WO2019112229A2 - 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도 - Google Patents
줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a new use of an exosome kit comprising exosomes derived from stem cells.
- the present invention relates to a method for preventing, suppressing, alleviating, ameliorating or treating skin irritation or skin itching, which comprises applying a mask pack, a mask sheet or a patch containing a stem cell-derived exosome as an active ingredient, , An iontophoresis device, and the like.
- Skin pruritus or pruritus is a sensation that is common in most skin diseases, along with pain, and can be defined as an unpleasant sensation that causes a desire to scratch or rub the skin in the clinic.
- Scratching the skin due to itching can cause scarring and bacterial infections and inflammation. These bacterial infections and inflammations activate immune cells such as T-cells and macrophages, secrete several cytokines, and exacerbate itching. Patients with itching may be unconscious or unconscious. Severe scratching or rubbing of the lesion may result in severe scarring, or various side effects such as erythema, cracking, ulceration, urticaria or pigmentation.
- TSLP Thimic stromal lymphopoietin
- Methods of applying a lipid complex of ceramides to restore skin moisturization and skin barrier to improve skin itching or methods such as antihistamines, steroids, antibiotics, antiviral agents, antifungal agents, anesthetics, immunosuppressants, .
- these methods are problematic in that the therapeutic effect is temporary or limited depending on the type of itching, and adrenocorticosteroids and corticosteroids have a short-term use only in acute or severe cases considering side effects .
- exosome which has intercellular signal transduction
- Extracellular vesicles Cells release various membrane-type vesicles in the extracellular environment, and these release vesicles are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
- the extracellular endoplasmic reticulum is sometimes referred to as cell membrane-derived endoplasmic reticulum, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes and, in some cases, differentiated from exosomes.
- Exosome is an endoplasmic reticulum of several tens to several hundreds of nanometers in size, composed of double lipid membranes identical to the cell membrane structure, and contains proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosomal cargo inside.
- Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
- Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
- Exosomes contain specific genetic material and bioactivity factors depending on the nature and condition of the derived cells.
- the proliferating stem cell-derived exosomes regulate cell behavior such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflect the characteristics of stem cells involved in tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
- the present inventors have conducted intensive studies on the development of new formulations capable of stably maintaining and storing exosomes and the combination of medical or cosmetic techniques, and have found that they can be applied to prevent, inhibit, alleviate, improve or treat skin moisturization, itching
- the present invention has been completed by developing an exosomic kit.
- the object of the present invention is to provide an exosome kit comprising exosome derived from stem cells and an application thereof. More specifically, the object of the present invention is to provide a mask pack, a mask sheet, a mask sheet or the like which is coated or immersed with a composition containing an exosome derived from a stem cell as an active ingredient for preventing, inhibiting, alleviating, Patches, and iontophoresis devices, which are well known in the art.
- Another object of the present invention is to provide a cosmetic method for controlling the condition of mammalian skin through prevention, suppression, alleviation or improvement of skin moisturizing and skin itching except for therapeutic use using the exosomic kit.
- the present invention provides a method for preventing, suppressing, alleviating, ameliorating, or treating skin itching, skin itching, or the like, comprising applying a composition comprising an exosome derived from stem cells as an active ingredient, , A mask sheet or patch, and an iontophoresis device.
- exosomes refers to an endoplasmic reticulum of several tens to several hundred nanometers (preferably about 30 to 200 nm) in size, consisting of double lipid membranes identical in structure to the cell membrane The particle size of the exosome can be varied according to the cell type, the separation method and the measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, DOI 10.1007 / s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins called exosomal cargo (cargo), nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.).
- Exosomal cargo contains a wide range of signaling factors, which are known to be specific for cell types and differentially regulated by the environment of the secretory cells.
- Exosome is an intercellular signaling mediator that is secreted by the cell, and various cell signals transmitted through it regulate cell behavior including activation, growth, migration, differentiation, de-differentiation, apoptosis, and necrosis of target cells It is known.
- exosome refers to a vesicle that has a nano-sized vesicle structure secreted from various stem cells and released into the extracellular space and has a composition similar to exosome (e.g., - pseudo-bezacl).
- the type of the stem cell is not limited, but may be, for example, a mesenchymal stem cell, for example, a fat, a bone marrow, an umbilical cord or a cord blood derived stem cell, Derived stem cells.
- the type of the adipose-derived stem cell is not limited as long as it does not cause a risk of infection by a pathogen and does not cause an immune rejection reaction, but it may be preferably a human adipose-derived stem cell.
- the stem cell-derived exosomes used in the present invention are not limited to those which are used in the art or which can be used in the future as long as they are effective for preventing, inhibiting, alleviating, improving or treating skin moisturizing and itchy skin, It is of course possible to use an exosome derived from a stem cell. Therefore, it should be understood that the exosome isolated according to the separation method of the following embodiments should be understood as an example of exosome that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
- the term " itching of the skin” is not particularly limited and, as one example, itching caused by skin dryness; Itching by urticaria; Itching caused by insect bites; Itching caused by rashes, acne, rash, frostbite, contact dermatitis, seborrheic dermatitis or psoriasis; Itching caused by various skin diseases; Scalp itching, and the like.
- the present invention does not exclude skin itching of various causes other than the skin itching listed above.
- the present invention includes all itching known in the art such as dermatologic cause itching, systemic itching, neuropathic itching, and psychogenic cause itching.
- skin moisturizing means that the homeostasis of the living body is maintained by appropriately controlling moisture loss (moisture evaporation) of the skin and the like.
- the term "iontophoresis” as used herein refers to a method in which an ionized active ingredient is allowed to permeate through the skin by an electrical repulsive force by applying a minute current to the skin to which the effective substance is applied, .
- the iontophoresis used in one embodiment of the present invention is a method in which a current flows from an external power source to an electrode patch on the skin to introduce minute current into the skin, A method in which minute current is introduced, a method in which minute current is introduced into skin through a patch equipped with a reversed electrodialysis means for generating current through a difference in ion concentration between a high concentration electrolyte solution and a low concentration electrolyte solution, and the like .
- the present invention is not limited thereto, and it is needless to say that various types of iontophoresis can be used.
- the exosome kit of one embodiment of the present invention comprises a first mask pack, a mask sheet or a patch which is applied or immersed with a composition containing an exosome derived from a stem cell as an active ingredient, And an iontophoresis device for flowing an electric current.
- an exosome kit is characterized in that the first mask pack, the mask sheet or the patch is brought into contact with or attached to the skin of the mammal, and the ion mask By positioning the phoresis device, the first mask pack, mask sheet or patch can be contacted or attached to be used in such a way that micro-currents flow to the skin of the mammal to which the composition is applied.
- the stem cell-derived exosome reduces the expression or production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin).
- TSLP Thimic stromal lymphopoietin
- the composition may be used in combination with a conventional itching remedy and / or moisturizer to the extent that it does not impair its action (skin dryness or relieving or amelioration of itching symptoms caused by the skin).
- the composition may be supported on or mixed with at least one of hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate), or hyaluronic acid gel.
- the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol.
- the gel polymer is at least one selected from the group consisting of pluronic, purified agar, agarose, gellan gum, alginic acid, carrageenan, cacao gum, xanthan gum, galactomannan, glucomannan, pectin, cellulose, guar gum and locust bean gum
- the polyhydric alcohol may be at least one selected from the group consisting of ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, isobutylene glycol, dipropylene glycol, sorbitol, xylitol and glycerin.
- the iontophoresis device may be applied to a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a dry battery, a mercury battery, a lithium battery, a nickel-cadmium battery, Or a second mask pack, a mask sheet, or a patch having the at least one battery mounted thereon.
- the second mask pack, the mask sheet or the patch may be laminated on the first mask pack, the mask sheet or the patch.
- At least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch, at least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch may be coated with a hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronic acid salt (for example, sodium hyaluronate) At least one of the gels may be applied.
- the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. The gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
- the micro current flows from the iontophoresis device, so that the stem cell-derived exosome can effectively penetrate the epidermis and penetrate deeply into the skin. Thereby making it possible to more effectively contribute to prevention, suppression, improvement, alleviation or treatment of itching.
- the exosome kit of one embodiment of the present invention can be effectively used for preventing, suppressing, improving, alleviating or treating skin dryness or itching caused thereby.
