JP2005168485A

JP2005168485A - ｓｉＲＮＡの設計方法

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Publication number: JP2005168485A
Application number: JP2004055924A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Suzuki; 勉鈴木; Takayuki Kato; 敬行加藤
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-11-20
Filing date: 2004-03-01
Publication date: 2005-06-30
Also published as: WO2005049830A1

Abstract

【課題】標的ｍＲＮＡ中の最適なｓｉＲＮＡ配列を設計するための手法を提供すること。
【解決手段】ＲＮＡｉ活性とｓｉＲＮＡの特徴（位置、配列及び塩基組成）との関係を統計的に調べることにより、最適な活性を有するｓｉＲＮＡを設計するための新規な手法を確立した。即ち、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡを標的とする可能な全デザインからなる７０２種類のｓｉＲＮＡを統計的に調べることによりアルゴリズムを開発し、それを用いることにより最適な活性を有するｓｉＲＮＡを設計することを見出した。また、ｓｉＲＮＡ配列の５’末端側及び／または３’末端側に、標的遺伝子の配列との対応を必要としない、二本鎖の１〜５塩基対のエフェクター配列を追加することにより、既存のｓｉＲＮＡの活性を高める。
【選択図】なし

Description

本発明は、ｓｉＲＮＡの設計方法に関する。より詳細には、本発明は、標的遺伝子の発現を効率良く抑制することができる高活性ｓｉＲＮＡを設計する方法に関する。

低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、哺乳動物細胞で配列特異的な転写後の遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている（非特許文献１〜３）。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を用いた配列特異的な遺伝子の一時的な発現抑制は、植物、真菌、昆虫、原生動物及び哺乳動物を含む真核生物における迅速な遺伝子解析のための重要な手段である（非特許文献４〜１０）。哺乳動物細胞では、ｄｓＲＮＡ誘導抗ウイルス経路から免れるｓｉＲＮＡとして知られている２１〜２３ヌクレオチドの短いｄｓＲＮＡを用いることによって、配列特異的な遺伝子の発現抑制が成功している（非特許文献１１及び１２）。ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、ＲＮＡ誘導発現抑制複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれ（非特許文献１３及び１４）、ここでアンチセンスＲＮＡは、同種のｍＲＮＡの認識と切断を誘導する（非特許文献１５及び１６）。しかし、ｓｉＲＮＡの機能の正確な分子機構並びに効率的な活性に必要な配列については、十分には解明されていない。

哺乳動物細胞でｓｉＲＮＡ技術を用いることにより、各種遺伝子の機能が解明されてきた（非特許文献１７〜２０）。ｓｉＲＮＡは医療用としても期待されている。ｓｉＲＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ)、ヒトパピローマウイルス等のウイルス遺伝子の発現を阻害することができる（非特許文献２１〜２８）。しかしながら、ＲＮＡｉ活性はｓｉＲＮＡの標的配列に応じて変化するので、長いｍＲＮＡを標的とした高活性ｓｉＲＮＡを設計することは困難である。現在の所、標的ｍＲＮＡ中の最適なｓｉＲＮＡ配列を見つけるための原則は確立されていない。従って、効率的な活性を有する最適なｓｉＲＮＡをスクリーニングするためには標的の有効性について多数のｓｉＲＮＡを化学的に合成する必要があり、ｓｉＲＮＡ技術は高価で手間のかかる技術であった。

Elbashir, S. M. et al. Nature 411, 494-8. (2001) Elbashir, S. M., et al. Genes Dev 15, 188-200. (2001) Caplen, N. J., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 9742-7. (2001) Hannon, G. J. Nature 418, 244-51. (2002) Fire, A. et al. Nature 391, 806-11. (1998) Fraser, A. G. et al. Nature 408, 325-30. (2000) Gonczy, P. et al. Nature 408, 331-6. (2000) Kamath, R. S. et al. Nature 421, 231-7. (2003) Clemens, J. C. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6499-503. (2000) Chuang, C. F. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 4985-90. (2000) Manche, L., et al. Mol Cell Biol 12, 5238-48. (1992) Minks, M. A., et al. J Biol Chem 254, 10180-3. (1979) Hammond, S. M., et al. Nature 404, 293-6. (2000) Hammond, S. M., et al. Science 293, 1146-50. (2001) Martinez, J., et al. Cell 110, 563-74. (2002) Elbashir, S. M., et al. Embo J 20, 6877-88. (2001) Harborth, J., et al. J Cell Sci 114, 4557-65. (2001) Czauderna, F. et al. Nucleic Acids Res 31, 670-82. (2003) Verma, U. N., et al. Clin Cancer Res 9, 1291-300. (2003) Katome, T. et al. J Biol Chem 278, 28312-23. (2003) Lee, N. S. et al. Nat Biotechnol 20, 500-5. (2002) Novina, C. D. et al. Nat Med 8, 681-6. (2002) Jacque, J. M., et al. Nature 418, 435-8. (2002) Kapadia, S. B., et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2014-8. (2003) Wilson, J. A. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2783-8. (2003) Jiang, M. et al. Oncogene 21, 6041-8. (2002) Ge, Q. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 2718-23. (2003) Gitlin, L., et al. Nature 418, 430-4. (2002)

本発明は上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。即ち、本発明は、標的ｍＲＮＡ中の最適なｓｉＲＮＡ配列を設計するための手法を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、ＲＮＡｉ活性とｓｉＲＮＡの特徴（位置、配列及び塩基組成）との関係を統計的に調べることにより、最適な活性を有するｓｉＲＮＡを設計するための新規な手法を確立した。即ち、本発明者らは、緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)ｍＲＮＡを標的とする可能な全デザインからなる７０２種類のｓｉＲＮＡを統計的に調べることによりアルゴリズムを開発し、それを用いることにより最適な活性を有するｓｉＲＮＡを設計できることを見出した。

