CN101874111B - 利用内源性乳糜微粒递送用于抑制靶基因表达的核酸的体系 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种可更安全有效地体内递送诸如用于体内抑制靶基因表达的siRNA的核酸的体系，并提供利用该体系的一种表达抑制剂和一种药物组合物。通过在诱导体内产生乳糜微粒的条件下进行所述核酸的给药，可将导入乳糜微粒的物质、特别是α-生育酚结合的用于抑制靶基因表达的核酸更安全有效地体内递送至肝细胞。供选择地，将α-生育酚结合的核酸与提取的乳糜微粒相混合，然后对它们进行给药。结果，靶基因的表达受到抑制，由此由所述靶基因的表达增加所导致的疾病可得到更安全有效的治疗。

Description

利用内源性乳糜微粒递送用于抑制靶基因表达的核酸的体系
技术领域
本发明涉及一种用于体内递送诸如用于抑制靶基因表达的siRNA的核酸的体系，并涉及利用该体系的一种表达抑制剂和一种药物组合物。
背景技术
能够抑制特定基因表达的siRNA广泛用作研究工具。siRNA还因为用于许多种疾病包括肿瘤、感染性疾病以及遗传性疾病的治疗剂而受到关注。在siRNA的临床用途中，最关键的问题在于应该将siRNA特异地和有效地体内递送至靶细胞的这一事实。例如，已知一种递送方法，该方法中利用病毒载体通过高压和高体积静脉注射合成的siRNA的方式来体内递送siRNA。然而，该方法使用病毒载体，从安全等角度来讲该方法的临床用途受到限制。因此，已经开发了可将siRNA体内递送至肝脏、肿瘤或其他组织的多种非病毒体系。
近来开发的非病毒递送体系的实例包括使用下述物质的那些：胆固醇-siRNA复合物(非专利文献1)；稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)(非专利文献2)；干扰性纳米颗粒(iNOP)(非专利文献3)等。在这些非病毒递送体系中，SNALP带来了很大的改进，因为使用SNALP注射临床合适量的siRNA使得能够敲除肝脏中的靶mRNA。然而，治疗量(2.5mg/kg)的SNALP对食蟹猴的肝脏造成严重损害，在给药后48小时其转氨酶水平(ALT和AST)超过了1000U/L。另外，SNALP和iNOP的严重缺点是这些递送体系仅能通过利用可导致毒性的颗粒的亲脂性质而将siRNA复合物被动地递送至肝脏。
近来，已经报道了新型的非病毒递送体系，包括可经受体递送siRNA的siRNA载体(RVG-9R)(非专利文献4)和“Dynamic PolyConjugateTR”(Mirus)(非专利文献5)。上述的RVG-9R是从添加了9个精氨酸残基的狂犬病毒的糖蛋白衍生的短肽。通过利用该RVG-9R，可经乙酰胆碱受体将siRNA递送至神经细胞。同时，Dynamic PolyConjugate含有结合N-乙酰半乳糖胺(NAG)的膜活性形式的聚合物，作为靶向肝细胞的配体。尽管使用诸如RVG-9R和Dynamic PolyConjugate的这些受体介导的递送体系可改进siRNA体内递送至靶细胞的效率和特异性，在这些体系中使用的人工合成的载体分子仍具有可导致严重副作用的有害性质，特别当剂量增加时导致严重副作用。
最近，已经报道了一种递送方法，其包括提取内源性脂蛋白，使得LDL和HDL离体摄取脂蛋白中胆固醇分子结合的siRNA，以及经脂蛋白受体将siRNA导入肝脏(非专利文献6)。与游离胆固醇-siRNA相比，该复合物被肝脏摄取的效率高5至8倍。然而，该复合物的有效性仅达到下述程度：即，使用13mg/kg的siRNA静脉给药，它可抑制肝脏中的靶基因约55％，这远远不够。
在这些情况下，需要一种可有效地和特异性地体内递送siRNA且具有导致副作用的较低危险性的siRNA递送体系。
非专利文献1：Nature 432：173-178，2004；非专利文献2：Nature441：111-114，2006；非专利文献3：ACS Chem Biol.2：237-241，2007；非专利文献4：Nature 448：39-43，2007；非专利文献5：Proc Natl Acad Sci USA.104：12982-12987，2007；非专利文献6：Nature Biotechnology 25：1149-1157，2007。
发明内容
技术问题
本发明的目的是提供一种可更安全有效地体内递送诸如用于体内抑制靶基因表达的siRNA的核酸的体系，并提供利用该体系的一种表达抑制剂和一种药物组合物。
技术方案
本发明人在体内诱导产生内源性乳糜微粒的条件下施用维生素E结合的siRNA，并成功地更为安全有效地体内递送siRNA。结果，本发明人发现靶基因表达可非常有效地受到抑制，并因此完成了本发明。
更具体地，本发明涉及一种用于抑制靶基因表达的制剂，其包含用于抑制靶基因表达的核酸，其中，导入乳糜微粒或乳糜微粒残余物的物质与所述核酸相结合，并且其中，(1)在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将所述制剂给药至所述脊椎动物；(2)根据(1)所述的制剂，其中，所述条件是将脂质给药至脊椎动物之后12小时内的条件；(3)根据(2)所述的制剂，其中，以口服摄入的形式进行脂质的给药；(4)根据(1)所述的制剂，其中，在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒之前将LPL抑制剂给药至所述脊椎动物；(5)根据(1)所述的制剂，其中，在将核酸给药至脊椎动物之前将LPL和/或肝素给药至所述脊椎动物；(6)根据(1)所述的制剂，其中，在脂质给药之前使得脊椎动物处于饥饿状态；(7)根据(1)所述的制剂，其中，将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至脊椎动物，所述核酸与从脊椎动物获得的浓缩的乳糜微粒相混合；(8)根据(1)所述的制剂，其中，所述物质是亲脂维生素或胆固醇；(9)根据(8)所述的制剂，其中，所述亲脂维生素是维生素E；(10)根据(1)所述的制剂，其中，所述核酸是选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适体、核酶以及诱饵(decoy)的一种或多种核酸；(11)根据(10)所述的制剂，其中，所述核酸是siRNA；(12)根据(1)所述的制剂，其中，所述核酸是经受抗RNA酶处理的RNA；(13)根据(12)所述的制剂，其中，所述抗RNA酶处理是2′-O-甲基化处理和/或硫代磷酸化处理。
(14)本发明还涉及一种包含根据(1)所述的制剂作为活性成分的药物组合物。
(15)本发明还涉及一种用于体内递送用于抑制靶基因表达的核酸的方法，其包括在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒或乳糜微粒残余物的条件下将所述核酸给药至所述脊椎动物，其中，导入乳糜微粒的物质与所述核酸相结合。
