BRPI0708554A2 - uso de um extrato da espécie de planta siphonochilus aethiopicus, composição, e, uso de um composto - Google Patents

Abstract

USO DE UM EXTRATO DA ESPéCIE DE PLANTA SIPHONOCHILUS AETHIOPICUS, COMPOSIçãO, E, USO DE UM COMPOSTO A invenção provê o uso de pelo menos uma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae, na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas. A planta é opcionalmente selecionada dos gêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella e a espécie é opcionalmente selecionada de Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia Aethiopica e Cienkowskiella aethiopica. A doença alérgica é selecionada de asma e atopia.

Description

"USO DE UM EXTRATO DA ESPÉCIE DE PLANTA SIPHONOCHILUSAETHIOPICUS, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UM COMPOSTO"

Esta invenção refere-se a compostos úteis no tratamentopreventivo e remissão de doenças alérgicas. Mais especificamente, estainvenção refere-se a compostos úteis no tratamento preventivo e remissão daasma e/ou atopia.

Os glicocorticóides são largamente usados no tratamentopreventivo da asma e outras doenças alérgicas. Os glicocorticóides ligam-seao receptor de glicocorticóides (GR), desse modo ativando o GR. O GRativado então liga-se a um elemento responsivo aos glicocorticóides e supraregula os genes para agentes antiinflamatórios, tais como lipocortina. Aindução da licocortina da proteína antiinflamatória, por sua vez, inibe afosfolipase A2 da enzima, desse modo diminuindo a produção dosmediadores da alergia, tais como prostaglandinas e leucotrienos. Alergia eDoenças Alérgicas: The new Mechanism and Therapeutics, edited by J.A.Denburg, Human Press Inc., Totowa, NJ, Schleimer RP, Effects ofGlucocorticosteroids on inflammatory cells relevant to their TherapeuticApplication in Asthma, Am. Rev. Respir. Dis., 1990, 141, S59-S69.

Um dos outros principais efeitos do GR ativado é a regulaçãodescendente de uma larga variedade de agentes, incluindo os agentes dascitocinas e da quimiocina, tais como interleucina-4 (IL-4) e interleucina-5(IL-5). A capacidade dos glicocorticóides em inibir a produção das citocinas,em particular IL-5, provou ser um componente principal de sua eficácia notratamento de doenças alérgicas e, especialmente, asma e atopia.

Além disso, as isoenzimas da fosfodiesterase (PDE's) e, maisparticularmente, os inibidores da PDE 4 estão recebendo interesse especialcomo agentes anti-asmáticos, devido à evidência de que estas enzimas podematuar tanto como agentes antiinflamatórios como broncodilatadores tanto emanimais como humanos. Cortijo J, Beleta J, Cardelus I, Llenas E, Morcillo E.,Investigation into the role of phosphodiesterase IV in bronchorelaxation,including studies with human bronchus, Br. J. Pharmcol., 1993, 108, 562-568.

Os leucotrienos são também de particular interesse no estudode doença alérgica, por causa de sua marcante ação broncoconstritora. Osleucotrienos têm um ação broncoconstritora 1000 vezes maior do que ashistaminas e prostaglandinas. Os leucotrienos são sub-produtos do ácidoaraquidônico, que é localizado nas bi-camadas fosfolipídicas das membranascelulares dos mastócitos. Durante um ataque de asma, o ácido araquidônico éconvertido em cinco leucotrienos. Esta conversão é mediada por uma enzima,5-Iipoxigenase (5-LO), que converte o ácido araquidônico primeiro em ácido5-hidroxiperoxieicosatetraenóico (5-HPETE) e então em leucotrieno A4(LTA4), que é o precursor dos outros quatro leucotrienos. Dos cincoleucotrienos produzidos durante um ataque de asma, a classe de cisteinila dosleucotrienos (LTC4, LTD4 e LTE4) contém os mais potentesbroncoconstritores. Werz O, Steinhilber D, Therapeutic options for 5-lipoxygenase inhibitors, Pharmacology and Therapeutics, 2006, 112, 701-718.

Dentro deste processo, os inibidores da biossíntese dosleucotrienos têm um importante papel a representar, uma vez que eles inibema ação de 5-LO, desse modo inibindo a eventual síntese dos leucotrienosbroncoconstritores.

O trajeto acima pode, assim, ser manipulado pelaadministração de um composto de ligação do receptor de glicocorticóides(GR), um inibidor de PDE e/ou um inibidor de 5-LO em um paciente emnecessidade dele.

Presentemente, isto é realizado na maioria dos casosadministrando-se compostos esteróides em um paciente sofrendo de umadoença ou reação alérgica, tal como asma ou atopia. Devido a muitos efeitoscolaterais prejudiciais sendo associados com os compostos esteróides notratamento de tais doenças, há uma necessidade de um composto não-esteróide exibindo as propriedades benéficas associadas com os compostosesteroidais e formulações contendo esteróide.

Nas doenças inflamatórias crônicas, tais como asma, artritereumatóide, doença inflamatória do intestino e psoríase, diversas citocinasrecrutam as células imunes e inflamatórias ativadas para o sítio das lesões,desse modo ampliando e perpetuando o estado inflamatório. Estas célulasativadas produzem muitos outros mediadores da inflamação. O ciclo viciosopode ser suprimido por terapia glicocorticóide ou imunossupressiva, porémnão há tratamento curativo para qualquer doença inflamatória crônica. Osfatores de transcrição representam um papel chave nas respostas imunes einflamatórias e um fator de transcrição de particular importância é o fator-kB(NF-kB). O NF-kB é um mediador central da resposta imune humana,regulando a transcrição de vários mediadores pró-inflamatórios einflamatórios, tais como as citocinas Interleucina-I (EL-1), Interleucina-2 (IL-2), Interleucina-8 (IL-8) e TNF-α, bem como os genes codificando a ciclo-oxigenase II, sintase do óxido nítico, imunorreceptores, moléculas de adesãocelular ou proteínas de fase aguda. Em estudos clínicos de pacientes comasma alérgica, os níveis de plasma da Interleucina-8 (IL-8) foram elevadosnestes pacientes. Blackwell TS, Christian JW, The role of nuclear factor- KBin cytokine gene regulation. Am. J. Respir. Cell MoI Biol 1997; 17:3-9,Hashimoto, S., Matsumoto, K., Gon, Y. et al. 2000. p38 MAP kinaseregulates TNF alpha-, IL-I alpha- and PAF- induced RANTES and GM-CSFproduction by human bronchial epithelial cells. Clinicai and ExperimentalAllergy. 30: 48-55. Herlaar, E. and Brown, Z. 1999. p38 MAPK signalingcascades in inflammatory disease. Molecular Medicine Today. 5: 439-447.Holden, N. S., Catley, M.C., Cambridge, LM., Barnes, PJ. and Newton, R.2004. ICAM- 1 expression is highly NF-kappaB-dependent in A549 cells.European Journal of Biochemistry. 271: 785-791. Portanto, a inibição de NF-kB, resultando na regulação descendente das quimiocinas tais como IL-8,poderia ser benéfica no tratamento da asma e doenças inflamatórias.De acordo com um aspecto da invenção, é provido um extratode solvente orgânico ou um óleo essencial de uma planta da famíliaZingiberaceae para uso no tratamento preventivo e remissão de doençasalérgicas.

As plantas da família Zingiberaceae incluem os gênerosSiphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e/ou Cienkowskiella.

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode serobtido de material de plantas selecionadas das espécies Siphonochilusaethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferianatalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiellaaethiopica.

Preferivelmente, o dito extrato de solvente orgânico ou óleoessencial compreende, como um ingrediente ativo, um composto tendo afórmula estrutural 1:

<formula>formula see original document page 5</formula>

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)

O nome químico (IUPAC) do composto de fórmula 1 é4,4a,5,9- tetraídro-3,5,8a-trimetilnaflo[2,3-b]furan-8-ona.

O composto de fórmula 1 pode ser usado na forma de umamistura racêmica ou na forma de um de seus estereoisômeros.