即ち、本発明によれば、標的遺伝子中の標的配列の相補配列を有し、標的遺伝子の発現を抑制するために使用されるｓｉＲＮＡを設計する方法において、以下の（１）〜（５）を特徴とする方法が提供される。
（１）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の３番目、４番目、６番目、７番目、１２番目、１３番目、１５番目、１８番目及び１９番目の塩基として、Ａがなるべく多く配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（２）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の１０番目の塩基として、Ｕが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（３）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の１６番目の塩基として、Ａ又はＵが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；及び／又は
（４）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の６番目及び７番目の塩基として、Ｃが配置されないようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する。
（５）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に５’−ＮＮＡＡＮＡＡＮＮＵＮＡＡＮＡＷＮＡＡ−３’（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵを示し、ＷはＡ又はＵを示す）から成る塩基配列を標的遺伝子中から探索して、該塩基配列をｓｉＲＮＡとして使用する方法。なお、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分は１９塩基には限定せず、１９塩基より短い場合と１９塩基よりも長い場合においても、上記の配列の５’と３’端に塩基の短縮あるいは延長を可能とする。

本発明において好ましくは、ＧＣ含量が３０〜５０％の範囲内になるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を設計することができる。本発明においてさらに好ましくは、二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の１番目、２番目、５番目、８番目、１１番目、１４番目及び／または１７番目の塩基がＧ又はＣとなる塩基配列を選択することによりＧＣ含量が３０〜５０％の範囲内になるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を設計することができる。

本発明によればさらに、１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に５’−ＮＮＡＡＮＡＡＮＮＵＮＡＡＮＡＷＮＡＡ−３’（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵを示し、ＷはＡ又はＵを示す）から成る塩基配列を標的遺伝子中から探索して、該塩基配列をｓｉＲＮＡとして使用する方法が提供される。なお、ｓｉＲＮＡの二本鎖部分は１９塩基には限定せず、１９塩基より短い場合と１９塩基よりも長い場合においても、上記の配列の５’と３’端に塩基の短縮あるいは延長を可能とする。延長部分については必ずしも標的遺伝子の配列と対応している必要は無く、ｓｉＲＮＡ配列の５’末端側および３’末端側にそれぞれ１〜５塩基対の長さの二本鎖のエフェクター配列を追加することができる。
好ましくは、ｓｉＲＮＡ配列のセンス鎖５’末端側にＳＳＳ、３’末端側にＳＮＡで示される３塩基対ずつのエフェクター配列（ここで、ＳはＧまたはＣを示し、ＮはＡまたはＵまたはＧまたはＣを示す。）を追加することができる。

本発明によればさらに、以下の工程を含むｓｉＲＮＡ活性を予測する方法が提供される。
（１）マクロ効果値はsiRNAの最適な塩基組成から算出された値であり、以下の式(マクロ効果値１)で与えられる。マクロ効果値とＲＮＡi活性のより高い相関係数を得るためには、Ａの係数(Ｋ_A)＞Ｕの係数(Ｋ_U)＞Ｇの係数(Ｋ_G)＞Ｃの係数(Ｋ_C)を満たす必要がある。最適な塩基組成をＡ：Ｕ：Ｇ：Ｃ=０．４:０．３５:０．１５:０．１とした場合にマクロ効果値は(マクロ効果値２)で与えられる。さらに、ＲＮＡi活性値を０−１００％で規格化した場合には、より実測値に近い(マクロ効果値３)が与えられる。
(マクロ効果値１)＝Ｋ_A×Ｎ_A＋Ｋ_U×Ｎ_U＋Ｋ_G×Ｎ_G＋Ｋ_C×Ｎ_C
(マクロ効果値２)＝０．４×Ｎ_A＋０．３５×Ｎ_U＋０．１５×Ｎ_G＋０．１×Ｎ_C
(マクロ効果値３)＝6.073×Ｎ_A＋5.111×Ｎ_U＋1.265×Ｎ_G＋0.304×Ｎ_C
（式中、Ｋ_Xは最適な塩基組成から算出された係数とする。Ｎ_XはＸ残基の数を示す。）
（２）ミクロ効果値は二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に、各塩基部位と塩基種ごとに、ＲＮＡi活性値−マクロ効果値の差分値に対し、相関係数が最大になるように算出した最適なパラメーターを合計することにより得られる値であり、以下の式で与えられる。
19
(ミクロ効果値)=Σ(P_Xi )
i=1
（Ｐxiは二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にi番目の部位における塩基種Ｘのパラメーターを示す。）
（３）上記工程（１）及び（２）で得られたミクロ効果値とマクロ効果値を加算することによってｓｉＲＮＡの予測値を求める工程。