(16)本发明还涉及一种用于治疗通过抑制靶基因表达而缓解的疾病的方法，其包括在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒或乳糜微粒残余物的条件下将用于抑制靶基因表达的核酸给药至所述脊椎动物，其中，导入乳糜微粒的物质与所述核酸相结合；(17)根据(15)或(16)所述的方法，其中，所述条件是将脂质给药至脊椎动物之后12小时内的条件；(18)根据(17)所述的方法，其中，以口服摄入形式进行所述脂质的给药；(19)根据(15)或(16)所述的方法，其包括在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒之前将LPL抑制剂给药至所述脊椎动物；(20)根据(15)或(16)所述的方法，其包括在将核酸给药至脊椎动物之前将LPL和/或肝素给药至所述脊椎动物；(21)根据(15)或(16)所述的方法，其包括在脂质给药之前使得脊椎动物处于饥饿状态；(22)根据(15)或(16)所述的方法，其包括将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至脊椎动物，所述核酸与从脊椎动物获得的浓缩的乳糜微粒相混合；(23)根据(22)所述的方法，其包括在将核酸给药至脊椎动物之前将LPL和/或肝素给药至所述脊椎动物；(24)根据(15)或(16)所述的方法，其中，所述物质是亲脂维生素或胆固醇；(25)根据(24)所述的方法，其中，所述亲脂维生素是维生素E；(26)根据(15)或(16)所述的方法，其中，所述核酸是选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适体、核酶以及诱饵(decoy)的一种或多种核酸；(27)根据(26)所述的方法，其中，所述核酸是siRNA；(28)根据(15)或(16)所述的方法，其中，所述核酸是经受抗RNA酶处理的RNA。
附图简述
图1，该图显示了体内递送α-生育酚(维生素E)结合的siRNA(Toc-siRNA)的总体概况。
图2，该图显示了在不同类型的组织之间α-生育酚的运输。
图3，该图显示了通过对骨架键进行硫代磷酸化和对核苷酸的核糖进行2′-O-甲基化而被化学修饰的siRNA的稳定性和表达抑制活性。A：该图显示了靶向小鼠apoB mRNA的Toc-siRNA序列和对该序列的化学修饰。B：该图显示了修饰的siRNA在血清中的稳定性。C：该图显示了修饰的siRNA的体外表达抑制效率。
图4：该图显示了α-生育酚(维生素E)结合的siRNA的化学结构。
图5：该图显示了siRNA与脂蛋白的相互作用。
图6：该图显示了静脉注射至小鼠中的Toc-siRNA已经被摄取至肝脏中。A：该图显示了在Cy3标记的Toc-siRNA给药之后对肝脏组织切片的荧光显微镜观察。B：该图显示了被摄取至肝脏中的27/29mer Toc-siRNA被切丁酶(dicer)剪切而产生21mer siRNA。
图7，该图显示了小鼠肝脏中经Toc-siRNA的apoB mRNA表达抑制的效率具有基因特异性和剂量依赖性。同时，图7中的数据均基于n＝3、均值+/-标准差(SE)显示。A：该图显示了靶向apoB基因的Toc-siRNA以apoB基因特异性的方式减少mRNA表达。B：该图显示了通过Toc-siRNA给药，apoB基因表达的暂时变化。C：该图显示了Toc-siRNA具有剂量依赖性的表达抑制活性。
图8，该图显示了摄取至Hepa 1-6细胞系中的27/29mer Toc-siRNA/LP被切丁酶剪切而产生21mer siRNA。
图9，该图显示了小鼠肝脏中经Toc-siRNA/LP的apoB mRNA表达抑制作用具有基因特异性和剂量依赖性。同时，图9中的数据均基于n＝3、均值+/-标准差(SE)显示。A：该图显示了肝脏中的apoB mRNA表达由于Toc-siRNA/LP给药而减少。B：该图显示了靶向apoB基因的Toc-siRNA/LP以apoB基因特异性的方式减少mRNA表达。C：该图显示了apoB-siRNA/LP具有剂量依赖性的表达抑制活性。
图10，该图显示了在Toc-siRNA/LP给药之前喂饲的作用。同时，图10中的数据均基于n＝3、均值+/-标准差(SE)显示。
图11，该图显示了在Toc-siRNA/LP给药之后肝脏的病理学分析结果。
图12，该图显示了Toc-siRNA对肝脏apoB mRNA的表达抑制活性，和与其他已知的非病毒载体的比较(然而，HDL载体(Swiss)的数值是从肝脏apoB蛋白量的数据取的)。
实施发明的最佳方式
本发明用于抑制靶基因表达的制剂的特征在于，所述制剂含有导入乳糜微粒的物质所结合的用于抑制靶基因表达的核酸(下文中也称为“导入乳糜微粒的物质结合的核酸”)，并且在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将所述制剂给药至所述脊椎动物。
根据脂蛋白比重而将其分为乳糜微粒、VLDL、LDL以及HDL。肝细胞具有上述脂蛋白的受体。这些受体是：结合乳糜微粒残余物的LRP-1受体，该乳糜微粒残余物为乳糜微粒的代谢物；结合LDL的LDL受体；以及结合HDL的SR-B1受体。各脂蛋白通过受体介导的胞吞作用而被摄取至细胞中。内源性脂质由LDL-LDL受体和HDL-SR-B1受体恒定摄取，而外源性脂质，包括在餐后短时间内被大量吸收的维生素E，主要通过乳糜微粒摄取，被LPL(脂蛋白脂酶)代谢为乳糜微粒残余物，之后由肝细胞经乳糜微粒残余物受体(LDL受体相关蛋白1；LRP-1受体)摄取。肝细胞上的LRP-1受体在餐后移动至细胞表面而变得活化。
这一向肝细胞中摄取的体系用于导入siRNA，该体系受乳糜微粒残余物-LRP-1受体介导，而后者当吸收内源性脂质时在餐后被活化。
在脂质摄入之后诱导产生内源性乳糜微粒的条件下，进行导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药时，导入乳糜微粒的物质结合的核酸的导入乳糜微粒的物质与乳糜微粒等相互作用，以形成导入乳糜微粒的物质结合的核酸和乳糜微粒的复合物。该导入乳糜微粒的物质结合的核酸和乳糜微粒的复合物经LRP-1受体被摄取至细胞中，由此用于抑制靶基因表达的核酸被体内摄取至细胞中，特别是被非常充分地摄取至肝细胞中。另外，由于使用生理学体系，可获得与传统的抑制剂相比显著更为安全的表达抑制剂。同时，图1显示了本发明递送的概况，在该情况中，使用维生素E作为导入乳糜微粒的物质，使用抑制小鼠apoB基因表达的siRNA作为用于抑制靶基因表达的核酸。
上述用于抑制靶基因表达的核酸可为任何天然核苷酸、修饰的天然核苷酸或合成的核苷酸，只要所述核酸具有抑制靶基因表达的活性(下文中也称为“表达抑制活性”)即可。所述核酸可为DNA、RNA或它们的嵌合体形式，而通过具体示例的方式，所述核酸为siRNA、shRNA(短发夹RNA)、反义、寡核苷酸、antagomir、核酸适体、核酶或诱饵(诱饵分子)，其中siRNA可为优选示例。通过具体示例的方式，靶向小鼠apoB基因的siRNA是由SEQID NO：1(GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA)(27mer)构成的有义链和SEQ ID NO：2(UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC)(29mer)构成的反义链构成的siRNA。
