KR101517828B1 - 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 - Google Patents

홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 체내에서 항산화 작용을 하는 효능, 체내에서 항염증 작용을 하는 효능, 리파아제의 활성을 억제하는 효능, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효능, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효능, 지방 세포의 크기를 감소시키는 효능, 신주위 지방의 무게를 감소시키는 효능을 보유하는 특징을 가지고 있다.

Description

홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물{A COMPOSOTION FOR THE TREATMENT OF OBESITY COMPRISING THE RED GINSENG COMPLEX}
본 발명은 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물 중 1개 이상의 추출물을 혼합한 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 비만 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 체내에서 항산화 작용을 하는 효능, 체내에서 항염증 작용을 하는 효능, 리파아제의 활성을 억제하는 효능, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효능, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효능, 지방 세포의 크기를 감소시키는 효능, 신주위 지방의 무게를 감소시키는 효능을 보유하는 특징을 가지고 있다.
본 발명은, 홍삼 추출물 100 ~ 300 중량부 기준으로, 천마 추출물, 적하수오 추출물 또는 상엽 추출물을 30 ~ 100 중량부로 선택적으로 혼합하여 제조한 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
당뇨병, 내당능 장애, 비만, 고혈압, 고지혈증, 심장병, 뇌졸중, 죽상경화 등의 질환은 여러 심혈관계 위험인자들이 한 개체 내에서 군집적으로 다양하게 발현되어 발병되는 질환들로, 서로 연관성이 있는 질환들이다. 예를 들어, 당뇨병 발병시 대사증후군과 관련된 심혈관 질환의 위험도가 증폭된다. 이들은 이렇게 상호유기적으로 맞물려 있는 질환이므로 최근에 들어서는 당뇨병, 내당능 장애, 비만, 고혈압, 죽상경화, 고지혈증, 심장병, 뇌졸중 등의 질환을 같은 계통의 질환으로 인식하고 있는 추세이다. 대사증후군(metabolic syndrome)이라는 단어는 이러한 질환들을 아우르는 개념이다.
대사증후군은 유전적 소인, 식생활 습관 및 영양상태, 신체 활동 정도 등 다양한 요인에 의해 영향을 받는 질환이기 때문에 대사증후군을 진단할 수 있는 지표, 즉 진단기준은 매우 다양하다.
현재 사용되고 있는 대사증후군의 진단기준은 세계보건기구(1998년), 유럽인슐린저항성연구회(1999년), 미국 국립 콜레스테롤 교육 프로그램 위원회의 제3차 보고서(2001년) 등에 있는 진단기준을 사용하고 있다. 국제당뇨병연맹(International Diabetes Federation)에서도 2005년에 새로운 대사증후군의 진단기준을 발표하였다. 하단의 [표 1]은 주요 연구 기관에서 각각 제시한 대사증후군의 진단 기준을 비교한 것이다.
구분 세계보건기구(1998년) 미국 국립콜레스테롤 교육 프로그램 위원회 제3차
보고서(2001년)		 국제당뇨병연맹(2005년)
인슐린 저항성 내당능장애,
공복혈당장애,
제2형 당뇨병, 또는 인슐린 감수성 감소
-다음 중 2가지 이상		 없음
그러나 다음 5가지 중 3가지 이상		 없음
체중 남자 : 허리-엉덩이 둘레비>0.90
여자 : 허리-엉덩이 둘레비>0.85
체질량지수>30kg/m2 		허리둘레 102 cm(남)
또는 88 cm(여)
-아시아 기준치 90 cm(남), 80 cm(여)		 (인종에 따른) 허리둘레 증가 + 다음 중 2가지 이상
지질
 중성지방 150mg/dL 또는 HDL-C<35mg/dL(남), <39mg/dL(여)
 중성지방 150 mg/dL 중성지방 150 mg/dL 또는 고중성지방혈증 치료중
HDL-C<40 mg/dL(남) 또는 <50 mg/dL (여) HDL-C<40 mg/dL(남) 또는 <50 mg/dL (여) 또는 저HDL-C 혈증 치료중
혈압 140/90 mmHg 130/85 mmHg 수축기혈압 130 mmHg 또는 이완기혈압 85 mmHg 또는 고혈압 치료중
혈당 내당능장애, 공복혈당, 또는 제2형 당뇨병 110 mg/dL (당뇨병 포함) 100 mg/dL (당뇨병 포함)
기타 미세알부민뇨
대사증후군의 발병 추이에 대해서는 근래에 시행된 1998년과 2001년에 국민건강영양 조사 자료를 근거로 조사하였다.
한국인의 대사증후군의 증가양상에 대한 분석결과에 의하면 연령보정 대사증후군 유병률이 1998년 22.5 %에서 2001년 24.1 %로 최근 3년간 약 7.1 % 증가하였다. 최근 연세대학교 의과대학 예방의학교실 김현창 교수 연구팀이 조사한 2005년 국민영양건강조사 보고서에 의하면 60대 이상의 국민 50 % 이상이 대사증후군 유병률을 보이고 있다.
최근에는 젊은층인 30대의 대사증후군 발병률도 크게 높아지고 있다. 미국역학학회에서 발간하는 국제학술지(Annals of Epidemiology)에서 강북삼성병원 산업의학과 유승호 교수팀은 2002년 직장건강검진에서 대사증후군이 없었던 30대 직장인 4천779명을 대상으로 추적 관찰한 결과, 평균 2년 1개월 만에 14.8 %(708명)가 새로운 대사증후군 환자로 진단됐다고 밝혔다. 이처럼 대사 증후군은 요인에 관계없이 발병할 수 있는 질환으로, 사회 경제적으로 중요한 이슈로 대두되고 있다.
대사증후군의 치료법으로는 체중감량약제나 PPAR 작용약물, β-3 수용체 효현제, 알파-리포익 산(alpha-lipoic acid), 혈당강하제, 당뇨 치료제, 혈압강하제 등을 쓸 수 있다.
한편, 비만은 섭취한 열량이 소비한 열량보다 높아 소모되지 않은 열량이 몸에 과도하게 축적된 상태를 지칭한다. 수치상의 개념으로는 BMI(body mass index, 체질량지수) 측정시 25 이상일 경우를 비만으로 정의한다. BMI 측정법은 체중(kg)을 키의 제곱(㎡)으로 나눈 값을 통해 체지방의 양을 추정하는 비만측정법이다.
비만의 원인은 유전적 요인, 생활습관적 요인 등으로 나눌 수 있다. 유전적 요인으로는 FTO 등의 비만 유전자를 보유한 경우를 들 수 있다. 비만 유전자는 현재까지 20여 종이 밝혀져 있으며, 그 중 FTO가 대표적인 비만 유전자이다. FTO는 시상하부의 포만감을 조절하는 중추에 관여하여, 포만감을 느낄 수 있는 호르몬의 분비를 억제하는 것으로 알려져 있다.
