTOR信号通路的影响。(A)骨组织免疫组化和(B)半定量分析；蛋白质印迹测定分析评估骨中GPCR6A、AMPK、mTOR等蛋白的表达(C)。#p<0.05,##p<0.01vs.假手术组；*p<0.05，**p<0.01与模型组相比。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现槲皮素能够提高治疗雄激素如睾酮缺乏症，并改善雄激素缺乏的骨微结构、生物力学、平衡运动能力、肌肉的质量变化、骨质流失和/或增加骨形成、脂质代谢、糖代谢，从而能够有效治疗睾酮缺乏及其并发症。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包括”、“包含”与“含有”可互换使用，不仅包括开放式定义，还包括半封闭式、和封闭式定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如文本所用，术语“槲皮素”的CAS号：117-39-5，结构如下：
Figure BDA0003588777590000041
在本发明中，术语“预防”表示预防疾病和/或它的附随症状的发作或者保护对象免于获得疾病的方法
在本发明中，术语“治疗”包括延缓和终止疾病的进展，或消除疾病，并不需要100％抑制、消灭和逆转。在一些实施方案中，与不存在本发明所述的槲皮素观相比，本发明所述槲皮素减轻、抑制和/或逆转了睾酮缺乏症例如至少10％、至少约50％、至少约80％，或100％。
用途
本发明提供一种槲皮素的用途，用于选自下组的一种或多种用途：(1)制备预防和/或治疗雄激素缺乏症的组合物；(2)制备预防和/或治疗羧化不全骨钙素缺乏症的组合物；(3)制备改善雄激素缺乏的骨微结构的组合物；(4)制备改善雄激素缺乏的生物力学的组合物；(5)制备改善雄激素缺乏的平衡运动能力的组合物；(6)制备改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化的组合物；(7)制备减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成的组合物；(8)制备改善雄激素缺乏的脂质代谢的组合物；(9)制备改善雄激素缺乏的糖代谢的组合物；(10)制备升高骨组织中的GPRC6A表达的组合物；(11)制备升高骨组织中的p-AMPK/AMPK比率的组合物；和/或(12)制备降低p-mTOR/mTOR比率的组合物。
在本发明的一个优选例中，所述的雄激素包括(但不限于)睾酮。
优选地，所述的睾酮包括血液、血清或血浆中的睾酮。
优选地，所述的羧化不全骨钙素包括血液、血清或血浆中的羧化不全骨钙素。
在本发明的一个优选例中，所述的(3)改善雄激素缺乏导致的骨微结构包括：
(3-1)提高骨小梁体积/组织体积(BV/TV)；
(3-2)提高骨小梁厚度(Tb.Th)；
(3-3)降低骨小梁分离(Tb.Sp)；
(3-4)提高骨密度；
(3-5)提高骨小梁数量；
(3-6)增强骨小梁间连接性；和/或
(3-7)降低骨质流失；
在本发明的一个优选例中，所述的(4)改善雄激素缺乏的生物力学包括：
(4-1)增加骨的载荷、挠度、断裂能量和/或刚度。
优选地，所述的骨包括皮质骨。
在本发明的一个优选例中，所述的(5)改善雄激素缺乏的平衡运动能力包括：
(5-1)提高步幅和/或步频率；
(5-2)降低步长变异性和/或步态对称性；
(5-3)防止跌倒；和/或
(5-4)降低骨质疏松症骨折风险。
优选地，所述肌肉包括腓肠肌。
在本发明的一个优选例中，所述(6)改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化包括：
(6-1)提高纤维横截面积；
(6-2)改善肌纤维萎缩；
(6-3)提高肌肉中胶原纤维面积；
(6-4)增加肌纤维体积；
(6-5)降低肌肉胶原纤维化和/或脂肪浸润。
在本发明的一个优选例中，所述(7)减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成包括：
(7-1)降低β-CTX和/或IL-6含量；
(7-2)提高OCN含量；和/或
(7-3)降低B-ALP含量。
优选地，所述β-CTX包括血液、血清或血浆中的β-CTX。
优选地，所述IL-6包括血液、血清或血浆中IL-6。
优选地，所述OCN包括血液、血清或血浆中的OCN。
优选地，所述B-ALP包括血液、血清或血浆中的B-ALP。
在本发明的一个优选例中，所述(8)改善雄激素缺乏的脂质代谢包括：
(8-1)降低甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和/或脂肪酸含量；和/或
(8-1)升高高密度脂蛋白。