本発明により、標的ｍＲＮＡ中の最適なｓｉＲＮＡ配列を設計することが可能になった。

本発明は、標的遺伝子中の標的配列の相補配列を有し、標的遺伝子の発現を抑制するために使用されるｓｉＲＮＡを設計する方法に関するものであり、特に以下の（１）〜（４）を特徴とする方法である。
（１）ｓｉＲＮＡの塩基配列の３番目、４番目、６番目、７番目、１２番目、１３番目、１５番目、１８番目及び１９番目の塩基として、Ａがなるべく多く配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（２）ｓｉＲＮＡの塩基配列の１０番目の塩基として、Ｕが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（３）ｓｉＲＮＡの塩基配列の１６番目の塩基として、Ａ又はＵが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；及び／又は
（４）ｓｉＲＮＡの塩基配列の６番目及び７番目の塩基として、Ｃが配置されないようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する。
本発明者らは、ＥＧＦＰｍＲＮＡを標的とする７０２種類のｓｉＲＮＡについて、ＲＮＡｉ活性とｓｉＲＮＡの特徴（位置、配列及び塩基組成）との関係を統計的に調べた結果、上記（１）〜（４）の条件を満たすようにｓｉＲＮＡを設計することにより、標的遺伝子の発現を効率よく抑制することができるｓｉＲＮＡを選択できることを見出した。上記は、ｓｉＲＮＡとして１９塩基の長さのＲＮＡを使用する場合であるが、１９塩基以外の長さのｓｉＲＮＡを設計する場合についても上記と条件に準じて好適なｓｉＲＮＡを設計することができる。なお、「ｓｉＲＮＡの塩基配列の３番目、４番目、６番目、７番目、１２番目、１３番目、１５番目、１８番目及び１９番目の塩基として、Ａがなるべく多く配置される」とは、これら９箇所の塩基の全てがＡとなることが最も好ましいが、必ずしも全ての位置がＡである必要はなく、例えば、これらのうちの少なくとも５箇所以上、好ましくは６箇所以上、より好ましくは７箇所以上、さらに好ましくは８箇所以上がＡとなるように、ｓｉＲＮＡを設計することができる。上記の中でも、特に、ｓｉＲＮＡの塩基配列の６番目、７番目、１３番目及び１９番目の塩基はＡであることが好ましい。

ｓｉＲＮＡの活性は、ＧＣ含量にも依存することが知られているが、本発明で設計するｓｉＲＮＡのＧＣ含量は３０〜５０％の範囲内になることが好ましい。ｓｉＲＮＡのＧＣ含量は、好ましくは、ｓｉＲＮＡの塩基配列の２番目、５番目、８番目、１１番目、１４番目及び／または１７番目の塩基がＧ又はＣとなる塩基配列を選択することにより、ＧＣ含量が３０〜５０％の範囲内になるように調節することができる。ｓｉＲＮＡの塩基配列の1番目、２番目、５番目、８番目、１１番目、１４番目及び／または１７番目の塩基は、ｓｉＲＮＡの活性に及ぼす影響が低いと考えられるので、これらの位置の塩基をＧ又はＣとしても活性の低下は生じにくいと考えられるからである。上記（１）〜（４）の条件を満たす具体的な塩基配列としては、５’−ＮＮＡＡＮＡＡＮＮＵＮＡＡＮＡＷＮＡＡ−３’（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵを示し、ＷはＡ又はＵを示す）（配列番号１）から成る塩基配列が挙げられる。

本発明はさらに、ｓｉＲＮＡ活性を予測する方法に関する。該方法は、以下の工程を含む方法である。
（１）マクロ効果値はsiRNAの最適な塩基組成から算出された値であり、以下の式(マクロ効果値１)で与えられる。マクロ効果値とＲＮＡi活性のより高い相関係数を得るためには、Ａの係数(Ｋ_A)＞Ｕの係数(Ｋ_U)＞Ｇの係数(Ｋ_G)＞Ｃの係数(Ｋ_C)を満たす必要がある。最適な塩基組成をＡ：Ｕ：Ｇ：Ｃ=０．４:０．３５:０．１５:０．１とした場合にマクロ効果値は(マクロ効果値２)で与えられる。さらに、ＲＮＡi活性値を０−１００％で規格化した場合には、より実測値に近い(マクロ効果値３)が与えられる。
(マクロ効果値１)＝Ｋ_A×Ｎ_A＋Ｋ_U×Ｎ_U＋Ｋ_G×Ｎ_G＋Ｋ_C×Ｎ_C
(マクロ効果値２)＝０．４×Ｎ_A＋０．３５×Ｎ_U＋０．１５×Ｎ_G＋０．１×Ｎ_C
(マクロ効果値３)＝6.073×Ｎ_A＋5.111×Ｎ_U＋1.265×Ｎ_G＋0.304×Ｎ_C
（式中、Ｋ_Xは最適な塩基組成から算出された係数とする。Ｎ_XはＸ残基の数を示す。）
（２）ミクロ効果値は二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に、各塩基部位と塩基種ごとに、ＲＮＡi活性値−マクロ効果値の差分値に対し、相関係数が最大になるように算出した最適なパラメーターを合計することにより得られる値であり、以下の式で与えられる。
19
(ミクロ効果値)=Σ(P_Xi )
i=1
（Ｐxiは二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にi番目の部位における塩基種Ｘのパラメーターを示す。）
（３）上記工程（１）及び（２）で得られたミクロ効果値とマクロ効果値を加算することによってｓｉＲＮＡの予測値を求める工程。

具体的には、以下の実施例のＡ．方法、（４）ｓｉＲＮＡ活性の予測値の計算に記載した方法に準じて行うことができる。例えば、上記の工程（１）では、マクロ効果値を求める計算式として、6.073・N_A+5.111・N_U+1.265・N_G +0.304・N_C を使用しているが、各N_Xについての係数（即ち、6.073、5.111、1.265、0.304）は一例を示すものに過ぎず、これに準じた類似の係数を使用することができる。また、上記の工程（２）で用いる各ヌクレオチド位置について最適化したパラメーターの一例としては、以下の実施例の表１に記載したパラメーターが挙げられるが、これも最適化したパラメーターの一例に過ぎず、これに準じた類似のパラメーターを使用することもできる。