생활습관적 요인에는 운동 부족, 불균형한 식습관 등을 들 수 있다. 운동이 부족하면 체내의 지방이 연소되지 않고 축적된다. 또한 탄수화물 및 지방을 과다섭취하고 비타민 및 섬유질을 적게 섭취하는 등 영양소의 균형이 잡히지 않으면 운동 부족 시와 동일하게, 체내의 지방이 연소되지 않고 축적된다.
비만의 치료에는 약물 요법 등이 있다. 약물 요법은 비만치료제를 비만 환자에게 투여하는 치료법으로, 비만치료제에 대하여 간략히 살펴보겠다.
비만치료제의 종류에는 식욕억제제, 대사항진제, 흡수억제제, 열생성 촉진제 등이 있다. 식욕억제제는 포만감항진제라고도 하며, 시상하부의 포만감 중추에 작용하여 음식을 소량 섭취하여도 다량 섭취한 것과 유사한 효과를 낸다. 펜디메트라진, 펜터민 등이 있다.
대사항진제는 체내의 에너지 소비를 증가시켜 기초대사량을 증가시킨다.
흡수 억제제는 위장관 지방분해 효소의 작용을 억제하여 지방흡수를 저해한다. 열생성 촉진제는 식욕억제제의 효과를 극대화해줄 수 있어 식욕억제제와 함께 보조적으로 처방된다.
그러나 각 약물들에는 모두 부작용이 있다. 하단의 [표 2]는 각 약물의 부작용을 표기한 것이다.
비만 치료제 종류 부작용
식욕억제제(포만감 항진제) 두통, 불면 등
대사항진제 손발 저림 등
흡수억제제 지방변, 잦은 방귀 등
열생성촉진제 손떨림 등
따라서 본 출원인은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용을 동반하지 않으며, 혈장 내 지질을 효과적으로 감소시킴으로써 비만을 예방 또는 개선할 수 있는 조성물을 안출하였다.
본 발명은 천연물 소재로 홍삼, 천마, 적하수오 및 상엽을 사용하고 있는바, 이하에서 천연물 소재 및 추출방법에 대하여 간략히 서술한다.
홍삼은 오가피과에 속하는 다년생 식물인 인삼(Panax ginseng C. A. Meyer)을 수증기(증삼) 또는 기타 방법으로 쪄서 건조하여 가공한 것을 일컫는다.
인삼은 건조여부와 가공방법에 따라 수삼, 건삼, 홍삼 추출물으로 나눌 수 있다. 수삼은 어떠한 가공도 하지 않은 날것의 인삼이며, 건삼은 익히지 않고 햇볕, 열풍 등으로 말린 인삼이다.
본 발명을 안출하기 위한 실험에서는 홍삼의 소재로서 전라북도 진안군에서 생산된 홍삼을 이용하였다.
천마(Gastrodia elata)는 난초과에 속하는 여러해살이풀이다. 한국, 일본, 중국, 타이완에 분포하며, 부식질이 많은 계곡의 숲 속에서 식물의 뿌리에 활물기생한다.
높이는 60~100cm이며, 잎이 없고 감자 모양의 덩이줄기가 있다. 덩이줄기는 긴 타원형이며 길이 10~18cm, 지름 3.5cm 정도로 뚜렷하지 않은 테가 있다. 줄기는 붉은 밤색에 조그만 잎이 듬성듬성 난다. 잎집 같은 잎은 막질이며 잔맥이 있고 밑부분이 줄기를 둘러싼다.
꽃은 6~7월에 황갈색으로 개화하며 총상꽃차례를 이루어 많이 달린다. 열매는 삭과(殼果)로 달걀을 거꾸로 세운 모양이며 겉에 화피가 남아 있다. 전초를 강장제, 신경쇠약, 현기증, 두통 등에 사용한다.
적하수오(Pleuropterus multflorus)는 마디풀과에 속하는 여러해살이풀이다. 중국에 분포하며, 한국에서는 지리산 능선과 계방산 계곡에 서식한다. 뿌리줄기가 땅속으로 뻗으면서 굵은 덩이뿌리가 생긴다. 원줄기는 가지가 갈라지면서 길게 벋어가고 털이 없다.
잎은 어긋나고 달걀 모양, 심장형이며 끝이 뾰족하다. 잎 가장자리는 밋밋하고 턱잎은 원통 모양으로 짧다. 잎자루 밑부분에는 짧은 잎집이 있다. 꽃은 8~9월에 흰색으로 개화하며 원추꽃차례로 달리고 2가화이다.
열매는 수과로서 넓은 달걀을 거꾸로 세운 듯한 모양이고 꽃받침으로 싸이며 3개의 날개가 있다. 강장제, 강정제, 완하제 등으로 사용한다.
상엽은 뽕나무과에 속하는 뽕나무(Morus alba)의 잎을 일컫는다.
뽕나무는 온대, 아열대 지방에 분포한다. 작은 가지는 회색빛을 띤 갈색 또는 회색빛을 띤 흰색이고 잔털이 있으나 점차 없어진다.
잎은 달걀 모양 원형 또는 긴 타원 모양 원형이며 3~5개로 갈라지고 길이 10cm로서, 가장자리에 둔한 톱니가 있으며 끝이 뾰족하다. 잎자루와 더불어 뒷면 맥 위에 잔털이 있다. 꽃은 6월에 개화하며, 열매는 6월에 검은색으로 익는다. 열매를 '오디'라고 지칭하며 술을 담그거나 생과로 먹는다.
잎은 발열, 두통, 안구충혈, 해수, 구갈, 피부 두드러기 등의 치료에 사용하며 뿌리껍질은 한방에서 해열, 진해, 이뇨제, 소종에 쓰고 목재는 가구재로 이용한다.
비만에 대한 선행 기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제 1020030075067호에는 체중감량에 도움을 주는 진피 복합제의 추출방법에 관하여 기재되어 있다.
개략적으로 살펴 보면, 감귤 껍질을 말린 진피 23%, 상엽 18.7%, 결명자 17.2%, 녹차잎 13.8%, 숙지황 10.3%, 오가피 5.2%, 두충 5.2%, 홍삼 3.4%, 당귀 3.4%를 혼합한 혼합물 100: 물 400의 비율로 혼합하는 공정과, 상기 혼합물 100: 물 400의 비율로 혼합하여 중탕기에서 80 ℃의 온도로 8시간 동안 액상으로 중탕하는 공정과, 상기 중탕 액을 여과기로 여과하는 공정과, 상기 농축된 혼합액 90%에 폴리덱스트로오스 10%를 혼합하는 공정과, 상기 혼합액 90 %에 폴리덱스트로오스 10%를 혼합 후 가열기에서 온도 80~90 ℃로 30분간 가열시켜 살균처리 한 다음 봉지에 약 30 ㎖씩 밀봉하는 공정으로 진피 복합제를 이용한 비만 치료제 조성물을 추출하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 선행 기술은 체중 감량에 대한 것이긴 하나, 리파아제의 활성을 억제하는 효능, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효능, 단백질 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효능, 지방 세포의 크기를 감소시키는 효능, 신장 주위 지방의 무게를 감소시키는 효능 등에 대해서는 밝히고 있지 못하다.

