KR20020011553A - 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물 - Google Patents

꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20020011553A
KR20020011553A KR1020000044891A KR20000044891A KR20020011553A KR 20020011553 A KR20020011553 A KR 20020011553A KR 1020000044891 A KR1020000044891 A KR 1020000044891A KR 20000044891 A KR20000044891 A KR 20000044891A KR 20020011553 A KR20020011553 A KR 20020011553A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extract
compound
flavonoid compound
acid
methanol
Prior art date
Application number
KR1020000044891A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100361090B1 (ko
Inventor
장현욱
손건호
김현표
Original Assignee
강삼식
손건호
김현표
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강삼식, 손건호, 김현표 filed Critical 강삼식
Priority to KR1020000044891A priority Critical patent/KR100361090B1/ko
Publication of KR20020011553A publication Critical patent/KR20020011553A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100361090B1 publication Critical patent/KR100361090B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/04—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring
    • C07D311/22—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4
    • C07D311/26—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3
    • C07D311/28—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring with oxygen or sulfur atoms directly attached in position 4 with aromatic rings attached in position 2 or 3 with aromatic rings attached in position 2 only
    • C07D311/32—2,3-Dihydro derivatives, e.g. flavanones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/60—Moraceae (Mulberry family), e.g. breadfruit or fig
    • A61K36/605—Morus (mulberry)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드(prenylated flavonoid) 화합물과 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 꾸지나무(Broussonetia papyrifera) 근피로부터 메탄올 및 아세테이트 추출과 크로마토그래피를 이용하여 분리한 항염증 효과가 뛰어난 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물, 약학적으로 허용되는 이들의 염, 상기 화합물 및 추출물의 제조방법 및 이들을 유효 성분으로 포함하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 염증매개 물질의 생성에 관여하는 효소의 활성을 저해하거나 발현을 억제함으로써 생체외 및 생체내에서 우수한 항염증 효과를 나타내어 급성염증을 비롯하여 류마티스 관절염과 같은 관절내 질환, 건선등의 피부질환, 기관지 천식 등의 알러지성 염증질환 등의 다양한 염증질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을 함유하는 약학적 조성물{A novel prenylated flavonoid-type compound showing antiinflammatory activity purified from Broussonetia papyrifera and extracts containing the said compound as a major component, a method for preparing them and pharmaceutical compositions containing them}
본 발명은 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드(prenylated flavonoid) 화합물과 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 꾸지나무(Broussonetia papyrifera) 근피로부터 메탄올 및 아세테이트 추출과 크로마토그래피를 이용하여 분리한 항염증 효과가 뛰어난 상기 화학식 1로 표시되는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물, 약학적으로 허용되는 이들의 염, 상기 화합물 및 추출물의 제조방법 및 이들을 유효 성분으로 포함하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
브라우소네티아(Broussonetia)속 식물은 낙엽활엽성의 관목으로 닥나무(Broussonetia kazinoki Sieb.), 꾸지나무(Broussonetia papyrifera Vent.) 등으로 분류되며 한국의 대부분 지역, 중국, 대만, 일본 등에 분포하는데, 지리적으로는 산기슭 양지 또는 밭둑 등에서 성장한다.
꾸지나무의 인피섬유는 제지의 원료로 사용되고 있으며 꾸지나무로부터 추출한 여러 성분들이 다양한 약효를 가지고 있음이 보고되었다. 구체적으로, 꾸지나무는 강장, 명복(明目)작용, 음위, 수종, 익기, 이뇨등에 효과를 나타내는 성분, 풍을 제거할 수 있는 성분 및 피를 맑게하고 시력감퇴 등에 효능을 나타내는 성분 등을 함유하는 것으로 보고되어 왔다.
