BRPI0708554B1

BRPI0708554B1 - uso de um composto

Info

Publication number: BRPI0708554B1
Application number: BRPI0708554-0A
Authority: BR
Inventors: Roelof Marthinus Horak; Ebrahim Wadiwala; Marina Mikhailovna Van Der Merwe; Vinesh Jaichand Maharaj; Louis Gabriël Jozua Ackerman; Gerda Fouché
Original assignee: Csir
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2007-02-28
Publication date: 2021-01-19
Also published as: US20100168227A1; CN101432009A; RU2008137281A; US20090082433A1; AP2893A; WO2007113698A3; AP2008004630A0; ZA200807874B; BRPI0708554B8; CN101432009B; EP2007408A2; BRPI0708554A2; US8158165B2; WO2007113698A2; EP2007408B1

Abstract

USO DE UM EXTRATO DA ESPÉCIE DE PLANTA SIPHONOCHILUS AETHIOPICUS, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UM COMPOSTO. A invenção provê o uso de pelo menos uma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae, na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas. A planta é opcionalmente selecionada dos gêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella e a espécie é opcionalmente selecionada de Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia Aethiopica e Cienkowskiella aethiopica. A doença alérgica é selecionada de asma e atopia.

Description

Esta invenção refere-se a compostos úteis no tratamento preventivo e remissão de doenças alérgicas. Mais especificamente, esta invenção refere-se a compostos úteis no tratamento preventivo e remissão da asma e/ou atopia.

Os glicocorticóides são largamente usados no tratamento preventivo da asma e outras doenças alérgicas. Os glicocorticóides ligam-se ao receptor de glicocorticóides (GR), desse modo ativando o GR. O GR ativado então liga-se a um elemento responsivo aos glicocorticóides e supra regula os genes para agentes antiinflamatórios, tais como lipocortina. A indução da licocortina da proteína antiinflamatória, por sua vez, inibe a fosfolipase A2 da enzima, desse modo diminuindo a produção dos mediadores da alergia, tais como prostaglandinas e leucotrienos. Alergia e Doenças Alérgicas: The new Mechanism and Therapeutics, edited by J.A. Denburg, Human Press Inc., Totowa, NJ, Schleimer RP, Effects of Glucocorticosteroids on inflammatory cells relevant to their Therapeutic Application in Asthma, Am. Rev. Respir. Dis., 1990, 141, S59-S69.

Um dos outros principais efeitos do GR ativado é a regulação descendente de uma larga variedade de agentes, incluindo os agentes das citocinas e da quimiocina, tais como interleucina-4 (IL-4) e interleucina-5 (IL-5). A capacidade dos glicocorticóides em inibir a produção das citocinas, em particular IL-5, provou ser um componente principal de sua eficácia no tratamento de doenças alérgicas e, especialmente, asma e atopia.USO DE UM EXTRATO DA ESPÉCIE DE PLANTA SIPHONOCHILUS AETHIOPICUS, COMPOSIÇÃO, E, USO DE UM COMPOSTO. A invenção provê o uso de pelo menos uma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae, na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas. A planta é opcionalmente selecionada dos gêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella e a espécie é opcionalmente selecionada de Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia Aethiopica e Cienkowskiella aethiopica. A doença alérgica é selecionada de asma e atopia.

Além disso, as isoenzimas da fosfodiesterase (PDE’s) e, mais particularmente, os inibidores da PDE 4 estão recebendo interesse especial como agentes anti-asmáticos, devido à evidência de que estas enzimas podem atuar tanto como agentes antiinflamatórios como broncodilatadores tanto em animais como humanos. Cortijo J, Beleta J, Cardelus I, Llenas E, Morcillo E.,

Investigation into the role of phosphodiesterase IV in bronchorelaxation, including studies with human bronchus, Br. J. Pharmcol., 1993, 108, 562-568.

Os leucotrienos são também de particular interesse no estudo de doença alérgica, por causa de sua marcante ação broncoconstritora. Os leucotrienos têm um ação broncoconstritora 1000 vezes maior do que as histaminas e prostaglandinas. Os leucotrienos são sub-produtos do ácido araquidônico, que é localizado nas bi-camadas fosfolipídicas das membranas celulares dos mastócitos. Durante um ataque de asma, o ácido araquidônico é convertido em cinco leucotrienos. Esta conversão é mediada por uma enzima, 5-lipoxigenase (5-LO), que converte o ácido araquidônico primeiro em ácido 5-hidroxiperoxieicosatetraenóico (5-HPETE) e então em leucotrieno A4 (LTA4), que é o precursor dos outros quatro leucotrienos. Dos cinco leucotrienos produzidos durante um ataque de asma, a classe de cisteinila dos leucotrienos (LTC4, LTD4 e LTE4) contém os mais potentes broncoconstritores. Werz O, Steinhilber D, Therapeutic options for 5- lipoxygenase inhibitors, Pharmacology and Therapeutics, 2006, 112, 701-718.

Dentro deste processo, os inibidores da biossíntese dos leucotrienos têm um importante papel a representar, uma vez que eles inibem a ação de 5-LO, desse modo inibindo a eventual síntese dos leucotrienos broncoconstritores.

O trajeto acima pode, assim, ser manipulado pela administração de um composto de ligação do receptor de glicocorticóides (GR), um inibidor de PDE e/ou um inibidor de 5-LO em um paciente em necessidade dele. Presentemente, isto é realizado na maioria dos casos administrando-se compostos esteróides em um paciente sofrendo de uma doença ou reação alérgica, tal como asma ou atopia. Devido a muitos efeitos colaterais prejudiciais sendo associados com os compostos esteróides no tratamento de tais doenças, há uma necessidade de um composto não- esteróide exibindo as propriedades benéficas associadas com os compostos esteroidais e formulações contendo esteróide.

Nas doenças inflamatórias crônicas, tais como asma, artrite reumatóide, doença inflamatória do intestino e psoríase, diversas citocinas recrutam as células imunes e inflamatórias ativadas para o sítio das lesões, desse modo ampliando e perpetuando o estado inflamatório. Estas células ativadas produzem muitos outros mediadores da inflamação. O ciclo vicioso pode ser suprimido por terapia glicocorticóide ou imunossupressiva, porém não há tratamento curativo para qualquer doença inflamatória crônica. Os fatores de transcrição representam um papel chave nas respostas imunes e inflamatórias e um fator de transcrição de particular importância é o fator-kB (NF-kB). O NF-kB é um mediador central da resposta imune humana, regulando a transcrição de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, tais como as citocinas Interleucina-1 (IL-1), Interleucina-2 (IL- 2), Interleucina-8 (IL-8) e TNF-oc, bem como os genes codificando a ciclo- oxigenase II, sintase do óxido nítico, imunorreceptores, moléculas de adesão celular ou proteínas de fase aguda. Em estudos clínicos de pacientes com asma alérgica, os níveis de plasma da Interleucina-8 (IL-8) foram elevados nestes pacientes. Blackwell TS, Christian JW, The role of nuclear factor- KB in cytokine gene regulation. Am. J. Respir. Cell Mol Biol 1997; 17:3-9, Hashimoto, S., Matsumoto, K., Gon, Y. et al. 2000. p38 MAP kinase regulates TNF alpha-, IL-1 alpha- and PAF- induced RANTES and GM-CSF production by human bronchial epithelial cells. Clinical and Experimental Allergy. 30: 48-55. Herlaar, E. and Brown, Z. 1999. p38 MAPK signaling cascades in inflammatory disease. Molecular Medicine Today. 5: 439-447. Holden, N. S., Catley, M.C., Cambridge, LM., Barnes, PJ. and Newton, R. 2004. ICAM- 1 expression is highly NF-kappaB-dependent in A549 cells. European Journal of Biochemistry. 271: 785-791. Portanto, a inibição de NF- kB, resultando na regulação descendente das quimiocinas tais como IL-8, poderia ser benéfica no tratamento da asma e doenças inflamatórias.