또한, 동의생리병리학회지, 26(5), 2011, pp.724-731에는 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 혼합물이 고과당식이에서 지방세포의 크기를 감소시켜 항비만 효과를 가지는 것이 기재되어 있다. 이는 홍삼과 상엽만을 소재로 하고 있으며, 체내에서 항산화 작용을 하는 효능, 체내에서 항염증 작용을 하는 효능, 리파아제의 활성을 억제하는 효능, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효능, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효능 및 신주위 지방의 무게를 감소시키는 효능에 대해서는 밝히고 있지 않다.
대한민국 공개특허공보 제 1020030075067호 (2003.09.22)
동의생리병리학회지, 26(5), 2011, pp.724-731
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성 없이 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 체내에서 항산화 작용을 하여 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 체내에서 항염증 작용을 하여 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 리파아제의 활성을 억제하여 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하여 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하여 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시켜 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 지방 세포의 크기를 감소시켜 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 신주위 지방의 무게를 감소시켜 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성 없이 비만을 예방, 개선하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 항산화 작용, 항염증 작용, 리파아제의 활성을 억제하는 작용, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 작용, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 작용, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 작용, 지방 세포의 크기를 감소시키는 작용, 신주위 지방의 무게를 감소시키는 작용을 하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 홍삼 추출물 100 ~ 300 중량부 기준으로, 천마 추출물, 적하수오 추출물 또는 상엽 추출물을 30 ~ 100 중량부로 선택적으로 혼합하여 제조한 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는, 비만의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 조성물에 식품학적으로 허용가능한 첨가제 또는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가한 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은, 비만 및 기타 대사증후군 예방, 개선용 약학적 조성물로 제공될 수 있으며, 각각의 조성물은 식품학적으로 허용되는 첨가제를 이용하여 건강기능식품으로 제조하여 제공한다.
본 발명에 따른 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 건강보조식품, 차, 과자류 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명이 약학적 조성물로 이용되기 위하여는 약제학적 분야에서의 공지의 방법에 의해 제조될 수 있으며, 그 자체 또는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 등과 혼합하여 분말, 과립, 정제, 캡슐제 또는 주사제 등의 제형으로 제조되어 사용될 수 있다. 또한 이들은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 유효 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 물활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질환의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 이용하여 환, 과립, 음료, 타블렛, 캅셀 등의 제형을 제조할 수 있으며, 이 경우에 각 제형을 제조하기 위하여 첨가제가 추가될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 천연 유래의 물질을 활용하여 부작용 및 세포독성이 없는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 체내에서 항산화 작용을 하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 체내에서 항염증 작용을 하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 리파아제의 활성을 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 지방 세포의 크기를 감소시키는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른, 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하여 비만을 예방, 개선하는 조성물은 신장 주위 지방의 무게를 감소시키는 효과를 보유하고 있다.
도 1은 홍삼 추출물, 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리하였을 시의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리하였을 시의 항산화 효능을 ORAC assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다
도 3은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리하였을 시의 항염증 효능을 NO assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리하였을 시의 항염증 효능을 NO assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 홍삼 추출물과 천마 추출물을 병용 처리하였을 시와 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 NF-kB 전사 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하였을 시의 3T3-L1 세포 분화도를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 7은 홍삼 추출물 및 천마 추출물을 병용 처리하였을 시와 홍삼 추출물 및 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 3T3-L1 세포 분화도를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 8은 홍삼 추출물 및 천마 추출물을 병용 처리하였을 시와 홍삼 추출물 및 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 PPARγ의 전사 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 아디포카인의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 10은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 나타낸 사진이다.
도 11은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 12는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 13은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 14는 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴(leptin)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 17은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 18은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 19는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 20은 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 21은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 22는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
이하 제조예에서 제조되는 추출물들의 복합물은 모두 '홍삼 복합물'의 범주에 들어가는 의미로 사용하였음을 미리 밝혀둔다.
제조예 1. 홍삼 복합물의 제조
① 홍삼, 천마, 적하수오, 상엽을 추출한다.
홍삼, 천마, 적하수오, 상엽 중 1개 이상의 소재를 추출한다. 여기에서, 천마, 적하수오 및 상엽 외의 기타 한방 약재가 추가될 수도 있다.
홍삼, 천마, 적하수오, 상엽의 추출에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 수증기 증류법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법, 열수 추출법, 발효 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법이 실행될 수 있다. 추출 시간 역시 임의로 조정할 수 있다. 2가지 이상의 추출 방법을 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다.
용매 추출시의 추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올, 메탄올, 지방유, 글리세린, 마유, 플로필렌글리콜, 에테르, 클로르포름, 석유에테르, 헥산, 벤젠, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 부탄올, 이소프로판올 등이 있다. 바람직하게는 에탄올이 이용될 수 있다.
또한, 분배계수가 다른 2가지 이상의 용매를 동시에 사용하여 추출할 수도 있으며, 2가지 이상의 용매를 사용하여 2차 이상 추출할 수 있다. 추출 용매의 농도는 용매의 종류에 따라 조절될 수 있다.
② 홍삼, 천마, 적하수오, 상엽의 추출물을 선택적으로 혼합한다.
홍삼, 천마, 적하수오, 상엽의 추출물을 선택적으로 혼합할시의 중량비는 실험 결과를 기반으로 설정한다.
여기에서, 실험을 통해 홍삼 추출물과 천마 추출물을 3:1 및 1:1의 중량비로 혼합할시의 효능, 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 3:1 및 1:1의 중량비로 혼합할시의 효능, 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 3:1 및 1:1의 중량비로 혼합할시의 효능이 모두 입증되었다. 이를 통해, 홍삼 추출물의 중량이 상기 3종의 각 소재의 추출물의 3배 이상일 시에도 효능을 발휘할 수 있음을 유추할 수 있다.
예를 들어, 홍삼 추출물 100 중량부 기준으로 천마 추출물 10 중량부를 혼합할시에도, 실험 결과에 의거하여 효능을 발휘할 수 있음을 유추할 수 있다.
또한, 홍삼 추출물과 상기 소재 중 2개 이상의 추출물을 혼합할시에 홍삼 추출물과 각 소재의 추출물의 중량비가 실험 결과에 의거한 수치 범위 내에 포함되면 효능을 발휘할 수 있음을 유추할 수 있다.
예를 들어, 홍삼 추출물 100 중량부 기준으로 천마 추출물 30 중량부, 적하수오 추출물 30 중량부를 혼합하거나, 또는 천마 추출물 30 중량부, 적하수오 추출물 30 중량부 및 상엽 추출물 30 중량부를 혼합하는 경우를 들 수 있다.
③ 추출된 홍삼, 천마, 적하수오 상엽의 추출물을 건조한다.