- Another embodiment of the present invention provides a cosmetic method for controlling the condition of a mammalian skin by preventing, suppressing, alleviating or improving skin moisturization, skin itching except for therapeutic use using the exosomic kit.
- conditioning of the skin means improvement of the condition of the skin and / or prevention of the condition of the skin
- improvement of the condition of the skin means visual and / Or a tactile perceptible positive change.
- improving the condition of the skin may be a moisturizing or smooth condition of the skin, or an improvement in the condition of the skin which may be worsened by scratching or rubbing the skin with itching.
- the cosmetic method of one embodiment of the present invention can be carried out using the exosome kit as described above.
- the cosmetic method of one embodiment of the present invention comprises the steps of (a) contacting a first mask pack, a mask sheet or a patch with a composition containing an exosome derived from a stem cell as an active ingredient, (B) positioning the iontophoresis device on the first mask pack, mask sheet or patch, and (c) contacting the first mask pack, mask sheet or patch with the iontophoresis device, Performing iontophoresis to flow a microcurrent into the skin of the mammal to which the composition is applied; and (d) delivering the exosomes through the microcurrent to the inside of the mammalian skin.
- the stem cell-derived exosomes reduce the expression or production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin).
- At least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch, at least one surface of the first mask pack, the mask sheet or the patch may be coated with a hydrogel, hyaluronic acid, hyaluronate (e.g., sodium hyaluronate) At least one of the gels may be applied.
- the type of the hydrogel is not limited, but it may preferably be a hydrogel obtained by dispersing a gelated polymer in a polyhydric alcohol. The gelled polymer and the polyhydric alcohol may be exemplified in the above description.
- the iontophoresis device comprises a flexible battery, a lithium ion secondary battery, an alkaline battery, a dry battery, a mercury battery, a lithium battery, a nickel-cadmium battery, Or a second mask pack, a mask sheet or a patch having the at least one battery mounted thereon.
- the step (b) may be performed by laminating the second mask pack, the mask sheet or the patch on the first mask pack, the mask sheet or the patch.
- the microcurrent flows from the iontophoresis device so that the stem cell-derived exosome can effectively penetrate the epidermis and deeply penetrate into the skin. Thereby making it possible to more effectively contribute to prevention, suppression, improvement, alleviation or treatment of itching.
- the exosome kit of the present invention exhibits an effect of suppressing, alleviating or ameliorating skin itch, and exhibiting skin moisturizing effect, and is excellent in skin beauty such as improving skin condition deteriorated due to skin dryness or itching, .
- the exosome kit of the present invention can prevent the exosome applied or deposited on the mask pack, the mask sheet or the patch by the iontophoresis action to effectively penetrate the epidermis and penetrate deeply into the skin, resulting in dry or itching And exhibits an effect of improving or improving the skin condition.
- FIG. 1 shows the results of physical property analysis of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
- Figure 1A shows the particle size distribution and number of particles by TRPS (tunable resistive pulse sensing) analysis.
- Figure 1B shows particle size distribution and particle number by NTA (nanoparticle tracking analysis) analysis.
- Fig. 1C shows particle images by transmission electron microscopy (TEM) according to magnification.
- Figure 1D shows the Western blot results of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
- RTI ID 0.0 > 1E < / RTI > shows flow cytometric analysis results for CD63 and CD81 in marker assays for exosomes obtained according to one embodiment of the present invention.
- FIG. 2 shows the result of confirming the absence of cytotoxicity after treatment of exosomes obtained according to one embodiment of the present invention in human skin fibroblast HS68 cells.
- FIG. 3 shows the results of treatment of exosomes used in the exosomic kit of the present invention together with Poly I: C against HaCaT cells as human keratinocytes, showing that the amount of mRNA expression of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) decreased And a real-time PCR result.
- TSLP Thimic stromal lymphopoietin
- FIG. 4 shows that the production of TSLP (Thymic stromal lymphopoietin) decreased in HaCaT cells, which are human keratinocytes, as a result of treatment with exosomes used in the exosomal kit of the present invention together with Poly I: C Western blot results.
- TSLP Thimic stromal lymphopoietin
- Fig. 5 shows fluorescence intensity measurement results of exosomes stained with PKH67.
- FIG. 6 is an image of a fluorescence microscope confirming the extent of fluorescence-stained exosomes transferred into pig skin tissue.
- FIG. 7 is a confocal fluorescence microscope image showing the extent of fluorescence-stained exosomes transferred into the mouse skin tissue.
- Fig. 8 is a graph showing a comparison of the total fluorescence intensity obtained by measuring the fluorescence intensity on each image in Fig. 7; Fig.
- FIG. 9 is a photograph showing the skin condition before and after the treatment of human skin with the exosomal kit of the present invention.
- FIG. 10 is a graph showing the results of the iontophoresis of applying a composition containing exosome used in the exosome kit of the present invention to human skin (affected part) and then flowing a microcurrent to the skin (affected part) applied with the composition As a result, it is a photograph showing that erythema of the skin (lesion) is remarkably improved.
- Fig. 11 shows the result that skin moisturization is remarkably improved when the exosomic kit of the present invention is applied to human skin.
- FIG. 12 shows the results of pre-treatment of exosomes used in the exosomic kit of the present invention before treatment of Poly I: C with HaCaT cells as human keratinocytes.
- TSLP Thimic stromal lymphopoietin
- FIG. 13 is a perspective view showing a configuration of the exosomes kit 100 according to one embodiment of the present invention.
- HS68 cells a human dermal fibroblast, were purchased from ATCC and cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (purchased from ThermoFisher Scientific) and 1% antibiotic-antimycotics (purchased from ThermoFisher Scientific) The cells were subcultured in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) medium containing 5% CO 2 at 37 ° C.
- adipose-derived stem cells were cultured at 5% CO 2 and 37 ° C. Then, the cells were washed with a phosphate-buffered saline (purchased from ThermoFisher Scientific), replaced with serum-free, non-phenol red medium, cultured for 1 to 10 days, and the supernatant .
- a phosphate-buffered saline purchased from ThermoFisher Scientific
- Trehalose was added to the culture medium in an amount of 2% by weight in order to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity in the process of separating exosome.
- the culture was filtered with a 0.22 ⁇ m filter to remove impurities such as cellular debris, waste products and large particles.
- the filtered cultures were immediately separated to isolate exosomes.
- the filtered culture was stored in a refrigerator (image below 10 ° C) and used for exosome isolation.
- the filtered culture was frozen in an ultra-low temperature freezer at -60 ° C or lower, and thawed, followed by exosome isolation. Then, the exosomes were separated from the culture medium by using Tangential Flow Filtration (TFF).
- TMF Tangential Flow Filtration
- Example 1 a TFF (Tangential Flow Filtration) method was used for separating, concentrating, desalting and diafiltration exosomes from a culture filtrated with a 0.22 ⁇ m filter.
- a cartridge filter also called a hollow fiber filter (purchased from GE Healthcare) or a cassette filter (purchased from Pall or Sartorius or Merck Millipore) was used.
- the TFF filter can be selected by a variety of molecular weight cutoffs (MWCO). Exosomes were selectively isolated and concentrated by selected MWCOs, and particles, proteins, lipids, nucleic acids, low molecular weight compounds, etc. smaller than MWCO were removed.
- MWCO molecular weight cutoffs
- TFF filters of MWCO 100,000 Da (Dalton), 300,000 Da, or 500,000 Da were used.
- the culture medium was concentrated to a volume of about 1/100 to 1/25 using the TFF method, and substances smaller than MWCO were removed to separate the exosomes.
- Separated and concentrated exosomal solutions were further desalted and buffered (diafiltration) using the TFF method.
- the desalination and buffer exchange are performed by continuous diafiltration or discontinuous diafiltration, and at least 4 times, preferably 6 times to 10 times or more, more preferably, Was performed using a buffer solution having a volume of 12 times or more.
- 2% by weight of trehalose dissolved in PBS was added to obtain an exosome having a uniform particle size distribution and high purity.
- NTA nanoparticle tracking analysis
- TRPS tunable resistive pulse sensing
- FIG. 1D shows the presence of CD9, CD63, CD81 and TSG101 markers as a result of performing Western blotting on isolated exosomes according to the method of one embodiment of the present invention.