De acordo com um aspecto da invenção, é provido um extrato de solvente orgânico ou um óleo essencial de uma planta da família Zingiberaceae para uso no tratamento preventivo e remissão de doenças alérgicas.

As plantas da família Zingiberaceae incluem os gêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e/ou Cienkowskiella.

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode ser obtido de material de plantas selecionadas das espécies Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiella aethiopica.

Preferivelmente, o dito extrato de solvente orgânico ou óleo essencial compreende, como um ingrediente ativo, um composto tendo a fórmula estrutural 1:

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S)

O nome químico (IUPAC) do composto de fórmula 1 é 4,4a,5,9- tetraídro-3,5,8a-trimetilnafto[2,3-b]furan-8-ona.

O composto de fórmula 1 pode ser usado na forma de uma mistura racêmica ou na forma de um de seus estereoisômeros.

Exemplos das doenças alérgicas são asma e atopia.

Tipicamente, o extrato de solvente orgânico ou óleo essencial é capaz de ligar-se a um receptor de glicocorticóide (GR), induzindo a produção de lipocortina e/ou a inibição da enzima fosfolipase A2 e/ou a diminuição da produção das prostaglandinas e/ou leucotrienos.

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode ter atividade anti-broncoconstritora e ainda pode regular descendentemente os agentes das citocinas e quimiocinas, tais como Interleucina-4 (IL-4) e Interleucina-5 (IL-5).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode ter atividade anti-broncoconstritora e ainda pode regular descendentemente os agentes das citocinas e quimiocina, tais como interleucina-4 (IL-4) e Interleucina-5 (IL-5).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode inibir o NF-kB, um mediador central da resposta imune humana, regulando descendentemente a transcrição de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, tais como as citocinas Interleucina-8 (IL-8).

O extrato de solvente orgânico ou óleo essencial pode ser obtenível por um método que inclui as etapas de preparar um extrato de material de uma planta da família Zingiberaceae e separar uma fração tendo atividade contra doenças alérgicas, os extratos contendo o ingrediente ativo tendo atividade contra doenças alérgicas.

O método pode incluir as etapas de extrair rizomas ou raízes úmidas ou amostras de planta moídas de ditas espécies, tais como Siphonochilus aethiopicus, ou secar os rizomas e/ou as raízes da planta por secagem ao ar ou secagem no forno, seguido por moagem dos rizomas e/ou raízes em um pó. Os extratos são preparados por extração usando-se solventes orgânicos, tais como dietil éter, di-isopropil éter, t-butil metil éter, t-butil etil éter, etil acetato ou benzil acetato. O ingrediente ativo pode ser extraído por técnicas de extração que incluem destilação por vapor e/ou purificação dos extratos usando-se divisão de solvente/solvente e/ou técnicas de separação cromatográfica.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma substância ou composição para uso em um método para o tratamento preventivo e remissão das doenças alérgicas, substância esta ou composição incluindo como ingrediente ativo um extrato como descrito acima, e dito método compreendendo administrar a um indivíduo uma dosagem eficaz de dita substância ou composição.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provida uma substância ou composição para uso em um método para o tratamento preventivo e remissão de doenças alérgicas, substância esta ou composição incluindo como ingrediente ativo um composto de fórmula 1 e dito método compreendendo administrar a um indivíduo uma dosagem eficaz de dita substância ou composição.

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um composto de fórmula 1 para uso em um método para o tratamento preventivo e remissão de doenças alérgicas.

De acordo com outro aspecto da invenção, é provido o uso do extrato de solvente orgânico ou óleo essencial como descrito na manufatura de um medicamento tendo atividade contra doenças alérgicas.

Exemplos de doenças alérgicas são asma e atopia.

De acordo ainda um outro aspecto da invenção, é provida uma composição para uso no tratamento preventivo e remissão de doenças alérgicas, que inclui uma quantidade eficaz de um de dito extrato, dito composto de fórmula 1 ou dito óleo essencial.

O extrato e composições do extrato podem ser em uma forma adequada para administração a indivíduos mamíferos, particularmente indivíduos humanos. O extrato pode ser na forma de um extrato de solvente orgânico e/ou óleo essencial ou suas combinações.

A invenção estende-se ao uso do extrato de solvente orgânico como descrito acima, do óleo essencial ou do composto de fórmula 1 na regulação descendente dos receptores de glicocorticóide, na inibição da fosfolipase A2, na regulação descendente dos mediadores da alergia, tais como prostaglandinas e leucotrienos, na regulação descendente das citocinas, tais como IL-4 e IL-5, na inibição da fosfodiesterase 4, na inibição da 5- lipoxigenase ou biossíntese do leucotrieno e na inibição da atividade específica da Resposta de Transcrição NF-kB, resultando na regulação descendente de IL-8.

Mais particularmente, a invenção provê o uso de um extrato de pelo menos uma planta selecionada das plantas da família Zingiberaceae, na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas.

A pelo menos uma planta pode ser selecionada dos gêneros Siphonochilus, Kaempferia, Cienkowskia e Cienkowskiella e das espécies Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiella aethiopica.

O extrato pode incluir, como um ingrediente ativo, um composto selecionado dos compostos tendo a fórmula estrutural 1,

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S) seus estereoisômeros e misturas de seus estereoisômeros. A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia. O extrato pode ser um óleo essencial obtido por Destilação a vapor de material de planta da pelo menos uma planta. Em disso, o extrato pode ser um extrato de solvente orgânico obtido por extração de material de planta da pelo menos uma planta com um solvente orgânico.

O solvente orgânico pode ser um éter selecionado de dietil éter, diisopropil éter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter. Em vez disso, o solvente orgânico pode ser um éster selecionado de metil acetato, etil acetato e benzil acetato.

O material de planta pode ser obtido de raízes ou rizomas da planta.

A invenção estende-se a uma composição para uso em um método de tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas, a composição incluindo um extrato de pelo menos uma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae.

A pelo menos uma planta pode ser como aqui antes descrito.

O extrato pode ser como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia e o material da planta pode ser obtido de raízes ou rizomas da planta.

A invenção estende-se ao uso de um extrato de pelo menos uma planta selecionada de plantas da família Zingiberaceae, na preparação de um medicamento para uso em qualquer uma ou mais da regulação descendente de receptores glicocorticóides, inibição da fosfolipase A2, regulação descendente de mediadores de alergia, regulação descendente das citocinas, inibição da fosfodiesterase 4, inibição da 5-lipoxigenase ou biossíntese de leucotrieno e na inibição da atividade específica da Resposta de Transcrição de NF-KB.

Os mediadores da alergia podem ser selecionados das prostaglandinas e leucotrienos. As citocinas podem ser selecionadas de IL-4, IL-5 e IL-8.

A pelo menos uma planta pode ser como aqui antes descrita.

O extrato pode ser como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia.

O material de planta pode ser obtido de raízes ou rizomas da planta.

A invenção estende-se, ainda, ao uso de um composto selecionado dos compostos tendo a fórmula estrutural 1.