한편, 염증이란 외부 세균의 침입에 의하여 형성되는 농양의 병리적 상태를 뜻한다. 구체적으로, 외부 세균이 특정 조직에 침입하여 증식을 하게되면 생체의 백혈구가 이를 인지하여 증식된 외부 세균을 활발히 공격하게 되는데, 이 과정중 발생되는 백혈구의 사해가 균에 의하여 침입받은 조직에 축적됨과 동시에 백혈구에 의하여 사멸된 침입균의 세포 파괴물이 침입받은 조직내로 융해되어 농양이 형성된다. 염증에 의한 농양의 치료는 소염작용을 통하여 촉진될 수 있는데, 소염작용이란 항균제를 이용하여 침입균의 증식을 억제하거나 농양중에 축적된 이물질들을 탐식하는 마크로파지(macrophage)를 활성화하여 상기 이물질들을 소화 및 배설하는마크로파지의 기능을 항진시키는 등의 염증치료 촉진작용이다.
일반적으로 염증반응은 생체의 세포나 조직에 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습으로 인한 손상을 수복 재생하기 위한 생체 방어 반응과정이고, 이 반응과정에는 국소의 혈관, 체액의 각종 조직세포 및 면역세포 등이 작용한다. 상술한 바와 같이, 정상적으로 외부 침입균에 의하여 유도되는 염증반응은 생체를 보호하기 위한 방어 시스템인 반면, 비정상적으로 과도한 염증반응이 유도되면 다양한 질환들이 나타나게 되는데, 이러한 질환들을 염증질환이라 총칭한다. 상기 염증질환은 외부 자극에 의하여 활성화된 표적세포로부터 분비되는 다양한 염증 매개물질이 염증을 증폭 및 지속시켜 인체의 생명을 위협하는 질환으로서 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 관절내에서의 질환, 건선등의 형태로 나타나는 피부질환 및 기관지 천식등의 알러지성 염증질환 등을 포함한다.
염증질환을 유도하는 핵심적인 염증 매개물질은 프로스타글란딘류(prostaglandins), 수산화 지방산류(hydroxy fatty acids), 히드록시에이코사테트라에노익 산(hydroxyeicosatetraenoic acid, 이하 "HETE"이라 약칭함) 및 류코트리엔류(leukotrienes)같은 에이코사노이드(eicosanoid)라 총칭되는 물질이고, 이들은 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase) 및 리폭시게나제(lipoxy-
genase)에 의하여 전구체인 아라키돈산(arachidonic acid)로부터 생성된다.
상기 염증질환의 치료를 위하여, 여러 가지 항염증 물질이 개발되었는데, 현재까지 보고된 항염증 물질들은 급성염증에서 손상된 조직세포, 염증에 관여하는세포 또는 주화인자에 의해 유주된 백혈구의 세포막으로부터 물리화학적 및 생리적 자극에 의해 활성화되는 프로스타글란딘류의 생합성을 억제하는 약물들이다 (Moyazawa, K and Mikami, T.,Japan J. Pharmacol., 38, 199, 1985). 그러나 상기 물질들은 급성염증에 대해서는 치료효과를 가지고 있지만 류마티스 관절염 같은 만성염증에 대해서는 1차적인 염증현상만을 완화할 뿐이며, 면역학적 치료효과는 기대할 수 없다고 보고되고 있다.
한편, 프로스타글란딘류 이외에 사이클로옥시게나제 및 리폭시게네이즈에 의하여 아라키돈 산으로부터 생성되는 HETE 및 류코트리엔류에 관한 활발한 연구결과, 상기 두 효소들의 활성을 저해하는 물질이 만성염증에 대해서도 효과를 나타낼 것으로 기대되고(Huskisson, E.D.et al., Inflammation, Mechanism and Treatment, 55, 1980) 최근에 발견된 사이클로옥시게나제의 동위효소(isozyme)인 사이클로옥시게나제-2의 저해제가 항염증제로 각광을 받고 있어 사이클로옥시게나제 및 리폭시게네이즈 활성 저해효과를 가지는 새로운 항염증제의 개발 필요성이 제시되고 있다.