Exemplos das doenças alérgicas são asma e atopia.Tipicamente, o extrato de solvente orgânico ou óleo essencialé capaz de ligar-se a um receptor de glicocorticóide (GR), induzindo aprodução de lipocortina e/ou a inibição da enzima fosfolipase A2 e/ou adiminuição da produção das prostaglandinas e/ou leucotrienos.O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode teratividade anti-broncoconstritora e ainda pode regular descendentemente osagentes das citocinas e quimiocinas, tais como Interleucina-4 (IL-4) eInterleucina-5 (IL-5).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode teratividade anti-broncoconstritora e ainda pode regular descendentemente osagentes das citocinas e quimiocina, tais como interleucina-4 (IL-4) eInterleucina-5 (IL-5).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode inibir oNF-kB, um mediador central da resposta imune humana, regulandodescendentemente a transcrição de vários mediadores pró-inflamatórios einflamatórios, tais como as citocinas Interleucina-8 (IL-8).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode serobtenível por um método que inclui as etapas de preparar um extrato dematerial de uma planta da família Zingiberaceae e separar uma fração tendoatividade contra doenças alérgicas, os extratos contendo o ingrediente ativotendo atividade contra doenças alérgicas.

O método pode incluir as etapas de extrair rizomas ou raízesúmidas ou amostras de planta moídas de ditas espécies, tais comoSiphonochilus aethiopicus, ou secar os rizomas e/ou as raízes da planta porsecagem ao ar ou secagem no forno, seguido por moagem dos rizomas e/ouraízes em um pó. Os extratos são preparados por extração usando-se solventesorgânicos, tais como dietil éter, di-isopropil éter, t-butil metil éter, t-butil etiléter, etil acetato ou benzil acetato. O ingrediente ativo pode ser extraído portécnicas de extração que incluem destilação por vapor e/ou purificação dosextratos usando-se divisão de solvente/solvente e/ou técnicas de separaçãocromatográfica.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provida umasubstância ou composição para uso em um método para o tratamentopreventivo e remissão das doenças alérgicas, substância esta ou composiçãoincluindo como ingrediente ativo um extrato como descrito acima, e ditométodo compreendendo administrar a um indivíduo uma dosagem eficaz dedita substância ou composição.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provida umasubstância ou composição para uso em um método para o tratamentopreventivo e remissão de doenças alérgicas, substância esta ou composiçãoincluindo como ingrediente ativo um composto de fórmula 1 e dito métodocompreendendo administrar a um indivíduo uma dosagem eficaz de ditasubstância ou composição.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido umcomposto de fórmula 1 para uso em um método para o tratamento preventivoe remissão de doenças alérgicas.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provido o uso doextrato de solvente orgânico ou óleo essencial como descrito na manufaturade um medicamento tendo atividade contra doenças alérgicas.

Exemplos de doenças alérgicas são asma e atopia.

De acordo ainda um outro aspecto da invenção, é provida umacomposição para uso no tratamento preventivo e remissão de doençasalérgicas, que inclui uma quantidade eficaz de um de dito extrato, ditocomposto de fórmula 1 ou dito óleo essencial.

O extrato e composições do extrato podem ser em uma formaadequada para administração a indivíduos mamíferos, particularmenteindivíduos humanos. O extrato pode ser na forma de um extrato de solventeorgânico e/ou óleo essencial ou suas combinações.

A invenção estende-se ao uso do extrato de solvente orgânicocomo descrito acima, do óleo essencial ou do composto de fórmula 1 naregulação descendente dos receptores de glicocorticóide, na inibição dafosfolipase A2, na regulação descendente dos mediadores da alergia, taiscomo prostaglandinas e leucotrienos, na regulação descendente das citocinas,tais como JL-4 e IL-5, na inibição da fosfodiesterase 4, na inibição da 5-lipoxigenase ou biossíntese do leucotrieno e na inibição da atividadeespecífica da Resposta de Transcrição NF-kB, resultando na regulaçãodescendente de LL-8.

Mais particularmente, a invenção provê o uso de um extrato depelo menos uma planta selecionada das plantas da família Zingiberaceae, napreparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia dedoenças alérgicas.

A pelo menos uma planta pode ser selecionada dos gênerosSiphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella e das espéciesSiphonochilus aethiopieus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopiea,Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopiea eCienkowskiella aethiopiea.

O extrato pode incluir, como um ingrediente ativo, umcomposto selecionado dos compostos tendo a fórmula estrutural 1,

<formula>formula see original document page 8</formula>

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)

seus estereoisômeros e misturas de seus estereoisômeros.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia.

O extrato pode ser um óleo essencial obtido por Destilação avapor de material de planta da pelo menos uma planta. Em disso, o extratopode ser um extrato de solvente orgânico obtido por extração de material deplanta da pelo menos uma planta com um solvente orgânico.

O solvente orgânico pode ser um éter selecionado de dietiléter, diisopropil éter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter. Emvez disso, o solvente orgânico pode ser um éster selecionado de metil acetato,etil acetato e benzil acetato.

O material de planta pode ser obtido de raízes ou rizomas daplanta.

A invenção estende-se a uma composição para uso em ummétodo de tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas, a composiçãoincluindo um extrato de pelo menos uma planta selecionada de plantas dafamília Zingiberaceae.

A pelo menos uma planta pode ser como aqui antes descrito.

O extrato pode ser como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia e omaterial da planta pode ser obtido de raízes ou rizomas da planta.

A invenção estende-se ao uso de um extrato de pelo menosuma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae, na preparação deum medicamento para uso em qualquer uma ou mais da regulaçãodescendente de receptores glicocorticóides, inibição da fosfolipase A2,regulação descendente de mediadores de alergia, regulação descendente dascitocinas, inibição da fosfodiesterase 4, inibição da 5-Iipoxigenase oubiossíntese de leucotrieno e na inibição da atividade específica da Resposta deTranscrição de NF-kB.

Os mediadores da alergia podem ser selecionados dasprostaglandinas e leucotrienos. As citocinas podem ser selecionadas de IL-4,IL-5 e IL-8.

A pelo menos uma planta pode ser como aqui antes descrita.

O extrato pode ser como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia.

O material de planta pode ser obtido de raízes ou rizomas daplanta.A invenção estende-se, ainda, ao uso de um compostoselecionado dos compostos tendo a fórmula estrutural 1.

<formula>formula see original document page 10</formula>

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)

seus estereoisômeros e misturas de seus estereoisômeros, napreparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia dedoenças alérgicas.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia.

A invenção estende-se ainda a um método de tratamento deuma doença alérgica, o método incluindo administrar a uma pessoa ou animalem necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de umextrato, uma composição ou um composto selecionado dos compostos defórmula estrutural 1, como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser como aqui antes descrita.

A invenção será agora descrita, por meio de exemplo, comreferência aos desenhos diagramáticos e tabelas anexos.

Nos desenhos,

A Figura 1 mostra um fluxograma ilustrando um protocolopara a extração do composto de fórmula 1:

A Figura 2 mostra uma curva de inibição para liberação domediador de citotoxicidade induzida por Con-A pelo composto de fórmula 1;

A Figura 3 mostra uma curva de inibição para liberação domediador de citotoxicidade induzida por Con-A por um controle padrãoDMSO;

A Figura 4 mostra uma curva de resposta de inibição ouconcentração para a Resposta de Transcrição de NF-κΒ para o composto defórmula 1, em que a curva foi normalizada;

A Figura 5 mostra uma curva de resposta de inibição ouconcentração para a Resposta de Transcrição NF-κΒ para um controlepositivo de Ciclosporina A;

A Figura 6 mostra uma curva de inibição combinada para aliberação do mediador IL-I por tanto o composto de fórmula 1, bem como umcontrole padrão de Dexametasona;

A Figura 7 mostra uma curva de inibição combinada para aliberação do mediador IL-5 por tanto o composto de fórmula 1 como ocontrole padrão de Dexametasona, em que a curva de inibição do compostode fórmula 1 foi normalizada;

A Figura 8 mostra uma curva de inibição ou concentração paraa Resposta de Transcrição NF-κΒ para um extrato de dietil éter contendo o composto de fórmula 1, em que a curva foi normalizada; e

A Figura 9 mostra uma curva de resposta de inibição ouconcentração para a Resposta de Transcrição NF-κΒ para um controlepositivo de Ciclosporina A.