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S) seus estereoisômeros e misturas de seus estereoisômeros, na preparação de um medicamento para uso no tratamento ou profilaxia de doenças alérgicas.

A doença alérgica pode ser selecionada de asma e atopia.

A invenção estende-se ainda a um método de tratamento de uma doença alérgica, o método incluindo administrar a uma pessoa ou animal em necessidade de tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz de um extrato, uma composição ou um composto selecionado dos compostos de fórmula estrutural 1, como aqui antes descrito.

A doença alérgica pode ser como aqui antes descrita.

A invenção será agora descrita, por meio de exemplo, com referência aos desenhos diagramáticos e tabelas anexos.

Nos desenhos,A Figura 1 mostra um fluxograma ilustrando um protocolo para a extração do composto de fórmula 1:

A Figura 2 mostra uma curva de inibição para liberação do mediador de citotoxicidade induzida por Con-A pelo composto de fórmula 1;

A Figura 3 mostra uma curva de inibição para liberação do mediador de citotoxicidade induzida por Con-A por um controle padrão DMSO;

A Figura 4 mostra uma curva de resposta de inibição ou concentração para a Resposta de Transcrição de NF-KB para o composto de fórmula 1, em que a curva foi normalizada;

A Figura 5 mostra uma curva de resposta de inibição ou concentração para a Resposta de Transcrição NF-KB para um controle positivo de Ciclosporina A;

A Figura 6 mostra uma curva de inibição combinada para a liberação do mediador IL-1 por tanto o composto de fórmula 1, bem como um controle padrão de Dexametasona;

A Figura 7 mostra uma curva de inibição combinada para a liberação do mediador IL-5 por tanto o composto de fórmula 1 como o controle padrão de Dexametasona, em que a curva de inibição do composto de fórmula 1 foi normalizada;

A Figura 8 mostra uma curva de inibição ou concentração para a Resposta de Transcrição NF-KB para um extrato de dietil éter contendo o composto de fórmula 1, em que a curva foi normalizada; e

A Figura 9 mostra uma curva de resposta de inibição ou concentração para a Resposta de Transcrição NF-KB para um controle positivo de Ciclosporina A.

O extrato de planta ou destilado da invenção pode ser produzido por extração de rizomas, raízes ou amostras de planta úmidos de Siphonochilus aethiopicus, ou secagem dos rizomas e/ou raízes da planta por secagem por ar ou secagem em forno, seguido por moagem dos rizomas e/ou raízes em um pó. Seu ingrediente ativo pode ser extraído por técnicas de extração, que incluem destilação por vapor e extração por solvente. O composto pode ser refinado ainda separando-se os compostos individuais do extrato ou destilado, usando-se divisão de solvente/solvente e/ou técnicas de separação cromatográfica. Estas técnicas são examinadas mais detalhadamente nos Exemplos ilustrativos abaixo.

EXEMPLO 1: Infusão e fracionamento aquosos de material de planta:

Como mostrado na Figura 1, uma infusão 14 é preparada de material de planta, tal como folhas, rizomas ou raízes. Um litro de água em ebulição deionizada, mostrada em 12, é adicionado a 22,08 g de rizomas moídos secados em forno (60 °C), mostrado em 10, e deixado repousar por 1 hora com agitação ocasional. A água é filtrada e os sólidos 11 são removidos e a fase aquosa é extraída quatro vezes com 500 ml de dietil éter, como mostrado em 16. Os extratos obtidos de cada extração são combinados, secados, filtrados e o solvente removido por meio de um evaporador rotativo em um banho de água em uma temperatura de 25 °C, como mostrado em 18, para produzir uma porção de éter 20 (WG13A) pesando 119 mg, que é designada a fração orgânica. Uma camada intermediária na forma de um sólido 22 (WG13D) forma-se durante a divisão líquido-líquido. Aproximadamente 107 mg de sólido 22 são obtidos, que são mantidos separados. A camada aquosa é secada por congelamento, como mostrado em 24, para produzir 2,52 g de material sólido 26 (WG13B), que é designado a fração aquosa. O composto de fórmula 1 está presente na fração orgânica e é identificado usando-se cromatografia de camada delgada. O composto pode então ser ainda purificado usando-se cromatografia de coluna.

EXEMPLO 2: Extração orgânica de material de planta

Em vez de seguir o método do Exemplo 1, e novamente com referência à Figura 1, um litro de dietil éter é adicionado a 22,08 g de rizomas moídos secados em forno (60 °C) e deixado repousar por 1 hora com agitação ocasional. O éter é filtrado e cuidadosamente evaporado sob baixo vácuo para produzir um extrato seco 34 (WG-I-101 ou WG-I-58A) de aproximadamente 1,5 g. O composto de fórmula 1 é identificado no extrato orgânico utilizando- se cromatografia de camada.

EXEMPLO 3: Fracionamento de extrato orgânico

Os extratos de dietil éter produzidos pelos procedimentos de extração aquosa ou de extração orgânica descritos acima foram purificados ainda por cromatografia flash (gel de sílica), como mostrado em 30, usando- se acetato de etil-hexano (1:9, v/v) como eluente, para produzir o sesquiterpenóide de fórmula 1 WG13C ou WG-I-94B, como mostrado em 32. 5 Um óleo essencial é obtido por Destilação a vapor dos rizomas e/ou raízes da espécie de planta Siphonochilus aethiopicus. As composições químicas dos componentes principais do óleo essencial são mostrados na Tabela 1 abaixo. A identificação dos componentes principais é realizada utilizando-se cromatografia de gasosa-espectrometria de massa e a técnica de 10 índices Kovats. O sesquiterpenóide de fórmula 1 cristaliza na interface do óleo essencial e o condensado obtido durante o processo de Destilação a vapor. No subseqüente esfriamento do óleo essencial a abaixo de 4 °C, o composto de fórmula 1 cristaliza do óleo. Tabela 1: Composição química do óleo essencial (reportar-se à Tabela 20 para 15 a nomenclatura IUPAC dos compostos listados na Tabela 1)

EXEMPLO 4: Destilação a vapor

Aproximadamente 600 g de rizomas frescos e/ou raízes são lavados com água e secados com ao ar. As raízes polpudas são separadas dos rizomas. As raízes são moídas e os rizomas são fatiados em fatias tendo uma espessura de aproximadamente 2-3 mm cada. Tanto as raízes como os rizomas fatiados são destilados por vapor em uma unidade de Destilação a vapor por 3 h. Um litro de condensado é coletado em um funil separatório. Os cristais que formam-se no condensador são retirados por lavagem com água deionizada e filtrados através de um funil de vidro sinterizado. Os cristais contêm o composto de fórmula 1.

A mistura do óleo essencial e água do condensado e funil separador é permitida repousar em temperatura ambiente por 16 h. Os cristais resultantes presentes na superfície, compreendendo o composto de fórmula 1 são removidos por drenagem do condensado e filtragem usando-se um funil de vidro sinterizado. Um total de 480 mg do composto de fórmula 1 é assim obtidos.

A designação estrutural do composto de fórmula 1 é baseada em um estudo detalhado dos dados espectrais de ressonância magnética nuclear JH e 13C de elevado campo do composto. O primeiro estágio da caracterização do composto é a identificação dos sinais NMR pertencentes aos sistemas de spin isolados. Isto é conseguido por meio de espectroscopia de correlação bidimensional (2D), empregando-se uma seqüências COSY-45. As multiplicidades das diferentes ressonâncias dos espectros C NMR são deduzidas does espectros 13C NMR acoplados, bem como dos sub- espectros CH, CH2 e CH3 desacoplados do próton, obtidos usando-se uma seqüências de pulso DEPT. As ressonâncias C são parcialmente atribuídas por correlação dos átomos de carbono contendo próton, com ressonâncias específicas em experimentos de mudança química 2D ( C, H).