另外，优选对上述核酸进行修饰使得它们不容易在体内降解。具体地，当所述核酸为RNA时，优选使所述核酸经受诸如甲基化处理或硫代磷酸化处理的抗RNA酶处理，使得所述核酸不容易被细胞内的RNA酶降解。更优选地，在其2′位对核酸核糖进行甲基化，或对核酸的骨架结合进行硫代磷酸化。经受甲基化或硫代磷酸化的核苷酸的数量和位置可轻度影响核酸的表达抑制活性，因此，对经受甲基化或硫代磷酸化的核苷酸的数量、位置等具有优选的模式。该优选的模式可根据待修饰的核酸序列而不同，因此不能明确阐明，而所述优选的模式可通过证实被修饰核酸的表达抑制活性而容易地发现。例如，通过示例的方式，由上述SEQ ID NO：1和2构成的siRNA的抗RNA酶处理的优选模式包括：对有义链(SEQ ID NO：1)的核苷酸编号2、5、11、15、21、24以及25的核苷酸和反义链(SEQ ID NO：2)的核苷酸编号1、2、5、12、14、21、24、25以及26的核苷酸在其核糖的2′位进行甲基化；对有义链(SEQ ID NO：1)的核苷酸编号26的核苷酸的骨架结合进行硫代磷酸化；以及对反义链(SEQ ID NO：2)的核苷酸编号3、4、6、27以及28的核苷酸在其核糖的2′位进行进一步的甲基化以及它们骨架结合的硫代磷酸化。
上述术语核酸的“抑制靶基因表达的活性”意思是当将核酸导入细胞时，与无该导入的情况相比减少靶基因的细胞内表达的活性。所减少的靶基因的细胞内表达可通过对靶基因mRNA或由该靶基因编码的蛋白质进行定量而检测。通过对于本发明中使用的核酸对靶基因表达的抑制水平进行示例的方式，当以2mg/kg将所述核酸导入给定细胞时，与无该导入的情况相比，在mRNA水平或在蛋白质水平，靶基因细胞内表达为80％或更少，更优选60％或更少，甚至更优选40％或更少，还更优选20％或更少。
当上述核酸是siRNA时，有义链和/或反义链的核苷酸的数量可为21，而优选地所述数量为大于21，由于细胞内切丁酶在上述导入乳糜微粒的具有siRNA部分的物质与siRNA(21个核苷酸)之间剪切，由此具有21个核苷酸的siRNA可有效行使其表达抑制作用。
上述用于抑制靶基因表达的核酸可基于靶基因序列或转录因子可结合的靶基因序列的部分的信息通过已知方法来设计。例如，当所述核酸是siRNA时，可以使用日本专利特许公开申请No.2005-168485中描述的方法来设计用于抑制靶基因表达的核酸；当所述核酸是核酸适体时，可使用Nature，1990，346(6287)：818-22中描述的方法；当所述核酸是核酶时，可使用FEBS Lett，1988，239，285；Tanpakushitsu-kakusan-kouso(蛋白-核酸酶)，1990，35，2191；以及Nucl Acids Res，1989，17，7059中描述的方法。另外，可分别基于靶基因序列和转录因子可结合的靶基因序列部分的信息容易地设计反义寡核苷酸、antagomir或诱饵。
可使用已知方法等来制备上述核酸。例如，反义寡核苷酸或核酶可通过下述方法制备：基于靶基因的cDNA序列或基因组DNA序列确定mRNA或早期转录产物的靶序列，使用可商购获得的DNA/RNA自动合成仪(AppliedBiosystems、Beckman等)合成与靶序列互补的序列。另外，诱饵或siRNA可通过下述方法制备：使用DNA/RNA自动合成仪分别合成有义链和反义链，在约90℃至约95℃在合适的退火缓冲液中对链进行变性约1分钟，然后在约30℃至约70℃退火约1至约8小时等。另外，可通过日本专利特许公开申请No.2007-014292中描述的方法来制备核酸适体。
上述导入乳糜微粒的物质并非特别受到限制，只要该物质可被摄取至诸如乳糜微粒的脂蛋白中即可，优选的导入物质为：脂溶性物质，例如烃、高级醇、高级醇酯、高级脂肪酸、高级脂肪酸酯、固醇(特别是胆固醇)以及固醇酯；肽，例如可透过细胞的肽载脂蛋白共轭物；脂质样分子，例如将丙烯酸烷基酯或烷基-丙烯酰胺添加至伯胺或仲胺。在这些物质中，脂溶性维生素，为不能在体外合成的外源性脂质，是更为优选的，而维生素E因为比较安全为特别优选。
作为上述维生素E、由下列通式(1)表示的生育酚或由下列通式(2)表示的生育三烯酚或含有两种或多种这些化合物的混合物可优选示例如下：
化学式1
Figure GPA00001141181500081
化学式2
(其中，R1和R2表示氢原子或甲基，R3表示氢原子或羧酸残基)。在这些物质中，特别优选的是：α-生育酚(在通式(1)中，R1＝甲基，R2＝甲基，R3＝氢原子)；β-生育酚(在通式(1)中，R1＝甲基，R2＝氢原子，R3＝氢原子)；γ-生育酚(在通式(1)中，R1＝氢原子，R2＝甲基，R3＝氢原子)；δ-生育酚(在通式(1)中，R1＝氢原子，R2＝氢原子，R3＝氢原子)；α-生育三烯酚(在通式(2)中，R1＝甲基，R2＝甲基，R3＝氢原子)；β-生育三烯酚(在通式(2)中，R1＝甲基，R2＝氢原子，R3＝氢原子)；γ-生育三烯酚(在通式(2)中，R1＝氢原子，R2＝甲基，R3＝氢原子)；δ-生育三烯酚(在通式(2)中，R1＝氢原子，R2＝氢原子，R3＝氢原子)；以及上述化合物的醋酸酯以及琥珀酸酯。在上述物质中，α-生育酚和γ-生育酚为特别优选的。另外，同样可使用维生素E的d、l以及dl形式中的任何一种。
同时，可以使用上述导入乳糜微粒的物质中的两种或多种的组合。另外，导入乳糜微粒的物质可为天然物质或合成物质。
在上述导入乳糜微粒的物质和核酸之间的键可为直接键或通过介于它们之间的另一种物质形成的间接键。优选地，所述键由诸如共价键、离子键或氢键的化学键直接形成，其中共价键提供了更稳定的键并因此可为特别优选的示例。
使导入乳糜微粒的物质和核酸结合的方法并非特别受到限制。例如，当导入乳糜微粒的物质和核酸共价结合时，优选根据Tetrahedron Letters 33；2729-2732，1992中所描述的方法来形成共价键，当利用离子键或氢键时，优选使得具有正电荷的精氨酸残基结合导入乳糜微粒的物质并利用该精氨酸残基的正电荷和诸如siRNA的核酸的负电荷之间的离子键或氢键来形成键。同时，从获得与核酸的更稳定结合的角度来讲，结合导入乳糜微粒的物质的精氨酸残基的数量优选为至少两个、更优选至少三个以及甚至更优选至少四个。
除了上述基本组分以外，按照需要可将本发明的表达抑制剂与不影响本发明效果的质量和定量范围内的用于医学产品的组分一起配制，例如，脂蛋白、水、油溶液、蜡、硅酮、表面活性剂、醇、多元醇、水溶性高分子增稠剂、pH调节剂、风味剂、抗氧化剂、螯合剂、染料、防腐剂以及其他医学组分以及无机或有机组分。
可根据常用方法使用上述基本组分和按照需要的任选组分将本发明的表达抑制剂配制成多种剂型，包括：固体制剂，例如粉剂、粒剂、片剂以及胶囊；液体制剂，例如糖浆剂、乳剂以及注射剂(包括皮下注射剂、静脉注射剂、肌肉注射剂以及输液剂)；缓释制剂，例如舌下片剂、口腔含化剂、锭剂以及微胶囊；口内快速崩解剂；以及栓剂，其中注射剂可为优选示例。
在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将本发明的表达抑制剂给药至所述脊椎动物，目的是改进导入乳糜微粒的物质结合的核酸摄取至细胞中的效率，并由此增加靶基因表达的抑制效率。诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件并非受到限制，只要可达到上述目的即可，而优选的条件是在脂质口服给药至脊椎动物之后的12小时内(例如，10小时内、8小时内、6小时内、4小时内、2小时内以及1小时内)。脂质可作为脂质自身或以含脂餐的形式口服给药。优选地，在诱导内源性乳糜微粒之前使得给药的受治疗者处于饥饿状态。对于脂质给药和另外使得给药的受治疗者处于饥饿状态是如何改进了导入乳糜微粒的物质结合的核酸摄取至细胞中的效率，这一详细作用机制尚未被揭示。然而，考虑到已知脂蛋白摄取涉及的肝细胞上的LRP-1受体以较高水平在细胞膜上表达并且由于口服脂质摄入或通过胰岛素活化(Mol Pharmacol.2007Jul 3；17609417)的事实，认为脂质摄入等导致脂蛋白摄取中涉及的受体以较高水平表达并被活化，导致了向肝细胞中导入乳糜微粒增加并由此改进导入乳糜微粒的物质结合的核酸摄取至肝细胞中的效率。