O extrato de planta ou destilado da invenção pode serproduzido por extração de rizomas, raízes ou amostras de planta úmidos deSiphonochilus aethiopicus, ou secagem dos rizomas e/ou raízes da planta porsecagem por ar ou secagem em forno, seguido por moagem dos rizomas e/ouraízes em um pó. Seu ingrediente ativo pode ser extraído por técnicas deextração, que incluem destilação por vapor e extração por solvente. Ocomposto pode ser refinado ainda separando-se os compostos individuais doextrato ou destilado, usando-se divisão de solvente/solvente e/ou técnicas deseparação cromatográfica. Estas técnicas são examinadas maisdetalhadamente nos Exemplos ilustrativos abaixo.

EXEMPLO 1: Infusão e fracionamento aquosos de material deplanta:

Como mostrado na Figura 1, uma infusão 14 é preparada dematerial de planta, tal como folhas, rizomas ou raízes. Um litro de água emebulição deionizada, mostrada em 12, é adicionado a 22,08 g de rizomasmoídos secados em forno (60 0C), mostrado em 10, e deixado repousar por 1hora com agitação ocasional. A água é filtrada e os sólidos 11 são removidose a fase aquosa é extraída quatro vezes com 500 ml de dietil éter, comomostrado em 16. Os extratos obtidos de cada extração são combinados,secados, filtrados e o solvente removido por meio de um evaporador rotativoem um banho de água em uma temperatura de 25 0C, como mostrado em 18,para produzir uma porção de éter 20 (WG13A) pesando 119 mg, que édesignada a fração orgânica. Uma camada intermediária na forma de umsólido 22 (WG13D) forma-se durante a divisão líquido-líquido.

Aproximadamente 107 mg de sólido 22 são obtidos, que são mantidosseparados. A camada aquosa é secada por congelamento, como mostrado em24, para produzir 2,52 g de material sólido 26 (WG13B), que é designado afração aquosa. O composto de fórmula 1 está presente na fração orgânica e éidentificado usando-se cromatografia de camada delgada. O composto podeentão ser ainda purificado usando-se cromatografia de coluna.

EXEMPLO 2: Extração orgânica de material de plantaEm vez de seguir o método do Exemplo 1, e novamente comreferência à Figura 1, um litro de dietil éter é adicionado a 22,08 g de rizomasmoídos secados em forno (60 0C) e deixado repousar por 1 hora com agitaçãoocasional. O éter é filtrado e cuidadosamente evaporado sob baixo vácuo para produzir um extrato seco 34 (WG-I-101 ou WG-I-58A) de aproximadamente1,5 g. O composto de fórmula 1 é identificado no extrato orgânico utilizando-se cromatografia de camada.

EXEMPLO 3: Fracionamento de extrato orgânicoOs extratos de dietil éter produzidos pelos procedimentos deextração aquosa ou de extração orgânica descritos acima foram purificadosainda por cromatografia flash (gel de sílica), como mostrado em 30, usando-se acetato de etil-hexano (1:9, v/v) como eluente, para produzir osesquiterpenóide de fórmula 1 WG13C ou WG-I-94B, como mostrado em 32.

Um óleo essencial é obtido por Destilação a vapor dos rizomase/ou raízes da espécie de planta Siphonochilus aethiopicus. As composiçõesquímicas dos componentes principais do óleo essencial são mostrados naTabela 1 abaixo. A identificação dos componentes principais é realizadautilizando-se cromatografia de gasosa-espectrometria de massa e a técnica deíndices Kovats. O sesquiterpenóide de fórmula 1 cristaliza na interface doóleo essencial e o condensado obtido durante o processo de Destilação avapor. No subseqüente esfriamento do óleo essencial a abaixo de 4 0C, ocomposto de fórmula 1 cristaliza do óleo.

Tabela 1: Composição química do óleo essencial (reportar-se à Tabela 20 paraa nomenclatura IUPAC dos compostos listados na Tabela 1)

<table>table see original document page 13</column></row><table>

EXEMPLO 4: Destilação a vapor

Aproximadamente 600 g de rizomas frescos e/ou raízes sãolavados com água e secados com ao ar. As raízes polpudas são separadas dosrizomas. As raízes são moídas e os rizomas são fatiados em fatias tendo umaespessura de aproximadamente 2-3 mm cada. Tanto as raízes como osrizomas fatiados são destilados por vapor em uma unidade de Destilação avapor por 3 h. Um litro de condensado é coletado em um funil separatório. Oscristais que formam-se no condensador são retirados por lavagem com águadeionizada e filtrados através de um funil de vidro sinterizado. Os cristaiscontêm o composto de fórmula 1.

A mistura do óleo essencial e água do condensado e funilseparador é permitida repousar em temperatura ambiente por 16 h. Os cristaisresultantes presentes na superfície, compreendendo o composto de fórmula 1são removidos por drenagem do condensado e filtragem usando-se um funilde vidro sinterizado. Um total de 480 mg do composto de fórmula 1 é assimobtidos.

A designação estrutural do composto de fórmula 1 é baseadaem um estudo detalhado dos dados espectrais de ressonância magnéticanuclear 1H e 13C de elevado campo do composto. O primeiro estágio dacaracterização do composto é a identificação dos sinais NMR 1H pertencentesaos sistemas de spin isolados. Isto é conseguido por meio de espectroscopiade correlação (1H51H) bidimensional (2D), empregando-se uma seqüênciasCOSY-45. As multiplicidades das diferentes ressonâncias dos espectros 13CNMR são deduzidas does espectros 13C NMR acoplados, bem como dos sub-espectros CH, CH2 e CH3 desacoplados do próton, obtidos usando-se umaseqüências de pulso DEPT. As ressonâncias 13C são parcialmente atribuídaspor correlação dos átomos de carbono contendo próton, com ressonânciasespecíficas em experimentos de mudança química 2D (13Cj1H).

Informação subseqüente, bem como os sinais dos átomos decarbono quaternário, é designada pelos experimentos de mudança química13C-(1H) (HMBC) de longo alcance 2-D, como mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4abaixo:Tabela 2: dados 1H Í500 MHz) NMR para o composto de fórmula 1 deCD7Cl7

<table>table see original document page 15</column></row><table>

Com referência à Tabela 3:

<table>table see original document page 15</column></row><table>

1. Espectro de massa do composto de fórmula 1:m/z 230 (M+); 215 (M+-CH3); 187 (-CO); 83 (pico de base).

2. Rotação Óptica [a]D = +108.8° (c = 1,0, CH2Cl2)

3. p.f. 89-90°CTabela 4: Experimento de mudança química ISC-I1Hl (HMBC) de longoalcance 2D

<table>table see original document page 16</column></row><table>

A estequiometria relativa do composto de fórmula 1 resulta damagnitude das constantes de acoplamento (ΙΗ,ΙΗ) e dos resultados dosexperimentos IH-(IH) n.O.e homonucleares, como mostrado na Tabela 5abaixo:

(1) (4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)

Tabela 5: Resultados dos experimentos IH- ΓIHI n.O.e. homonucleares

<table>table see original document page 17</column></row><table>

Estudos de bioensaios e inibição:

Os resultados dos ensaios bioquímicos como apresentados aquisão refletidos como a inibição percentual da ligação ou atividade específica deum composto. O ensaio é descrito em Cidlowski, J.A. e Cidlowski, N. B.,Regulation of glucocorticoid receptors by glucocorticoids in cultured HeLaS3 cells. Endocrinology 109: 1975-1982, 1981, cujo conteúdo é incorporadoaqui por referência. Este ensaio especificamente mede a capacidade dosglicocorticóides ativos da regulação descendente do receptor deglicocorticóides. Os compostos de teste responsivos são, portanto, julgadospossuírem atividades similares àquelas dos glicocorticóides ativos.

A Tabela 6 (abaixo) mostra os resultados obtidos pela seleçãode uma combinação da fração de éter orgânico (designada WG-I-13A naFigura 1), da fração aquosa (designada WG-I-13D na figura 1). A fraçãocombinada é designada WG-I-5AB+WG-I-5C, como mostrado na Figura 1.