Informação subseqüente, bem como os sinais dos átomos de carbono quaternário, é designada pelos experimentos de mudança química 13C-{!H} (HMBC) de longo alcance 2-D, como mostrado nas Tabelas 2, 3 e 4 abaixo: Tabela 2: dados (500 MHz) NMR para o composto de fórmula 1 de CP2C12

Com referência à Tabela 3: 1. Espectro de massa do composto de fórmula 1: m/z 230 (MÓ; 215 (M^-CHs); 187 (-CO); 83 (pico de base). 2. Rotação Óptica [α]D = +108.8° (c = 1,0, CH2CI2) 3. p.f. 89-90°C 10 Tabela 4: Experimento de mudança química ISC-^H) (HMBC) de longo alcance 2D

A estequiometria relativa do composto de fórmula 1 resulta da magnitude das constantes de acoplamento (1H,1H) e dos resultados dos experimentos 1H-{1H} n.O.e homonucleares, como mostrado na Tabela 5 abaixo:

Estudos de bioensaios e inibição:

Os resultados dos ensaios bioquímicos como apresentados aqui são refletidos como a inibição percentual da ligação ou atividade específica de um composto. O ensaio é descrito em Cidlowski, J.A. e Cidlowski, N. B., Regulation of glucocorticoid receptors by glucocorticoids in cultured HeLa S3 cells. Endocrinology 109: 1975-1982, 1981, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência. Este ensaio especificamente mede a capacidade dos glicocorticóides ativos da regulação descendente do receptor de glicocorticóides. Os compostos de teste responsivos são, portanto, julgados possuírem atividades similares àquelas dos glicocorticóides ativos.

A Tabela 6 (abaixo) mostra os resultados obtidos pela seleção de uma combinação da fração de éter orgânico (designada WG-I-13A na Figura 1), da fração aquosa (designada WG-I-13D na figura 1). A fração combinada é designada WG-I-5AB+WG-I-5C, como mostrado na Figura 1. Como pode ser visto pela Tabela 6, atividade significativa é observada em um ensaio de ligação dos receptores de glicocorticóide (GR) (inibição de 61%) em células HeLa S3 (carcinoma cérvico epitelóide humano) em uma concentração de 100 μg/ml da fração combinada (WG-I-5AB+WG-I- • *3 5C)). Este ensaio mede a ligação de [ H]Dexametasona em receptores de glicocorticóides humanos. As células HeLa S3 são suspensas em tampão HEPES modificado, pH 7,2, usando-se técnicas padrão. Tabela 6: Bioensaios das frações combinadas WG-I-5AB+WG5C (mistura da fração insolúvel, dietil éter e extratos aquosos)

* hum = humano; pig = porcino; ca = crotalus atrox; gp = porquinho da índica; n = número de tubos

As células (1 x 106) são incubadas com 6 nM [3H]Dexametasona por 120 minutos a 25 °C. A ligação não-específica é estimada na presença de 20 μM Dexametasona. As membranas são filtradas e lavadas três vezes e os filtros são contados para determinar a [3H]Dexametasona especificamente ligada. Os compostos são avaliados a 10 μM quanto à atividade.

Com base nos resultados mostrados na Tabela 6, segue-se que a fração combinada (WG-I-5AB+WG-I-5C) é eficaz na ligação ao sítio do receptor de glicocorticóide (GR). Além disso, atividade significativa, associada com esta combinação de fração, é observada em um ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 (inibição 52%) em células U937 humanas. Este efeito inibitório implica em que a fração combinada (WG-I-5AB+WG-I- 5C) tem um efeito broncodilatador. Para o teste PDE4, PDE4 que foi parcialmente purificado de células pronocíticas U-937 humanas é usado. O composto de teste e/ou veículo é incubado com 0,2 μg de enzima e 1 μM cAMP contendo 0,01 μM [3H]cAMP em tampão Tris pH 7,5 por 20 minutos a 30 °C. A reação é terminada ebulindo-se por 2 minutos e AMP resultante é convertido em adenosina pela adição de 10 mg/ml de nucleotidase de veneno de cobra e mais incubação a 30 °C por 10 minutos. cAMP não-hidrolisado é ligado à resina AGI-X2 e a [ H]adenosina da fase aquosa é quantificada por contagem por cintilação. Os compostos são selecionados a 100 μM. IBX (3- isobutil-l-metilxantina) é usada como agente de referência padrão.

Tendo estabelecida a especificidade de atividade de todas as frações combinadas, a fração de éter orgânica (WG-I-13A), a fração aquosa (WG-I-13B), bem como a fração insolúvel que forma-se na interface da camada orgânica e extrato (designada WG-I-13D na Figura 1), são separadamente bioensaiados usando-se o ensaio de ligação do receptor de glicocorticóide (GR) e o ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 acima descrito.

Os resultados obtidos por estes experimentos são mostrados nas Tabelas 7, 8 e 9 abaixo. Um aumento da atividade inibitória foi observado para o extrato de éter orgânico (WG-I-13A), quando utilizando-se o ensaio de ligação do receptor de glicocorticóide (GR) (inibição 57%), em uma concentração de extrato de 100 μg/ml. Nenhuma atividade significativa foi observada para a fração aquosa (WG-I-13B) ou para a fração de interface solúvel (WG13D).

A impressão digital química da fração orgânica 20 (WG-I- 13 A), utilizando-se LC-MS (cromatografia líquida-espectroscopia de massa combinadas) não indicou a presença de compostos tipo esteroidal. O fracionamento da fração orgânica resultou no isolamento de um composto principal, que foi quimicamente caracterizado e identificado como o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 (designado WG-I-13C na Figura 1). O composto sesquiterpenóide foi avaliado quanto à atividade mais uma vez usando-se o ensaio de ligação do receptor de glicocorticóide (GR) e o ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 acima. Os resultados destes experimentos são mostrados na Tabela 10 abaixo. Tabela 10: Bio-ensaios de inibição para WG-I-13C (composto 1)

Uma atividade não significativa mais baixa foi observada para o ensaio de enzima de fosfodiesterase PDE4 (inibição de 35%), enquanto atividade de 104% foi observada para o ensaio de ligação do receptor de glicocorticóide (GR) a 200 μg/ml da concentração de composto puro. Isto implica em que o composto sesquiterpenóide, por si, não representa o papel mais significativo na broncodilatação e, no extrato de planta da invenção, outros compostos presentes contribuem para o efeito broncodilatador.