本発明ではさらに、19塩基対＋2塩基のオーバーハングをもつ既知のsiRNA配列の５’末端側と３’末端側にそれぞれ１〜５塩基対のエフェクター配列を追加することによってsiRNAの活性を向上させることができる。好ましくは、５’末端側のエフェクター配列にはＧまたはＣが少なくとも１個所以上に配置されるようにし、３’末端側のエフェクター配列にはＡまたはＵが少なくとも１個所以上に配置されるようにすることによってsiRNAの活性をより向上させることができる。より好ましくは、センス鎖５’末端側にＳＳＳ、３’末端側にＳＮＡという３塩基対ずつのエフェクター配列を追加する（Ｓ＝ＧまたはＣ、Ｎ＝ＡまたはＵまたはＧまたはＣ）（図８を参照）ことによって、siRNAの活性をさらに向上させることができる。エフェクター配列部分は2本鎖を形成し、ＡとＵ、ＧとＣのペアを形成する。ただし、３’末端についてはミスマッチとなっていてもよい。エフェクター配列はもとの19塩基対と2塩基オーバーハングの間に挿入する。エフェクター配列はターゲットmRNAの配列に対応している必要はない。活性をより高めるためには、アンチセンス鎖を効率よくRISCに導入することが必要であり、そのためには５’末端側にGCが多く解離しにくいこと、３’末端側にAUが多く解離しやすいことが重要である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが本発明は実施例によって限定されるものではない。

実施例１：
Ａ．方法
（１）siRNAの調製
小ヘアピンRNA (shRNA)をT7 RNAポリメラーゼで転写し、リボヌクレアーゼＴ１による限定分解によってsiRNA に転換した（Katoh, T. et al. Nucleic Acids Res Supplement 3, in press (2003)）。７２０塩基のＥＧＦＰコード領域の全位置を標的とした７０２種のsiRNAを作製した。GAPDH mRNA (1008塩基)を標的とするsiRNAの配列は、図５Ａに示す実験用では塩基位置8, 23, 33, 43, 53, 65, 93, 109, 120, 132, 145, 167, 198, 231, 241, 304, 337, 349, 368, 383, 402, 409, 448, 473, 491, 519, 539, 587, 595, 613, 636, 655, 676, 710, 734, 746, 761, 777, 789, 798, 802, 817, 845, 863, 889, 916, 941, 950, 974及び989から開始するもの、図５Ｂに示す実験用では塩基位置950-974から開始するものをそれぞれ使用した。ｓｉＲＮＡの作製の具体的方法を以下に記載する。

ｓｉＲＮＡ作製の模式図を図６に示す。低分子ヘアピン(sh)RNAの転写は、40mM Hepes-KOH(pH7.8)、20mM MgCl₂、5mM ジチオトレイトール、1mM NTP混合物、2mMスペルミジン、48μg/mlの牛血清アルブミン、100nM DNA鋳型 (Hokkaido System Science Inc.)、0.47μg/mlのパン酵母ピロホスファターゼ (Sigma)及び5.7μg/mlのT7 RNAポリメラーゼを含む400μｌの反応混合液中で42℃で1時間行った。転写したｓｈＲＮＡは、トリミングループに結合している１９塩基対の二本鎖領域と一本鎖５’−ＧＧＧ配列とを有している。トリミングループは、ループの２番目と最後の位置に２個の特異的なＧ残基を有している。RNase T1 (10,000U/ml)は、 100 mM MgCl₂ の存在下で０℃という限定された条件下で、これら２個のＧ残基及び５’−ＧＧＧ配列を特異的に切断する。トリミングしたｓｉＲＮＡをフェノールで抽出し、１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。精製したｓｉＲＮＡの品質はＰＡＧＥ分析及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析で確認した（図７）。７０種の完全二本鎖ｓｉＲＮＡを図７のＡに示す。ＥＧＦＰｍＲＮＡの位置５０を標的とするｓｉＲＮＡの質量スペクトルを図７のＢに示す。センス鎖（6886.2Da）及びアンチセンス鎖（6647.1Da）を別々に検出した。環状ホスフェートを有するセンス鎖及び３’末端にＣの突出を有するアンチセンス鎖も少量検出されたが、化学合成したｓｉＲＮＡはこの方法で得たｓｉＲＮＡと匹敵する活性を示したことから、活性には影響しないと考えられる（図７のＣ）。

（２）細胞培養及びトランスフェクション
Hyg/EGFP を安定に発現するHeLa細胞は、M.Miyagishi及びK.Taira博士 (東京大学)から供与された。Hyg/EGFP 遺伝子は、ＥＧＦＰとハイグロマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質を発現するpHygEGFP (Clontech)に由来するものである。細胞は、10％牛胎児血清（ＦＢＳ）、100unit/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び100μg/mlのハイグロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養した。7.5×10⁴ 個の細胞を６穴プレートに接種し、４８時間培養した。培地を、ハイグロマイシンを含まない1mlのOPTI-MEM I (Gibco)に交換した。10μｌのオリゴフェクタミン(Invitrogen)を用いて10μmolのＥＧＦＰ用siRNAs (最終濃度10 nM) を細胞にトランスフェクションし、4時間インキュベートした後、30% FBS を含む500μlのダルベッコ改変イーグル培地を添加した。GAPDHの場合は、25μmolのsiRNAs (f.c. 25 nM)を正常HeLa 細胞にトランスフェクションした。