Como pode ser visto pela Tabela 6, atividade significativa éobservada em um ensaio de ligação dos receptores de glicocorticóide (GR)(inibição de 61%) em células HeLa S3 (carcinoma cérvico epitelóide humano)em uma concentração de 100 μg/ml da fração combinada (WG-I-5AB+WG-I-5C)). Este ensaio mede a ligação de [3H]Dexametasona em receptores deglicocorticóides humanos. As células HeLa S3 são suspensas em tampãoHEPES modificado, pH 7,2, usando-se técnicas padrão.

Tabela 6: Bioensaios das frações combinadas WG-I-5AB+WG5C (mistura dafração insolúvel, dietil éter e extratos aquosos)

<table>table see original document page 18</column></row><table>

* hum = humano; pig = porcino; ca = crotalus atrox; gp = porquinho daindica; η = número de tubos

As células (1 χ IO6) são incubadas com 6 nM[3H]Dexametasona por 120 minutos a 25 0C. A ligação não-específica éestimada na presença de 20 μΜ Dexametasona. As membranas são filtradas elavadas três vezes e os filtros são contados para determinar a[3HJDexametasona especificamente ligada. Os compostos são avaliados a 10μΜ quanto à atividade.

Com base nos resultados mostrados na Tabela 6, segue-se quea fração combinada (WG-I-5AB+WG-I-5C) é eficaz na ligação ao sítio doreceptor de glicocorticóide (GR). Além disso, atividade significativa,associada com esta combinação de fração, é observada em um ensaio deenzima de fosfodiesterase PDE4 (inibição 52%) em células U937 humanas.

Este efeito inibitório implica em que a fração combinada (WG-I-5AB+WG-I-5C) tem um efeito broncodilatador. Para o teste PDE4, PDE4 que foiparcialmente purificado de células pronocíticas U-937 humanas é usado. 0composto de teste e/ou veículo é incubado com 0,2 μg de enzima e 1 μΜcAMP contendo 0,01 μΜ [3H]cAMP em tampão Tris pH 7,5 por 20 minutos a30 0C. A reação é terminada ebulindo-se por 2 minutos e AMP resultante éconvertido em adenosina pela adição de 10 mg/ml de nucleotidase de venenode cobra e mais incubação a 30 0C por 10 minutos. cAMP não-hidrolisado éligado à resina AGI-X2 e a [3H]adenosina da fase aquosa é quantificada porcontagem por cintilação. Os compostos são selecionados a 100 μΜ. IBX (3-isobutil-l-metilxantina) é usada como agente de referência padrão.

Tendo estabelecida a especificidade de atividade de todas asfrações combinadas, a fração de éter orgânica (WG-I-13A), a fração aquosa(WG-I-13B), bem como a fração insolúvel que forma-se na interface dacamada orgânica e extrato (designada WG-I-13D na Figura 1), sãoseparadamente bioensaiados usando-se o ensaio de ligação do receptor deglicocorticóide (GR) e o ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 acimadescrito.

Os resultados obtidos por estes experimentos são mostradosnas Tabelas 7, 8 e 9 abaixo. Um aumento da atividade inibitória foi observadopara o extrato de éter orgânico (WG-I-13A), quando utilizando-se o ensaio deligação do receptor de glicocorticóide (GR) (inibição 57%), em umaconcentração de extrato de 100 μg/ml. Nenhuma atividade significativa foiobservada para a fração aquosa (WG-I-13B) ou para a fração de interfacesolúvel (WG13D).Tabela 7: Bioensaios de inibição para WGl3B (extrato aquoso)

<table>table see original document page 20</column></row><table>

hum = humana; η - número de tubos

Tabela 8: Bio-ensaios de inibição para WG-I-13A (extrato de dietil éter)

<table>table see original document page 20</column></row><table>

hum = humana; η = número de tubos

Tabela 9: Bio-ensaios de inibição para WG-I-13D (fração insolúvel)

<table>table see original document page 20</column></row><table>

hum = humana; η = número de tubos

A impressão digital química da fração orgânica 20 (WG-I-13 A), utilizando-se LC-MS (cromatografia líquida-espectroscopia de massacombinadas) não indicou a presença de compostos tipo esteroidal. Ofracionamento da fração orgânica resultou no isolamento de um compostoprincipal, que foi quimicamente caracterizado e identificado como ocomposto sesquiterpenóide de fórmula 1 (designado WG-I-13C na Figura 1).

O composto sesquiterpenóide foi avaliado quanto à atividade mais uma vezusando-se o ensaio de ligação do receptor de glicocorticóide (GR) e o ensaiode enzima de fosfodiesterase PDE4 acima. Os resultados destes experimentossão mostrados na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10: Bio-ensaios de inibição para WG-I-13C (composto 1)

<table>table see original document page 20</column></row><table>

hum — humana; η = número de tubos

Uma atividade não significativa mais baixa foi observada parao ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 (inibição de 35%), enquantoatividade de 104% foi observada para o ensaio de ligação do receptor deglicocorticóide (GR) a 200 μg/ml da concentração de composto puro. Istoimplica em que o composto sesquiterpenóide, por si, não representa o papelmais significativo na broncodilatação e, no extrato de planta da invenção,outros compostos presentes contribuem para o efeito broncodilatador.

O valor IC50 do composto sesquiterpenóide do ensaio deligação de glicocorticóide foi determinado como sendo 50,3 μΜ, comomostrado na Tabela 11 abaixo.

Tabela 11: Determinação do valor ICsn do composto sesquiterpenóide (1)

<table>table see original document page 21</column></row><table>

hum = humana; conc. = concentração

Além disso, foi observada atividade significativa para ocomposto sesquiterpenóide em um ensaio de enzima de 5-Iipoxigenase (5-LO), isto é, 99% de inibição a 100 μ§/ηι1 da concentração do composto puro.Os resultados deste experimento são mostrados na Tabela 12 abaixo. Para oteste de 5-LO, uma preparação de enzima de 5-Iipoxigenase de células deleucemia basofílicas de rato (RBL-I) é usada. O composto de teste é pré-incubado com a enzima por 5 minutos em tampão Tris pH 7,2 em temperaturaambiente. A reação é iniciada pela adição de ácido araquidônico 15 μΜ comosubstrato e realizada por mais 8 minutos, após o que a reação é terminada pelaadição de ácido cítrico 70 mM e níveis de 5-HETE são determinados porensaio radioimune. Os compostos são avaliados a 30 μΜ. NDGA (ácidonordiidrogurético) é usado como agente de referência padrão.

Tabela 12: Bio-ensaios de 5-lipoxigenase sesquiterpenóide e inibição defosfodiesterase PDE4

<table>table see original document page 21</column></row><table>

hum = humana; η - número de tubosInibição da liberação da Interleucina-5 (IL-5), que é ummediador proeminente liberado em doenças alérgicas, foi tambémdeterminada para o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 em ensaioscelulares, cujas curvas de inibição são mostradas na Figura 6 e Figura 7,respectivamente. Os resultados obtidos para estes bioensaios são mostrados naTabela 13 abaixo.

Com referência ao texto de liberação de mediador IL-5humano, o composto de teste é incubado com células de leucócitosmononucleares de sangue periférico (PBMNL) humanas estimuladas porConcanavalina A (ConA) (10 μg/ml) em meio de crescimento RPMI-1640(pH 7,4) durante a noite a 37 0C em um incubador. Os níveis de produção dacitocina IL-5 no meio condicionado são quantificados usando-se um kitELISA sanduíche. Os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 μΜ.Estas mesmas concentrações são concomitantemente aplicadas a um grupo decélulas tratadas e avaliadas quanto à possível citotoxicidade induzida pelocomposto somente se inibição significativa de liberação foi observada.Dexametasona é usada como agente de referência padrão.

Além disso, os testes de citotoxicidade Con-A foramconduzidos usando-se o composto de fórmula 1, cujas curvas de inibição sãomostradas na Figura 2.

Para o teste de liberação/citotoxicidade do mediador induzidopor ConA, o composto de teste e/ou veículo é incubado com uma suspensãode leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMNL, 1 χ105/poço), na presença de Concanavalina A (Con A, 20 μ§/ηι1) em tampãoRPMI (pH 7,4) a 37 0C durante a noite em 5% CO2. Reagente AlamarBlue éadicionado e as células são incubadas a 37 0C por 16 horas. As células vivasabsorvem AlamarBlue e emitem fluorescência. A intensidade de fluorescênciaé medida usando-se uma leitora de placa SpectraFluor Plus com excitação a530 nm e emissão a 590 nm. Uma diminuição de 50% ou mais (50%) daintensidade de fluorescência relativa aos controles tratados com veículo indicasignificativa citotoxicidade. Os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01 e0,001 μΜ. Dexametasona é usada como agente de referência padrão.