O valor IC50 do composto sesquiterpenóide do ensaio de ligação de glicocorticóide foi determinado como sendo 50,3 μM, como mostrado na Tabela 11 abaixo. Tabela 11: Determinação do valor IC50 do composto sesquiterpenóide (1)

Além disso, foi observada atividade significativa para o composto sesquiterpenóide em um ensaio de enzima de 5-lipoxigenase (5- LO), isto é, 99% de inibição a 100 μg/ml da concentração do composto puro. Os resultados deste experimento são mostrados na Tabela 12 abaixo. Para o teste de 5-LO, uma preparação de enzima de 5-lipoxigenase de células de leucemia basofílicas de rato (RBL-1) é usada. O composto de teste é pré- incubado com a enzima por 5 minutos em tampão Tris pH 7,2 em temperatura ambiente. A reação é iniciada pela adição de ácido araquidônico 15 μM como substrato e realizada por mais 8 minutos, após o que a reação é terminada pela adição de ácido cítrico 70 mM e níveis de 5-HETE são determinados por ensaio radioimune. Os compostos são avaliados a 30 μM. NDGA (ácido nordiidrogurético) é usado como agente de referência padrão. Tabela 12: Bio-ensaios de 5-lipoxigenase sesquiterpenóide e inibição de fosfodiesterase PDE4

hum — humana; n = número de tubos

Inibição da liberação da Interleucina-5 (IL-5), que é um mediador proeminente liberado em doenças alérgicas, foi também determinada para o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 em ensaios celulares, cujas curvas de inibição são mostradas na Figura 6 e Figura 7, respectivamente. Os resultados obtidos para estes bioensaios são mostrados na Tabela 13 abaixo.

Com referência ao texto de liberação de mediador IL-5 humano, o composto de teste é incubado com células de leucócitos mononucleares de sangue periférico (PBMNL) humanas estimuladas por Concanavalina A (ConA) (10 μg/ml) em meio de crescimento RPMI-1640 (pH 7,4) durante a noite a 37 °C em um incubador. Os níveis de produção da citocina IL-5 no meio condicionado são quantificados usando-se um kit ELISA sanduíche. Os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 μM. Estas mesmas concentrações são concomitantemente aplicadas a um grupo de células tratadas e avaliadas quanto à possível citotoxicidade induzida pelo composto somente se inibição significativa de liberação foi observada. Dexametasona é usada como agente de referência padrão.

Além disso, os testes de citotoxicidade Con-A foram conduzidos usando-se o composto de fórmula 1, cujas curvas de inibição são mostradas na Figura 2.

Para o teste de liberação/citotoxicidade do mediador induzido por ConA, o composto de teste e/ou veículo é incubado com uma suspensão de leucócitos mononucleares de sangue periférico humano (PBMNL, 1 x 105/poço), na presença de Concanavalina A (Con A, 20 μg/ml) em tampão RPMI (pH 7,4) a 37 °C durante a noite em 5% CO2. Reagente AlamarBlue é adicionado e as células são incubadas a 37 °C por 16 horas. As células vivas absorvem AlamarBlue e emitem fluorescência. A intensidade de fluorescência é medida usando-se uma leitora de placa SpectraFluor Plus com excitação a 530 nm e emissão a 590 nm. Uma diminuição de 50% ou mais (50%) da intensidade de fluorescência relativa aos controles tratados com veículo indica significativa citotoxicidade. Os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 μM. Dexametasona é usada como agente de referência padrão.

Os resultados dos ensaios de controles (usando-se DMSO) 5 para os ensaios acima são mostrados na Figura 3. Tabela 13: Inibição da liberação do mediador pelo composto sesquiterpenóide (1)

hum = humana; ANT - antagonista

A IC5o do composto é de 16,1 μM para o ensaio de inibição de liberação do mediador de Interleucina-5 (IL-5). A inibição de 93% é 10 observada para o ensaio de inibição de liberação de mediador Interleucina-5 (IL-5), usando-se concentrações de 100 μM do composto ativo em cada experimento.

A citotoxicidade do composto ativo foi observada quando conduzindo-se os bio-ensaios acima, como mostrada na Tabela 14, vide 15 valores IC50 vs EC50. Embora um efeito citotóxico parcial tenha sido observado durante os ensaios de liberação do mediador, a eficácia do composto purificado de fórmula 1 é atribuída ao fato de que a ligação eficaz ao sítio do receptor de glicocorticóide (GR) foi es estabelecida. Tabela 14: Perfil de citotoxicidade do sesquiterpenóide (1)

hum = humano; ANT = antagonista; n = número de tubos Um óleo essencial, obtido por destilação por vapor dos rizomas secos como descrito no Exemplo 2, foi também avaliado usando-se o ensaio de enzima de 5-lipoxigenase e o ensaio de fosfodiesterase PDE4, para determinar seu(s) efeito(s) inibitório(s). A inibição de 99% foi observada usando-se o ensaio 5-LO, enquanto 73% de inibição foram observados usando-se o ensaio de fosfodiesterase PDE4, indicando que o óleo essencial tem um efeito broncodilatador e pode ser usado para inibir a ação da enzima 5-lipoxigenase. Os resultados obtidos são também mostrados na Tabela 12 acima.

EXEMPLO 5

Um extrato de dietil éter foi preparado de uma maneira similar à do Exemplo 1. Os rizomas da planta, Siphonochilus aethiopicus, foram lavados, cortados, secados no forno a 40 °C e em seguida moídos em um pó. 1 1 de água em ebulição deionizada foi adicionado a 25,0 g de rizomas moídos secados em forno e deixado repousar por 1 hora com agitação ocasional. A água foi filtrada e extraída com dietil éter (4 x 500 ml). As camadas de éter foram separadas das camadas de água, combinadas, secadas (MgSO4), filtradas e o solvente removido por meio de um evaporador rotativo em um banho de água em uma temperatura ambiente de 25 °C. 215 mg de extrato orgânico foram obtidos. Este extrato de dietil éter foi submetido a teste.

Impressão digital química da fração de dietil éter produzido da extração aquosa (vide procedimento experimenta acima) usando-se LC-MS (cromatografia líquida-espectroscopia de massa combinadas) indicou a presença do composto principal, um sesquiterpenóide de fórmula 1. O extrato de dietil éter foi purificado por cromatografia flash (gel de sílica) usando-se acetato de etila/hexano (1:9 v/v) como eluente para produzir o sesquiterpenóide de fórmula 1.

EXEMPLO 6: Ensaio biológico de transcrição NF-KB,

Os ensaios foram realizados e padrões de referência usados como uma parte integral de cada ensaio, para assegurar a validade dos resultados obtidos. O ensaio é descrito em Lenardo MJ, Baltimaore D. Lenardo MJ, Baltimaore D, NF-KB: A pleiotropic mediator of inducible and tissue specific gene control. Cell. 58: 227-229, 1989, cujo conteúdo é incorporado aqui por referência.

O extrato de dietil éter, preparado diretamente de plantas moídas (Figura 1) (WG-I-94B) foi avaliado quanto a suas propriedades antiinflamatórias no ensaio de Transcrição NF-KB (vide protocolo abaixo). Uma atividade de inibição significativa foi observada, com uma IC50 estimada de 14,3 μg/ml (vide Tabela 15 abaixo) neste ensaio na ausência de citotoxicidade em concentrações de até 100 μg/ml. Ciclosporina A foi usada como o composto de referência (IC50 de 0,0608 μM) (vide Tabela 15 abaixo) neste ensaio. Os resultados de inibição e citotoxicidade são mostrados na Tabela 16 e curvas de resposta de concentração são mostradas nas Figuras 8 e 9. Com base nestes resultados, foi estabelecido que o extrato de dietil éter era eficaz na inibição de NF-KB. Tabela 15: Inibição do fator de transcrição NF-KB pelo extrato de éter (WG-I- 58A)

Atividade de inibição significativa foi observada no ensaio celular de Resposta de Transcrição de NF-KB sem efeitos citotóxicos, desse modo inibindo a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, que são responsáveis pelo trajeto inflamatório da asma. Tabela 16: Citotoxicidade e Inibição do fator de transcrição NF-KB pelo extrato de dietil exter (WG-I-58A), resposta de dose

hum = humana; ANT = antagonista; n = número de tubos

EXEMPLO 7: Inibição do fator de transcrição NF-KB 1. Procedimento Experimental

Os rizomas e raízes frescos da planta (300 g), Siphonochilus aethiopicus, foram lavados com água e secados ao ar. As raízes frescas foram separadas dos rizomas. As raízes foram moídas e os rizomas foram fatiados em fatias tendo uma espessura de aproximadamente 2-3 mm cada. Tanto as 10 raízes e rizomas foram destilados por vapor em uma unidade de Destilação a vapor por 3 h. Os cristais que se formaram no condensador foram lavados com água deionizada e filtrados através de um funil de vidro sinterizado. A estrutura dos cristais é dada na Figura 1 (Amostra no: WG-I-94B). A mistura do óleo essencial e água no condensado de funil 15 separatório foi permitida repousar em temperatura ambiente por 18 h. Os cristais resultantes presentes na superfície, compreendendo o composto de fórmula 1, foram removidos por drenagem do condensado e filtragem usando- se um funil de vidro sinterizado. Um total de 240 mg dos cristais foram obtidos. Os cristais foram submetidos a teste.