이에, 본 발명자들은 염증을 유발하는 핵심물질인 에이코사노이드의 생성을 매개하는 효소들의 저해제를 개발하고자 노력하던 중, 꾸지나무 근피로부터 신규한 플레닐레이티드 화합물을 주성분으로 포함하는 추출물을 제조하고, 상기 추출물로부터 신규한 플레닐레이티드 화합물을 분리·정제한 후 그 구조를 결정하여 5,7,3',4'-테트라히드록시-6,5'-디플레닐플라보놀(5,7,3',4'-tetrahydroxy-6,5'-diprenylflavonol)로 동정하였다. 본 발명자들은 상기 신규한 플레닐레이티드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물이 생체외(in vitro) 및 생체내(in vivo)에서 우수한 항염증 효과를 나타낼 뿐만 아니라 항알러지 효과를 나타냄을 보여 염증질환 치료제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염증질환 치료제로서 우수한 항염증 효과를 나타내는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 꾸지나무로부터 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 분리·정제하는 제조방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 목적은 상기 화합물을 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물, 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.
마지막으로, 본 발명의 목적은 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 HMBC 스펙트럼에서 관찰되는1H-13C의 상관관계를 나타낸 것이고,
도 2는 본 발명의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 계열이 사이클로옥시게나제-2의 발현을 저해하는 효과를 웨스턴 블러팅(western blotting)을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것이고,
1: 사이클로옥시게나제-2의 발현을 유도하지 않은 세포
2: 사이클로옥시게나제-2의 발현을 유도한 세포
3: 사이클로옥시게나제-2의 발현의 유도와 동시에 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 10 μM 첨가한 세포
4: 사이클로옥시게나제-2의 발현의 유도와 동시에 본 발명의 플레닐레이티드플라보노이드 화합물을 100 μM 첨가한 세포
도 3은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물의 생체내(in vivo) 항알러지 활성을 PCA(passive cutaneous anaphylaxis)법을 이용하여 조사한 결과를 나타낸 것이다.
대조군: 시험 화합물을 첨가하지 않은 음성대조군
브라우스-K1(A): 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 20 ㎎/kg의 용량으로 투여한 실험군
브라우스-K1(B): 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 40 ㎎/kg의 용량으로 투여한 실험군
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 제공한다.
화학식 1
상기 화학식 1로 나타내는 화합물에 대하여 녹는점을 분석하고 EIMS(Electron Impact Mass Spectrum) 방법을 이용하여 질량을 측정한 후 수소 핵자기공명 스펙트럼(1H-NMR spectrum) 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼(13C-NMR spectrum)을 수행하여 본 발명의 화합물을 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물임을 확인하였다. 또한, 상기 화학식 1의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물에 대하여1H-1H COSY(Correlation spectroscopy), HMQC(Heteronuclear multi-quantum correlation) 및 HMBC(Heteronuclear multiple bond connectivity) NMR 실험을 수행하여 얻은 스펙트럼 데이타 및 문헌자료에 근거한 모델 화합물들과의 비교에 의하여 화학식 1의 화합물은 2 개의 γ,γ-디메틸아릴기(γ,γ-dimethylallyl group)가 결합된 5,7,3',4'-테트라히드록시-6,5'-디플레닐플라보놀로 동정되었다.
구체적으로, 본 발명의 화학식 1의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물에 대하여1H-1H COSY, HMQC 및 HMBC NMR을 수행한 결과, HMBC 스펙트럼에서 4 번 탄소의 케토기(keto group)와 수소결합하여 저자장에서 나타난 5 번 탄소에 결합된 수산기(OH group)의 흡수 스펙트럼(δ 12.72)과 6 번 탄소의 흡수 스펙트럼(δ 110.1)의 상관관계 뿐만 아니라, 6 번 탄소의 흡수 스펙트럼과 γ,γ-디메틸아릴기의 메틸렌(methylene) 수소 (CH2-9, δ 3.22)의 흡수 스펙트럼의 상관관계가 관찰되어 6 번 탄소 및 5' 번 탄소에 프레닐기(prenyl group)가 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 1참조).
상술한 바와 같은 스펙트럼 데이터 결과를 종합하여 볼 때, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물은 6 번 탄소 및 5' 번 탄소에 2 개의 γ,γ-디메틸아릴기가 붙어 있는 구조식을 가지며, 문헌검색 결과 보고되어 있지 않아 화학식 1로 표시되는 신규한 5,7,3',4'-테트라히드록시-6,5'디플레닐플라보놀 화합물로 동정되었다.
화학식 1로 표시되는 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartaric acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 꾸지나무로부터 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 분리·정제하는 제조방법을 제공한다.