- Anti-CD9 purchased from Abcam
- anti-CD63 purchasedd from System Biosciences
- anti-CD81 purchasedd from System Biosciences
- anti-TSG101 purchasedd from Abcam
- FIG. 1E shows the presence of CD63 and CD81 markers as a result of analysis using flow cytometry on exosomes isolated according to the method of one embodiment of the present invention.
- Human CD63 isolation / detection kit purchased from ThermoFisher Scientific
- PE-mouse anti-human CD63 PE-Mouse anti markers were stained using the PE-mouse CD63 (purchased from BD) and PE-mouse anti-human CD81 (purchased from BD), and analyzed using a flow cytometer (ACEA Biosciences) Respectively.
- exosomes derived from stem cells used in the present invention are not limited to the exosomes of the above-mentioned embodiments, and it is possible to use various stem cell-derived exosomes which are used in the art or can be used in the future Of course. It is to be understood that the exosomes isolated according to the above embodiments are to be understood as an example of exosomes derived from stem cells which can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
- exosomes were treated by concentration to the cells and the proliferation rate of the cells was confirmed.
- HS68 cells were suspended in DMEM containing 10% FBS, and the cells were mixed with 80 ⁇ 90% confluency and cultured in a 5% CO 2 incubator at 37 ° C for 24 hours. After 24 hours, the culture solution was removed, and the cell survival rate was evaluated by culturing the exosome prepared in Example 2 for each concentration and culturing for 24 to 72 hours.
- WST-1 reagent purchased from Takara
- MTT reagent purchased from Sigma
- CellTiter-Glo reagent purchased from Promega
- Aramar Blue reagent alamarBlue reagent purchased from ThermoFisher Scientific
- a microplate reader purchased from Molecular Devices
- the comparison group was based on the number of cells cultured in the normal cell culture medium not treated with exosome, and it was confirmed that the cytosolic effect of exosome derived from stem cells did not appear within the tested concentration range (FIG. 2).
- Example 5 Measurement of TSLP inhibitory effect using HaCaT cells
- Example 5-1 Co-treatment of Poly I: C and stem cell-derived exosome
- TSLP is excessively increased in epithelial cells and human keratinocytes in patients with itching, and is known to cause skin itching. Therefore, by confirming whether or not a specific candidate substance inhibits TSLP induced in keratinocytes, inhibition or mitigation of itching can be confirmed.
- Human dermal keratinocyte HaCaT cells were suspended in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 1% amphotericin B (purchased from Sigma) and 1% penicillin-streptomycin Each well of a 12-well plate was inoculated at a density of 1 x 10 < 5 > and cultured for 24 hours.
- the forward primer (5 '- > 3')
- the reverse primer (5 '- > 3') TSLP GCTATCTGGTGCCCAGGCTAT (SEQ ID NO: 1) CGACGCCACAATCCTTGTAAT (SEQ ID NO: 2) ⁇ -actin GGCCATCTCTTGCTCGAAGT (SEQ ID NO: 3) GACACCTTCAACACCCCAGC (SEQ ID NO: 4)
- HaCaT cells as human keratinocytes were suspended in DMEM (purchased from ThermoFisher Scientific) supplemented with 10% FBS (fetal bovine serum), 1% amphotericin B (purchased from Sigma) and 1% penicillin-streptomycin And then inoculated into each well of a 6-well plate at a density of 5 x 10 < 5 > and cultured for 24 hours. Then, the cells were washed twice with serum-free DMEM medium for 24 hours, and the cells were washed twice with PBS.
- DMEM obtained from ThermoFisher Scientific
- FBS fetal bovine serum
- amphotericin B purchased from Sigma
- penicillin-streptomycin 1% penicillin-streptomycin
- the cells were treated with Poly I: C (purchased from Sigma) and stem cells derived from serum-free medium
- the exosomes (used in the exosome kit of the present invention as the exosome prepared in Example 2) were treated and cultured for 24 hours.
- the amount of TSLP protein produced in each experimental group was measured by Western blotting using TSLP antibody (Abcam, Cambridge, Mass.).
- the amount of protein was determined by the BCA method using bovine serum albumin (BSA).
- BSA bovine serum albumin
- the amount of TSLP protein in each experimental group was normalized by the amount of GAPDH protein and corrected.
- Example 5-2 Pre-treatment of exosomes derived from stem cells before Poly I: C treatment
- Human skin keratinocyte HaCaT cells were cultured in 154CF medium (0.03 mM CaCl 2 ) supplemented with 10% HKGS (Human Keratinocyte Growth Supplement), 1% amphotericin B (purchased from Sigma) and 1% penicillin-streptomycin (ThermoFisher Scientific ) And then inoculated in each well of a 24-well plate at a density of 5 x 10 < 4 > and cultured for 24 hours. After incubation for 24 hours in serum-free 154CF medium, the adhered cells were washed twice with PBS.
- HKGS Human Keratinocyte Growth Supplement
- amphotericin B purchasedd from Sigma
- penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific
- the cells were washed twice with serum-free exosome (prepared in Example 2, ) Was pre-treated and cultured for 24 hours, then treated with Poly I: C (purchased from Sigma) and cultured for 4 hours.
- CDNA was prepared from RNA isolated from HaCaT cells of each experimental group and the amount of mRNA change of TSLP, which is a major cause of itching, was measured using a real time PCR method.
- the ⁇ -actin gene was used as a standard gene for quantifying the TSLP gene.
- the types and sequences of the primers used in the real-time PCR are shown in Table 1 above.
- Example 6 Skin permeability test of exosome used in the exosome kit of the present invention
- PKH67 dye (purchased from Sigma) was used to prepare fluorescently stained exosomes. 1 mM PKH67 was diluted in Diluent C (purchased from Sigma) to prepare a 10 ⁇ M PKH67 solution, mixed with an appropriate concentration of exosome solution, and allowed to react at room temperature for 10 minutes in the absence of light. After the reaction, an MW3000 spin column (purchased from ThermoFisher Scientific) was used to remove the remaining PKH67 dye from the exosomes stained with PKH67 (hereinafter abbreviated as "PKH-exosomes"). After confirming the use of a fluorescence analyzer (purchased from Molecular Devices), PKH67 not reactive with exosomes was removed, and fluorescence of sufficient intensity was detected in PKH-exosomes (FIG. 5).
- PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 particles / mL, and then applied to the outer surface of the pig skin.
- PBS phosphate buffer
- the nonwoven fabric was covered and allowed to react for an appropriate period of time, for example, 30 minutes to 1 hour to allow the PKH-exosomes to be delivered to the subcutaneous tissues.
- the PKH-exosomes were applied to the outer surface of the pig skin and covered with the nonwoven fabric, followed by flowing a microcurrent for a predetermined time, for example, 30 minutes to 1 hour.
- the pig skin tissue was immersed in a 3.7% formaldehyde solution, reacted overnight, and washed three times for 5 minutes each with phosphate buffered saline.
- the washed pig skin tissue was immersed in a 30% sucrose solution and treated with OCT compound.
- sections were prepared on a longitudinal section using a microtome, and tissue sections were placed on a slide glass.
- the preparation of the tissue section may be carried out before the tissue is fixed with formaldehyde solution. Fluorescence detected from PKH-exosomes in tissue sections was observed using fluorescence microscopy.
- the exosome kit of the present invention can effectively pass through the epidermis and be deeply transferred into the skin tissue, and can be effectively absorbed to the skin. Therefore, the exosome kit of the present invention is expected to be usefully used for skin moisturization, prevention, suppression, improvement, alleviation or treatment of itch.
- PKH-exosomes were dispersed in phosphate buffer (PBS) at a proper concentration, for example, 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 9 particles / mL, and then applied to the outside of the skin tissue of the mice.
- PBS phosphate buffer
- the nonwoven fabric was pre-positioned outside the mouse skin tissue, and PKH-exosomes were injected between the nonwoven fabric and skin tissue. Then, the reaction was carried out for 30 minutes to 1 hour.