（３）フローサイトメトリー及び免疫蛍光分析
トランスフェクションの７２時間後に、細胞をトリプシンで処理し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含むHanks緩衝液に再懸濁した。EGFPの蛍光をFACScalibur (Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。GAPDHの測定については、洗浄した細胞を3% パラホルムアルデヒドで１時間固定し、ＰＢＳ中の０．２％Triton X-100で２分間浸透化した。マウス抗-GAPDH モノクローナル抗体 (Chemicon)を添加し、室温で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄し、FITC結合抗マウス抗体 (Zymed laboratories)を添加し、室温で３０分間インキュベートした。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで細胞を３回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含むHanks緩衝液に再懸濁した。ＦＩＴＣの蛍光をフローサイトメトリーで測定した。

（４）ｓｉＲＮＡ活性の予測値の計算
（ａ）マクロ効果値
計算値とＲＮＡｉ活性（０〜１００％）とを比較するために、マクロ効果の係数を、A:U:G:C=0.4:0.35:0.15:0.1 から6.073:5.111:1.265:0.304へと標準化した（下記式２）。例えば、ＥＧＦＰｍＲＮＡの位置５を標的とするｓｉＲＮＡ(5'-UGAGCAAGGGCGAGGAGCU-3')（配列番号２）のマクロ効果は、6.073×5＋5.111×2＋1.265×9＋0.304×3＝52.884と計算される。
(マクロ効果)=6.073×N_A＋5.111×N_U＋1.265×N_G＋0.304×N_C （２）
式中、N_X は X残基の数を示す。

（２）ミクロ効果値
ミクロ効果値と、ｓｉＲＮＡ活性とマクロ効果値の相違値との相関係数が最大になるように、パラメーター（表１）をコンピューターにより最適化した。各ヌクレオチド位置について最適化したパラメーターを合計することにより、ミクロ効果値が得られる（式３）。例えば、EGFP mRNAの位置５を標的とするｓｉＲＮＡ (5'-UGAGCAAGGGCGAGGAGCU-3')（配列番号２）のミクロ効果値(図３）は、-3.155+0.364+1.190-1.362+0.698+3.034+3.038-0.735-0.938-0.737-1.119-0.177+2.601+1.037+1.962+2.758-1.090-0.530+1.354(=8.143)
と計算される。

（ｃ）予測値
予測値は、ミクロ効果値をマクロ効果値に足すことによって得られる。位置５を標的とするｓｉＲＮＡの予測値は、52.884+8.143(=61.027)である。

Ｂ．結果
ＥＧＦＰｍＲＮＡのＯＲＦ（７０２塩基）の全ヌクレオチド位置を標的とした７０２種類のｓｉＲＮＡを作製した。作製したｓｉＲＮＡは、両鎖の３’末端に２ヌクレオチドの突出を有し、ｍＲＮＡ中の標的配列に対応する１９ヌクレオチドから構成されている。７０２種類のｓｉＲＮＡの品質は質量スペクトル及びポリアクリルアミドゲル電気泳動で確認した。各ｓｉＲＮＡを、ＥＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ細胞に導入した。ＥＧＦＰの蛍光を、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション７２時間後にフローサイトメトリーにより測定した。ＥＧＦＰ蛍光の減少率をＲＮＡｉ活性（％）とみなした。この実験で得られたデータは高い再現性を示した。７０２種類のｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性は、小さな活性の変動を伴う大きな波形曲線から構成されていた（図２及び３）。図１Ａに示す通り、ＲＮＡｉ活性は、ｓｉＲＮＡの全塩基組成から計算される値（Ｂ）と密接な相関を示した（式１、ＮｘはＸ残基の数を示す）。サーチにより、最適な塩基組成はＡ：Ｕ：Ｇ：Ｃ＝０．４：０．３５：０．１５：０．１であることが判明した。ｓｉＲＮＡの最適な塩基組成から計算した値（Ｂ）に対するＲＮＡｉ活性の相関係数（Ｒ）は０．６０１であった（図２Ａ）。ＲＮＡｉ活性とｓｉＲＮＡのＡＵ含量（Ａ：Ｕ：Ｇ：Ｃ＝０．５：０．５：０：０）との間には有意な相関（Ｒ＝０．５８６）が存在していた。より高い相関係数を得るためにはＡの係数はＵの係数より高く、Ｇの係数はＣの係数よりも高くなければならないことは注目すべきである（図１Ａ）。
Ｂ＝０．４×Ｎ_A＋０．３５×Ｎ_U＋０．１５×Ｎ_G＋０．１×Ｎ_C （１）

次に、活性に対するｓｉＲＮＡの位置効果を分析した。７０２種のｓｉＲＮＡの各位置から得たＲＮＡｉ活性とＢ値との相関係数を図１Ｂにプロットした。図１Ｂは、位置４、７、１０、１３、１６及び１９（３ｎ＋１、ｎ＝回数）のＢ値は活性と比較的高い相関係数を有するが、位置２、５、８、１１、１４及び１７（３ｎ＋２）のＢ値は活性と相関しない（ほぼ０）ことを示す。位置３、６、９、１２、１５及び１８（３ｎ）は、３ｎ＋１と３ｎ＋２の場合の中程度の相関を示す。また、各々の特異的位置以外の１８箇所の位置のＢ値と活性との相関を調べた（図１Ｂ、棒）。その結果、各位置での１塩基の分析で得られた相関係数と負の相関が明確に示された。従って、３ｎ＋１の塩基がない場合は相関係数が有意に減少し、３ｎの塩基がない場合は相関係数がやや減少し、３ｎ＋２の塩基がない場合は相関係数が減少しないことが予測される。また、位置１は活性に影響しない。