同时，上述术语“饥饿状态”是指持续一定时间段未摄入食物或饮料(除了诸如水的无卡路里的饮料或食物)的状态，包括，例如，给药的受治疗者未被给予任何食物至少6小时、优选至少8小时、更优选至少12小时以及甚至更优选至少24小时的状态。
为了使所给药的乳糜微粒被代谢为将被快速摄取至肝细胞中的乳糜微粒残余物，需要足够的LPL。因此，优选在进行脂质(或含脂质的产品)给药之前进行诸如triton的LPL抑制剂的给药(例如通过静脉注射)，以增加乳糜微粒的浓度。另外，LPL作用于肝细胞并导致它们摄取维生素E。随着肝素给药，内皮细胞表面上结合硫酸乙酰肝素的LPL可游离至血液中。因此，优选在进行核酸给药前将LPL和/或肝素给药至脊椎动物。
另外，可通过与富含乳糜微粒的脂蛋白离体混合而进行本发明表达抑制剂的给药。脂蛋白并非特别受到限制，只要脂蛋白含有脂质和载脂蛋白，并且可通过任何脂蛋白受体被摄取至细胞中即可。优选的脂蛋白含有胆固醇、甘油三酯、磷脂以及载脂蛋白。脂蛋白可自活体、重组体采集或化学合成，而从实现较高水平的安全性的角度来讲优选源于活体的脂蛋白。另外，从进一步减少由于免疫变态反应导致的副作用的角度来讲，更优选地，从作为给药的受治疗者本身的个体或从与表达抑制剂给药的受治疗者相同的物种的个体采集脂蛋白。
通过具体和优选的示例的方式，上述源于活体的脂蛋白为：在肠粘膜上由体内吸收的脂质和载脂蛋白形成的乳糜微粒；或由血管内皮脂蛋白脂酶降解乳糜微粒产生的乳糜微粒残余物。在这些物质中，乳糜微粒为优选示例。上述的载脂蛋白并非特别受到限制，通过优选的示例的方式，所述载脂蛋白为apoB蛋白或apoE蛋白。
用于本发明的含有乳糜微粒的脂蛋白可从活体采集，从合成获得的物质制备，或是它们的混合物。对于从活体采集脂蛋白的方法，可在脂质摄入之后几小时采集血液，而通过优选的示例方式，静脉注射0.08至0.4g/kg的Triton，之后将5至25ml/kg的高蛋白/脂质溶液(10mg/ml的白蛋白，40mg/ml的三油酸甘油酯，以及40mg/ml的牛磺胆酸钠)口服给药至活体，然后在3至12小时之后采集血液。另外，通过优选的示例的方式，从活体制备上述富含乳糜微粒的脂蛋白的方法为例如下述方法：其中，向从脂质摄入之后几小时的活体采集的血清中以与血清相同的体积添加一种溶液(一种每1升水含有11.4g的NaCl、0.1g的EDTA和1ml的1N NaOH的溶液，比重1.006)，并且对溶液进行离心，以提供从中收集上清液的混悬液。
另外，本发明的表达抑制剂可根据上述制剂的类型口服或肠外给药，而从更快速和有效实现表达抑制作用的角度来讲，表达抑制剂优选肠外给药，更优选通过注射给药，甚至更优选通过静脉注射给药。
本发明的表达抑制剂的应用剂量根据给药的受治疗者的年龄、体重、症状、影响给药的受治疗者的疾病的类型以及表达抑制剂中含有的siRNA等的序列而不同。通常，可通过将给药量分为每天1至3次分别给药来进行0.1至30mg/kg(siRNA重量基础)的给药。
本发明的表达抑制剂的靶疾病并非特别受到限制，只要特定基因的抑制可导致疾病的治疗即可。上述疾病由特定的病理靶基因的表达导致，通过特别优选的示例的方式，所述疾病为由肝炎病毒基因表达升高而导致的病毒性肝炎或由转甲状腺素蛋白基因变异体表达而导致的家族性淀粉样神经病。
本发明中给药的受治疗者并非特别受到限制，只要受治疗者是动物即可。通过优选的示例的方式，给药的受治疗者为脊椎动物，而属于哺乳动物或鸟类的动物为更优选示例，其中，人类、大鼠、小鼠、猪、家兔、狗、猫、猴、马、牛、山羊以及绵羊可甚至为更优选示例，人类为特别优选示例。
另外，本发明的表达抑制剂可用作本发明的药物组合物的活性成分。本发明的药物组合物的特征在于，其含有本发明的表达抑制剂作为活性成分。
在本发明中，用于递送核酸至细胞中的方法(下文中也称为本发明的递送方法)的特征在于，所述方法包括步骤(C)：在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的用于抑制靶基因表达的核酸给药至所述脊椎动物。当在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至所述脊椎动物时，导入乳糜微粒的物质结合的核酸的导入乳糜微粒的物质与脂蛋白相互作用而形成导入乳糜微粒的物质结合的核酸和脂蛋白的复合物。该导入乳糜微粒的物质结合的核酸与脂蛋白的复合物经脂蛋白受体而被摄取至细胞中，因此使得能够非常有效地体内细胞内递送用于抑制靶基因表达的核酸。与传统方法相比，甚至与体内传统方法相比，本发明的递送方法的使用还使得能够更安全地递送核酸。本发明递送方法中的术语“导入乳糜微粒的物质结合的用于抑制靶基因表达的核酸”和“脂蛋白”具有如上所述的含义。
在本发明的递送方法中，在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至所述脊椎动物的方法并非特别受到限制，可通过与本发明的表达抑制剂相同的方法进行核酸的给药。
可通过本发明的递送方法递送导入乳糜微粒的物质结合的核酸的组织并非特别受到限制，导入乳糜微粒的物质结合的核酸可体内递送至任何组织，例如肝、脑、外周神经、肺、肠道、胰腺、肾、心肌以及骨骼肌。
图2显示了α-生育酚在体内运输的图解，显示了脂溶性物质结合的核酸可通过本发明的递送方法体内递送至各组织。
如图2所示，食物或饮料中含有的α-生育酚被小肠吸收，并且进一步主要被摄取至乳糜微粒(一种脂蛋白)中。该乳糜微粒被脂蛋白脂酶(LPL)代谢为乳糜微粒残余物，并由该乳糜微粒残余物运输至肝脏。在肝细胞质中，α-生育酚被α-TTP(α-生育酚转运蛋白)摄取至VLDL(极低密度脂蛋白)中。之后，含有α-生育酚的VLDL被分泌至血液中并代谢为LDL(低密度脂蛋白)或HDL(高密度脂蛋白胆固醇)而形成含有α-生育酚的LDL或HDL。这些LDL和HDL被血液运输至各组织，使得α-生育酚通过由存在于各组织上的脂蛋白受体(例如，LRP-1受体、LDL受体、HDL受体等)介导的受体介导胞吞作用而被有效摄取至多种组织中。顺便提一句，甚至当除了α-生育酚以外的物质用作本发明的导入乳糜微粒的物质时，本发明的导入乳糜微粒的物质结合的核酸与脂蛋白一起通过由脂蛋白受体介导的胞吞作用而被摄取至各组织的细胞中。
本发明的递送方法并非特别受到限制，只要该方法包括上述步骤(C)即可，而从提高核酸递送效率以实现靶基因表达的抑制效率提高的角度来讲，优选地，在诱导产生内源性乳糜微粒的条件下将核酸给药至脊椎动物之前，该方法包括将肝素和/或LPL给药至给药的受治疗者(步骤(B))；以及在步骤(C)之前，该方法还包括使得脊椎动物处于饥饿状态(步骤(A))。上述术语“饥饿状态”是指其中持续一定时间段未摄入食物或饮料的状态(除了诸如水的无卡路里的食物或饮料)。上述饥饿状态包括其中给药的受治疗者未被给予食物例如至少6小时、优选至少8小时、更优选至少12小时以及甚至更优选至少24小时的状态。