- the PKH-exosomes were injected between the nonwoven fabric and the skin tissue, and the microcurrent was flowed for a predetermined time, for example, 30 minutes to 1 hour. After completion of the reaction, the PKH-exosomes transferred into the skin tissue were confirmed immediately using a confocal fluorescence microscope (Leica, SP8X) or the skin tissue and the PKH-exosomal solution were further reacted for 1 hour to 6 hours , And PKH-exosomes were identified by confocal fluorescence microscopy. As a result, it was confirmed that the exosomes were more effectively passed through the epidermis and deeply transferred into the skin tissues and more effectively absorbed to the skin when active transdermal delivery was performed (see FIGS. 7 and 8) ).
- exosomes are expected to effectively pass through the epidermis and effectively function in prevention, suppression, alleviation, improvement, or treatment of skin moisturizing and itching.
- the exosome kit 100 includes a liquid immersion sheet mask 10 (a white sheet mask on which a composition containing a stem cell-derived exosome is applied or immersed) And a transdermal permeation promoting sheet mask (silver sheet mask) 20 which is an iontophoresis device.
- a stem cell-derived exosome (12) is applied or deposited on the surface or inside of the liquid immersion sheet mask (10).
- a battery 22 for generating a microcurrent is mounted on the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20 and a conductive pattern 24 electrically connected to the cell 22 is attached to the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20, So that the micro current generated from the battery 22 can be uniformly transmitted to the entirety of the percutaneous permeation enhancing sheet mask 20.
- the conductive pattern 24 is formed by printing or plating a conductive metal such as gold, silver, or copper.
- exosome kit 100 having the above-described structure is applied once to the face of a person having a flushing symptom and skin trouble (hereinafter referred to as "case 1") related to skin dryness and itching, And whether the symptoms of redness were alleviated or improved.
- case 1 a flushing symptom and skin trouble
- case 2 a person with flushing symptom
- a liquid immersion sheet mask 10 containing 5 ⁇ 10 5 exosomes 12 was uniformly adhered to the entire faces of the cases 1 and 2 by aligning them with the eyes and mouth parts and then a microcurrent of about 0.3 to 0.4 mA
- An activated percutaneous permeation enhancing sheet mask 20 which was activated to flow was laminated on the liquid immersion sheet mask 10 and used for about 25 to 30 minutes.
- the exosome kit 100 composed of the liquid-immersion sheet mask 10 containing the stem cell-derived exosome 12 at a concentration of 5 ⁇ 10 5 particles / mask and the percutaneous permeation- (See case 1 in FIG. 9), and overall skin tone was improved in "case 2" and flushing was alleviated (see case 2 in FIG. 9) . Therefore, the exosomal kit (present invention) comprising the liquid immersion sheet mask 10 in which the composition containing the stem cell-derived exosome as an active ingredient is immersed and the percutaneous permeation promoting sheet mask (iontophoresis device) 100) can be said to have the effect of preventing, suppressing, alleviating or alleviating redness symptoms and skin troubles associated with skin dryness and itching.
- compositions containing a stem cell-derived exosome at a concentration of 0.29 x 10 8 particles / mL was applied to the affected part (hand, neck, arm, etc.) of three severe atopic patients complaining of itching Iontophoresis was carried out by using a iontophoresis device (IONZYME DF MACHINE) (purchased from Environ) to flow a micro current of 0.4 mA for 20 minutes to the affected part of the composition.
- IONZYME DF MACHINE purchased from Environ
- the exosome kit 100 of the present invention can be effectively used for preventing, suppressing, improving, alleviating or treating skin dryness and itching caused by the above-mentioned clinical tests.
- Example 8 Test of moisturizing effect on human skin
- the acute and chronic physical disease-free healthy women 20 for the stem cells a bit derived from the exo (Example 2 little ready-exo-in) containing a skin disease 1 ⁇ 10 7 of the particles / mL (Semitransparent fluid phase) and the exosome kit 100 of the present invention were used once every three days in the evening to test the skin moisturizing effect.
- the amount of skin moisture was measured by a moisture meter (Corneometer CM825) (Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany) before use of the ampoule and exosome kit 100, 2 weeks after use, 4 weeks after use, Respectively.
- the liquid immersion sheet mask 10 was brought into close contact with the eyes and the mouth, and the entire surface of the face was evenly adhered. Then, an activated percutaneous permeation- The mask 20 was laminated on the liquid immersion sheet mask 10 and used for about 25 to 30 minutes.
- the exosome kit 100 of the present invention exhibits superior skin moisturizing effect as compared with the conventional clinical treatments, as confirmed by the above-mentioned clinical tests.
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Abstract
본 발명은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공한다. 본 발명의 엑소좀 키트는 피부 가려움증을 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과 및 피부보습 효과를 나타내고, 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 엑소좀 키트는 이온토포레시스 작용에 의해 마스크팩, 마스크시트 또는 패취에 도포되거나 침적되어 있는 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하게 하고 피부 내부 깊숙이 침투시켜 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 호전시키는 효과를 나타낸다.
Description
본 발명은 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공하는 것에 관한 것이다.
피부 가려움증 또는 소양증(pruritus)은 통증과 함께 대부분의 피부질환에서 흔히 유발되는 감각으로서, 임상에서는 피부를 긁거나 문지르고 싶은 욕망을 일으키는 불쾌한 감각으로 정의될 수 있다.
가려움증으로 인해 피부를 긁다 보면 상처가 나게 되고 세균감염 및 염증이 동반된다. 이러한 세균감염 및 염증으로 인해 T-세포 및 대식세포와 같은 면역세포들이 활성화되고 여러 사이토카인 등이 분비되어 가려움증을 더욱 악화시킨다. 가려움증이 있는 환자는 의식 또는 무의식적으로 환부를 긁게 된다. 환부를 심하게 긁거나 문지르는 경우, 긁은 흔적이 심하게 남게 되거나 홍반, 균열, 궤양, 두드러기 또는 색소침착 등의 다양한 부작용이 나타날 수 있다.
현재까지의 연구 결과에 따르면, 가려움증 매개물질이 여러 피부질환에서 가려움증을 유발하는 것으로 알려져 있는데, 면역세포(T 세포, 대식세포 등)로부터 분비된 여러 사이토카인 및 히스타민이 가려움증을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)가 피부염의 중증도와 연관되어 있고, 가려움 증세의 원인이라고 알려졌다(Wilson SR et al., The epithelial cell-derived atopic dermatitis cytokine TSLP activates neurons to induce itch. Cell. 2013;155(2):285-95). 특히, 피부 가려움증은 건조된 피부에서 발생하기 쉬우며, 건조된 피부와 피부질환은 피부 가려움증을 악화시킨다. 따라서, 피부 가려움증은 피부 보습과 밀접한 관련이 있다.
피부 가려움증을 개선하기 위하여 피부 보습 및 피부장벽을 복구하는 세라마이드의 지질복합체를 적용하거나, 항히스타민제, 스테로이드, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 마취제, 면역억제제, 광선치료 등의 방법이 일반적으로 사용되어 왔다. 그러나 이들 방법은 치료 효과가 일시적이거나 제한적으로 가려움증의 종류에 따라 특이성을 나타내는 문제가 있으며, 부신피질 호르몬제 및 코르티코스테로이드(corticosteroid)는 부작용을 고려하여 급성 또는 심한 경우에 한하여 단기간 사용해야 하는 문제가 있다.
이러한 문제점을 감안하여 천연물을 이용하여 가려움증을 억제 내지는 완화하고자 하는 연구가 활발하다. 이러한 천연물을 원료로 하는 가려움증 억제 또는 완화용 조성물의 경우, 천연 추출물 내의 유효성분 함량이 적은 관계로 가려움증 억제 또는 완화 효과를 얻기 위해서는 많은 양의 사용이 필요하고, 이들 중 대부분은 천연물 소재라는 점을 마케팅에 활용하고 있을 뿐 가려움증 억제 또는 완화의 실질적 효능에 대해서는 과학적 연구가 좀더 필요한 상황이다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)'이 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
그러나 엑소좀을 이용한 특정 질환의 치료에 대한 가능성 제시 등 다양한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 엑소좀의 사용 편의성 및 효능 증대 등을 위한 다양한 의료 내지는 미용기술과의 접목은 상대적으로 주목받고 있지 못하고 있다.