塩基特異的な相関係数も、各ヌクレオチド位置において計算した（図１Ｃ）。Ａ及びＵ残基による活性に対する正の効果が、位置３ｎ及び３ｎ＋１（即ち、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ７、Ｕ１０、Ａ１２、Ａ１３、Ａ１５、Ｗ（Ａ及びＵ）１６、Ａ１８及びＡ１９）で認められる。特に、Ａ１９は活性に対して最大の効果を示した。Ｕ１０は、位置９及び１０で標的ｍＲＮＡを切断するＲＩＳＣで触媒される切断反応と相関しているようである。Ｇ及びＣ残基の負の相関が、位置３ｎ及び３ｎ＋１（即ち、Ｃ３、Ｇ４、Ｃ６、Ｃ７、Ｇ１０、Ｃ１２、Ｓ（Ｇ及びＣ）１３、Ｃ１５、Ｓ１６、Ｇ１８及びＳ１９）で認められる。位置３ｎ＋２については、活性との強い相関は認められず、位置３ｎ＋２の塩基は活性に影響しないことが示された。これらの結果は、図１Ｂに示した位置効果を裏付けている。効率的な活性のための理想的なｓｉＲＮＡは、５’−ＮＮＡＡＮＡＡＮＮＵＮＡＡＮＡＷＮＡＡ−３’（配列番号１）であることが判明した。

これらの結果に基づいて、ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性の予測を試みた。簡略化のために、全部で１９残基の最適塩基組成（マクロ効果）、並びに個々の位置での個々の塩基による位置効果（ミクロ効果）を別々に考慮した。これらの効果をパラメーター化して、ｓｉＲＮＡ活性の予測についての具体的な値を計算した。Ｂ値の係数を標準化して、Ｂ値をＲＮＡｉ活性（０−１００％）と比較するためのマクロ値を得た。図２Ａ及び図３に示す通り、マクロ効果は、７０２種のｓｉＲＮＡ活性を相関係数０．６０１として予測した（図２Ａ）。ｓｉＲＮＡ活性の大まかなパターンはマクロ効果に支配されていると考えられる。

一方、マクロ効果のパラメーターはマクロ及びミクロ効果の両方を含んでいるので、マクロ効果のパラメーターを図１Ｂ及びＣに示すデータから直接計算することはできない。ミクロ効果のパラメーターを、ｓｉＲＮＡ活性とマクロ効果の値との相違値から計算した。相違値は、マクロ効果を有さない個々の塩基の位置効果に由来するミクロ効果から主として成るものと仮定できる。ミクロ効果値と相違値との相関係数が最大になるように、ミクロ効果のパラメーターセットをコンピューターにより決定した。各ｓｉＲＮＡのミクロ効果値は、各位置のパラメーターセットを合計することによって得られる。

最終的に、予測値はミクロ効果値とマクロ効果値を加算することによって得られる。７０２種のｓｉＲＮＡの活性に対する予測値の相関係数は０．７２６まで増加した（図２Ｂ及び図４）。位置１〜５０（図３）では、３塩基毎の周期的な活性の変動を、相関係数０．８０５として、予測値により予測することができる（図３）。この変動は、ｓｉＲＮＡの３塩基毎の周期的な効果から生じているはずである（図１Ｂ及びＣ）。スキャッタープロットに示す通り（図４）、７０２種のｓｉＲＮＡのうちの８０以上の予測値を有する８種のｓｉＲＮＡは、８０％以上の活性を示す。従って、本方法を使用して高い活性のｓｉＲＮＡを設計することが可能である。

本発明の予測方法を内在遺伝子に適用可能であることを確証するために、ｓｉＲＮＡの全塩基組成を変化させないようにして、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｍＲＮＡを標的としたランダムに選択した５０種のｓｉＲＮＡを作製した。フローサイトメトリーを用いた免疫蛍光分析により測定したノックダウン効率を、ＲＮＡｉ活性（％）とみなした。活性に対する予測値の相関係数は、０．７７６であった（図５Ａ）。ＲＮＡｉ活性の周期変動を調べるために、GAPDH mRNAの３’末端領域の位置（位置９５０〜９７４）（この領域では、Ａ及びＵ残基が３塩基毎に頻繁に出現する）を標的とした２５種のｓｉＲＮＡを作製した。位置３ｎ＋１にＡ又はＵ残基を有するｓｉＲＮＡは、次の位置を標的とするｓｉＲＮＡより高いＲＮＡｉ活性を示したことから、ミクロ効果もGAPDH mRNAに対するＲＮＡｉ活性を予測するのに有効であることが示された（図５Ａ）。これらの結果から、本発明の予測方法は内在遺伝子についても有効であることが実証された。

ＲＮＡｉ活性は、標的ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの接近可能性に依存すると考えられる。しかし、標的ｍＲＮＡの二次構造とｓｉＲＮＡとの明白な相関関係は存在しないことから、ｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡの接近可能性はＲＮＡｉ活性に対して及ぼす影響は小さいと考えられる。ｓｉＲＮＡの接近可能性に対するｍＲＮＡ結合蛋白質（例えば、開始複合体又はＵＴＲ結合タンパク質など）の効果を排除する必要がある。実際、GAPDH mRNAの位置８、２３及び３３を標的とするｓｉＲＮＡは高い活性を示した（それぞれ79、61及び62%；図２Ａ）。従って、標的部位の配列が活性に大きな効果をもたらしていると結論できる。EGFP mRNAのｓｉＲＮＡのＧＣ含量は36.8から84.2 %の範囲内であるので、この予測アルゴリズムは、ｓｉＲＮＡのＧＣ含量が同様の範囲内にある標的ｍＲＮＡに適用することができる。