Os resultados dos ensaios de controles (usando-se DMSO)para os ensaios acima são mostrados na Figura 3.

Tabela 13: Inibição da liberação do mediador pelo composto sesquiterpenóide (1)

<table>table see original document page 23</column></row><table>

hum = humana; ANT - antagonista

A IC5O do composto é de 16,1 μΜ para o ensaio de inibição deliberação do mediador de Interleucina-5 (IL-5). A inibição de 93% éobservada para o ensaio de inibição de liberação de mediador Interleucina-5(IL-5), usando-se concentrações de 100 μΜ do composto ativo em cadaexperimento.

A citotoxicidade do composto ativo foi observada quandoconduzindo-se os bio-ensaios acima, como mostrada na Tabela 14, videvalores IC5o vs EC50. Embora um efeito citotóxico parcial tenha sidoobservado durante os ensaios de liberação do mediador, a eficácia docomposto purificado de fórmula 1 é atribuída ao fato de que a ligação eficazao sítio do receptor de glicocorticóide (GR) foi es estabelecida.

Tabela 14: Perfil de citotoxicidade do sesquiterpenóide (1)

<table>table see original document page 23</column></row><table><table>table see original document page 24</column></row><table>

hum = humano; ANT -- antagonista; η = número de tubos

Um óleo essencial, obtido por destilação por vapor dosrizomas secos como descrito no Exemplo 2, foi também avaliado usando-se oensaio de enzima de 5-lipoxigenase e o ensaio de fosfodiesterase PDE4, paradeterminar seu(s) efeito(s) inibitório(s). A inibição de 99% foi observadausando-se o ensaio 5-LO, enquanto 73% de inibição foram observadosusando-se o ensaio de fosfodiesterase PDE4, indicando que o óleo essencialtem um efeito broncodilatador e pode ser usado para inibir a ação da enzima5-lipoxigenase. Os resultados obtidos são também mostrados na Tabela 12acima.

EXEMPLO 5

Um extrato de dietil éter foi preparado de uma maneira similarà do Exemplo 1. Os rizomas da planta, Siphonochilus aethiopicus, foramlavados, cortados, secados no forno a 40 0C e em seguida moídos em um pó. 11 de água em ebulição deionizada foi adicionado a 25,0 g de rizomas moídossecados em forno e deixado repousar por 1 hora com agitação ocasional. Aágua foi filtrada e extraída com dietil éter (4 χ 500 ml). As camadas de éterforam separadas das camadas de água, combinadas, secadas (MgSO^,filtradas e o solvente removido por meio de um evaporador rotativo em umbanho de água em uma temperatura ambiente de 25 0C. 215 mg de extratoorgânico foram obtidos. Este extrato de dietil éter foi submetido a teste.

Impressão digital química da fração de dietil éter produzido daextração aquosa (vide procedimento experimenta acima) usando-se LC-MS(cromatografia líquida-espectroscopia de massa combinadas) indicou apresença do composto principal, um sesquiterpenóide de fórmula 1. O extratode dietil éter foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica) usando-seacetato de etila/hexano (1:9 v/v) como eluente para produzir osesquiterpenóide de fórmula 1.

EXEMPLO 6: Ensaio biológico de transcrição NF-kB.

Os ensaios foram realizados e padrões de referência usadoscomo uma parte integral de cada ensaio, para assegurar a validade dosresultados obtidos. O ensaio é descrito em Lenardo MJ, Baltimaore D.Lenardo MJ, Baltimaore D, NF-κΒ: A pleiotropic mediator of inducible andtissue specific gene control. Cell. 58: 227-229, 1989, cujo conteúdo éincorporado aqui por referência.

O extrato de dietil éter, preparado diretamente de plantasmoídas (Figura 1) (WG-I-94B) foi avaliado quanto a suas propriedadesantiinflamatórias no ensaio de Transcrição NF-κΒ (vide protocolo abaixo).Uma atividade de inibição significativa foi observada, com uma IC50 estimadade 14,3 μg/ml (vide Tabela 15 abaixo) neste ensaio na ausência decitotoxicidade em concentrações de até 100 μg/ml. Ciclosporina A foi usadacomo o composto de referência (IC50 de 0,0608 μΜ) (vide Tabela 15 abaixo)neste ensaio. Os resultados de inibição e citotoxicidade são mostrados naTabela 16 e curvas de resposta de concentração são mostradas nas Figuras 8 e9. Com base nestes resultados, foi estabelecido que o extrato de dietil éter eraeficaz na inibição de NF-κΒ.

Tabela 15: Inibição do fator de transcrição NF-κΒ pelo extrato de éter (WG-I-58 A)

<table>table see original document page 25</column></row><table>

Atividade de inibição significativa foi observada no ensaiocelular de Resposta de Transcrição de NF-κΒ sem efeitos citotóxicos, dessemodo inibindo a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios einflamatórios, que são responsáveis pelo trajeto inflamatório da asma.Tabela 16: Citotoxicidade e Inibição do fator de transcrição NF-κΒ peloextrato de dietil exter (WG-I-58A), resposta de dose

<table>table see original document page 26</column></row><table>

hum - humana; ANT = antagonista; η = número de tubos

EXEMPLO 7: Inibição do fator de transcrição NF-kB

1. Procedimento Experimental

Os rizomas e raízes frescos da planta (300 g), Siphonochilusaethiopicus, foram lavados com água e secados ao ar. As raízes frescas foramseparadas dos rizomas. As raízes foram moídas e os rizomas foram fatiadosem fatias tendo uma espessura de aproximadamente 2-3 mm cada. Tanto asraízes e rizomas foram destilados por vapor em uma unidade de Destilação avapor por 3 h. Os cristais que se formaram no condensador foram lavadoscom água deionizada e filtrados através de um funil de vidro sinterizado. Aestrutura dos cristais é dada na Figura 1 (Amostra no: WG-I-94B).

A mistura do óleo essencial e água no condensado de funilseparatório foi permitida repousar em temperatura ambiente por 18 h. Oscristais resultantes presentes na superfície, compreendendo o composto defórmula 1, foram removidos por drenagem do condensado e filtragem usando-se um funil de vidro sinterizado. Um total de 240 mg dos cristais foramobtidos. Os cristais foram submetidos a teste.2. Ensaios biológicos

Os ensaios foram realizados em MDS Pharma em Taiwan e ospadrões de referência usados como uma parte integral de cada ensaio, paraassegurar a validade dos resultados obtidos.

O composto de fórmula 1 foi avaliado quanto a suaspropriedades antiinflamatórias no ensaio de resposta de transcrição celularNF-κΒ (vide Anexo I para o protocolo) bem como o correspondente ensaiocelular de Resposta de Transcrição celular de NF-κΒ. O composto provocou >100 % de inibição a 100 μΜ no ensaio de resposta de transcrição celular NF-κΒ, sem citotoxicidade aparente na mesma concentração. Isto mostra que ainibição do composto na transcrição celular NF-κΒ não é devida àcitotoxicidade geral. Um IC50 DE 15,6 μg/ml foi calculada neste ensaio eciclosporina A foi usada como o composto de referência (IC5o de 0,0608 μΜ).

Os resultados e as curvas de resposta de concentração são mostradas noAnexo II. Com base nestes resultados, foi estabelecido que o composto defórmula 1 foi eficaz na inibição de NF-κΒ.

3. Propriedades benéficas

O composto, um sesquiterpenóide, isolado de Siphonochilusaethiopicus foi avaliado em ensaios in vitro, que representam um papelprincipal nas doenças inflamatórias crônicas, tais como asma. Atividade deinibição significativa foi observada no ensaio de resposta de transcriçãocelular NF-κΒ sem efeitos citotóxicos. O composto (isolado da Destilação avapor das raízes e rizomas frescamente preparados) pode assim ser usado parainibir a atividade específica da resposta de transcrição NF-κΒ, desse modoinibindo a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios,que são responsáveis pelo trajeto inflamatório da asma. NF-κΒ representa umregulador mestre da inflamação e é, portanto, um alvo atrativo paradesenvolvimento de medicamento.