본 발명자들은 엑소좀을 안정적으로 유지·보관할 수 있는 새로운 제형 개발과 의료 내지는 미용기술과의 접목에 대해 예의 연구를 거듭하던 중, 피부 보습, 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용가능한 엑소좀 키트를 개발하여 본 발명을 완성하였다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트 및 이의 응용을 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 엑소좀 키트를 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료를 위해, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 이온토포레시스(iontophoresis) 디바이스를 포함하는 엑소좀 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 다양한 줄기세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 줄기세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 바람직하게는 중간엽 줄기세포, 예를 들어 지방, 골수, 제대 또는 제대혈 유래 줄기세포일 수 있으며, 보다 바람직하게는 지방 유래 줄기세포일 수 있다. 상기 지방 유래 줄기세포의 종류는 병원체에 의한 감염의 위험이 없고 면역 거부 반응을 일으키지 않는 것이라면 제한되지 않으나, 바람직하게는 인간지방 유래 줄기세포일 수 있다.
그러나 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 효과가 있고 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들의 분리방법에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 용어 "피부 가려움증"은 특별히 제한되지 않으며, 하나의 예시로서, 피부건조에 의한 가려움증; 두드러기에 의한 가려움증; 벌레물림에 의한 가려움증; 땀띠, 여드름, 짓무름, 동상, 접촉성 피부염, 지루성 피부염 또는 건선 등으로 유발되는 가려움증; 각종 피부질환에 의한 가려움증; 두피 가려움증 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명에서는 이상에서 열거한 피부 가려움증 이외의 다양한 원인의 피부 가려움증을 배제하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명은 당업계에 알려진 모든 가려움증, 예를 들어 피부과적 원인 가려움증, 전신성 원인 가려움증, 신경병증성 원인 가려움증 및 심인성 원인 가려움증 등을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 생체의 항상성을 유지하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 용어, "이온토포레시스(iontophoresis)"는 유효물질이 적용된 피부에 미세전류를 흐르게 하여 전위차를 주어 피부의 전기적 환경을 변화시킴으로써 이온화된 유효성분을 전기적 반발력으로 피부를 투과하게 하는 방법을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 사용되는 이온토포레시스(iontophoresis)는 피부 위의 전극 패치에 외부전원으로부터의 전류가 흘러들어가 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 전극 패치 자체에 배터리가 장착되어 피부에 미세전류가 도입되는 방식, 고농도 전해질 용액 및 저농도 전해질 용액 간의 이온 농도 차이를 통해 전류를 발생시키는 역전기투석(Reversed Electrodialysis) 수단이 장착된 패치를 통해 피부에 미세전류가 도입되는 방식 등을 포함할 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며, 다양한 방식의 이온토포레시스가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와, 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함한다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 이온토포레시스 디바이스를 위치시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 방식으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 발현 또는 생성을 감소시킨다.
또한, 상기 조성물은 엑소좀 이외에, 그 작용(피부 건조 또는 이로 인한 가려움증 증상 완화 내지는 개선 등)을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용된 가려움증 치료제 및/또는 보습제를 함께 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종에 담지되거나 혼합될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자는 플루로닉, 정제한천, 아가로오스, 젤란검, 알긴산, 카라기난, 카시아검, 잔탄검, 갈락토만난, 글루코만난, 펙틴, 셀룰로오스, 구아검 및 로커스트빈검으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있고, 상기 다가 알코올은 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 이소부틸렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨, 자일리톨 및 글리세린으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적층되어 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트에 따르면, 상기 이온토포레시스 디바이스로부터 미세전류가 흐름으로써 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하고 피부 내부 깊숙이 침투할 수 있게 된다. 이에 따라 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 보다 효과적으로 기여할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 구체예의 엑소좀 키트는 피부 건조 또는 이로 인한 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 상기 엑소좀 키트를 이용하여, 치료용을 제외한 피부 보습, 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법을 제공한다. 본 발명의 미용방법에 있어서, 피부의 상태 조절이란 피부의 상태를 개선시키고/시키거나 피부의 상태를 예방적으로 조절하는 것을 의미하고, 피부의 상태 개선이란 피부 조직의 외관 및 느낌의 시각적 및/또는 촉각적으로 지각할 수 있는 긍정적인 변화를 의미한다. 예를 들어, 피부의 상태 개선이란 피부의 상태를 촉촉하게 하거나 매끈하게 하는 것, 또는 가려움증으로 피부를 긁거나 문질러서 나빠진 피부 상태의 개선일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법은, 전술한 바와 같은 엑소좀 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 미용방법은 (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착하는 단계와, (b) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 이온토포레시스 디바이스를 위치시키는 단계와, (c) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스를 수행하는 단계와, (d) 상기 미세전류를 통하여 상기 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 포함한다. 상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 발현 또는 생성을 감소시킨다.
본 발명의 일 구체예의 미용 방법에 있어서, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취의 적어도 일면(一面)에는 하이드로겔, 히알루론산, 히알루론산 염(예를 들어 히알루론산 나트륨 등), 또는 히알루론산 겔 중 적어도 1종이 도포될 수 있다. 상기 하이드로겔의 종류는 제한되지 않으나, 바람직하게는 겔화 고분자를 다가 알코올에 분산시켜 얻은 하이드로겔일 수 있다. 상기 겔화 고분자 및 다가 알코올은 앞선 설명들에서 예시된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용 방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취일 수 있다. 상기 (b) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 미용방법에 있어서, 상기 이온토포레시스 디바이스로부터 미세전류가 흐름으로써 줄기세포 유래의 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하고 피부 내부 깊숙이 침투할 수 있게 된다. 이에 따라 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 보다 효과적으로 기여할 수 있다.
본 발명의 엑소좀 키트는 피부 가려움증을 억제, 완화 내지는 개선시켜 주는 효과 및 피부보습 효과를 나타내고, 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 정상상태로 회복시키는 등의 피부 미용에 있어서 우수한 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 엑소좀 키트는 이온토포레시스 작용에 의해 마스크팩, 마스크시트 또는 패취에 도포되거나 침적되어 있는 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하게 하고 피부 내부 깊숙이 침투시켜 피부건조 또는 가려움증으로 인해 나빠진 피부 상태를 개선 또는 호전시키는 효과를 나타낸다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 물리적 특성 분석 결과를 도시한 것이다. "도 1A"는 TRPS(tunable resistive pulse sensing) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1B"는 NTA(nanoparticle tracking analysis) 분석에 의한 입자 크기 분포와 입자수를 나타낸다. "도 1C"는 TEM(transmitted electron microscopy) 분석에 의한 입자 이미지를 배율에 따라 도시하였다. "도 1D"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀의 웨스턴 블랏 결과를 나타낸다. "도 1E"는 본 발명의 일 구체예에 따라 얻어진 엑소좀에 대한 마커 분석에 있어서 CD63 및 CD81에 대한 유세포분석 결과를 나타낸다.
도 2는 인체 피부섬유아세포인 HS68 세포에 본 발명의 일 구체예에 따라 수득된 엑소좀을 처리한 후 세포 독성이 없음을 확인한 결과를 도시한다.
도 3은 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 4는 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C와 함께 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 처리한 결과, TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 생성량이 감소한 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 5는 PKH67로 염색된 엑소좀을 확인한 형광강도 측정 결과를 도시한다.
도 6은 돼지 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 형광현미경 이미지이다.
도 7은 생쥐 피부조직 내부로, 형광염색된 엑소좀이 전달된 정도를 확인한 공초점형광현미경 이미지이다.
도 8은 도 7의 각 이미지 상의 형광강도를 측정하여 얻은 총 형광강도를 비교하여 도시한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 엑소좀 키트를 사람 피부에 처리하고 처리 전후의 피부 상태를 비교하는 사진이다.
도 10은 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 포함하는 조성물을 사람의 피부(환부)에 도포한 후 상기 조성물이 도포된 피부(환부)에 미세전류를 흘려주는 이온토포레시스를 수행한 결과, 피부(환부)의 홍반 등이 현저히 개선된 것을 보여주는 사진이다.
도 11은 본 발명의 엑소좀 키트를 사람 피부에 처치한 경우, 피부 보습이 현저히 개선된 결과를 도시한다.