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물의 제조방법은
1) 꾸지나무 근피에 메탄올(methanol)을 첨가하고 환류시킨 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻는 단계(단계 1);
2) 상기 메탄올 추출물을 증류수 녹인 후 에틸아세테이트(ethylacetate) 용매로 분획추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계(단계 2);
3) 상기 에틸아세테이트층을 감압증류하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 3); 및
4) 상기 에틸아세테이트 추출물을 크로마토그래피를 수행하여 항염증 활성물질을 얻는 단계(단계 4)로 이루어진다.
아울러, 본 발명은 항염증 효과를 나타내는 꾸지나무 추출물, 약학적으로 허용되는 그의 염 및 그의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 꾸지나무 추출물은 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 포함하여 생체외 및 생체내에서 우수한 항염증 효과를 나타낸다.
본 발명의 꾸지나무 추출물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 화학식 1의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 형용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 유리산으로는 유리산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 꾸지나무 추출물의 제조방법은
1) 꾸지나무 근피에 메탄올(methanol)을 첨가하고 환류시킨 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻는 단계(단계 1);
2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 녹인 후 에틸아세테이트(ethylacetate) 용매로 분획추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계(단계 2); 및
3) 상기 에틸아세테이트층을 감압증류하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 3)로 이루어진다.
마지막으로, 본 발명은 화학식 1로 나타내는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 화학식 1로 표시되는 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물은 염증을 매개하는 에이코사노이드의 생성에 관여하는 효소들의 활성을 저해하거나 일부 효소의 발현을 억제하여 항염증 효과를 나타낸다.
화학식 1의 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 피부적용과 같이 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부적용, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.
화학식 1의 화합물의 유효 용량은 일반적으로 성인에게 1 내지 300 mg/kg이고, 바람직하기로는 10 내지 100 mg/kg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 1 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 급성독성 실험결과 MLD 값이 300 mg/kg 이상으로 매우 안정한 화합물임을 확인하였다.
또한, 화학식 1의 화합물을 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물의 유효 용량은 일반적으로 성인에게 10 내지 1000 mg/kg이고, 바람직하기로는 100 내지 300 mg/kg이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하기로는 하루 1 회 내지 3 회 분할 투여될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 급성독성 실험결과 MLD 값이 300 mg/kg 이상으로 매우 안정한 화합물임을 확인하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 꾸지나무 추출물의 제조
본 발명자들은 꾸지나무 근피로부터 항염증 효과를 나타내는 플레닐레이트 플라보노이드 화합물을 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물을 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
꾸지나무 근피 1 kg에 메탄올을 첨가하고 5 시간 동안 환류시킨 후 감압증류하여 140 g의 건조 메탄올 추출물을 얻고, 상기 추출물을 증류수에 녹인 후 에틸아세테이트로 용매로 분획추출하고 감압증류하여 30 g의 에틸아세테이트 추출물을 얻음으로써 항염증 효과를 나타내는 플레닐레이트 플라보노이드 화합물을 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 항염증 효과를 나타내는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물의 제조
본 발명자들은 꾸지나무 근피로부터 항염증 효과를 나타내는 플레닐레이트 플라보노이드 화합물을 분리·정제하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
꾸지나무 근피 1 kg에 메탄올을 첨가하고 5 시간 동안 환류시킨 후 감압증류하여 140 g의 건조 메탄올 추출물을 얻고, 상기 추출물을 증류수와 에틸아세테이트로 분획하고 감압증류하여 30 g의 에틸아세테이트 추출물을 얻은 후 헥산-에틸아세테이트(hexane-ethylacetate)를 기울기 용출용매로 이용하는 실리카 젤 칼럼 크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 수행하여 얻은 분획중 헥산-에틸아세테이트(8:5)에서 용출된 분획으로부터 본 발명의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 얻었다(Rf:0.16, 헥산-에틸아세테이트=8:5).