Fórmula 1 WG-I-94B

2. Ensaios biológicos

Os ensaios foram realizados em MDS Pharma em Taiwan e os padrões de referência usados como uma parte integral de cada ensaio, para assegurar a validade dos resultados obtidos.

O composto de fórmula 1 foi avaliado quanto a suas propriedades antiinflamatórias no ensaio de resposta de transcrição celular NF-KB (vide Anexo I para o protocolo) bem como o correspondente ensaio celular de Resposta de Transcrição celular de NF-KB. O composto provocou > 100 % de inibição a 100 μM no ensaio de resposta de transcrição celular NF- KB, sem citotoxicidade aparente na mesma concentração. Isto mostra que a inibição do composto na transcrição celular NF-KB não é devida à citotoxicidade geral. Um IC50 DE 15,6 μg/ml foi calculada neste ensaio e ciclosporina A foi usada como o composto de referência (IC50 de 0,0608 μM). Os resultados e as curvas de resposta de concentração são mostradas no Anexo II. Com base nestes resultados, foi estabelecido que o composto de fórmula 1 foi eficaz na inibição de NF-KB.

3. Propriedades benéficas

O composto, um sesquiterpenóide, isolado de Siphonochilus aethiopicus foi avaliado em ensaios in vitro, que representam um papel principal nas doenças inflamatórias crônicas, tais como asma. Atividade de inibição significativa foi observada no ensaio de resposta de transcrição celular NF-KB sem efeitos citotóxicos. O composto (isolado da Destilação a vapor das raízes e rizomas frescamente preparados) pode assim ser usado para inibir a atividade específica da resposta de transcrição NF-KB, desse modo inibindo a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, que são responsáveis pelo trajeto inflamatório da asma. NF-KB representa um regulador mestre da inflamação e é, portanto, um alvo atrativo para desenvolvimento de medicamento.

EXEMPLO 8: Resposta de Transcrição, NF-KB (humano)

Número do Teste: 361000 Introdução: Nas células remanescentes, o local citoplásmico do fator de transcrição nuclear NF-KB é ligado por uma subunidade inibitória IKB; A ligação de IKB eficazmente mascara as seqüências de localização nuclear presentes nas subunidades P50 e P65 de NF-KB, evitando a translocação nuclear. Parece que, na estimulação celular, um trajeto de transdução de sinal é ativado, resultando em fosforilação dos resíduos de serina chave no polipeptídeo, depois do que o complexo NF-KB-1KB se dissocia, IKB é rapidamente degradado e o sinal de localização nuclear não mascarado permite que NF-KB transloque-se para dentro dos núcleos e ative a transcrição dos genes específicos. E sabido que NF-KB regula muitos fatores pró- inflamatórios e pró-trômbicos produzidos pelos leucócitos ativados. NF-KB representa um regulador mestre da inflamação e é, portanto, um alvo atrativo para desenvolvimento de medicamento. Procedimento: Células Jukart de linfócitos T humanos, transfectadas com um repórter lacZ de elemento de resposta, em que a transcrição do gene β- galactosidase é dirigida pelo sítio de ligação para o fator de transcrição nuclear NF-KB, são usadas. O composto de teste e/ou veículo são incubados com as células (1,5 x 106/ml) na presença de 0,5 μM A23187 e 50 ng/ml PMA (forbol 12-miristato 13-acetato) em RPMI-1640 pH 7,4 a 37 °C por 4 horas. A atividade de β-galactosidase induzida pelo composto de teste é determinada pela conversão de FDG (fluoresceína di-β-D-galactopiranosideo) em fluoresceína. A intensidade da fluorescência é lida em leitora de placa SpectroFluor Plus. A diminuição de 50 por cento ou mais (> 50%) da intensidade de fluorescência, em relação à ciclosporina A 10 μM, indica 5 significativa atividade inibitória, os compostos são avaliados a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 μM. Estas mesmas concentrações são concomitantemente aplicadas a um grupo separado de células tratadas e avaliadas quanto à possível citotoxicidade induzida por composto somente se estimulação ou inibição significativas for observada (Cat. #361100). 10 Dados de Referência: Inibidor (nM) * Ciclosporina A 50 * Indica agente de referência padrão usado. Tabela 17: Resultados de ensaio - Resultados de citotoxicidade e eficácia (resposta de transcrição) para o composto 1 (WG-I-94B)

* Batch - Representa compostos testados concomitantemente no(s) mesmo(s) ensaio(s) Parcialmente solúvel em solvente de teste in vitro * Indica critérios de encontro de item para significância Ag = Agonista; ant. = antagonista; Resp. = Resposta; ND = Ensaio de Teste Não Realizado; R = Comentários adicionais; hum = humano

EXEMPLO 9: Efeito de extração de éter em modelos de rato asmáticos in vivo Fundamentos da Invenção

Existem muitas citocinas que são conhecidos mediadores da inflamação e estão envolvidas no processo de doença asmática. Quando um agente causativo como um alérgeno é inalado, as células epiteliais bronqueais são ativadas e produzem certas citocinas pró-inflamatórias (interleucinas, abreviado IL) em particular a cimiocina IL-8.

Do resultado dos ensaios in vitro anteriores, um adequado modelo animal in vivo foi selecionado para determinar a atividade anti- asmática e anti-alérgica do extrato de dietil éter (WG-I-101) da planta Siphonochilus aethiopicus. Procedimento Experimental

Os rizomas da planta, Siphonochilus aethiopicus, foram lavados, cortados, secados no forno a 40 °C e em seguida moídos em um pó. 5 1 de dietil éter foram adicionados a 110,40 g de rizomas moídos secados em forno e deixados repousar por 1 hora com agitação ocasional. O dietil éter foi filtrado e extraído com dietil éter (4x2 1). As camadas de éter foram combinadas, secadas (MgSO4), filtradas e o solvente removido por meio de um evaporador rotativo em um banho de água em uma temperatura de 25 °C. 1,075 g de extrato orgânico foram obtidos. Este extrato de dietila (amostra no: WG-I-101) foi submetido a teste. Ensaio biológico

Foram realizados ensaios em MDS Pharma em Taiwan e padrões de referência usados como uma parte integral de cada ensaio, para assegurar a validade dos resultados obtidos. O ensaio biológico empregado foi o ensaio Pulmonary, Antigen/Lipoxygenase Meatolites e o extrato de dietil éter de Siphonochilus aethiopicus foi avaliado quanto a possível atividade neste ensaio in vivo.