도 12는 인간 피부각질세포(human keratinocyte)인 HaCaT 세포에 대해 Poly I:C를 처리하기 전에 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀을 전처리(pre-treatment)한 결과, 엑소좀의 용량 의존적으로 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인한 리얼타임 PCR 결과를 도시한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)의 구성을 나타내는 사시도이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
인체 피부 섬유아세포(human dermal fibroblast)인 HS68 세포는 ATCC에서 구입하여, 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: ThermoFisher Scientific에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제 (antibiotics-antimycotics: ThermoFisher Scientific에서 구입)가 함유된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 5% CO2, 37℃ 조건에서 계대 배양하였다.
당해 발명이 속하는 기술분야에 알려진 세포배양 방법에 따라 5% CO2, 37℃ 조건에서 지방 유래 줄기세포를 배양하였다. 그 다음, 인산염 완충용액(phosphate-buffered saline)(ThermoFisher Scientific에서 구입)으로 세척 후, 무혈청, 무페놀레드 배지로 교체하여 1일 내지 10일간 배양하고 그 상층액(이하, 배양액)을 회수하였다.
엑소좀의 분리 과정에서 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 배양액에 트레할로오스를 2 중량% 첨가하였다. 트레할로오스를 첨가한 후 배양액을 0.22 μm 필터로 여과하여 세포 잔해물, 노폐물 및 거대 입자 등의 불순물을 제거해 주었다. 여과된 배양액은 즉시 분리 과정을 통해 엑소좀을 분리하였다. 또한, 여과된 배양액은 냉장고(영상 10℃ 이하)에서 보관한 후 엑소좀 분리에 사용하였다. 또한, 여과된 배양액은 -60℃ 이하의 초저온 냉동고에서 동결 보관하였다가 해동시킨 후 엑소좀 분리를 수행하였다. 이후, 배양액으로부터 접선흐름여과장치(Tangential Flow Filtration; TFF)를 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
실시예 2: TFF 방법에 의한 엑소좀의 분리 및 정제
실시예 1에서 0.22 μm 필터로 여과된 배양액으로부터 엑소좀을 분리, 농축, 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 위해 TFF(Tangential Flow Filtration) 방법을 사용하였다. TFF 방법을 위한 필터로는 카트리지 필터(cartridge filter, 일명 hollow fiber filter; GE Healthcare에서 구입) 또는 카세트 필터(cassette filter; Pall 또는 Sartorius 또는 Merck Millipore에서 구입)를 사용하였다. TFF 필터는 다양한 분자량 차단(molecular weight cutoff; MWCO)에 의해 선택될 수 있다. 선택된 MWCO에 의해 선별적으로 엑소좀을 분리, 농축하였고, MWCO보다 작은 입자나 단백질, 지질, 핵산, 저분자 화합물 등은 제거하였다.
엑소좀을 분리, 농축하기 위하여 MWCO 100,000 Da(Dalton), 300,000 Da, 또는 500,000 Da의 TFF 필터를 사용하였다. 배양액을 TFF 방법을 이용하여 1/100 내지 1/25 정도의 부피가 될 때까지 농축하면서, MWCO보다 작은 물질들은 제거하여 엑소좀을 분리하였다.
분리, 농축된 엑소좀 용액은 TFF 방법을 이용하여 추가로 탈염과 버퍼교환(diafiltration)을 수행하였다. 이때, 탈염과 버퍼교환은 연속적으로 수행(continuous diafiltration)하거나 단속적으로 수행(discontinuous diafiltration)하였으며, 시작 부피(starting volume)에 대하여 적어도 4배, 바람직하게는 6배 내지는 10배 이상, 보다 바람직하게는 12배 이상의 부피를 갖는 완충용액을 이용하여 수행하였다. 완충용액에는 입자크기 분포가 균일하고 순도가 높은 엑소좀을 수득하기 위하여 PBS에 녹인 2 중량%의 트레할로오스를 첨가하였다.
실시예 3: 분리된 엑소좀의 특성 분석
분리된 엑소좀은 나노입자 트랙킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; Malvern에서 구입) 또는 가변 저항펄스 감지(tunable resistive pulse sensing: TRPS; Izon Science에서 구입)에 의해 입자의 크기와 농도를 측정하였다. 분리된 엑소좀의 균일도와 크기는 투과전자현미경(transmitted electron microscopy: TEM)을 이용하여 분석하였다. 본 발명의 일 구체예에 따라 분리된 엑소좀의 TRPS, NTA, TEM 분석 결과는 도 1A 내지 도 1C에 도시하였다.
도 1D는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 웨스턴 블랏을 수행한 결과로서, CD9, CD63, CD81 및 TSG101 마커의 존재를 확인하였다. 각 마커에 대한 항체로는 각각 항-CD9 (Abcam에서 구입), 항-CD63 (System Biosciences에서 구입), 항-CD81 (System Biosciences에서 구입), 및 항-TSG101 (Abcam에서 구입)을 사용하였다.
도 1E는 본 발명의 일 구체예의 방법에 따라 분리된 엑소좀에 대해 유세포분석기를 이용하여 분석한 결과로서 CD63 및 CD81 마커의 존재를 확인하였다. CD63에 대해 양성(positive)인 엑소좀을 분리하기 위하여 엑소좀-휴먼 CD63 분리/검출 키트(ThermoFisher Scientific에서 구입)를 제조사의 방법에 따라 사용하였고, PE-마우스 항-인간 CD63 (PE-Mouse anti-human CD63)(BD에서 구입) 및 PE-마우스 항-인간 CD81 (PE-mouse anti-human CD81)(BD에서 구입)을 사용하여 마커를 염색한 후, 유세포분석기 (ACEA Biosciences)를 이용하여 분석하였다.
한편, 본 발명에서 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 전술한 바와 같은 실시예들의 엑소좀에 제한되는 것이 아니며, 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 줄기세포 유래의 엑소좀을 사용할 수 있음은 물론이다. 상기 실시예들에 따라 분리된 엑소좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 줄기세포 유래의 엑소좀의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
실시예 4: 엑소좀 처리에 따른 세포 독성 측정
인체 피부 섬유아세포인 HS68 세포에서 본 발명의 일 구체예의 분리 방법에 따라 수득된 엑소좀의 독성을 평가하기 위해 세포에 농도별로 엑소좀을 처리하고 세포의 증식률을 확인하였다. HS68 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 80 내지 90%의 밀집도(confluency)를 갖도록 분주하고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 24시간 후, 배양액을 제거하고 실시예 2에서 준비된 엑소좀을 농도 별로 처리하여 24 내지 72시간 동안 배양하면서 세포 생존율을 평가하였다. 세포 생존율을 WST-1 시약(WST-1 reagent)(Takara에서 구입), MTT 시약(Sigma에서 구입), 셀타이터-글로 시약(CellTiter-Glo reagent)(Promega에서 구입), 또는 아라마르 블루 시약(alamarBlue reagent)(ThermoFisher Scientific에서 구입)과 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 측정하였다.
비교군은 엑소좀이 처리되지 않은 일반 세포배양배지에서 배양된 세포수를 기준으로 하였고, 시험된 농도 범위 내에서 줄기세포 유래의 엑소좀에 의한 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 2).
실시예 5: HaCaT 세포를 이용한 TSLP 억제 효과 측정
실시예 5-1: Poly I:C와 줄기세포 유래의 엑소좀 동시 처리 (co-treatment)
TSLP는 가려움증이 심한 환자의 상피세포나 피부각질세포(human keratinocytes)에서 과도하게 증가되어 있고, 피부 가려움증의 원인이 되는 물질로 알려져 있다. 따라서, 특정 후보물질이 피부각질세포에서 유도되는 TSLP를 억제하는지 여부를 확인하면 후보물질의 가려움증 억제 내지 완화 효과를 확인할 수 있다. 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 12웰 플레이트 (12 well plate)의 각 웰에 1×105의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 DMEM 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 3에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 Poly I:C (Sigma에서 구입) 및 히스타민(Histamine)(Sigma에서 구입)과, 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용됨)을 함께 처리하여 24시간 배양하였다. 각 실험군의 HaCaT 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 가려움증의 주요 원인이 되는 TSLP의 mRNA 변화량을 측정하였다. TSLP 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 β-액틴 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 하기 표 1과 같다.
| 유전자 | 서열 | |
| 정방향 프라이머 (5' → 3') | 역방향 프라이머 (5' → 3') | |
| TSLP | GCTATCTGGTGCCCAGGCTAT (서열번호 1) | CGACGCCACAATCCTTGTAAT (서열번호 2) |
| β-actin | GGCCATCTCTTGCTCGAAGT (서열번호 3) | GACACCTTCAACACCCCAGC (서열번호 4) |
또한, 인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM (ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 6웰 플레이트(6-well plate)의 각 웰에 5×105의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 DMEM 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 4에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 Poly I:C (Sigma에서 구입) 및 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용됨)을 처리하여 24시간 배양하였다. 각 실험군에서의 TSLP 단백질의 생성량을 TSLP 항체 (Abcam, Cambridge, MA)를 이용한 웨스턴 블랏을 통해 측정하였다. 단백질 양은 표준 물질인 BSA(bovine serum albumin)를 사용한 BCA 방법으로 정량하였다. 각 실험군에서의 TSLP 단백질 양은 GAPDH 단백질 양으로 정규화(normalization)하여 보정하였다.