건조 방법에는 양건조, 음건조, 동결건조, 열풍건조, 피막건조, 진공건조 등의 다양한 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는 동결 건조 방법이 사용될 수 있다.
설계 조건에 따라, 홍삼 복합물의 제조예는 상기 사항에 한정되지 않으며, 각 단계의 순서는 유동적으로 변경될 수 있다.
즉, 상기 사항과 달리 각 소재의 혼합 후 추출이 실행될 수도 있으며, 각 소재의 건조 후 추출이 실행될 수도 있다. 또한 각 소재에 혼합과 추출의 단계를 실행한 후 건조하여 용매에 혼합할 수도 있다.
최종적인 일 예로, 각 소재들을 50% 에탄올로 추출한 후 혼합하여 동결건조하여 물에 혼합할 수 있다.
실험예 1. ABTS assay 를 통한 홍삼 복합물의 세포 내 항산화 효능 실험
1-1. 실험 과정
ABTS가 산화되어 생성되는 라디칼 양이온인 ABTS+의 분해를 측정하여 일반적인 방법으로 항산화 활성을 계산하였다.
1-2. 실험 결과
하단의 [표 3]은 홍삼 추출물, 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리 시의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 측정한 결과이다.
Sample IC50(ug/ml)
홍삼 추출물 414.59
천마 추출물 148.56
적하수오 추출물 >200
상엽 추출물 50<
홍삼 추출물 1000 ug/ml 및 천마 추출물 50<
홍삼 추출물 1000 ug/ml 및 적하수오 추출물 50<
홍삼 추출물 1000 ug/ml 및 상엽 추출물 50<
BHA 3.19
도 1은 홍삼 추출물, 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리하였을 시의 항산화 효능을 ABTS assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
홍삼 추출물, 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물의 IC50 값이 414.59 ug/ml, 148.56 ug/ml, 200 ug/ml 이상, 50 ug/ml 이하로 양성 대조군인 BHA (Butylated hydroxyanisole)보다는 다소 낮은 소거작용을 보였지만 천마 추출물, 상엽 추출물은 항산화 활성이 200 ug/ml 이하로 우수한 것으로 나타났다. 항산화 활성이 우수한 천마 추출물, 상엽 추출물을 홍삼 추출물과 병용 처리하여 실험한 결과 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 효능이 월등히 우수해지는 것을 관찰할 수 있었다. 또한 단독 처리 시 IC50 값이 200 ug/ml 이상으로 효능이 다소 떨어진 적하수오 추출물도 홍삼 추출물과 병용 처리 시 시너지 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2. ORAC assay 를 통한 홍삼 복합물의 세포 내 항산화 효능 실험
2-1. 실험 과정
홍삼 추출물의 항산화 활성은 과산화 라디컬(peroxy radical)의 생성과 소멸에 의한 형광 감소율을 측정함으로써 이루어졌다. 실험 과정은 다음과 같다.
① 과산화 라디컬의 생성을 위해 AAPH {2,2'-azobis (2-methylpropionamidine)dihychloride} 를 사용하였고 ORAC 측정 키트(Cell biolabs Co.)를 사용해 측정하였다.
② 각 시료는 500 ug/ml부터 두 배 폴드(fold)로 희석하여 사용하였고, 검량 곡선을 작성하기 위해 항산화 활성 비교 표준액으로 트로록스(Trolox)를 각각 0, 1.65, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50 uM 농도로 희석하였다.
③ 플루오레센트(fluorescent) 표준용액은 1X 플루오레센스 버퍼(fluorescence buffer) 150 ul와 프리 라디칼 이니시에이터 솔루션(Free radical initiator solution)을 25 ul 넣어 플루오로미터(Fluorometer) (PerkinElmer Co., Victor)를 이용하여 형광의 감소 과정을 60분 동안 2분 간격으로 측정하였다.
④ 자극은 535 nm에서, 배출은 590 nm에서 실행하였다.
2-2. 실험 결과
하단의 [표 4]는 홍삼 추출물 및 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리 시의 항산화 효능을 ORAC assay를 통해 측정한 결과이다.
Sample 용량(ug/ml) =트로록스 (uM TE)
홍삼 추출물 1000 452.02 (113.17 ug/ml)
2000 466.24 (116.69 ug/ml)
상엽 추출물 50 353.25 (88.41 ug/ml)
100 374.82 (93.81 ug/ml)
200 384.90 (96.33 ug/ml)
홍삼 추출물 및 상엽 추출물 1000+50 458.46 (114.75 ug/ml)
1000+100 457.34 (114.46 ug/ml)
1000+200 447.80 (112.07 ug/ml)
도 2는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리 시의 항산화 효능을 ORAC assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
항산화 활성 측정방법의 일종인 ORAC assay를 통해 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 항산화 효능을 확인해 보았다. 홍삼 추출물 ABTS assay 결과 효능이 가장 우수한 것으로 나타난 상엽 추출물의 항산화 활성을 다시 한 번 확인해 본 결과 홍삼 추출물과 상엽 추출물 모두 항산화 효과가 관찰되었다. 홍삼 추출물 1000, 2000 ug/ml을 단독 처리한 농도에서는 각각 113.17, 116.69 ug/ml 트로록스의 ORAC 활성을 나타내었고, 상엽 추출물을 단독 처리한 50, 100, 200 ug/ml에서는 88.41, 93.81, 96.33 ug/ml 트로록스와 동등한 항산화 효능을 나타내었다. 또한, 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 병용 처리 시 항산화 효능이 상엽 추출물 농도별로 홍삼 단독 처리 시와 같거나 다소 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.
실험예 3. DPPH assay 를 통한 홍삼 복합물의 세포 내 항산화 효능 실험
3-1. 실험 과정
실험 과정은 다음과 같다.
① 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물과 DPPH를 메탄올에 78 ug/ml이 되게 녹여 여과한 용액을 1:1 비율로 혼합한 뒤 37 ℃에서 30분간 방치하였다.
② 520 nm에서 흡광도를 측정하여 IC50 값을 측정하였다.
3-2. 실험 결과
하단의 [표 5]는 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물의 항산화 효능을 DPPH assay를 이용하여 측정한 결과이다.
Sample IC50(ug/ml)
홍삼 추출물 827.36
천마 추출물 1262.6
상엽 추출물 982.4
BHA 3.44
홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물은 IC50 값이 827.36, 1262.6, 982.4 ug/ml로 양성 대조군인 BHA (Butylated hydroxyanisole, 부틸레이트 하이드)보다는 다소 낮은 소거작용을 보였다. 그러나 ORAC 결과와 동일하게, 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 항산화 효능 측정값이 유사하였으므로 ORAC 활성에 비해 항산화 효능이 적지만 항산화 활성이 있는 것을 유추할 수 있었다.