优选地，所述甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、脂肪酸和/或高密度脂蛋白包括血液、血清或血浆中的甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白、脂肪酸和/或高密度脂蛋白。
在本发明的一个优选例中，所述(9)改善雄激素缺乏的糖代谢包括：
(9-1)降低胰岛素含量；
(9-2)升高胰岛素样生长因子-1含量；和/或
(9-3)降低血糖水平。
优选地，所述糖包括葡萄糖。
组合物和施用
本发明所述的组合物包括(但并不限于)药物组合物等。
代表性地，可将本发明的槲皮素制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物组合物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
本发明的组合物还可以包括药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可接受的载体可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
Figure BDA0003588777590000061
)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明组合物施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内)、局部施用，优选的施用方式为口服施用和注射施用。
施用组合物时，是将安全有效量的本发明槲皮素适用于需要治疗的人或非人动物(如大鼠、小鼠、狗、猫、牛、鸡、鸭等)，其中施用时剂量为药学上可接受认为的有效给药剂量。如本文所用，术语“安全有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“安全有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。例如，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为0.1～1000mg，优选1～600mg，更优选为2-300mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要技术效果包括：
本发明首次发现槲皮素能够提高治疗雄激素如睾酮缺乏症，并改善雄激素缺乏的骨微结构、生物力学、平衡运动能力、肌肉的质量变化、骨质流失和/或增加骨形成、脂质代谢、糖代谢，从而能够有效治疗睾酮缺乏及其并发症。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
1材料与方法
1.1动物
在南京中医药大学实验动物中心，标准屏障设施中饲养48只雄性C57BL/6小鼠(12周龄)。动物房的温度受控：24±2℃，湿度：60±2％，暗光周期为12:12h。实验动物获得南京中医药大学动物伦理委员会的批准(NO.ACU170804)。
1.2睾丸切除术和实验分组
小鼠睾丸切除术是睾酮快速丢失的经典模型。与之前的研究(20)一样，手术过程在无菌条件下进行，所有小鼠均通过腹腔注射1％戊巴比妥钠(60mg/kg体重)进行麻醉。在皮肤准备后，在阴囊中间切一条约1.5cm的切口，逐层分离并结扎睾丸血管，切除睾丸和附睾，最后在切口闭合后涂抹四环素软膏预防感染。假手术组采用相同的手术方式，仅切除部分脂肪组织，但不切除睾丸和附睾。
所有治疗给药方案均在手术后8周开始。假手术组(sham，n＝12)接受剂量为0.001mL/kg/d的生理盐水。除假手术组外，将去睾丸小鼠(n＝36)随机分为四组，设置了两种不同的浓度，分组如下：(a)模型组(model)和假手术组(sham)接受等体积的生理盐水，(b)低槲皮素组(QL)接受75mg/kg/d的槲皮素，(c)高槲皮素组(QH)接受150mg/kg/d的槲皮素。每天一次生理盐水或药物灌胃，持续8周后，麻醉下小鼠以眶后静脉采集血液，然后实施安乐死。取出腓肠肌、股骨和胫骨并小心收集。右侧腓肠肌、股骨、胫骨保存在4％多聚甲醛中，左侧腓肠肌、股骨、胫骨保存在-80℃以供进一步实验。
1.3步态分析
步态分析使用大小鼠行走跑步仪(MSI，美国)进行。在正式记录之前，所有小鼠首先进行至少七次适应性跑步训练。在适应性跑步后，用相机以12厘米/秒的速度在同一方向上对小鼠进行运动和记录。分析步幅、步幅变异系数(CV)、步频和步态对称性以评估动态平衡能力。
1.4微计算机断层扫描(MicroCT)
使用microCT(德国Skyscan1176)对骨小梁的骨微结构进行分析。参数设置如下：分辨率大小9μm，电压55kv，电流70ma。扫描完成后，在距股骨远端生长板最高点0.3至0.6mm的距离内选择感兴趣区域(ROI)。分析3D图像并测量骨特征，包括骨密度、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁分离度(Tb.Sp)。