그 결과, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부각질세포에서, 가려움증의 원인이 되는 TSLP의 mRNA 발현량 및 단백질 생성량을 감소시키는 것을 확인하였다(도 3 및 도 4). 이러한 결과들은 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀이 가려움증을 일으키는 주요 표적인 TSLP에 대해 효과적으로 작용하며, 본 발명의 엑소좀 키트는 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 5-2: Poly I:C 처리 전에 줄기세포 유래의 엑소좀 전처리 (pre-treatment)
인간 피부각질세포인 HaCaT 세포를 10% HKGS(Human Keratinocyte Growth Supplement), 1% 암포테리신 B(Sigma에서 구입) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 154CF 배지(0.03mM CaCl2)(ThermoFisher Scientific에서 구입) 배지에 현탁시킨 후 24웰 플레이트 (24 well plate)의 각 웰에 5×104의 밀도로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후 무혈청 154CF 배지에서 추가로 24시간 배양 후 부착된 세포를 PBS로 2회 세척하였고, 도 12에 도시된 실험군 분류에 따라 무혈청 배지에서 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀으로서 본 발명의 엑소좀 키트에 사용됨)을 전처리(pre-treatment)하여 24시간 배양한 다음, Poly I:C (Sigma에서 구입)를 처리하고 4시간 배양하였다. 각 실험군의 HaCaT 세포로부터 분리한 RNA로부터 cDNA를 제조하고 리얼타임 PCR 방법을 이용하여 가려움증의 주요 원인이 되는 TSLP의 mRNA 변화량을 측정하였다. TSLP 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로서 β-액틴 유전자를 사용하였다. 리얼타임 PCR에 사용한 프라이머의 종류와 서열은 상기 표 1과 같다.
그 결과, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 줄기세포 유래의 엑소좀은 피부각질세포에서, 가려움증의 원인이 되는 TSLP의 mRNA 발현량을 엑소좀의 용량 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다(도 12). 이러한 결과는 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀이 가려움증을 일으키는 주요 표적인 TSLP에 대해 효과적으로 작용하며, 본 발명의 엑소좀 키트는 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료를 위해 유용하게 사용될 수 있는 것임을 강력히 시사한다.
실시예 6: 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀의 피부 투과 능력 시험
형광염색된 엑소좀을 제조하기 위하여 PKH67 염료(Sigma에서 구입)를 사용하였다. 1 mM의 PKH67을 Diluent C (Sigma에서 구입)에 희석하여 10 μM의 PKH67 용액을 제조한 후, 적정 농도의 엑소좀 용액과 혼합하여 상온에서 빛을 차단한 상태로 10분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, PKH67로 염색된 엑소좀(이하, "PKH-엑소좀"으로 약칭)으로부터 잔여 PKH67 염료를 제거하기 위하여 MW3000 스핀 컬럼(ThermoFisher Scientific에서 구입)을 사용하였다. 형광측정기(Molecular Devices에서 구입)를 이용하여 확인한 결과 엑소좀과 반응하지 않은 PKH67을 제거한 후, PKH-엑소좀에서 충분한 강도의 형광이 검출됨을 확인하였다(도 5).
PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 돼지 피부 바깥면에 도포하였다. 도포된 PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 덮어 준 후 적정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 반응시켜 PKH-엑소좀이 피하 조직에 전달되도록 하였다. 또한, PKH-엑소좀을 돼지 피부 바깥면에 도포하고 부직포를 덮어 준 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 종료된 후, 돼지 피부조직을 3.7% 포름알데히드 용액에 담궈 하룻밤 동안 반응시키고, 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척하였다. 세척된 돼지 피부조직을 30% 수크로오스 용액에 담가 처리한 후, OCT 화합물을 처리하였다. 다시 인산완충용액으로 5분씩 3회 세척한 후, 마이크로톰을 이용하여 종단면으로 절편을 제작하여 슬라이드글라스 위에 조직 절편을 위치시켰다. 한편 조직 절편의 제작은 포름알데히드 용액으로 조직을 고정하기 전에 진행할 수도 있다. 조직 절편에서 PKH-엑소좀으로부터 검출되는 형광은 형광현미경을 이용하여 관찰하였다. 이상의 방법으로 돼지 피부조직의 표피를 투과하여 피하 조직으로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 도 6에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 키트에 사용되는 엑소좀은 표피를 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달될 수 있고, 피부에 대해 효과적으로 흡수될 수 있다. 따라서, 본 발명의 엑소좀 키트는 피부 보습, 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료 등에 있어서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
다음으로, 헤어리스 마우스의 피부조직을 적출하여 프란츠 확산셀(Franz Diffusion Cell)의 챔버 위쪽에 위치시켰다. 이때, 확산셀의 내부는 인산완충용액으로 채워주었다. PKH-엑소좀을 적정 농도, 예를 들어 1×105 입자/mL 내지 1×109 입자/mL 농도로 인산완충용액(PBS)에 분산시킨 후, 생쥐의 피부조직 바깥쪽에 도포하였다. 이때, PKH-엑소좀의 건조를 막기 위하여 부직포를 생쥐 피부조직 바깥쪽에 미리 위치시키고, 부직포와 피부조직 사이에 PKH-엑소좀을 주입하였다. 그 후 30분 내지 1시간 동안 반응시켰다. 또한, PKH-엑소좀을 부직포와 피부조직 사이에 주입한 후, 일정 시간, 예를 들어 30분 내지 1시간 동안 미세 전류를 흘려주었다. 반응이 끝난 후, 즉시 공초점형광현미경(Leica, SP8X)을 이용하여 피부조직 내부로 전달된 PKH-엑소좀을 확인하거나, 1시간 내지 6시간 동안 피부조직과 PKH-엑소좀 용액을 추가로 반응시킨 후, 공초점형광현미경으로 PKH-엑소좀을 확인하였다. 그 결과, 미세 전류를 흘려주는 경우(active transdermal delivery), 엑소좀이 표피를 보다 효과적으로 통과하여 피부조직 내부로 깊숙이 전달되었고, 피부에 대해 보다 효과적으로 흡수되는 것을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8 참조).
이상의 실험결과들을 종합하면, 본 발명의 엑소좀 키트를 피부에 적용할 경우, 엑소좀이 표피를 효과적으로 통과하여 피부 보습, 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료 등에 있어서 효과적으로 작용할 것으로 기대된다.
실시예 7: 사람 피부에 대한 엑소좀 키트의 처치
도 13에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 구체예에 따른 엑소좀 키트(100)는 액상 침적 시트 마스크(10)(줄기세포 유래의 엑소좀을 함유하는 조성물이 도포되거나 침적된 흰색 시트 마스크)와 이온토포레시스 디바이스인 경피투과 촉진 시트 마스크(은색 시트 마스크)(20)로 구성되어 있다. 액상 침적 시트 마스크(10)의 표면 내지는 내부에는 줄기세포 유래의 엑소좀(12)이 도포되거나 침적되어 있다. 또한, 경피투과 촉진 시트 마스크(20)에는 미세전류를 발생시키는 전지(22)가 장착되어 있고, 이러한 전지(22)와 전기적으로 연결되어 있는 도전성 패턴(24)이 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 상에 형성되어 전지(22)로부터 발생된 미세전류를 경피투과 촉진 시트 마스크(20) 전반에 골고루 전달할 수 있다. 도전성 패턴(24)은 금, 은, 또는 구리 등의 도전성 금속이 프린팅되거나 도금(plating)되어 형성된다.