用于治疗本发明的疾病的方法(下文中也称为本发明的治疗方法)的特征在于，所述方法包括步骤(C)：在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的用于抑制靶基因表达的核酸给药至所述脊椎动物。当如上所述在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至所述脊椎动物时，脂溶性物质结合的核酸被非常有效地体内摄取至细胞中，由此以与传统方法相比更安全的方式充分表现了抑制靶基因表达的作用。因此，获得了针对疾病的优越的治疗作用。在本发明的治疗方法中，术语“导入乳糜微粒的物质结合的用于抑制靶基因表达的核酸”和“富含乳糜微粒的脂蛋白”具有如上所述的含义。
在本发明的治疗方法中，在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒的条件下将导入乳糜微粒的物质结合的核酸给药至所述脊椎动物的方法并非特别受到限制，可通过与本发明的表达抑制剂相同的方法对所述核酸进行给药。另外，本发明的治疗方法的靶疾病并非特别受到限制，只要该疾病由给定基因的表达升高导致即可。通过具体的示例的方式，所述疾病与上述本发明表达抑制剂的靶疾病相同。
将参照下述实施例详细描述本发明，而本发明的范围不受这些示例的限制。
实施例
实施例1
细胞培养
以下列方式维持用于下文所述实验中采用的小鼠肝癌细胞系(Hepa 1-6细胞系)。
在37℃和5％(按质量)CO2的条件下，使用添加10％(按质量)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg链霉素的生长培养基(DMEM：Sigma)维持小鼠肝癌细胞系(Hepa 1-6细胞系)。
实施例2
具有高乳糜微粒含量的富含脂蛋白的血清的分离
以下列方式分离和调整用于下文所述实验中采用的具有高乳糜微粒含量的富含脂蛋白的血清。使用0.4g/kg的Triton WR-1339(Nacalai Tesque，Inc.：Kyoto，Japan)对12至14周龄的ICR小鼠(Charles River Laboratories：U.S.A)进行尾部静脉注射。在注射之后10分钟，给上述小鼠口服施用含有5mg牛血清白蛋白(Sigma)、20mg三油酸甘油酯(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.：Tokyo，Japan)以及20mg牛磺胆酸钠(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.：Tokyo，Japan)的0.5ml富含蛋白质的流体食物。向从口服施用富含蛋白质的流体食物后3至12小时的小鼠采集的血清中添加与血清相同体积的一种溶液(每1升水中含有11.4g的NaCl、0.1g的EDTA、1ml的1N NaOH的溶液，比重1.006)，然后在16℃的条件下26,000g离心30分钟。将所得混悬液的上1/6收集为富含脂蛋白的血清。使用甘油三酯E-TST试剂盒(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.：Tokyo，Japan)测量该富含脂蛋白的血清中的甘油三酯，并根据需要调整使用量。
实施例3
使用Toc-siRNA等给药的小鼠的肝脏的分离
以下述方式制备用于下文所述实验的Toc-siRNA等给药的小鼠的肝脏。
首先，提供4周龄的ICR小鼠(Charles River Laboratories：U.S.A)。在进行Toc-siRNA等给药之前对上述小鼠禁食24小时。然后，使用0.08-0.2g/kg的Triton对小鼠进行尾部静脉注射。接着，给上述小鼠口服施用含有250μg牛血清白蛋白(Sigma)和1mg三油酸甘油酯(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.：Tokyo，Japan)的0.5ml富含蛋白质的流体食物。在施用富含蛋白质的流体食物10分钟至10小时，对小鼠尾部单次静脉给予0.25ml含Toc-siRNA等的10％(按质量)麦芽糖溶液。在进行Toc-siRNA给药之前的10分钟，给小鼠尾部静脉注射8至10个单位的肝素。然后，根据需要通过60mg/kg戊巴比妥的腹膜内给药对小鼠进行麻醉，通过经心脏输注PBS溶液处死，并取出肝脏。
实施例4
定量RT-PCR
除非另有说明，以下列方式实施下文所述实验中进行的定量RT-PCR。
使用Isogen(Nippon Gene Co.，Ltd.：Tokyo)从小鼠的培养细胞或组织提取总RNA。按照附属方案的指导，通过使用Superscript III和随机六聚体(Invitrogen)逆转录上述RNA而获得与该RNA互补的DNA。按照附属方案的指导，使用0.5μl上述互补的DNA、预定引物以及TaqMan Universal PCRMaster Mix(Applied Biosystems)进行定量RT-PCR。在上述定量RT-PCR中，使用ABI PRISM 7700序列检测仪(Applied Biosystems)通过重复40个如下的循环进行扩增：各循环由在95℃变性15秒和在60℃退火60秒组成。同时，用作上述预定引物的用于小鼠apoB基因的引物、用于GAPDH基因的引物以及用于TTR(转甲状腺素蛋白)基因的引物由Applied Biosystems设计。
实施例5
Northern印迹分析
除非另有说明，以下列方式实施下文所述实验中进行的Northern印迹分析。
使用MirVana(Ambion，Inc.：Austin，Texas，U.S.A)从Hepa 1-6细胞系或小鼠肝脏提取总RNA。使用Ethachinmete(Nippon Gene Co.，Ltd.：Tokyo，Japan)浓缩提取的RNA。使用14％(按质量)的聚丙稀酰胺凝胶(含尿素)从获得的RNA电泳分离2μg，然后转移至Hybond-N+膜(AmershamBiosciences，Inc.：Piscataway，New Jersey，U.S.A)上。
同时，提供了使用基因图像3′-寡核苷酸标记试剂盒(AmershamBiosciences，Inc.)荧光标记的siRNA反义链作为Northern印迹的探针。
使用上述转移膜和探针等，根据常用方法进行Northern印迹分析。使用基因图像CDP-星检测试剂盒(Amersham Biosciences，Inc.)显现来自上述荧光标记的信号。
实施例6
siRNA合成
基于小鼠apoB基因序列，设计靶向小鼠apoB基因的siRNA。该siRNA的有义链(27mer)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1(GUCAUCACACUGAAUACCAAUGCUGGA)，其反义链(29mer)的核苷酸序列示于SEQ ID NO：2(UCCAGCAUUGGUAUUCAGUGUGAUGACAC)。根据常用方法合成所述有义链和反义链的这些核苷酸序列。