EXEMPLO 8: Resposta de Transcrição, NF-κΒ (humano)

Número do Teste: 361000

Introdução:

Nas células remanescentes, o local citoplásmico do fator de transcrição nuclear NF-κΒ é ligado por uma subunidade inibitória IkB; Aligação de IkB eficazmente mascara as seqüências de localização nuclearpresentes nas subunidades P50 e P65 de NF-κΒ, evitando a translocaçãonuclear. Parece que, na estimulação celular, um trajeto de transdução de sinalé ativado, resultando em fosforilação dos resíduos de serina chave nopolipeptídeo, depois do que o complexo NF-κΒ-ΙκΒ se dissocia, IkB érapidamente degradado e o sinal de localização nuclear não mascaradopermite que NF-κΒ transloque-se para dentro dos núcleos e ative a transcriçãodos genes específicos. É sabido que NF-κΒ regula muitos fatores pró-inflamatórios e pró-trômbicos produzidos pelos leucócitos ativados. NF-κΒrepresenta um regulador mestre da inflamação e é, portanto, um alvo atrativopara desenvolvimento de medicamento.

Procedimento:

Células Jukart de linfócitos T humanos, transfectadas com umrepórter IacZ de elemento de resposta, em que a transcrição do gene β-galactosidase é dirigida pelo sítio de ligação para o fator de transcriçãonuclear NF-κΒ, são usadas. O composto de teste e/ou veículo são incubadoscom as células (1,5 χ 106/ml) na presença de 0,5 μΜ A23187 e 50 ng/mlPMA (forbol 12-miristato 13-acetato) em RPMI-1640 pH 7,4 a 37 0C por 4horas. A atividade de β-galactosidase induzida pelo composto de teste édeterminada pela conversão de FDG (fluoresceína di-p-D-galactopiranosídeo)em fluoresceína. A intensidade da fluorescência é lida em leitora de placaSpectroFluor Plus. A diminuição de 50 por cento ou mais (> 50%) daintensidade de fluorescência, em relação à ciclosporina A 10 μΜ, indicasignificativa atividade inibitória. os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01e 0,001 μΜ. Estas mesmas concentrações são concomitantemente aplicadas aum grupo separado de células tratadas e avaliadas quanto à possívelcitotoxicidade induzida por composto somente se estimulação ou inibiçãosignificativas for observada (Cat. #361100).

Dados de Referência: Inibidor (nM)

<table>table see original document page 29</column></row><table>

* Indica agente de referência padrão usado.

Tabela 17: Resultados de ensaio - Resultados de citotoxicidade e eficácia(resposta de transcrição) para o composto 1 (WG-I-94B)

<table>table see original document page 29</column></row><table>

* Batch - Representa compostos testados concomitantemente no(s) mesmo(s)ensaio(s) £ Parcialmente solúvel em solvente de teste in vitro

* Indica critérios de encontro de item para significânciaAg — Agonista; ant. = antagonista; Resp. = Resposta; ND = Ensaio de Teste

Não Realizado; R = Comentários adicionais; hum = humano

EXEMPLO 9: Efeito de extração de éter em modelos de rato asmáticos in vivo

Fundamentos da Invenção

Existem muitas citocinas que são conhecidos mediadores dainflamação e estão envolvidas no processo de doença asmática. Quando umagente causativo como um alérgeno é inalado, as células epiteliais bronqueaissão ativadas e produzem certas citocinas pró-inflamatórias (interleucinas,abreviado IL) em particular a cimiocina IL-8.

Do resultado dos ensaios in vitro anteriores, um adequadomodelo animal in vivo foi selecionado para determinar a atividade anti-asmática e anti-alérgica do extrato de dietil éter (WG-I-IOl) da plantaSiphonochilus aethiopicus.

Procedimento Experimental

Os rizomas da planta, Siphonochilus aethiopicus, foramlavados, cortados, secados no forno a 40 0C e em seguida moídos em um pó. 51 de dietil éter foram adicionados ali 0,40 g de rizomas moídos secados emforno e deixados repousar por 1 hora com agitação ocasional. O dietil éter foifiltrado e extraído com dietil éter (4x2 1). As camadas de éter foramcombinadas, secadas (MgSO4), filtradas e o solvente removido por meio deum evaporador rotativo em um banho de água em uma temperatura de 25 0C.

1,075 g de extrato orgânico foram obtidos. Este extrato de dietila (amostra no:WG-I-101) foi submetido a teste.

Ensaio biológico

Foram realizados ensaios em MDS Pharma em Taiwan epadrões de referência usados como uma parte integral de cada ensaio, paraassegurar a validade dos resultados obtidos. O ensaio biológico empregado foio ensaio Pulmonary, Antigen/Lipoxygenase Meatolites e o extrato de dietiléter de Siphonochilus aethiopicus foi avaliado quanto a possível atividadeneste ensaio in vivo.

(1) Substância de teste e padrão de dosagemWG-I-101 foi suspensa em 0,5% CMC/0,1% Tween 80. Asubstância de teste, em uma dose de 500 mg/kg foi dada oralmente duas vezesdiariamente por 3 consecutivos dias e uma dose final adicional foi adicionadaem uma hora antes da provocação do dia de teste de Ovalbuminon. O volumede dosagem de 10 ml/kg foi usado. A formulação é resumida como segue:

<table>table see original document page 31</column></row><table>

(a) Isto é baseado na observação visualS: solúvel; I: Insolúvel; ppt: precipitação

(b) Y: a fórmula é mantida em tubo ou frasco com cor marrom ou cobertocom folha de alumínio

(c) TR: temperatura ambiente; preparado e armazenado sob 15 °C ~ 30 °C;Temperatura por todo o experimento mais baixa ou mais elevada do que atemperatura ambiente é especificada.

(2) Animais

Porquinhos da índia derivados de Dunkin-Hartley machosfornecidos pelo Laboratory Animal Center of National Taiwan UniversityCollege of Medicine foram usados. A alocação de espaço para os animais foicomo segue: 45 χ 23 χ 21 cm para 3 porquinhos da índia. Cada gaiola deanimal foi esterilizada com autoclave. Todos os animais foram mantidos emuma temperatura controlada (22° - 24° C) e umidade (60% - 80%) de meioambiente com ciclos de luz/escuro de 12 horas por pelo menos uma semanano laboratório antes do uso. Livre acesso para comida de laboratório padrão(PMI Nutrition International, Inc., USA) e água RO foram garantidos. Todosos aspectos deste trabalho incluindo alojamento, experimentação e descartedos animais foram realizados em geral de acordo com o Guide for the Careand Use of Laboratory Animais (National Academy Press, Washington, D.C.,1996).

(3) Método

Grupos de 5 porquinhos da índia machos derivados de Dunkin-Hartley, pesando 400 ± 50 g (dia final) foram empregados. Os animais foramanestesiados com pentobarbital sódio ((50 mg/kg IP, com mais 5 mg/kg IP senecessário). Uma placa de alumínio mantida a 37 0C através do fluxo de águade um banho foi colocada embaixo dos animais de teste, para manter atemperatura corporal. A traquéia foi canulada e um ventilador de roedor(Harvard, USA) foi usado para ventilação artificial (10 ml/kg, 50respirações/minuto). Através de um braço-lateral da cânula, a pressãointratraqueal (ITP) foi medida usando-se um transdutor de pulso Pneumatic(Narco Biosystem, USA). Uma artéria carótida foi canulada (PE50, ClayAdams, USA) para medições da pressão sangüínea, usando-se um transdutorStathem P23 χ L (Viggo-Spectramed, USA) e freqüência cardíaca foi obtidapor ECG derivação II. Os porquinhos da índia foram sensibilizados eminjeções IP de ovalbumina (0,5 μg/0,5 ml/animal) e Al (OH3) (1 mg/0,5ml/animal) nos dias 1 e 8. Os animais foram então provocados com 15 μg/kgde Ovalbumina (IV) entre os dias 19 e 23 e a constrição broncopulmonar foiregistrada como um aumento de ITP.