実施例２：
EGFP mRNAのORFの５’末端側から94番目〜112番目の位置をターゲットとするsiRNAについて、エフェクター配列を付加しないものと付加したものを作成し、活性の比較を行った。siRNAの配列は以下の3種類のものを用意した。
配列（１）５’− GGCGAGGGCGAGGGCGAUG −３’（配列番号３）
配列（２）５’− GGG＋GGCGAGGGCGAGGGCGAUG＋AAA −３’（配列番号４）
配列（３）５’− GGC＋GGCGAGGGCGAGGGCGAUG＋CAA −３’（配列番号５）

siRNAは、実施例１のＡ．方法の（１）siRNAの調製の記載と同様に、転写合成法により作製した。小ヘアピンRNAの転写は、40mM Hepes-KOH(pH7.8)、20mM MgCl₂、5mM ジチオトレイトール、1mM NTP混合物、2mMスペルミジン、48μg/mlの牛血清アルブミン、100nM DNA鋳型 (Hokkaido System Science Inc.)、0.47μg/mlのパン酵母無機ピロホスファターゼ (Sigma)及び5.7μg/mlのT7 RNAポリメラーゼを含む400μｌの反応混合液中で42℃で1時間行った。転写したｓｈＲＮＡは、トリミングループに結合している１９塩基対の二本鎖領域と一本鎖５’−ＧＧＧ配列とを有している。トリミングループは、ループの２番目と最後の位置に２個の特異的なＧ残基を有している。RNase T1 (10,000U/ml)は、 100 mM MgCl₂ の存在下で０℃という限定された条件下で、これら２個のＧ残基及び５’−ＧＧＧ配列を特異的に切断する。

細胞培養およびsiRNAのトランスフェクションは、実施例１のＡ．方法の（２）細胞培養及びトランスフェクションの記載と同様に行った。Hyg/EGFP を安定に発現するHeLa細胞は、M.Miyagishi及びK.Taira博士 (東京大学)から供与された。Hyg/EGFP 遺伝子は、ＥＧＦＰとハイグロマイシン耐性遺伝子との融合蛋白質を発現するpHygEGFP (Clontech)に由来するものである。細胞は、10％牛胎児血清（ＦＢＳ）、100unit/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン及び100μg/mlのハイグロマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地で培養した。7.5×10⁴ 個の細胞を６穴プレートに接種し、４８時間培養した。培地を、ハイグロマイシンを含まない1mlのOPTI-MEM I (Gibco)に交換した。10μｌのオリゴフェクタミン(Invitrogen)を用いて10μmolのＥＧＦＰ用siRNAs (最終濃度10 nM) を細胞にトランスフェクションし、4時間インキュベートした後、30% FBS を含む500μlのダルベッコ改変イーグル培地を添加した。

フローサイトメトリーによるsiRNAの活性測定方法は、実施例１のＡ．方法の（３）フローサイトメトリー及び免疫蛍光分析と同様に行った。トランスフェクションの７２時間後に、細胞をトリプシンで処理し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、０．１％アジ化ナトリウム及び０．２％ＢＳＡを含むHanks緩衝液に再懸濁した。EGFPの蛍光をFACScalibur (Becton Dickinson)を用いてフローサイトメトリーにより測定した。

EGFPの蛍光強度の減少割合（％）をsiRNAの活性とした。活性の測定はそれぞれ3回行い、その平均値をとった。3種類のsiRNAの活性を図９に示す。エフェクター配列を付加しない配列（１）（配列番号３）のsiRNAでは活性は１２％であったのに対し、エフェクター配列を付加した配列（３）（配列番号５）のsiRNAでは活性は５０％に上昇した。３’末端側をAAAとした配列（２）（配列番号４）のsiRNAも配列（１）よりは活性が高く有効であるが、配列（３）よりは低かった。したがって３’末端側のエフェクター配列は３塩基周期性を考慮することが望ましいと言える。