실험예 4. NO 측정을 통한 홍삼 복합물의 항염증 효능 실험
4-1. 실험 과정
배양액 내의 NO(nitrite oxide) 농도를 측정하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
① RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1.0×105 cells/well이 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후 NO 생성 양성 대조군으로 LPS (lipopolysaccharide, 리포폴리사카라이드) 0.5 ug/ml 농도로 처리하였다.
② 음성 대조군으로 LPS 처리하지 않은 군을 나누어 배지를 갈아준 후 2000 ug/ml부터 62.5 ug/ml까지 두 배 폴드(fold)로 홍삼 추출물을 처리하였다.
③ 천마 추출물과 상엽 추출물은 200 ug/ml부터 6.25 ug/ml까지 처리하고 다시 24 시간 동안 배양하였다.
④ 1 M NaNO2 (Sodium Nitrite, 소듐 니트레이트)를 0, 3.12, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 uM이 되도록 희석하여 기준 값을 잡아 표준 곡선을 만들었다.
⑤ 시료 상등액과 표준 NaNO2를 50 ul 씩 플레이트에 넣고 1 % 설파닐아미드(sulfanilamide)와 0.1 % N-(1-naphtyl) 에틸렌다이아민 디하이드로클로라이드 리에이전트(ethylenediamine dihydrochloride reagent)를 1:1로 혼합하여 well당 50 ul씩 주입하고 10분간 상온에 방치하였다.
⑥ 시료 상등액과 표준 NaNO2를 540 nm에서 측정한 값을 구하였다. 표준 곡선과 대비하여 샘플의 NO 생성 억제량을 측정하였다.
4-2. 실험 결과
도 3은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리 하였을 시의 항염증 효능을 NO assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 단독으로 각각 처리하거나 병용 처리 하였을 시의 항염증 효능을 NO assay를 통해 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
홍삼 추출물의 염증 억제 활성을 NO assay를 통해 확인해 본 결과 독성이 발견되지 않은 농도에서 항염증 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
마우스의 대식세포주인 RAW 264. 7 세포주에서는 100 ug/ml과 200 ug/ml 농도에서 세포독성이 나타났으나, 사람의 신장 세포주인 HEK-293T 세포주에서는 세포독성이 나타나지 않았다.
홍삼 추출물에서 독성이 발견되지 않았던 농도인 500 ug/ml을 기준으로 천마 추출물과 상엽 추출물을 처리하여 항염증 효과를 확인하였다. 그 결과 홍삼 추출물 단독 처리 시 독성이 없던 농도인 500 ug/ml에 천마 추출물과 상엽 추출물을 농도별로 처리한 시료에서 세포독성이 발생하여 항염증 효능을 측정할 수 없었다.
홍삼 추출물에서와 동일하게, 마우스의 대식세포주인 RAW 264. 7 세포주에서는 200 ug/ml 농도에서 세포독성이 나타났으나 사람의 신장 세포주인 HEK-293T 세포주에서는 세포독성이 나타나지 않았다.
실험예 5. NF - kB 의 전사 활성 분석을 통한 홍삼 복합물의 항염증 효능 시험
5-1. 실험 과정
실험 과정은 다음과 같다.
① HEK 293T cell에 NF-kB 루시퍼레이즈 리포터(luciferase reporter) 유전자와 pRL-SV-40 플라스미드를 트렌스펙션(transfection) 하였다.
② 유전자들을 하루 동안 발현시킨 후 세포에 홍삼 추출물 500, 1000, 2000 ug/ml과 천마 추출물, 상엽 추출물 시료 50, 100 및 200 ug/ml을 24 시간 동안 함께 처리하였다.
③ 그 후, 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물 시료에 의한 NF-kB의 전사 활성 정도를 루시퍼레이즈(luciferase)의 발현 강도를 통해 관찰하였다.
5-2. 실험 결과
도 5는 홍삼 추출물 및 천마 추출물을 병용 처리하였을 시와 홍삼 추출물 및 상엽 추출물을 병용 처리하였을 시의 항염증 효능을 NF-kB 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
염증에 관여하는 NF-kB 전사 활성도를 측정해 본 결과 NF-kB의 전사 활성도는 천마 추출물, 상엽 추출물을 모두 병용 처리하였을 시에 억제되었음을 확인할 수 있었다.
실험예 6. 리파아제 억제 활성 평가를 통한 홍삼 복합물의 세포 내 항비만 효능 실험
6-1. 실험 준비
본 실험에서는 포신 판크리틱 리파아제(Porcine pancreatic lipase)의 억제 정도를 측정하였다. p-NPB이 p-니트로페놀(nitrophenol)로 가수분해되는 정도를 측정하였다.
효소로는 포신 판크리틱 리파아제를 준비하고 기질로는 p-NPB (p-nitrophenylbutyrate)를 준비하였으며, 리파아제 활성 억제 비만치료제로 알려진 올리스타트를 양성 대조군으로 설정하였다.
6-2. 실험 과정
10 unit 포신 판크리틱 리파아제 용액 30 ul에 Tris buffer (100mM Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 7.0) 850 ul를 넣고 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물과 대조군인 올리스타트(Orlistat) 시료를 농도별로 100 ul 씩 첨가하여 37 ℃에서 15분간 반응시켰다.
반응 후 기질 용액인 10 mM p-NPB (p-nitrophenylbutyrate) 20 ul를 첨가하여 37 ℃에서 15분간 효소 반응을 시켰다.
효소 반응이 끝난 후 리파아제 활성은 400 nm 파장에서 ELISA reader를 사용하여 측정하였다.
6-3. 실험 결과
[표 6]은 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물의 리파아제 활성 저해 측정 결과를 나타낸 것이다.
Sample IC50 (ug/ml)
홍삼 추출물 >2000
천마 추출물 >2000
상엽 추출물 >2000
올리스타트 15 ng/ml
리파아제 활성 저해 측정 결과, 올리스타트는 15 ng/ml에서 50% 억제 활성을 보였다. 그러나 홍삼 추출물, 천마 추출물, 상엽 추출물은 농도를 2000 ug/ml까지 높여도 리파아제 활성 저해능이 없는 것으로 확인되었다.
실험예 7. 홍삼 복합물 투여 후의 3 T3 - L1 지방전구세포의 분화 양상 측정
7-1. 실험 준비
3T3-L1 지방전구세포는 미국세포주은행(ATCC)으로부터 구매하여 실험에 사용하였다. 3T3-L1은 지방세포의 대사과정을 연구하는 데에 널리 이용되는 세포주로서, 상기 세포의 분화가 활발할수록 지방세포 내의 지방 축적이 활발하여 비만을 유도하게 된다. 따라서 항비만 효과를 가질 것으로 생각되는 물질을 상기 세포에 처리하였을 때, 세포의 분화가 적을수록 항비만 효과가 큰 물질인 것으로 볼 수 있다.
7-2. 실험 과정
마우스의 지방전구세포인 3T3-L1을 10 % BCS DMEM 배지를 넣고 37 ℃ , 5 % CO2의 조건에서 배양하였다.