A substância de teste a 500 mg/kg foi administrada oralmenteduas vezes diariamente por 3 dias consecutivos e uma dose adicional final foiadicionada no dia de teste, em seguida, uma hora após a dose final, os animaisforam injetados intravenosamente (1 ml/kg) com um "coquetel":Indometacina (10 mg/kg), Mepiramina (2 mg/kg) e Propanolol (100 μg/kg),seguido por provocação com ovalbumina 5 minutos mais tarde. Em animaistratados com veículo, a provocação de antígeno resultou em respostasbroncoconstritoras (aumento em ITP) variando de 45 a 85 por cento debroncoconstrição possível máxima, conforme medido por oclusão traquealcompleta. Uma inibição de 50 por cento ou mais (>50%) da broncoconstriçãoinduzida por ovalbumina, relativa aos animais de controle tratados comveículo, é considerada significativa. O fluido de lavagem broncoalveolar foirecuperado após instilar 5 ml de solução salina tamponada com fosfato por 2vezes. TNF-α, IL-I β e IL-8 dos sobrenadantes de fluido de lavagembroncoalveolar (BALF) foram medidos com ELISA após provocação comovalbumina. ANOVA de uma direção, seguida por Teste de Dunnett, foiaplicada para comparação entre os grupos tratados com controle de veículo ecomposto de teste. P < 0,05 é considerado significativo.

(4) Resultados do ensaio in vivo

Os resultados do ensaio são resumidos na Tabela 18 emostraram que o extrato de dietil éter (WG-I-101) provocou inibiçãomoderada (19%) da constrição das vias aéreas aguda induzida porOvalbumina, em relação ao controle tratado por veículo (Tabela 18). (> 50%de inibição é considerado como significativo).

Tabela 18: Porquinho da índia em resultados de ensaio in vivo

Ensaio #570000 Pulmonar, Antígeno/Metabólitos Lipoxigenase, em PressãoIntratraqueal (ITP) de Porquinhos da India

<table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>

Porquinhos da índia anestesiados e artificialmente ventilados,previamente sensibilizados, foram pré-tratados com Mepiramina 2 mg/kg,Indometacina 10 mg/kg e Propanol 0,1 mg/kg por 5 minutos; pressãosangüínea arterial (BP, mm Hg), freqüência cardíaca (HR, batidas/min) epressão traqueal (TP, cm H20) foram registradas após dosagem oral por 3dias. No final da dosagem crônica, aumento induzido por antígeno(Ovalbumina 5 μg/kg IV) da pressão traqueal (ITP) acima de uma linha debase inicial de 6 cm H20 foi então registrado como uma indicação dabroncoconstrição. A inibição percentual (%) é calculada de acordo com afórmula [Aumento da Pressão Traqueal (tratado-veículo)] - [aumento daPressão Traqueal (tratado com substância de teste) / [Aumento da PressãoTraqueal (tratado-veículo)] χ 100%.

1. ΔΙΤΡ: Mudanças em ITP em relação aos valores de linhade base correspondentes; (-) Oval: Resposta a veículo ou substância de testeapenas e antes da provocação com Ovalbumina; (+) Oval: Mudanças daresposta para provocação com Ovalbumina.

2. % Controle: resposta ITP à substância de teste, veículoexpresso em termos de percentagem da resposta ITP a Ovalbumina (15 μg/kgIV) no controle tratado com veículo (100%).

3. Uma inibição de 50 por cento ou maior (> 50%) dabroncoconstrição induzida por Ovalbumina relativa ao controle tratado comveículo é considerada significativa.

Amostras de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) nogrupo tratado com WG-I-IOl foram preparadas para medições de TNF-α, IL-1β após provocação de ovalbumina. ANOVA de uma direção, seguida porteste de Dunnett, foi aplicada para comparação entre os grupos tratados comcontrole de veículo e composto de teste. P < 0,05 é considerado significativo.WG-I-IOl provocou grande inibição da produção de EL-8 (P < 0,05) versuscontrole, após provocação com ovalbumina em porquinhos da índia, semefeitos significativos sobre secreção de TNF-α e IL-I β. Os resultados sãomostrados na Tabela 19.

Tabela 19: Resultados de expressão de citocina

<table>table see original document page 35</column></row><table>

As amostras de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) nogrupo tratado com WG-1-101 foram preparadas para medições de TNF-α, IL-1β e IL-8 após provocação com Ovalbumina. Os níveis de TNF-α, EL-I β eIL-8 de cada amostra foram avaliados usando-se kits de ELISA de TNF-α,IL-Iβ e IL-8, respectivamente. ANOVA de uma direção, seguido por Teste deDunnet, foi aplicado para comparação entre os grupos tratados com controleveículo e composto de teste. P < 0,05 é considerado significativo.

EXEMPLO 10: Pulmonar, Antígeno/Metabólitos de LipoxigenaseNúmero de Teste: 570000Procedimento:Grupos de 5 porquinhos da índia Dunkin-Hartley machos,pesando 250 ± 50 g são anestesiados com pentobarbital sódio (50 mg/kg i.p.,mais 15 mg/kg adicionais i.p. se necessário) e cloreto de succinilcolina (2mg/animal i.p.) é subseqüentemente administrado para evitar respiraçãoespontânea. A temperatura corporal é mantida a 37 a 38 0C.

A traquéia é canulada e o porquinho da índia ventilado comum respirador de roedor Harvard em um sistema fechado. A pressão traquealé registrada através de um braço lateral da cânula conectada a um transdutorP231D Statham. A taxa respiratória ajustada a 50 cursos/minuto com umvolume de curso (aproximadamente 1 ml/100 g) suficiente para produzir umapressão traqueal de linha de base de 6 cm H2O. A pressão arterial média émonitorada por uma artéria carótida canulada e a freqüência cardíaca é obtidapor elétrodos peitorais dispostos para derivação II. A veia jugular é canuladapara administração de veículo ou medicamento i.v. em um volume de 1ml/kg.

A lipoxigenase é ativada e os leucotrienos resultantes geradosatravés de provocação por antígeno em animais previamente sensibilizados.Porquinhos da índia são sensibilizados com injeções de ovalbumina eAl(OH)3 (0,5 μg e 1 mg, respectivamente, em um volume de 0,5 ml/animali.p.) no dia 1, reforçadas com a mesma dose de ovalbumina e Al(OH)3 no dia8 e provocados entre o dia 19 e 23 com ovalbumina (50 μg/kg i.v.) pararealizar uma constrição das vias aéreas induzida-máxima, refletida como umaumento da pressão traqueal (cm H2O). Um aumento da pressão traqueal podetambém ser relacionado com um aumento da dureza do sistema respiratório.

Os animais são pré-tratados com composto CSIR por gavagem oral por doisdias. No dia do experimento, os animais recebem o composto CSIR 30 minantes da anestesia e cirurgia que leva 15 min. A provocação de ovalbumina éadministrada 60 min após dosagem com CSIR. Os animais são pré-tratados 5minutos antes da administração da substância de teste com indometacina i.v.(10 mg/kg), mepiramina (2 mg/kg) e propanolol (0,1 mgkg): um coqueteldesignado para inibir a geração de produtos de ciclooxigenase (tromboxanos,etc.) bem como antagonizar os receptores da histamina e β-adrenérgicos. Emanimais de controle tratados com veículo, a provocação com antígeno resultaem respostas constritoras das vias aéreas variando de 45 a 85 por cento deconstrição das vias aéreas máxima possível, obtidas por oclusão traqueal.

Fenidona, o padrão positivo, é administrado i.v. (30 mg/kg) 5minutos antes da provocação com ovalbumina em 5 porquinhos da indica.Uma inibição de 50 por cento ou mais (> 50) da constrição das vias aéreasinduzida, em relação aos animais de controle tratados com veículo, éconsiderada significativa.

<table>table see original document page 37</column></row><table>

* agente de referência padrão usado

LY-171883=1 [2-hidróxi-3-propil-4-[4-( 1 H-tetrazol-5-il)butoxi]fenil] etanona;NDGA = ácido nordiidroguarético

NOTA:

As substâncias de teste ativas neste sistema modelo indicampossíveis inibição in vivo de atividade de lipoxigenase e/ou antagonismo desua ativação do receptor gerado por leucotrieno(s). Conseqüentemente, podevalor a pena comparar resultados deste sistema modelo com aqueles obtidosda: inibição da ciclooxigenase para determinar a especificidade para inibiçãoenzimática; antagonismo de leucotrieno D4, para determinar a ação dasubstância de teste sobre a ativação do receptor produto final da enzima emrelação à inibição enzimática da lipoxigenase; atividade anticolinérgica e/ouatividade antiistamínica H1 e H3, para determinar a seletividade paraantagonismo de receptor e/ou ação broncodilatadora.