接下来，将这些核苷酸序列进行修饰以对体内RNA酶具有改进的稳定性。更具体地，使siRNA有义链(SEQ ID NO：1)的核苷酸编号2、5、11、15、21、24以及25的核苷酸和反义链(SEQ ID NO：2)的核苷酸编号1、2、5、12、14、21、24、25以及26的核苷酸经受′-O-核糖甲基化；使有义链(SEQ ID NO：1)的核苷酸编号26的核苷酸的骨架键经受硫代磷酸化；并且进一步，使反义链(SEQ ID NO：2)的核苷酸编号3、4、6、27以及28的核苷酸经受2′-核糖甲基化和其骨架键的硫代磷酸化。
接下来，根据文献(Tetrahedron Letters 33；2729-2732.1992)中描述的方法，使α-生育酚(Tokyo Chemical Industry Co.，Ltd.：Tokyo，Japan)与siRNA反义链的5′末端结合(图4)。
在无RNA酶的蒸馏水(DW)中于95℃对上述α-生育酚结合的反义链核苷酸序列和有义链核苷酸序列进行退火1分钟，然后在37℃孵育1小时，由此获得用于本研究的α-生育酚结合的siRNA(下文也称为“Toc-siRNA”)。同时，该siRNA具有如上所述长度不同的有义链核苷酸序列和反义链核苷酸序列，并且在反义链的3′末端产生了2mer核苷酸的悬突(图3A)。
实施例7
siRNA稳定性检测
为了测试上文实施例6中的化学修饰对siRNA稳定性的作用，进行了下列实验。
首先，制备上文实施例6中靶向小鼠apoB基因并经化学修饰的siRNA(下文中也称为“修饰的siRNA”)(2μg)。在蒸馏水(DW)中或在根据实施例2中描述的方法制备的上述富含脂蛋白的血清中于37℃孵育该siRNA 24小时。分别从每个获得的溶液中取给定量，使用蛋白酶K处理1小时，并使用2％(按质量)琼脂糖凝胶使其经受电泳。
另外，代替上述修饰的siRNA，以相同方式将除了未被修饰之外与上述siRNA相同的siRNA(下文中也称为“未修饰的siRNA”)(2μg)用于进行电泳。
电泳结果示于图3B。从图3B可看出，在血清中，修饰的siRNA显示了与未修饰的siRNA(裸siRNA)相比显著改进的稳定性。这证明了修饰的siRNA与未修饰的siRNA相比对于血清中含有的RNA酶更稳定。
实施例8
siRNA的体外活性检测
siRNA的化学修饰有时损害siRNA的表达抑制活性(沉默活性)。为了测试上述修饰的siRNA的体外表达抑制活性，进行了下列实验。
首先，制备上述靶向小鼠apoB基因的修饰的siRNA(2μg)。接下来，使用Lipofect Amine RNAiMAX(Invitrogen)以10nM上述修饰的siRNA转染Hepa 1-6细胞系。在转染之后，培养转染的细胞系24小时。从所得细胞系提取总RNA，并通过上文实施例4中描述的定量RT-PCR检测内源性apoBmRNA的量。
另外，通过使用未修饰的siRNA或非靶向的基因的siRNA(对照siRNA)代替上述修饰的siRNA，以相同方式进行定量RT-PCR。
结果示于图3C。从图3C可看出，修饰的siRNA表现了与未修饰的siRNA(裸siRNA)具有可比性的表达抑制活性。
实施例9
Toc-siRNA和脂蛋白的相互作用
为了测试Toc-siRNA是否被摄取至具有高乳糜微粒含量的富含脂蛋白(LP)的血清中，进行了下列实验。
首先，将45μl的0.4μg/ml Toc-siRNA的水溶液与含有2.7mg根据上文实施例2中所描述的方法制备的甘油三酯的135μl富含脂蛋白的血清一起孵育1小时，以制备含有α-生育酚结合的siRNA的脂蛋白(Toc-siRNA/LP)溶液。使用阻断具有等于或大于100,000分子量的物质的离心过滤装置Micron YM-100(Millipore)过滤该Toc-siRNA/LP溶液。使用2％(按质量)琼脂糖凝胶使通过过滤获得的溶液经受电泳，并使用溴化乙锭对RNA进行染色。
另外，代替上述“Toc-siRNA/LP溶液”，将其缺乏α-生育酚键形式的“siRNA/LP溶液”、其缺乏脂蛋白形式的“Toc-siRNA溶液”以及其缺乏α-生育酚键和缺乏脂蛋白形式的“siRNA溶液”用于进行相同的操作。
另外，对各种上述情况，将通过洗脱过滤后留在过滤器上的级分而获得的溶液代替通过过滤获得的溶液使用，来进行相同的操作。
这些实验的结果示于图5。图5的上列显示了通过洗脱留在过滤器上的级分获得的溶液(离心装置中)的电泳结果，下列显示了通过过滤获得的溶液(过滤的未共轭的siRNA)的电泳结果。从图5中的结果可以看出，仅在siRNA与α-生育酚结合(生育酚共轭+)并与富含脂蛋白的血清(脂蛋白+)一起孵育的情况下，siRNA才被上述过滤器捕获。这表明仅当siRNA与α-生育酚结合(生育酚共轭+)并与富含脂蛋白的血清(脂蛋白+)一起孵育时才产生了siRNA和脂蛋白的相互作用，且因此提示了Toc-siRNA被体内摄取至乳糜微粒等中且转移至各组织并经诸如LRP-1受体的受体被各组织吸收的可能性。
实施例10
Toc-siRNA的体内siRNA递送
为了测试Toc-siRNA是否体内递送其siRNA，进行了下列实验。
首先，根据上文实施例3中描述的方法，将使用Cy3荧光染料标记的Toc-siRNA给药至小鼠。过1小时之后，处死小鼠并取出肝脏。
接下来，于4％(按质量)多聚甲醛/PBS溶液中固定部分肝脏6小时，并浸没于30％蔗糖/PBS溶液中4℃过夜。将固定的肝脏包埋于OCT化合物(Sakura Finetek Japan Co.，Ltd.：Tokyo，Japan)中，通过液氮冷冻，然后使用Leica CM3050Cryostat(Leica：Germany)切成4μm厚度。将冷冻的切片移至Super Frost plus显微镜载玻片(Fisher Scientific：Pittsburg，Pennsylvania，U.S.A)上，使用13nM Alexa-488鬼笔环肽(Invitrogen)/PBS溶液和40nMTopro-3(Invitrogen)/PBS溶液复染20分钟。然后，将切片包封在vector shield(Vector：Burlingame，California，U.S.A)中并使用LSM 510共聚焦扫描显微镜(Zeiss：Germany)观察(图6A)。
图6A是对于肝血窦相邻区的观察结果。通常在血管周围的部分强烈检测到Cy3荧光染料信号(图6A中虚线分开的图像的右部分)，证实了siRNA被导入肝细胞(通过示例，图6A中由三角显示的细胞)和非实质细胞(通过示例，图6A中由箭头显示的细胞)。这证明了Toc-siRNA能够将其siRNA递送至肝脏。
实施例11
有效的体内Toc-siRNA加工
为了测试摄取至肝细胞中的Toc-siRNA是否被加工成siRNA的成熟形式，进行了下列实验。
首先，以上文实施例3中所描述的方法相同的方式，提供Toc-siRNA给药之后1小时的小鼠的肝脏，并根据上文实施例5中所描述的方法进行siRNA的检测(图6B)。从图6B的结果可以看出，除了原始的27/29mersiRNA，还证实了存在加工过的21mer siRNA。这表明Toc-siRNA被摄取至肝细胞中，并然后被存在于细胞质中的切丁酶从27/29mer siRNA剪切为21mer siRNA。
实施例12
关于Toc-siRNA导致的基因沉默的动物试验
为了测试Toc-siRNA减少体内靶基因表达的能力，进行了下列实验。