3T3-L1 지방전구세포를 24 well plate에 5×104/well의 세포 수로 분주한 후, 세포 수가 100 % 컨플루언시(confluency) 시점이 되었을 때 2일 동안 더 유지시켰다.
지방전구세포를 MDI {0.5 mM 3-IBMX (isobutyl-1-methylxanthine), 1 uM dexamethasone, 1 ug/ml 인슐린}가 포함된 10 % FBS DMEM 배지에 2일간 배양하여 세포 분화를 유도하였다.
2일 후, MDI가 포함된 10% FBS DMEM 배지에 배양한 지방전구세포를 1 ug/ml 인슐린만 포함된 10 % FBS DMEM에 배양하였다.
홍삼 추출물 500, 1000, 2000 ug/ml과 천마 추출물, 상엽 추출물 50% 에탄올층 시료를 25, 50, 100, 200 ug/ml 농도까지 처리하고, 분화가 완성되는 시점인 8일째에 지방세포 분화 정도를 관찰하였다.
7-2. 실험 결과
천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물을 통해 마우스의 지방전구세포인 3T3-L1 세포주를 이용하여 지방 세포로의 분화억제 실험을 수행하였다. 분화를 유도한 대조군 세포에 비해 천마 추출물, 적하수오 추출물, 상엽 추출물의 지방세포 분화 억제 활성을 측정해 본 결과 적하수오 추출물의 경우 200 ug/ml에서는 40% 정도 지방세포 분화 억제 효과가 나타났으나 50, 100 ug/ml에서는 억제 효과가 미비하였으며, 천마 추출물과 상엽 추출물은 농도 의존적으로 지방세포 분화를 억제하는 것으로 나타났다.
이 결과를 토대로 홍삼 추출물이 대조군 대비 60% 정도 억제 효능이 있는 농도인 1000 ug/ml에 천마 추출물과 상엽 추출물을 농도별로 처리했을 때 억제 효능이 증가하는지를 확인해 보았다. 그 결과 천마 추출물의 경우 낮은 농도에서는 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 억제 효과가 없었으나 고농도에서는 병용 처리한 시료가 효과가 더 우수하였고, 상엽 추출물의 경우 홍삼 추출물 단독 처리시보다 농도 의존적으로 지방세포 분화를 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 8. RT - PCR 을 통한 홍삼 복합물의 지방 세포 분화 억제 효능 측정
8-1. 실험 과정
홍삼 추출물을 500, 1000 ug/ml 및 2000 ug/ml 농도로 처리한 후 8일 동안 분화를 시켜 C/EBP와 PPAR, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현 정도를 RT(real time, 리얼 타임)-PCR로 확인하였다.
분화가 완벽히 된 3T3-L1 세포를 PBS로 두 번 세척한 후 셀 펠렛(cell pellet)을 모아 RNA prep kit를 사용하여 RNA만 분리하였다.
추출된 RNA를 1 ug 사용하여 cDNA를 합성한 후 SYBR 그린(green)과 프라이머(primer)를 이용하여 RT-PCR을 수행하였으며, 대조군 유전자로는 GAPDH를 사용하였다.
하단의 [표 7]은 RT-PCR 실행시 표적으로 하는 사이토카인의 프라이머 시퀀스(Primer sequence)를 나열한 것이다.
Target Primer sequences Accession No.
GAPDH 5-GTATGACTCCACTCACGGCAAA-3 (sense)
5-GGTCTCGCTCCTGGAAGATG-3 (antisense)		 BC083080
PPAR 5-CGCTGATGCACTGCCTATGA-3 (sense)
5-AGAGGTCCACAGAGCTGATTCC-3 (antisense)		 NM_011146
C/EBP 5-AGGTGCTGGAGTTGACCAGT-3 (sense)
5-CAGCCTAGAGATCCAGCGAC-3 (antisense)		 BC058161
Adiponectin 5-AGCCTGGAGAAGCCGCTTAT-3 (sense)
5-TTGCAGTAGAACTTGCCAGTGC-3 (antisense)		 NM_009605
aP2 5-CATGGCCAAGCCCAACAT-3 (sense)
5-CGCCCAGTTTGAAGGAAATC-3 (antisense)		 NM_024406
ADD1/SREBP1c 5-CAAACTGCCCATCCACCGAC-3 (sense)
5-TGCCTCCTCCACTGCCACAA-3 (antisense)		 NM_011480
Resistin 5-TCAACTCCCTGTTTCCAAATGC-3 (sense)
5-TCTTCACGAATGTCCCACGA-3 (antisense)		 NM_011480
Fas 5-CTGAGATCCCAGCACTTCTTGA-3 (sense)
5-GCCTCCGAAGCCAAATGAG-3 (antisense)		 NM_007988
Leptin 5-CCAAAACCCTCATCAAGACCC-3 (sense)
5-CTCAAAGCCACCACCTCTGC-3 (antisense)		 NM_008493
8-2. 실험 결과
지방세포 분화 억제가 어떠한 분자적 메커니즘을 통해 유도되는지 확인하기 위해 PPARγ의 전사 활성 정도를 검토하였다. 그 결과 홍삼 추출물 단독 처리군과 천마 추출물 및 상엽 추출물을 병용 처리한 샘플 모두 대조군과 비교했을 때 전사 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 좀 더 확실한 PPARγ 유전자의 반응을 확인해 보기 위해 PPARγ이 같은 연구 결과를 토대로 지방세포 분화 억제가 어떠한 분자적 메커니즘을 통해 유도되는지 확인하기 위해 PPARγ 전사 활성 정도를 검토하였다. 그 결과 홍삼 추출물을 단독 처리한 시료와 천마 추출물, 상엽 추출물 병용 처리한 샘플 모두 대조군과 비교했을 때 전사 활성을 억제하는 것을 확인할 수 있었고, 좀 더 확실한 PPARγ 유전자의 반응을 확인해 보기 위해 PPARγ 작용제와 병용 처리하여 전사활성 정도를 관찰하였다. 홍삼 추출물 단독 처리 시에는 PPARγ 작용제인 트로글리타존을 처리한 샘플보다 억제 활성을 보였으나, 천마 추출물을 병용 처리한 결과 트로글리타존보다 활성이 증가하였고, 상엽 추출물의 경우 홍삼 추출물 단독 처리 시와 거의 비슷한 효과를 나타내었다.
좀 더 정확한 기전을 연구 확인하기 위해 지방세포 분화 시 유도되는 아디포카인의 활성을 RT-PCR을 통해 유전자 수준에서 확인해 본 결과, ADD1/SREBP1c를 제외한 유전자에서 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 분화 유도시 증가되는 아디포카인들의 활성을 억제하는 것을 관찰하였다. 그리고 지방세포 분화 과정에 중심적인 역할을 하는 PPARγ와 C/EBP의 단백질 수준에서의 발현 정도를 확인해 보았다. 그 결과 유전자 수준에서 확인한 결과와 마찬가지로 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 상엽 추출물을 병용 처리한 시료에서 PPARγ와 C/EBP의 단백질 수준의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 관찰하였다.