Tabela 20: nomes IUPAC de compostos referidos na Tabela 1 acima

<table>table see original document page 38</column></row><table>

Os extratos da invenção são componentes não-esteróidesisolados em uma forma natural, porém tendo o mesmo modo de ação que oscompostos esteróides comumente usados para o tratamento preventivo dedoença alérgica, tal como asma e atopia.

Além disso, o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 dainvenção mostra atividade como um modificador de leucotrieno, inibindo asações dos mediadores inflamatórios e leucotrienos.

Quando usado na forma de um óleo essencial, o extrato temum efeito combinado pelo fato de a redução da inflamação da asma e alergiaocorrer através da broncodilatação, inibição da biossíntese dos leucotrienos,bem como devido à regulação descendente dos receptores glicocorticóides.

Além disso, um extrato de dietil éter, contendo o compostosesquiterpenóide de fórmula 1 da invenção, mostra significante atividade deinibição no ensaio celular de Resposta de Transcrição de NF-κΒ sem efeitoscitotóxicos. O extrato de dietil éter pode assim ser usado para inibir aatividade específica da resposta de transcrição NF-κΒ, desse modo inibindo aliberação de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, tais como aInterleucina-8 (IL-8) da citocina, que são responsáveis pelo trajetoinflamatório da asma.

Além disso, um extrato de dietil éter, contendo o compostosesquiterpenóide de fórmula 1 da invenção, apresenta significativa inibição naprodução de IL-8, uma citocina inflamatória responsável pelo trajetoinflamatório da asma.

A invenção pode ser eficaz no tratamento preventivo total eremissão de doenças alérgicas, tais como asma, adicionando uma ferramentaútil no controle destas doenças.

A remissão de doenças alérgicas e asma é especificamentedefinida para fins desta especificação como um período livre de sintoma, semindivíduos recebendo tratamento convencionalmente disponível. Este períodode remissão é maior do que o período que é obtido usando-se tratamentoconvencional para o controle de doenças alérgicas, tais como asma.

O Requerente acredita ainda que a invenção, na forma deextratos de solventes orgânicos, rizomas secos, um óleo essencial ou como ocomposto químico único de fórmula 1, usado sozinho ou em combinação, oucomo composições, fornece uma alternativa ao uso de medicamentosantiinflamatórios esteróides, tais como glicocorticóides, para o tratamentopreventivo de longo termo e remissão de doenças alérgicas, especialmenteasma e atopia.

Agentes comercialmente disponíveis conhecidos do Requerente,que operam no nível do receptor glicocorticóide, tipicamente são de uma naturezaesteróide e têm numerosos efeitos colaterais nocivos durante seu uso de longo-termo. Os compostos, derivativos, composições e produtos da invenção são não-esteróides por natureza, embora, surpreendentemente, tenham sido constatadosatuarem eficientemente no nível do receptor de glicocorticóide (GR).

Claims (34)

1. Uso de um extrato de pelo menos uma planta selecionada deplantas da família Zingiberaceae, caracterizado pelo fato de ser na preparaçãode um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doençasalérgicas.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de a pelo menos uma planta ser selecionada dos gêneros Siphonochilus,Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de a pelo menos uma planta ser selecionada das espécies Siphonochilusaethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferianatalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiellaaethiopica.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de o extrato incluir, como um ingredienteativo, um composto selecionado dos compostos tendo a fórmula estrutural 1, <formula>formula see original document page 40</formula> (4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)seus estereoisômeros e suas misturas de estereoisômeros.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de a doença alérgica ser selecionada deasma e atopia.

6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de o extrato ser um óleo essencial obtidopor destilação a vapor do material de planta de pelo menos uma planta.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo fato de o extrato ser um extrato de solvente orgânico obtidopor extração de material de planta da pelo menos uma planta com um solventeorgânico.

8. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de o solvente orgânico ser um éter selecionado de dietil éter, diisopropiléter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter.

9. Uso de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de o solvente orgânico, ser um éster selecionado de metil acetato, etilacetato e benzil acetato.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 9,caracterizado pelo fato de o material de planta ser obtido de raízes ou rizomasda planta.

11. Composição para uso em um método de tratamento ouprofilaxia de doenças alérgicas, caracterizada pelo fato de incluir um extratode pelo menos uma planta selecionada das plantas da família Zingiberaceae.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato de pelo menos uma planta ser selecionada dos gênerosSiphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12,caracterizada pelo fato de pelo menos uma planta ser selecionada das espéciesSiphonochilus aethiopieus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopiea,Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopiea eCienkowskiella aethiopiea.

14. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 13, caracterizada pelo fato de o extrato incluir, comoingrediente ativo, um composto selecionado dos compostos tendo a fórmulaestrutural 1,<formula>formula see original document page 42</formula> (4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)seus estereoisômeros e suas misturas de estereoisômeros.

15. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 14, caracterizada pelo fato de a doença alérgica serselecionada de asma e atopia.

16. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de o extrato ser um óleoessencial obtido por destilação a vapor de material de planta da pelo menosuma planta.

17. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 15, caracterizada pelo fato de o extrato ser extrato desolvente orgânico obtido por extração de material de planta da pelo menosuma planta com um solvente orgânico.

18. Composição de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de o solvente orgânico ser um éter selecionado dedietil éter, diisopropil éter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter.

19. Composição de acordo com a reivindicação 17,caracterizada pelo fato de o solvente orgânico ser um éster selecionado demetil acetato, etil acetato e benzil acetato.

20. Composição de acordo com qualquer uma dasreivindicações 11 a 19, caracterizada pelo fato de o material de planta serobtido de raízes ou rizomas da planta.

21. Uso de um extrato de pelo menos uma planta selecionadade plantas da família Zingiberaceae, caracterizado pelo fato de ser napreparação de um medicamento para uso em qualquer um ou mais deregulação descendente de receptores glicocorticóides, da inibição dafosfolipase A2, de regulação descendente de mediadores da alergia, deregulação descendente das citocinas, de inibição da fosfodiesterase 4, deinibição da 5-Iipoxigenase ou biossíntese dos leucotrienos e de inibição daatividade específica da resposta de transcrição NF-kB.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelofato de os mediadores da alergia serem selecionados das prostaglandinas eleucotrienos.

23. Uso de acordo com a reivindicação 21 ou reivindicação 22,caracterizado pelo fato de as citocinas serem selecionadas de IL-4, IL-5 e IL--8.

24. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-23, caracterizado pelo fato da pelo menos uma planta ser selecionada dosgêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella.

25. Uso de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelofato da pelo menos uma planta ser selecionada das espécies Siphonochilusaethiopieus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopiea, Kaempferianatalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopiea e Cienkowskiellaaethiopiea.

26. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-25, caracterizado pelo fato de o extrato incluir, como um ingrediente ativo,<table>table see original document page 43</column></row><table>(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)seus estereoisômeros e suas misturas de estereoisômeros.

27. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-26, caracterizado pelo fato de a doença alérgica ser selecionada de asma eatopia.

28. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-27, caracterizado pelo fato de o extrato ser um óleo essencial obtido pordestilação a vapor de material de planta da pelo menos uma planta.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-27, caracterizado pelo fato de o extrato ser extrato de solvente orgânico obtidopor extração de material de planta da pelo menos uma planta com um solventeorgânico.

30. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de o solvente orgânico ser um éter selecionado de dietil éter, diisopropiléter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter.

31. Uso de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelofato de o solvente orgânico ser um éster selecionado de metil acetato, etilacetato e benzil acetato.

32. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 21a-31, caracterizado pelo fato de o material de planta ser obtido de raízes ourizomas de planta.

33. Uso de um composto selecionado dos compostos tendo afórmula 1,<formula>formula see original document page 44</formula>seus estereoisômeros e suas misturas de estereoisômeros, ditouso caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para usono tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas.

34. Uso de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelofato de a doença alérgica ser selecionada de asma e atopia.