1.5生物力学参数分析
收集右侧股骨进行生物力学三点弯曲测试。生物力学电动伺服液压测试系统(美国MTSacumen3)上以0.01的速度进行测试，以毫米/秒的速度记录峰值负载。然后根据位移和力计算刚度、最大载荷、最大挠度和断裂能量等生物力学参数。
1.6苏木精和伊红(HE)染色
4％多聚甲醛中固定后的股骨在脱钙液中脱钙4-6周，腓肠肌仅用4％多聚甲醛中固定。然后用梯度乙醇对股骨和肌肉进行脱水，二甲苯透明。然后将标本包埋于石蜡中，并以5μm厚度连续切片。切片用苏木精和伊红染色，通过倒置显微镜(Leica,DM1000)观察骨骼微结构的变化。
1.7TRAP染色
使用TRAP染色试剂盒(Sigma,387A)，具体实验步骤按照制造商说明进行，如前所述(21)。破骨细胞面积与骨表面(OCs/BS)的比率量化。
1.8马松和油红O染色
如前所述制备切片，根据Masson染色试剂盒方案(Yeasen,60532ES58)进行染色。红色代表肌肉纤维，蓝色代表胶原纤维，计算出肌肉纤维面积和胶原纤维面积。
腓肠肌固定后嵌入OCT化合物中，将切片放入油红O溶液中8分钟进行染色，切片用60％异丙醇洗涤两次，苏木精复染。最后，对切片进行拍照，分析脂滴形成的面积。
1.9酶联免疫吸附试验ELISA
所有试剂盒均由南京金益白生物科技公司(中国)提供。睾酮(金益柏，JEB-12629)、I型胶原C端端肽β-异构体(β-CTX，金益柏，JEB-12299)、TRAP(金益柏，JEB-12833)、IL的表达血清-6(金益柏，LA128802H)，骨碱性磷酸酶(B-ALP，金益柏，JEB-12359)，骨钙素(OCN，金益柏，JEB-17685)，胰岛素样生长因子-1(IGF-1，金益柏,JEB-12259)和胰岛素(Mercodia,10-1247-01)基于标准夹心ELISA方案进行测量。
2.0生化分析
使用自动生化分析仪(AU680，Beckman)检测甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和游离脂肪酸(FFA)水平。
2.1Western blotting
将左侧胫骨、腓肠肌在含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液中裂解，将样品超声处理并在冰上孵育30分钟，然后通过以12000rpm离心5分钟，收集上清液中的蛋白质，然后通过BCA试剂盒(Yeasen,20201ES76)进行定量。使用10％SDS-PAGE，在140V电压下进行电泳后，以400mA的恒定电流将凝胶转移到PVDF膜上。使用封闭液封闭PVDF膜15分钟后，将膜与抗Gprc6a(1:4000；SAB,47990)、抗AMPK(1:4000；CS T,2757)、抗p-AMPK(1:2000；CST,50081,)、抗RUXN2(1:4000；Proteintech,20700-1-AP)、抗Osterix(1:4000；Abcam,ab94744)和抗GAPDH(1:5000；Proteintech,10494-1-AP)在4℃下过夜，然后与二抗(1:10000；Proteintech,20536-1-AP)在水平摇床上在常温下孵育2小时。最后，使用ECL试剂润湿膜并曝光。
2.2Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)
使用Bone RNA Kit和Cell/Tissue Total RNA Kit(Yesaen,19211ES60)提取总RNA，然后使用1st Strand cDNA Synthesis Kit(Yesaen,11119ES60)进行RNA逆转录。Hieff qPCR SYBR Green PCR Master Mix(Yesaen,11201ES03)用于q-PCR分析。使用β-actin作为参考调整每个值，用2-ΔΔCt方法分析PCR阵列结果。qPCR引物序列如下：OCN：正向5'CTGAAAAGCCCACAGATACCAG3'和反向5'TGGAGAGGGTTGTTAGTGTGTC3'。RUNX2：正向5'ATGCTTCATTC GCCTCACAAA3'和反向5'GCACTCACTGACTCGGTTGG3'。Osterix：正向5'ATGGCGTCCTCTCTGCTTG3'和反向5'TGAAAGGTCAGCGTATGGCTT3'β-acti n：正向5'GGCTGTATTCCCCTCCATCG 3'和反向5'CCAGTTGGTAACAATGCC ATGT 3'
2.3统计分析
使用SPSS软件(v 23.0)进行统计分析数据。数据以平均值±标准差(SD)表示，非正态分布数据使用Kruskal-Wallis单向方差分析(ANOVA)进行分析。当P<0.05时，差异被认为是显着的。GraphPadPrism软件9.0.0用于生成图形。
3.结果
3.1血清睾酮水平的变化