首先，以上文实施例3中所描述的方法相同的方式，使用Toc-siRNA对小鼠给药，过24小时之后处死，并取出肝脏。接下来，根据上文实施例4中描述的方法，进行定量RT-PCR，检测apoB基因、GAPDH基因以及TTR基因各自的mRNA表达。结果示于图7A。从图7A可以看出，与使用与apoB无关的siRNA(对照Toc-siRNA)的情况或仅溶剂(麦芽糖)的情况相比，在使用靶向小鼠apoB基因的siRNA的Toc-siRNA(apoB-1Toc-siRNA)的情况中，apoB mRNA表达显著降低(n＝3，P＜0.001)。另外，肝脏上表达的其他内源性基因(GAPDH基因，TTR基因)的相对mRNA表达(基于总RNA的相对表达)与进行对照或仅麦芽糖给药的情况相比处于相同范围。上述事实证明了Toc-siRNA(apoB-1Toc-siRNA)仅特异性减少了肝脏中的靶基因表达且不影响非特异性基因表达，即Toc-siRNA不具有脱靶效应。
接下来，使Toc-siRNA给药的小鼠的取样时间交错，并检测时间依赖性变化。结果示于图7B。从图7B可以看出，直至Toc-siRNA给药之后的2天观察到apoB-1Toc-siRNA的apoB基因表达抑制活性的连续性，而到第4天，表达回复到与其他(对照Toc-siRNA，麦芽糖)相同的水平。
另外，通过逐渐改变Toc-siRNA剂量进行相似的实验。结果示于图7C。apoB-1Toc-siRNA对于apoB基因的表达抑制活性具有剂量依赖性。32.0mg/kg的剂量导致至少80％表达抑制的活性。
实施例13
Toc-siRNA相关的副作用的证实试验
根据上文实施例3中所描述的方法，对Toc-siRNA给药的小鼠检测副作用。
具体地，在2mg/kg Toc-siRNA/LP给药之后3天，从小鼠采集血液，检测血液中的白细胞计数(WBC)、血小板计数(Plt)并对蛋白总量(TP)、转氨酶(AST、ALT)以及血尿素氮水平(BUN)进行生物化学分析。
另外，在2mg/kg Toc-siRNA/LP给药之后3小时，检测小鼠中的干扰素(IFN)诱导。首先，将具有12.5pg/ml检测限的ELISA试剂盒(PBLBiochemical Laboratories，Biosource)用于检测血清中的干扰素-α(IFNα)浓度，但未检测到IFNα。另外，使用RT-PCR进行尝试以证实使用2mg/kg的Toc-siRNA给药的小鼠肝脏中干扰素β的表达，但没有检测到。
上述实验的结果示于表1中。上述事实表明Toc-siRNA几乎不导致副作用，Toc-siRNA的基因抑制并非由干扰素反应而导致。
表1：Toc-siRNA或麦芽糖静脉注射之后小鼠血清中IFN-α、BUN、TP、AST、ALT、WBC以及Plt的水平*
Figure GPA00001141181500201
*值代表均值±S.E.(n＝3)
实施例14
含有α生育酚结合的siRNA的脂蛋白的制备
使用10％(按质量)的麦芽糖溶液调整根据上文实施例2中描述的方法提供的具有高乳糜微粒含量的富含脂蛋白的血清，以获得20g/L的甘油三酯浓度。将Toc-siRNA(1μg/μl，根据siRNA的量)与相同体积的富含脂蛋白的血清(20g/L甘油三酯浓度)一起混合。将该混合物在37℃孵育1小时，获得含有α-生育酚结合的siRNA的脂蛋白(下文中也称为“Toc-siRNA/LP”)。
实施例15
有效的Toc-siRNA/LP体外加工
为了测试摄取至细胞中的Toc-siRNA/LP是否被加工成siRNA的成熟形式，进行了下列实验。
首先，给已经在无转染试剂的培养基中培养的Hepa 1-6细胞系添加100nM Toc-siRNA/LP，并然后再培养6小时。
使用该Hepa 1-6细胞系，根据上文实施例5中所描述的方法进行Northern印迹分析。结果示于图8。从图8可以看出，除了原始的27/29mersiRNA，还证实了存在加工过的21mer siRNA。这表明Toc-siRNA/LP可被摄取至Hepa 1-6细胞系的细胞中，且27/29mer siRNA被存在于细胞质中的切丁酶剪切成21mer siRNA。
实施例16
关于Toc-siRNA/LP的siRNA递送和基因沉默的动物试验
为了测试Toc-siRNA/LP体内递送其siRNA的能力或减少体内靶基因表达的能力，进行了下列实验。
首先，根据上文实施例3中所描述的方法，使用Toc-siRNA/LP对小鼠给药，过2天之后处死，并取出肝脏。使用该肝脏，根据上文实施例4中所描述的方法进行定量RT-PCR，并检测apoB基因、GAPDH基因以及TTR基因各自的mRNA表达。结果示于图9。从图9A可以看出，与使用与apoB无关的siRNA的Toc-siRNA/LP(无关的siRNA/LP)的情况或仅使用LP(对照(仅LP))的情况相比，在使用靶向小鼠apoB基因的siRNA的Toc-siRNA/LP(ApoB Toc-siRNA/LP载体)的情况中，apoB mRNA表达显著减少(n＝3，P＜0.001)。另外，图9B的结果显示该表达减少作用具有apoB基因特异性。更具体地，甚至当进行使用靶向apoB基因的siRNA的Toc-siRNA/LP给药时，肝脏上表达的其他内源性基因(GAPDH基因，TTR基因)的相对mRNA表达(基于总RNA的相对表达)与仅进行LP给药的情况相比处于相同范围。
接下来，通过逐渐改变Toc-siRNA/LP的剂量进行相同的实验。结果示于图9C。Toc-siRNA/LP对apoB基因的表达抑制活性(敲除作用)具有剂量依赖性。甚至1.0mg/kg的剂量导致了至少80％表达抑制的活性。
另外，为了测试禁食之后喂饲(施用富含蛋白质的流体食物)对Toc-siRNA/LP的表达抑制作用的影响，在其中于上述实验中不施用富含蛋白质的流体食物的情况检测表达抑制活性。结果示于图10。从图10可以看出，与喂饲(喂饲(+))的情况相比，在未喂饲(喂饲(-))的情况中，表达抑制活性减少31％。这提示Toc-siRNA/LP经肝脏上表达的LRP-1受体而被摄取，该受体通过喂饲而被活化以摄取乳糜微粒残余物。
实施例17
Toc-siRNA/LP相关的副作用的证实试验
如上文实施例13，还对使用Toc-siRNA/LP给药的小鼠的血液进行了生物化学分析等(表2)。
另外，从上文实施例3中描述的方法的Toc-siRNA/LP给药的小鼠取出肝脏。将部分肝脏固定于4％(按质量)多聚甲醛中、包埋于石蜡中，并制备4μm厚的切片。将该切片经受苏木精伊红染色以进行病理分析。另外，作为对照，显示了代替Toc-siRNA/LP仅使用LP给药的小鼠的肝脏切片的苏木精伊红染色结果(图11)。
如上所述，在Toc-siRNA/LP给药的小鼠的血液生物化学分析和肝脏组织病理学分析中均未观察到特别的异常。
另外，如上文实施例13，测试Toc-siRNA/LP给药的小鼠中的干扰素诱导，但没有检测到。
上述事实表明，如上述Toc-siRNA，Toc-siRNA/LP几乎不导致副作用。
表2：血液生物化学分析和细胞计数
  TP(g/dl)   Alb(g/dl)   T-Bil(mg/dl)   BUN(mg/dl)   Cre(mg/dl)   Na(mEq/l)   K(mEq/l)
  Toc-siRNA/LP   5.3±0.2   3.4±0.2   0.05±0.01   28.4±1.5   0.14±0.02   151±4   5.5±0.3
  仅LP   5.1±0.1   3.4±0.1   0.05±0.01   22.7±2.3   0.13±0.01   151±1   4.7±0.4