図１は、EGFPのノックダウン活性に対する７０２種のｓｉＲＮＡの塩基組成と位置効果を示す。図１のＡは、７０２種のｓｉＲＮＡの全塩基組成とそれらの活性との相関係数を示す。相関係数を、各塩基について係数を変化させることによって得たＢ値に対してプロットした。図１のＢは、７０２種のｓｉＲＮＡの活性に対する位置効果を示す。７０２種のｓｉＲＮＡの各位置から得たＢ値とそれらの活性との間の相関係数を赤でプロットした。各特異的位置以外の１８ｎｔの位置から得たＢ値とそれらの活性との間の相関係数を棒でプロットした。塩基の位置はｓｉＲＮＡのセンス鎖を示す。図１のＣは、７０２種のｓｉＲＮＡの塩基特異的相関係数を示す。塩基特異的な値は、以下の方法で得た；即ち、特異的な位置に調べたい塩基を有するｓｉＲＮＡを１と数え、他のｓｉＲＮＡを０と数えた。７０２種のｓｉＲＮＡの塩基特異的な値とそれらの活性との間の相関係数を各塩基についてプロットした（Aは赤、Ｕはピンク、Ｇが緑、Ｃは青）。活性に正の効果を有する塩基をグラフの上部に赤（０．２以上）、又はオレンジ（０．１以上）で示す。活性に負の効果を有する塩基を、グラフの下部に青（−０．２以下）、又は淡青（−０．１以下）で示す。図２は、ＥＧＦＰを標的とした７０２種のｓｉＲＮＡのノックダウン活性と予測値を示す。図２のＡは、ｓｉＲＮＡ活性とＢ値の相関を示す。ＥＧＦＰ蛍光の減少率から得たsiRNA 活性 (%)を棒で示す。702種のsiRNAのＢ値を青色で示す。Ｂ値に対するＲＮＡｉ活性の相関係数は0.601である。図２のＢは、アルゴリズムで計算した予測値を示す（赤線でプロット）。予測値に対するＲＮＡｉ活性の相関係数は０．７２６である。図３は、ｓｉＲＮＡの周期的な変動の予測を示す。塩基配列は、EGFP-siRNAの位置１−５０のセンス鎖を示す。色のついた塩基は、図１Ｃに示した分析による活性について正又は負の塩基を示す。最強の塩基Ａ１９は四角で囲む。ＥＧＦＰのsiRNA活性 (%) を棒で示す。各ｓｉＲＮＡのＢ値及び予測値を青及び赤でプロットした。図４は、７０２種のEGFP-siRNA活性とそれらの予測値のスキャッタープロットを示す。相関係数は０．７２６である。図５は、GAPDHのｓｉＲＮＡ活性の予測を示す。図５のＡは、50種のGAPDH-siRNA の活性とそれらの予測値のスキャッタープロットを示す。相関係数は０．７７６である。図５のＢは、GAPDHについての配列によるｓｉＲＮＡ活性の予測を示す。塩基配列は、GAPDH-siRNAの位置９５０−９７４のセンス鎖を示す。塩基のカラーコードは図３と同一である。ＧＡＰＤＨのsiRNA活性 (%)を棒に示す。各ｓｉＲＮＡの予測値を赤でプロットする。図６は、ｓｉＲＮＡ作製の模式図を示す。図７は、精製したｓｉＲＮＡの品質を確認した結果を示す。図８は、５’末端側にＳＳＳ、３’末端側にＳＮＡという３塩基対ずつのエフェクター配列を追加したsiRNAの構造を示す。図９は、エフェクター配列を付加しないsiRNAと付加したsiRNAの活性を測定及び比較した結果を示す。

Claims

標的遺伝子中の標的配列の相補配列を有し、標的遺伝子の発現を抑制するために使用されるｓｉＲＮＡを設計する方法において、以下の（１）〜（４）を特徴とする方法。
（１）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の３番目、４番目、６番目、７番目、１２番目、１３番目、１５番目、１８番目及び１９番目の塩基として、Ａがなるべく多く配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（２）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の１０番目の塩基として、Ｕが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；
（３）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の１６番目の塩基として、Ａ又はＵが配置されるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する；及び／又は
（４）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にセンス鎖の塩基配列の６番目及び７番目の塩基として、Ｃが配置されないようにｓｉＲＮＡの塩基配列を選択する。
ＧＣ含量が３０〜５０％の範囲内になるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を設計する、請求項１に記載の方法。
二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に塩基配列の１番目、２番目、５番目、８番目、１１番目、１４番目及び／または１７番目の塩基がＧ又はＣとなる塩基配列を選択することによりＧＣ含量が３０〜５０％の範囲内になるようにｓｉＲＮＡの塩基配列を設計する、請求項２に記載の方法。
二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に５’−ＮＮＡＡＮＡＡＮＮＵＮＡＡＮＡＷＮＡＡ−３’（式中、Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＵを示し、ＷはＡ又はＵを示す）から成る塩基配列を標的遺伝子中から探索して、該塩基配列をｓｉＲＮＡとして使用する方法。
ｓｉＲＮＡ配列の５’末端側及び／または３’末端側に、標的遺伝子の配列との対応を必要としない、二本鎖の１〜５塩基対のエフェクター配列を追加することにより、既存のsiRNAの活性を高める方法。
以下の工程を含むｓｉＲＮＡ活性を予測する方法。
（１）siRNAの最適な塩基組成から算出された値であるマクロ効果値を、以下の式(マクロ効果値１)から求める工程（ここで、マクロ効果値とＲＮＡi活性のより高い相関係数を得るためには、Ａの係数(Ｋ_A)＞Ｕの係数(Ｋ_U)＞Ｇの係数(Ｋ_G)＞Ｃの係数(Ｋ_C)を満たす必要がある。最適な塩基組成をＡ：Ｕ：Ｇ：Ｃ=０．４:０．３５:０．１５:０．１とした場合にマクロ効果値は(マクロ効果値２)で与えられる。さらに、ＲＮＡi活性値を０−１００％で規格化した場合には、より実測値に近い(マクロ効果値３)が与えられる。）
(マクロ効果値１)＝Ｋ_A×Ｎ_A＋Ｋ_U×Ｎ_U＋Ｋ_G×Ｎ_G＋Ｋ_C×Ｎ_C
(マクロ効果値２)＝０．４×Ｎ_A＋０．３５×Ｎ_U＋０．１５×Ｎ_G＋０．１×Ｎ_C
(マクロ効果値３)＝6.073×Ｎ_A＋5.111×Ｎ_U＋1.265×Ｎ_G＋0.304×Ｎ_C
（式中、Ｋ_Xは最適な塩基組成から算出された係数とする。Ｎ_XはＸ残基の数を示す。）
（２）二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合に、各塩基部位と塩基種ごとに、ＲＮＡi活性値−マクロ効果値の差分値に対し、相関係数が最大になるように算出した最適なパラメーターを合計することにより得られる値であるミクロ効果値を、以下の式から求める工程：
19
(ミクロ効果値)=Σ(P_Xi )
i=1
（Ｐxiは二本鎖部分が１９塩基のｓｉＲＮＡとした場合にi番目の部位における塩基種Ｘのパラメーターを示す。）
（３）上記工程（１）及び（２）で得られたミクロ効果値とマクロ効果値を加算することによってｓｉＲＮＡの予測値を求める工程。