睾丸切除术后，由于缺少睾丸和附睾，血清睾酮水平迅速下降。在槲皮素治疗8周后，低剂量槲皮素组(QL，75mg/kg/d)和高剂量槲皮素组(QH，150mg/kg/d)的睾酮水平均高于生理盐水干预的模型组(p<0.01，图1的图1A)。同时，槲皮素可促进睾酮分泌的羧化不全骨钙素(uOCN)的血清水平相应增加(p<0.01，图1的图1B)。
3.2槲皮素改善睾酮缺乏后的骨微结构
首先采用micro-CT扫描并评估股骨远端骨小梁的特征，结果如图2所示。模型组的骨微结构破坏明显(图2A)。与模型组相比，低剂量和高剂量槲皮素干预后，骨组织中骨小梁体积/组织体积(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)较高，骨小梁分离(Tb.Sp)明显较低(p<0.01)；高剂量槲皮素组的骨密度(BMD，p<0.01)和骨小梁数量(Tb.N，p<0.01)水平显着增加(图2B-F)。随后，使用H&E染色观察了远端股骨骨小梁的微观结构(图3的图3E)，与假手术组相比，模型组股骨远端骨小梁较少，皮质骨较薄。低剂量和高剂量槲皮素组中观察到骨小梁增加、骨小梁间连接性更好。可见，经过8周的治疗，高剂量槲皮素有效增加了去势小鼠的BMD并改善了骨微结构。此外，TRAP染色直接观察到股骨远端小梁骨的骨吸收区域明显减少(图3F)，槲皮素降低了OCs/BS比率，改善了去势后的骨质流失(图3G)。Elisa检测结果与TRAP染色一致，高剂量和低剂量的槲皮素干预后，血清中TRAP水平明显下降。(图3H)。
3.3槲皮素改善睾酮缺乏后的生物力学参数
使用三点弯曲试验评估股骨皮质骨的力学状态。模型组的最大载荷和挠度、断裂能量和刚度显着低于假手术组(图3A-D)，其中高剂量槲皮素组能够明显增加皮质骨的最大载荷和挠度、断裂能量和刚度(p<0.01)。而低剂量槲皮素组除刚度无显著差异外，最大载荷和挠度、断裂能量均有所改善(p<0.01)。
3.4槲皮素提高睾酮缺乏后平衡运动能力
肌肉骨骼系统是一个动态系统，需要强大的平衡能力。当骨骼系统发生变化时，躯体肌肉的顺应性降低。高剂量槲皮素治疗后，小鼠步幅和频率显着增加(p<0.01)，而步长变异性(CVs)和步态对称性相应降低(p<0.01，如图4的图4A-E)。低剂量的槲皮素也有同样的趋势，但步幅频率的增加并不显着。表明，槲皮素可以提高平衡运动能力，从而防止跌倒并降低骨质疏松症骨折的风险。
3.5槲皮素改善睾酮缺乏后腓肠肌的质量变化
对腓肠肌进行了H&E染色(如图5的图5A-B)。模型组肌纤维的平均横截面积明显减小，纤维间隙明显变宽。低剂量和高剂量槲皮素组的肌纤维横截面积显着高于模型组(分别为p<0.05和p<0.01)，表明肌纤维萎缩得到缓解。马松染色显示，模型组腓肠肌胶原纤维面积百分比显着高于假手术组(p<0.01)，而低剂量和高剂量槲皮素组干预后，腓肠肌中胶原纤维面积百分比明显下降(分别为p<0.05和p<0.01，图5C-D)。油红O染色评估腓肠肌中的脂质积累情况，结果显示低剂量和高剂量槲皮素组的脂滴面积均小于模型组(p<0.01，图5E-F)。以上结果表明，槲皮素可通过增加肌纤维体积、减少肌肉胶原纤维化和脂肪浸润来促进腓肠肌质量的改善。
3.6槲皮素减轻睾酮缺乏后骨质流失并增加骨形成
ELISA评估骨吸收(β-CTX和IL-6)和骨形成(OCN和B-ALP)标志物。去势后模型组血清β-CTX、IL-6水平较假手术组明显升高(p<0.01)。低、高剂量槲皮素治疗8周后，这些标志物水平均显著降低(p<0.01，如图6的图6A-B)。去势后血清OCN水平显着降低，B-ALP水平升高(图6C-D)，低剂量和高剂量槲皮素处理后可显着增加OCN、降低B-ALP水平(p<0.01)。同时，槲皮素处理后OCN、RUNX2和Osterix的蛋白表达水平显着上调(p<0.01，图6E-F)，mRNA水平同样升高(p<0.01，图6G)。
3.7槲皮素改善睾酮缺乏后的脂质代谢
生化分析结果显示，模型组血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和游离脂肪酸水平显着升高(p<0.01)，而高密度脂蛋白水平降低(p<0.01)。低、高剂量槲皮素治疗后，总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和游离脂肪酸显着降低，而高密度脂蛋白(HDL)增加(如图7的图7A-E)。低剂量槲皮素组甘油三酯和HDL的变化无统计学差异(图7B-C)。通过进一步研究槲皮素对与脂质代谢相关的关键蛋白Cebp/β和Ppar-γ的影响。如图8所示，槲皮素干预后，Cebp/β和Ppar-γ的蛋白质水平显着下降(p<0.01)。以上果表明，槲皮素可有效改善脂质代谢。
3.8槲皮素改善睾酮缺乏后的糖代谢