(1) Substância de teste e padrão de dosagem

WG-I-101 foi suspensa em 0,5% CMC/0,1% Tween 80. A substância de teste, em uma dose de 500 mg/kg foi dada oralmente duas vezes diariamente por 3 consecutivos dias e uma dose final adicional foi adicionada em uma hora antes da provocação do dia de teste de Ovalbuminon. O volume de dosagem de 10 ml/kg foi usado. A formulação é resumida como segue:

(a) Isto é baseado na observação visual 5: solúvel; I: Insolúvel; ppt: precipitação (b) Y: a fórmula é mantida em tubo ou frasco com cor marrom ou coberto com folha de alumínio (c) TR: temperatura ambiente; preparado e armazenado sob 15 °C ~ 30 °C; Temperatura por todo o experimento mais baixa ou mais elevada do que a temperatura ambiente é especificada. (2) Animais

Porquinhos da índia derivados de Dunkin-Hartley machos fornecidos pelo Laboratory Animal Center of National Taiwan University College of Medicine foram usados. A alocação de espaço para os animais foi como segue: 45 x 23 x 21 cm para 3 porquinhos da índia. Cada gaiola de animal foi esterilizada com autoclave. Todos os animais foram mantidos em uma temperatura controlada (22° - 24° C) e umidade (60% - 80%) de meio ambiente com ciclos de luz/escuro de 12 horas por pelo menos uma semana no laboratório antes do uso. Livre acesso para comida de laboratório padrão (PMI Nutrition International, Inc., USA) e água RO foram garantidos. Todos os aspectos deste trabalho incluindo alojamento, experimentação e descarte dos animais foram realizados em geral de acordo com o Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). (3) Método

Grupos de 5 porquinhos da índia machos derivados de Dunkin- Hartley, pesando 400 ± 50 g (dia final) foram empregados. Os animais foram anestesiados com pentobarbital sódio ((50 mg/kg IP, com mais 5 mg/kg IP se necessário). Uma placa de alumínio mantida a 37 °C através do fluxo de água de um banho foi colocada embaixo dos animais de teste, para manter a temperatura corporal. A traquéia foi canulada e um ventilador de roedor (Harvard, USA) foi usado para ventilação artificial (10 ml/kg, 50 respirações/minuto). Através de um braço-lateral da cânula, a pressão intratraqueal (ITP) foi medida usando-se um transdutor de pulso Pneumatic (Narco Biosystem, USA). Uma artéria carótida foi canulada (PE50, Clay Adams, USA) para medições da pressão sangüínea, usando-se um transdutor Stathem P23 x L (Viggo-Spectramed, USA) e freqüência cardíaca foi obtida por ECG derivação II. Os porquinhos da índia foram sensibilizados em injeções IP de ovalbumina (0,5 μg/0,5 ml/animal) e Al (OH3) (1 mg/0,5 ml/animal) nos dias 1 e 8. Os animais foram então provocados com 15 μg/kg de Ovalbumina (IV) entre os dias 19 e 23 e a constrição broncopulmonar foi registrada como um aumento de ITP.

A substância de teste a 500 mg/kg foi administrada oralmente duas vezes diariamente por 3 dias consecutivos e uma dose adicional final foi adicionada no dia de teste, em seguida, uma hora após a dose final, os animais foram injetados intravenosamente (1 ml/kg) com um “coquetel”: Indometacina (10 mg/kg), Mepiramina (2 mg/kg) e Propanolol (100 μg/kg), seguido por provocação com ovalbumina 5 minutos mais tarde. Em animais tratados com veículo, a provocação de antígeno resultou em respostas broncoconstritoras (aumento em ITP) variando de 45 a 85 por cento de broncoconstrição possível máxima, conforme medido por oclusão traqueal completa. Uma inibição de 50 por cento ou mais (>50%) da broncoconstrição induzida por ovalbumina, relativa aos animais de controle tratados com veículo, é considerada significativa. O fluido de lavagem broncoalveolar foi 5 recuperado após instilar 5 ml de solução salina tamponada com fosfato por 2 vezes. TNF-α, IL-lβ e IL-8 dos sobrenadantes de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) foram medidos com ELISA após provocação com ovalbumina. ANOVA de uma direção, seguida por Teste de Dunnett, foi aplicada para comparação entre os grupos tratados com controle de veículo e 10 composto de teste. P < 0,05 é considerado significativo. (4) Resultados do ensaio in vivo

Os resultados do ensaio são resumidos na Tabela 18 e mostraram que o extrato de dietil éter (WG-I-101) provocou inibição moderada (19%) da constrição das vias aéreas aguda induzida por 15 Ovalbumina, em relação ao controle tratado por veículo (Tabela 18). (> 50% de inibição é considerado como significativo). Tabela 18: Porquinho da índia em resultados de ensaio in vivo

Ensaio #570000 Pulmonar, Antígeno/Metabólitos Lipoxigenase, em Pressão Intratraqueal (ITP) de Porquinhos da índia

Porquinhos da índia anestesiados e artificialmente ventilados, previamente sensibilizados, foram pré-tratados com Mepiramina 2 mg/kg, Indometacina 10 mg/kg e Propanol 0,1 mg/kg por 5 minutos; pressão sangüínea arterial (BP, mm Hg), freqüência cardíaca (HR, batidas/min) e pressão traqueal (TP, cm H2O) foram registradas após dosagem oral por 3 dias. No final da dosagem crônica, aumento induzido por antígeno (Ovalbumina 5 μg/kg IV) da pressão traqueal (ITP) acima de uma linha de base inicial de 6 cm H2O foi então registrado como uma indicação da broncoconstrição. A inibição percentual (%) é calculada de acordo com a fórmula [Aumento da Pressão Traqueal (tratado-veículo)] - [aumento da Pressão Traqueal (tratado com substância de teste) / [Aumento da Pressão Traqueal (tratado-veículo)] x 100%. 1. ΔITP: Mudanças em ITP em relação aos valores de linha de base correspondentes; (-) Oval: Resposta a veículo ou substância de teste apenas e antes da provocação com Ovalbumina; (+) Oval: Mudanças da resposta para provocação com Ovalbumina. 2. % Controle: resposta ITP à substância de teste, veículo expresso em termos de percentagem da resposta ITP a Ovalbumina (15 μg/kg IV) no controle tratado com veículo (100%). 3. Uma inibição de 50 por cento ou maior (> 50%) da broncoconstrição induzida por Ovalbumina relativa ao controle tratado com veículo é considerada significativa.

Amostras de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) no grupo tratado com WG-I-101 foram preparadas para medições de TNF-oc, IL- lβ após provocação de ovalbumina. ANOVA de uma direção, seguida por teste de Dunnett, foi aplicada para comparação entre os grupos tratados com controle de veículo e composto de teste. P < 0,05 é considerado significativo.

WG-I-101 provocou grande inibição da produção de IL-8 (P < 0,05) versus controle, após provocação com ovalbumina em porquinhos da índia, sem efeitos significativos sobre secreção de TNF-oc e IL-lβ. Os resultados são mostrados na Tabela 19. Tabela 19: Resultados de expressão de citocina

As amostras de fluido de lavagem broncoalveolar (BALF) no grupo tratado com WG-1-101 foram preparadas para medições de TNF-oc, IL- lβ e IL-8 após provocação com Ovalbumina. Os níveis de TNF-oc, IL-lβ e IL-8 de cada amostra foram avaliados usando-se kits de ELISA de TNF-oc, 10 IL-lβ e IL-8, respectivamente. ANOVA de uma direção, seguido por Teste de

Dunnet, foi aplicado para comparação entre os grupos tratados com controle veículo e composto de teste. P < 0,05 é considerado significativo.