상기와 같은 구성을 갖는 "엑소좀 키트(100)"를 피부건조 및 가려움증과 관련이 있는 홍조 증상과 피부 트러블이 심한 사람(이하, "case 1"이라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 피부 트러블과 홍조 증상이 완화 내지는 개선되는지를 평가하였다. 또한, 본 발명의 엑소좀 키트(100)를 홍조 증상이 있는 사람(이하, "case 2"라 함)의 얼굴에 1회 적용하여 전체적인 피부톤과 홍조 증상이 개선되는지를 평가하였다. 5×105 입자의 엑소좀(12)이 포함된 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 case 1 및 2의 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용하였다.
그 결과, 줄기세포 유래의 엑소좀(12)을 5×105 입자/마스크의 농도로 함유하는 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(20)로 구성된 "엑소좀 키트(100)"의 한번의 사용만으로 "case 1"에서 홍조 및 피부 트러블이 현저히 개선되었고(도 9의 case 1 참조), "case 2"에서도 전체적인 피부톤이 개선되었으며 홍조가 완화되었다(도 9의 case 2 참조). 따라서, 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물이 침적된 액상 침적 시트 마스크(10)와 경피투과 촉진 시트 마스크(이온토포레시스 디바이스)(20)로 구성된 본 발명의 엑소좀 키트(100)는 피부건조 및 가려움증과 관련이 있는 홍조 증상 및 피부트러블을 예방, 억제, 완화 내지는 개선시키는 효과가 있다고 할 수 있다.
또한, 줄기세포 유래의 엑소좀을 0.29×108 입자/mL의 농도로 함유하는 조성물(엑소좀 현탁액)을, 가려움증을 호소하는 중증 아토피 환자 3인의 환부(손, 목, 팔 등)에 도포한 후 이온토포레시스 장비(IONZYME DF MACHINE)(Environ에서 구입)를 사용하여 상기 조성물이 도포된 환부에 20분 동안 0.4 mA의 미세전류를 흘려주는 이온토포레시스를 수행하였다. 상기와 같은 처치를 2주 동안 주3회에 걸쳐 시행한 결과, 환자들의 극심한 가려움증이 현저히 완화되었고, 홍반 증상 역시 현저히 개선되었다(도 10). 줄기세포 유래의 엑소좀을 함유하는 조성물을 적용한 환자들 모두 극심한 가려움증과 홍반이 완화되어 스테로이드나 항히스타민 제제의 처방을 중단해도 될 정도로 증상이 개선되었다.
따라서, 본 발명의 엑소좀 키트(100)는 상기와 같은 임상시험을 통해 확인되는 바와 같이 피부건조 및 이로 인한 가려움증의 예방, 억제, 개선, 완화 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 8: 사람 피부에 대한 보습 효과의 시험
피부질환을 포함하는 급·만성 신체 질환이 없는 건강한 여성 20명(만 35~59세)에 대해, 줄기세포 유래의 엑소좀(실시예 2에서 준비된 엑소좀)을 1×107 입자/mL의 농도로 함유하는 앰플(반투명 유액상)과 본 발명의 엑소좀 키트(100)를 3일에 한번 저녁에 사용하여 피부보습 효과를 시험하였다. 상기 앰플 및 엑소좀 키트(100)의 사용 전, 사용 2주 후, 사용 4주 후에, 수분측정기(Corneometer CM825)(Courage-Khazaka eletronic GmbH, Germany)로 피부 수분량을 측정하여 피부 보습 개선 효과를 평가하였다.
세안 후 상기 앰플의 내용물을 얼굴에 골고루 바르고 액상 침적 시트 마스크(10)를 눈과 입 부분에 맞추어 얼굴 전체에 고르게 밀착시킨 다음, 약 0.3~0.4 mA의 미세 전류가 흐르도록 액티베이션된 경피투과 촉진 시트 마스크(20)를 액상 침적 시트 마스크(10) 위에 적층시켜 25~30분 정도 사용하였다.
본 발명의 엑소좀 키트(100)의 사용 전후에 있어서 피부 수분 함유량을 평가한 결과, 사용 전과 비교하여 사용 2주 후, 사용 4주 후에 유의적인 개선 효과가 얻어졌다(도 11의 상단). 또한, 피부 수분 함유량의 변화율이 다른 임상 처치들의 경우 평균 10%인데 비해 본 발명의 엑소좀 키트(100)를 4주 동안 사용한 경우에는 21.383%로서 평균과 대비하여 매우 좋은 것으로 평가되었다(도 11의 하단).
시험 종료 후 유효성 설문조사(Global Assessment of Efficacy)를 실시하였다. 시험대상자가 본 발명의 엑소좀 키트(100) 사용 후 피부 보습에 대하여 아주좋음(4), 좋음(3), 보통(2), 나쁨(1), 아주나쁨(0)의 5단계로 설문조사에 답하도록 하였다. 실시한 설문조사에서 피부보습 항목에 대해 설문 값의 평균값과 표준편차 및 답변에 대한 시험대상자 수의 백분율을 구하였다. 본 발명의 엑소좀 키트(100)에 대한 설문조사 결과, 피부보습 항목에 대하여 시험대상자의 100%가 보통이상으로 평가하였다. 또한, 시험 종료 후 본 발명의 엑소좀 키트(100) 사용감에 대한 설문조사에 대하여 시험대상자가 답하도록 하였다. 시험대상자가 피부 촉촉함, 매끄러움, 발림성, 흡수성, 향, 전반적 사용감에 대하여 아주 좋음(4), 좋음(3), 보통(2), 나쁨(1), 아주 나쁨(0)의 5단계로 평가하도록 하였다. 평가항목 별로 설문 값의 평균값과 표준편차 및 답변에 대한 시험대상자 수의 백분율을 구하였다. 본 발명의 엑소좀 키트(100)에 대한 설문평가 결과, 모든 평가항목에 대하여 시험대상자의 100%가 보통이상으로 평가하였다.
한편, 시험대상자가 본 발명의 엑소좀 키트(100)를 사용하는 기간 동안 특별한 피부 이상반응에 대한 보고는 없었으며, 피부과 전문의에 의한 이학적 검사 상에도 이상소견은 관찰되지 않았다.
따라서, 본 발명의 엑소좀 키트(100)는 상기와 같은 임상시험을 통해 확인되는 바와 같이 종래의 임상 처치에 비해 우수한 피부 보습 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
Claims (9)
- 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취와,상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스 디바이스를 포함하는, 피부 보습 및 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료용 엑소좀 키트.
- 제1항에 있어서,상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착시키고, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 이온토포레시스 디바이스를 위치시킴으로써, 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 발현 또는 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취인, 엑소좀 키트.
- 제4항에 있어서,상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 적층되어 사용되는 것을 특징으로 하는, 엑소좀 키트.
- (a) 줄기세포 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물이 도포되거나 침적된 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 포유동물의 피부 위에 접촉 또는 부착하는 단계와,(b) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 이온토포레시스 디바이스를 위치시키는 단계와,(c) 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취가 접촉 또는 부착되어 상기 조성물이 적용된 포유동물의 피부에 미세전류를 흘려 주는 이온토포레시스를 수행하는 단계와,(d) 상기 미세전류를 통하여 상기 엑소좀을 포유동물 피부 내부로 전달하는 단계를 포함하는, 치료용을 제외한 피부 보습 및 피부 가려움증의 예방, 억제, 완화 또는 개선을 통해 포유동물 피부의 상태를 조절하는 미용방법.
- 제6항에 있어서,상기 줄기세포 유래의 엑소좀은 TSLP(Thymic stromal lymphopoietin)의 발현 또는 생성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 미용방법.
- 제6항 또는 제7항에 있어서,상기 이온토포레시스 디바이스는 가요성 배터리, 리튬이온 이차 전지, 알칼리 전지, 건전지, 수은 전지, 리튬 전지, 니켈-카드뮴 전지, 및 역전기 투석 전지로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종의 전지를 포함하거나, 상기 적어도 1종의 전지가 장착된 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취인, 미용방법.
- 제8항에 있어서,상기 (b) 단계는 상기 제1 마스크팩, 마스크시트 또는 패취 위에 상기 제2 마스크팩, 마스크시트 또는 패취를 적층하여 수행되는, 미용방법.
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