작용제와 병용 처리하여 전사활성 정도를 관찰하였다. 홍삼 추출물 단독 처리 시에는 PPARγ 작용제인 트로글리타존을 처리한 샘플보다 억제 활성을 보였으나, 천마 추출물을 병용 처리한 결과 트로글리타존보다 활성이 증가하였고, 상엽 추출물의 경우 홍삼 추출물 단독 처리 시와 거의 비슷한 효과를 나타내었다.
좀 더 정확한 기전을 연구 확인하기 위해 RT-PCR을 통해 지방세포 분화 시 유도되는 아디포카인의 활성을 유전자 수준에서 확인해 본 결과, ADD1/SREBP1c를 제외한 유전자에서 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 분화 유도 시 증가되는 아디포카인들의 활성을 억제하는 것을 관찰하였다. 그리고 지방세포 분화과정에 중심적인 역할을 하는 PPARγ와 C/EBP의 단백질 수준에서의 발현 정도를 확인해 보았다. 그 결과 유전자 수준에서 확인한 결과와 마찬가지로 홍삼 추출물 단독 처리 시보다 상엽 추출물을 병용 처리한 시료에서 PPARγ와 C/EBP의 단백질 수준의 발현을 효과적으로 억제하는 것을 관찰하였다.
실험예 9. 홍삼 복합물 투여 후 랫드의 체중 및 식이섭취량의 측정
9-1. 실험 과정
대사증후군 유발 식이 모델은 Harlan Teklad (Madison, WI)사의 60% 과당이 포함된 상엽 사료를 약 10주간 투여하였다.
또한 홍삼 추출물과 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물은 진안에서 생산된 한방소재와 각각의 비율로 혼합하여 2주 동안 상엽 사료를 투여한 랫드에 6주간 투여하였다.
하단의 [표 8]은 정상 식이와 상엽 식이의 성분을 비교한 표이다. [표 6]의 상단은 정상 식이의 성분 표, 하단은 상엽 식이의 성분 표이다.
식이
영양 성분명 정상
수분(%) 10.26
단백질(%) 20.78
지방(%) 4.8
섬유(%) 5.32
ASH(%) 5.82
칼슘(Calcium)(%) 1.16
인산(%) 0.65
식이
영양 성분명 60% 과당
카제인(casein)(g) 207.0
DL-메티오닌(methionine)(g) 3.0
과당(fructose)(g) 600.0
라드(lard)(g) 50.0
셀룰로스(cellulose)(g) 79.8
미네랄 믹스(mineral mix)(g) 50.0
징크 카보네이트(zinc carbonate)(g) 0.04
비타민 믹스(vitamin mix)(g) 10.0
그린 푸드 컬러(green food color(g) 0.15
9-2. 실험 결과
도 11은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
체중의 분석 결과, 5-7주째 대조군과 상엽 추출물 단독 투여군과의 유의성있는 차이가 보였으나, 8-9주째에는 유의성이 보이지 않았다. 그밖에 상엽 추출물 단독 투여군과 홍삼 추출물 및 천마 추출물의 혼합 투여군과의 유의성이 보이지 않았다. 식이 섭취량은 모든 군에서 일정하게 유지되는 것으로 나타났다.
도 12는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
체중의 분석 결과, 5-7주째 대조군과 상엽 추출물 단독 투여군과의 유의성 있는 차이가 보였으나, 8-9주째에는 유의성이 보이지 않았다. 그밖에 상엽 추출물 단독 투여군과 홍삼 추출물 및 적하수오 추출물의 혼합 투여군과의 유의성이 보이지 않았다. 식이 섭취량은 모든 군에서 일정하게 유지되는 것으로 나타났다.
도 13은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 체중 및 식이섭취량의 변화를 나타낸 그래프이다.
체중의 분석결과, 5-7주째 대조군과 상엽 추출물 단독 투여군과의 유의성있는 차이가 보였으나, 8-9주째에는 유의성이 보이지 않았다. 그밖에 상엽 추출물 단독 투여군과 홍삼 추출물 및 상엽 추출물의 혼합 투여군과의 유의성이 보이지 않았다. 식이 섭취량은 모든 군에서 일정하게 유지되는 것으로 나타났다.
실험예 10. 홍삼 복합물 투여 후의 혈청 내 렙틴의 농도 측정
10-1. 실험 과정
대사증후군 유발 식이 모델은 Harlan Teklad (Madison, WI)사의 60% 과당이 포함된 상엽 사료를 약 10주간 투여하였다.
또한 홍삼 추출물과 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물은 진안에서 생산된 한방소재와 각각의 비율로 혼합하여 2주 동안 상엽 사료를 투여한 랫드에 6주간 투여하였다.
10-2. 실험 결과
도 14는 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴(leptin)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
홍삼 추출물과 천마 추출물의 혼합 투여군에 의한 비만 개선 효과를 관찰한 결과, 대조군과 비교하였을 때 상엽 추출물 단독 투여군에서 혈청 내 렙틴(leptin)의 농도가 증가된 반면, 로지글리타존 투여군에서 유의성 있게 감소하였다. 또한 홍삼 추출물과 천마 추출물의 혼합 투여군에서도 렙틴의 발현 정도가 유의적으로 감소되었음을 확인하였다 (p<0.001). 그러나 고과당 식이군의 체중 증가에 대한 홍삼 추출물 단독 투여군의 체중 감소효과는 관찰할 수 없었으므로, 이러한 홍삼 추출물에 대한 렙틴의 감소효과는 렙틴 저항성을 감소시켜 비만 유전자 감수성을 증가시키는 효과를 나타내는 것으로 보인다.
도 15는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴(leptin)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여군에 의한 비만 개선 효과를 관찰한 결과, 대조군과 비교하였을 때 상엽 추출물 단독 투여군에서 혈청 내 렙틴의 농도가 증가된 반면, 로지글리타존 투여군에서 유의성 있게 감소하였다. 또한 상엽과 동시에 홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여군에서 발현 정도가 유의적으로 감소되었다 (p<0.005). 그러나 고과당 식이군의 체중 증가에 대한 홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여군의 체중 감소효과는 보여지지 않았기 때문에 이러한 홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여에 대한 렙틴의 감소효과는 렙틴의 저항성을 감소시켜 비만 유전자 감수성을 증가시키는 효과를 나타내는 것으로 보인다.
도 16은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 혈청 내 렙틴(leptin)의 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
홍삼 추출물과 상엽 추출물의 혼합 투여군에 의한 비만 개선 효과를 관찰한 결과, 대조군과 비교하였을 때 상엽 추출물 단독 투여군에서 혈청 내 렙틴의 농도가 증가된 반면, 로지글리타존 투여군에서 유의성 있게 감소하였다. 또한 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 혼합 투여군에서도 혈청 내 렙틴의 농도가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
그러나 고과당 식이군의 체중 증가에 대한 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 혼합 투여군의 체중 감소효과는 보여지지 않았다. 그러므로 홍삼 추출물과 상엽 추출물의 혼합 투여에 대한 렙틴의 감소 효과는 렙틴 저항성을 감소시켜 비만 유전자 감수성을 증가시키는 효과를 나타낸다고 보여진다.