EXEMPLO 10: Pulmonar, Antígeno/Metabólitos de Lipoxigenase Número de Teste: 570000 Procedimento:

Grupos de 5 porquinhos da índia Dunkin-Hartley machos, pesando 250 ± 50 g são anestesiados com pentobarbital sódio (50 mg/kg i.p., mais 15 mg/kg adicionais i.p. se necessário) e cloreto de succinilcolina (2 mg/animal i.p.) é subseqüentemente administrado para evitar respiração espontânea. A temperatura corporal é mantida a 37 a 38 °C.

A traquéia é canulada e o porquinho da índia ventilado com um respirador de roedor Harvard em um sistema fechado. A pressão traqueal é registrada através de um braço lateral da cânula conectada a um transdutor P231D Statham. A taxa respiratória ajustada a 50 cursos/minuto com um volume de curso (aproximadamente 1 ml/100 g) suficiente para produzir uma pressão traqueal de linha de base de 6 cm H2O. A pressão arterial média é monitorada por uma artéria carótida canulada e a freqüência cardíaca é obtida por elétrodos peitorais dispostos para derivação II. A veia jugular é canulada para administração de veículo ou medicamento i.v. em um volume de 1 ml/kg.

A lipoxigenase é ativada e os leucotrienos resultantes gerados através de provocação por antígeno em animais previamente sensibilizados. Porquinhos da índia são sensibilizados com injeções de ovalbumina e A1(OH)3 (0,5 μg e 1 mg, respectivamente, em um volume de 0,5 ml/animal i.p.) no dia 1, reforçadas com a mesma dose de ovalbumina e A1(OH)3 no dia 8 e provocados entre o dia 19 e 23 com ovalbumina (50 μg/kg i.v.) para realizar uma constrição das vias aéreas induzida-máxima, refletida como um aumento da pressão traqueal (cm H2O). Um aumento da pressão traqueal pode também ser relacionado com um aumento da dureza do sistema respiratório. Os animais são pré-tratados com composto CSIR por gavagem oral por dois dias. No dia do experimento, os animais recebem o composto CSIR 30 min antes da anestesia e cirurgia que leva 15 min. A provocação de ovalbumina é administrada 60 min após dosagem com CSIR. Os animais são pré-tratados 5 minutos antes da administração da substância de teste com indometacina i.v. (10 mg/kg), mepiramina (2 mg/kg) e propanolol (0,1 mgkg): um coquetel designado para inibir a geração de produtos de ciclooxigenase (tromboxanos, etc.) bem como antagonizar os receptores da histamina e β-adren0rgicos. Em animais de controle tratados com veículo, a provocação com antigeno resulta em respostas constritoras das vias aéreas variando de 45 a 85 por cento de constrição das vias aéreas máxima possível, obtidas por oclusão traqueal. Fenidona, o padrão positivo, é administrado i.v. (30 mg/kg) 5 minutos antes da provocação com ovalbumina em 5 porquinhos da índica. Uma inibição de 50 por cento ou mais (> 50) da constrição das vias aéreas induzida, em relação aos animais de controle tratados com veículo, é considerada significativa.

Dados de Referência: Composto MED mg/kg i.v. antagonismo de receptor e/ou ação broncodilatadora. Tabela 20: nomes IUPAC de compostos referidos na Tabela 1 acima

Os extratos da invenção são componentes não-esteróides isolados em uma forma natural, porém tendo o mesmo modo de ação que os 5 compostos esteróides comumente usados para o tratamento preventivo de doença alérgica, tal como asma e atopia.

Além disso, o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 da invenção mostra atividade como um modificador de leucotrieno, inibindo as ações dos mediadores inflamatórios e leucotrienos.

Quando usado na forma de um óleo essencial, o extrato tem um efeito combinado pelo fato de a redução da inflamação da asma e alergia ocorrer através da broncodilatação, inibição da biossíntese dos leucotrienos, bem como devido à regulação descendente dos receptores glicocorticóides.

Além disso, um extrato de dietil éter, contendo o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 da invenção, mostra significante atividade de inibição no ensaio celular de Resposta de Transcrição de NF-KB sem efeitos citotóxicos. O extrato de dietil éter pode assim ser usado para inibir a atividade específica da resposta de transcrição NF-KB, desse modo inibindo a liberação de vários mediadores pró-inflamatórios e inflamatórios, tais como a Interleucina-8 (IL-8) da citocina, que são responsáveis pelo trajeto inflamatório da asma.

Além disso, um extrato de dietil éter, contendo o composto sesquiterpenóide de fórmula 1 da invenção, apresenta significativa inibição na produção de IL-8, uma citocina inflamatória responsável pelo trajeto inflamatório da asma.

A invenção pode ser eficaz no tratamento preventivo total e remissão de doenças alérgicas, tais como asma, adicionando uma ferramenta útil no controle destas doenças.

A remissão de doenças alérgicas e asma é especificamente definida para fins desta especificação como um período livre de sintoma, sem indivíduos recebendo tratamento convencionalmente disponível. Este período de remissão é maior do que o período que é obtido usando-se tratamento convencional para o controle de doenças alérgicas, tais como asma.

O Requerente acredita ainda que a invenção, na forma de extratos de solventes orgânicos, rizomas secos, um óleo essencial ou como o composto químico único de fórmula 1, usado sozinho ou em combinação, ou como composições, fornece uma alternativa ao uso de medicamentos antiinflamatórios esteróides, tais como glicocorticóides, para o tratamento preventivo de longo termo e remissão de doenças alérgicas, especialmente asma e atopia.

Agentes comercialmente disponíveis conhecidos do Requerente, que operam no nível do receptor glicocorticóide, tipicamente são de uma natureza esteróide e têm numerosos efeitos colaterais nocivos durante seu uso de longo- termo. Os compostos, derivativos, composições e produtos da invenção são não- esteróides por natureza, embora, surpreendentemente, tenham sido constatados atuarem eficientemente no nível do receptor de glicocorticóide (GR).

Claims

1. Uso de um composto selecionado dos compostos tendo a fórmula 1,

(4a-S,5R,8a-R ou 4a-R,5S,8a-S) seus estereoisômeros e suas misturas de estereoisômeros, dito uso caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para o tratamento ou profilaxia de asma e atopia.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é parte de um extrato de uma espécie de planta selecionado a partir do grupo consistindo de Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiella aethiopica, em que o extrato é um extrato de solvente orgânico obtido pela extração do material de planta da planta com um solvente orgânico, em que o solvente orgânico é (i) um éter selecionado de dietil éter, diisopropil éter, t-butil metil éter, t-amil metil éter e t-butil etil éter; ou (ii) um éster selecionado a partir de metil acetato, etil acetato e benzil acetato.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a espécie de planta é Siphonochilus aethiopicus.

4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é parte de um extrato de uma espécie de planta selecionado a partir do grupo consistindo de Siphonochilus aethiopicus, Siphonochilus natalensis, Kaempferia aethiopica, Kaempferia natalensis, Kaempferia ethelae, Cienkowskia aethiopica e Cienkowskiella aethiopica, em que o extrato é um óleo essencial obtido por destilação a vapor do material da planta a partir da planta.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que o material de planta é obtido a partir de raízes 5 ou rizomas da planta.