除了脂质代谢，还分析了相应的葡萄糖代谢。在槲皮素治疗后，低剂量和高剂量槲皮素组干预后，血清中胰岛素显著下降，胰岛素样生长因子-1水平升高(图7F-G)。同时，分析了与葡萄糖代谢相关的主要蛋白GLUT4和ACO表达情况，结果显示在槲皮素干预后GLUT4和ACO蛋白表达水平增加(图8)。以上结果表明，槲皮素可有效改善葡萄糖代谢。
3.9槲皮素调节GPRC6/AAMPK/mTOR信号通路
作为一种重要的代谢活动调节剂，GPRC6A可能在骨质疏松症中发挥关键作用。为了进一步阐明发生这种情况的可能机制，分析了GPRC6A在股骨中的表达。如图9所示，GPRC6A在骨组织中广泛表达，去势后骨组织中GPRC6A的表达均显着下降(p<0.01，图9A-C)。槲皮素干预后，骨组织中的GPRC6A表达明显增加。此外，还检测了GPRC6A的下游信号，包括AMPK和mTOR(图9C)。发现在低剂量和高剂量槲皮素组中，GPRC6A下游信号p-AMPK/AMPK比率升高，而p-mTOR/mTOR比率降低。以上结果表明槲皮素可能促进AMPK磷酸化并抑制mTOR磷酸化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种槲皮素的用途，其特征在于，用于选自下组的一种或多种用途：(1)制备预防和/或治疗雄激素缺乏症的组合物；(2)制备预防和/或治疗羧化不全骨钙素缺乏症的组合物；(3)制备改善雄激素缺乏的骨微结构的组合物；(4)制备改善雄激素缺乏的生物力学的组合物；(5)制备改善雄激素缺乏的平衡运动能力的组合物；(6)制备改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化的组合物；(7)制备减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成的组合物；(8)制备改善雄激素缺乏的脂质代谢的组合物；(9)制备改善雄激素缺乏的糖代谢的组合物；(10)制备升高骨组织中的GPRC6A表达的组合物；(11)制备升高骨组织中的p-AMPK/AMPK比率的组合物；和/或(12)制备降低p-mTOR/mTOR比率的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的雄激素包括睾酮。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的睾酮包括血液、血清或血浆中的睾酮；
所述的羧化不全骨钙素包括血液、血清或血浆中的羧化不全骨钙素。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的(3)改善雄激素缺乏导致的骨微结构包括：
(3-1)提高骨小梁体积/组织体积(BV/TV)；
(3-2)提高骨小梁厚度(Tb.Th)；
(3-3)降低骨小梁分离(Tb.Sp)；
(3-4)提高骨密度；
(3-5)提高骨小梁数量；
(3-6)增强骨小梁间连接性；和/或
(3-7)降低骨质流失。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的(4)改善雄激素缺乏的生物力学包括：
(4-1)增加骨的载荷、挠度、断裂能量和/或刚度。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的(5)改善雄激素缺乏的平衡运动能力包括：
(5-1)提高步幅和/或步频率；
(5-2)降低步长变异性和/或步态对称性；
(5-3)防止跌倒；和/或
(5-4)降低骨质疏松症骨折风险。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述(6)改善雄激素缺乏的肌肉的质量变化包括：
(6-1)提高纤维横截面积；
(6-2)改善肌纤维萎缩；
(6-3)提高肌肉中胶原纤维面积；
(6-4)增加肌纤维体积；
(6-5)降低肌肉胶原纤维化和/或脂肪浸润。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述(7)减轻雄激素缺乏的骨质流失和/或增加骨形成包括：
(7-1)降低β-CTX和/或IL-6含量；
(7-2)提高OCN含量；和/或
(7-3)降低B-ALP含量。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述(8)改善雄激素缺乏的脂质代谢包括：
(8-1)降低甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白和/或脂肪酸含量；和/或
(8-1)升高高密度脂蛋白。
10.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述(9)改善雄激素缺乏的糖代谢包括：
(9-1)降低胰岛素含量；
(9-2)升高胰岛素样生长因子-1含量；和/或
(9-3)降低血糖水平。
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