실험예 11. 홍삼 복합물 투여 후의 지방 세포의 크기 측정
11-1. 실험 과정
대사증후군 유발 식이 모델은 Harlan Teklad (Madison, WI)사의 60% 과당이 포함된 상엽 사료를 약 10주간 투여하였다.
또한 홍삼 추출물과 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물은 진안에서 생산된 한방소재와 각각의 비율로 혼합하여 2주 동안 상엽 사료를 투여한 랫드에 6주간 투여하였다.
11-2. 실험 결과
도 17은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 18은 홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
부고환조직에서 지방세포의 크기는 고과당 식이군에서 현저하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 증가효과는 양성대조군인 로지글리타존 투여군과 홍삼 추출물과 천마 추출물의 혼합 투여군에서 유의성있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 홍삼 추출물이 렙틴 감수성을 증가시키고 지방세포 크기 증가를 저해함으로써 항비만 효과가 있을 것이라는 것을 시사하고 있으나 직접적인 체중감소효과는 보이지 않았다.
도 19는 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 20은 홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
부고환조직에서 지방세포의 크기는 고과당 식이군에서 현저하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 증가효과는 양성대조군인 로지글리타존 투여군과 홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여군에서 유의성있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 홍삼 추출물이 렙틴 감수성을 증가시키고 지방세포 크기 증가를 저해함으로써 항비만 효과가 있을 것이라는 것을 시사하고 있으나 직접적인 체중감소효과는 보이지 않았다.
도 21은 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 사진이다.
도 22는 홍삼 추출물과 상엽 추출물을 혼합 투여하였을 시의 지방 세포의 크기의 변화를 나타낸 그래프이다.
부고환조직에서 지방세포의 크기는 고과당 식이군에서 현저하게 증가하는 것을 볼 수 있었다. 이러한 증가효과는 양성 대조군인 로지글리타존 투여군과 홍삼 추출물과 상엽 추출물 혼합 투여군에서 유의성있게 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 홍삼 추출물이 렙틴 감수성을 증가시키고 지방세포 크기 증가를 저해함으로써 항비만 효과가 있을 것이라는 것을 시사하고 있으나 직접적인 체중감소효과는 보이지 않았다.
실험예 12. 홍삼 복합물 투여 후의 신장 주위 지방 무게 측정
12-1. 실험 과정
대사증후군 유발 식이 모델은 Harlan Teklad (Madison, WI)사의 60% 과당이 포함된 상엽 사료를 약 10주간 투여하였다.
또한 홍삼 추출물과 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물은 진안에서 생산된 한방소재와 각각의 비율로 혼합하여 2주 동안 상엽 사료를 투여한 랫드에 6주간 투여하였다.
12-2. 실험 결과
하단의 [표 9]는 홍삼 추출물 및 천마 추출물을 혼합 투여했을 시의 신주위 지방의 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
대조군 상엽
식이군		 로지글리타존
투여군		 홍삼 추출물
100 mg/kg과
천마 추출물의
혼합 투여군		 홍삼 추출물
300 mg/kg과
천마 추출물의
혼합 투여군
신주위 지방 6.15±0.59 10.16±0.79 10.87±1.29 9.03±0.65 9.14±0.74
(단위 : g)
홍삼 추출물과 천마 추출물을 혼합 투여한 후의 비만 억제 효과를 신주위 지방(perinephric fat)의 무게를 측정하여 확인하였다. 측정 결과, 상엽 추출물 단독 투여군에서는 대조군에 비하여 증가 양상을 보이고 있으나 양성대조군인 로지글리타존 투여군 및 홍삼 추출물 및 천마 추출물 혼합 투여군에서는 감소 효과를 보이지 않았다.
하단의 [표 10]은 홍삼 추출물 및 적하수오 추출물을 혼합 투여했을 시의 신주위 지방의 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
대조군 상엽
식이군		 로지글리타존 투여군 홍삼 추출물 100 mg/kg과
적하수오
추출물의
혼합 투여군		 홍삼 추출물
300 mg/kg과
적하수오
추출물의
혼합 투여군
신주위 지방 6.15±0.59 10.16±0.79 10.87±1.29 9.01±0.69 8.97±0.94
(단위 : g)
홍삼 추출물과 적하수오 추출물을 혼합 투여한 후의 신주위 지방의 무게를 측정한 결과, 상엽 추출물 단독 투여군에서는 대조군에 비하여 신주위 지방의 증가양상을 보였다. 또한 홍삼 추출물과 적하수오 추출물의 혼합 투여군에서는 상엽 추출물 단독 투여군 및 로지글리타존 투여군보다 더 적은 지방 증가 양상을 보였다.
하단의 [표 11]은 홍삼 추출물 및 상엽 추출물을 혼합 투여했을 시의 신주위 지방의 무게를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
대조군 상엽
식이군		 로지글리타존 투여군 홍삼 추출물
100 mg/kg과 상엽 추출물의
혼합 투여군		 홍삼 추출물 300 mg/kg과
상엽 추출물의 혼합 투여군
신주위 지방 6.15±0.59 10.16±0.79 10.87±1.29 9.01±0.69 8.97±0.94
(단위 : g)
상엽 추출물 단독 투여군에서는 대조군에 비하여 증가양상을 보이고 있으나 로지글리타존 투여군을 제외한 홍삼 추출물 300 mg/kg 및 상엽 추출물의 혼합 투여군에서 감소 효과를 보였다.

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 홍삼추출물, 천마 추출물, 적하수오 추출물 및 상엽 추출물을 혼합한 홍삼 복합물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
    상기 홍삼 복합물은 홍삼 추출물 300 중량부 기준으로, 천마 추출물 100 중량부, 적하수오 추출물 100 중량부 및 상엽 추출물 100 중량부를 혼합하여 제조되고,
    상기 조성물은 체내에서 항산화 작용을 하는 효능, 체내에서 항염증 작용을 하는 효능, 리파아제의 활성을 억제하는 효능, 3T3-L1 지방전구세포의 분화를 억제하는 효능, 지방세포 분화에 관여하는 단백질인 PPARγ와 C/EBPα의 발현을 억제하는 효능, 혈청 내 렙틴의 함량을 감소시키는 효능, 지방세포의 크기를 감소시키는 효능 및 신주위 지방의 무게를 감소시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는 비만의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품 조성물.
  5. 삭제
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고민철, ‘천마 에탄올 추출물이 고과당으로 유도된 대사증후군에 미치는 영향’, 원광대학교 대학원 학위논문, 2013. 2.*
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KR20230122822A (ko) 2022-02-15 2023-08-22 전라북도(농업기술원) 천마 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 조성물

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