  AST(U/l)   ALT(U/l)   LDH(U/l)   Alp(U/l)  RBC(×104/μl)   WBC(/μl)  Plt(×104/μl)
  Toc-siRNA/LP   57±5   21±1   278±6   541±58   791±22   6300±600   122±3
  仅LP   48±2   17±1   258±27   467±53   816±13   6600±200   92±13
实施例18
与其他非病毒载体进行比较
与其他已报道的非病毒载体(Nature 432：173-178，2004；Nature441；111-114，2006；ACS Chem Biol 2；237-241，2007；Proc Natl Acad Sci USA104；12982-12987，2007，Nature Biotechnology 25：1149-1157，2007)比较小鼠肝脏中apoB mRNA表达抑制的体内效率。结果示于图12。用于其他已知病毒载体的siRNA与用于本发明的Toc-siRNA或Toc-siRNA/LP的siRNA相同，靶向小鼠apoB mRNA的相同区域(Nature 432：173-178，2004)。另外，使用上文实施例12的图7B中的apoB-1Toc-siRNA的数值(在2.0mg/kg的给药后1天)作为本发明Toc-siRNA数据，使用上文实施例16的图9C中的Toc-siRNA/LP的数值(1.0mg/kg给药后2天)作为本发明Toc-siRNA/LP的数据。
图12的结果表明，与其他siRNA递送体系相比，本发明特别是Toc-siRNA/LP在siRNA的需要量及其表达抑制活性方面非常优越。
工业适用性
根据本发明的递送核酸的方法，可更安全有效地体内递送诸如用于抑制靶基因表达的siRNA的核酸。根据利用本发明递送方法的表达抑制剂和药物组合物，可体内更安全有效抑制导致疾病的特异基因的表达。另外，根据利用本发明递送方法的本发明治疗方法，可更安全有效体内抑制导致疾病的特异基因的表达，并因此可更安全有效地治疗疾病。
序列表
<110>国立大学法人东京医科齿科大学
<120>利用内源性乳糜微粒递送用于抑制靶基因表达的核酸的体系
<130>2008C4739
<150>US 60/990,796
<151>2007-11-28
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>27
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA有义链
<400>1
gucaucacac ugaauaccaa ugcugga                     27
<210>2
<211>29
<212>RNA
<213>人工的
<220>
<223>siRNA反义链
<400>2
uccagcauug guauucagug ugaugacac                   29

Claims (22)

1.一种下列(a)和(b)的复合物：
(a)用于抑制靶基因表达的核酸，其中，导入乳糜微粒或乳糜微粒残余物的物质与所述核酸相结合；
(b)乳糜微粒。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述乳糜微粒是内源性乳糜微粒。
3.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述物质是亲脂维生素或胆固醇。
4.根据权利要求3所述的复合物，其中，所述亲脂维生素是维生素E。
5.根据权利要求1所述的复合物，其中，所述核酸是选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适体、核酶以及诱饵的一种或多种核酸。
6.根据权利要求5所述的复合物，其中，所述核酸是siRNA。
7.根据权利要求6所述的复合物，其中，所述核酸是经受抗RNA酶处理的RNA。
8.根据权利要求7所述的复合物，其中，所述抗RNA酶处理是2′-O-甲基化处理和/或硫代磷酸化处理。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物在制备用于抑制靶基因表达的药物中的用途。
10.一种用于抑制靶基因表达的制剂，其包含作为活性成分用于抑制所述靶基因表达的核酸，其中导入乳糜微粒或乳糜微粒残余物的物质与所述核酸相结合，并且其中：在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒或乳糜微粒残余物的条件下将所述制剂给药至所述脊椎动物。
11.根据权利要求10所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述条件是将脂质给药至所述脊椎动物之后12小时内的条件。
12.根据权利要求11所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，以口服摄入形式进行所述脂质的给药。
13.根据权利要求10所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其包括在诱导脊椎动物中产生内源性乳糜微粒或乳糜微粒残余物之前将LPL抑制剂给药至所述脊椎动物。
14.根据权利要求10所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其包括在将核酸给药至脊椎动物之前将LPL和/或肝素给药至所述脊椎动物。
15.根据权利要求11所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其包括在脂质给药之前使所述脊椎动物处于饥饿状态。
16.根据权利要求10所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其包括将含有从血清中含有高浓度乳糜微粒的脊椎动物获得的浓缩的乳糜微粒的血清与导入乳糜微粒或乳糜微粒残余物的物质所结合的核酸预混合，并且将所述混合物给药至所述脊椎动物。
17.根据权利要求16所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其包括在将核酸给药至脊椎动物之前将LPL和/或肝素给药至所述脊椎动物。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述物质是亲脂维生素或胆固醇。
19.根据权利要求18所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述亲脂维生素是维生素E。
20.根据权利要求10所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述核酸是选自siRNA、shRNA、反义寡核苷酸、antagomir、核酸适体、核酶以及诱饵的一种或多种核酸。
21.根据权利要求20所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述核酸是siRNA。
22.根据权利要求21所述的用于抑制靶基因表达的制剂，其中，所述核酸是经受抗RNA酶处理的RNA。
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