상기 화합물에 대하여 녹는점을 분석하고 EIMS 방법을 이용하여 질량을 측정한 후 수소 핵자기공명 스펙트럼 및 탄소 핵자기공명 스펙트럼을 수행하여 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물임을 확인하였다. 또한, 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물에 대하여1H-1H COSY, HMQC 및 HMBC NMR을 수행한 결과, HMBC 스펙트럼에서 4 번 탄소의 케토기와 수소결합하여 저자장에서 나타난 5 번 탄소에 결합된 수산기의 흡수 스펙트럼(δ 12.72)과 6 번 탄소의 흡수 스펙트럼(δ 110.1)의 상관관계 뿐만 아니라, 6 번 탄소의 흡수 스펙트럼과 γ,γ-디메틸아릴기의 메틸렌 수소 (CH2-9, δ 3.22)의 흡수 스펙트럼의 상관관계가 관찰되어 6 번 탄소 및 5' 번 탄소에 프레닐기가 결합되어 있음을 알 수 있었다(도 1).
상술한 바와 같은 스펙트럼 데이터 결과를 종합하여 볼 때, 6 번 탄소 및 5' 번 탄소에 2 개의 γ,γ-디메틸아릴기가 붙어 있는 구조식을 가지는 있으며, 문헌검색 결과 보고되어 있지 않은 화학식 1로 표시되는 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물은 신규의 5,7,3',4'-테트라히드록시-6,5'-디플레닐플라보놀로 동정되었다.
m.p. 202-204oC
EIMS,m/z438[M+] 395(M-C3H7)+, 383(M-C4H7)+, 365(M-C4H7-H2O)+, 327(M-C4H7-C4H8)+
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) 1.62 (3H, s, CH3-17), 1,69 (6H, s, CH3-18, 13), 1.72 (3H, s, CH3-12), 3.22 (2H, d,J= 7.0 Hz, CH2-9), 3.27 (2H, d,J= 7.2 Hz, H-14), 5.18 (1H, m, H-10), 5.28 (1H, m, H-15), 6.45 (1H, s, H-8), 7.44 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6'), 7.59 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6'), 8.88, 9.24, 9.63(OH), 12.72(5-OH);13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) 144.5 (C-2), 135.6 (C-3), 175.7 (C-4), 102.7 (C-4a), 157.4 (C-5), 110.1 (C-6), 161.6 (C-7), 92.5 (C-8), 153.9 (C-8a), 121.2 (C-1'), 112.4 (C-2'), 146.6 (C-3'), 145.3 (C-4'), 128.0 (C-5'), 120.1 (C-6'), 128.2 (C-9), 122.3 (C-10), 130.6 (C-11), 17.7 (C-12), 17.7 (C-13), 21.0 (C-14), 122.7 (C-15), 131.5 (C-16), 25.5 (C-17), 25.5 (C-18).
<실험예 1> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 프로스타글란딘 E2에 대한 생성 저해효과 측정
상기 실시예 2에서 얻은 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 실시예 1의 꾸지나무 근피 추출물이 염증을 매개하는데 핵심적인역할을 담당하는 프로스타글라딘 E2(이하 "PGE2"라 약칭함)의 생성을 저해할 수 있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저, Kim 등의 방법(Kim,et al., Biochem. Pharmacol.58, 759-765, 1999)을 이용하여 96-웰 세포배양 플레이트(96-well cell culture plate)에서 RAW 264.7 세포(ATCC)(2 X 105세포/웰)를 배양한 후 리포폴리사카라이드(Lipopolysa-
ccharide, 이하 "LPS"라 약칭함)를 1 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 염증반응을 24 시간 유도한 후 배지에 생성된 PGE2의 양을 EIA(Enzyme linked immunoabsorbant assay)법으로 정량하여 그 결과를 하기 표 1에 나타었다. 이때, 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물은 LPS와 동시에 처리되었다.
<표 1> 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물(실시예 2의 화합물) 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물(실시예 1의 화합물)의 PGE2생성 저해효과
화합물 농도 PGE2생성율(%)
대조군 - 0
LPS 100
실시예 1의 꾸지나무 추출물 10 ㎍/㎖ 88
50 ㎍/㎖ 70
100 ㎍/㎖ 52
200 ㎍/㎖ 42
실시예 2의 화합물 1 μM 95
10 μM 81
50 μM 62
100 μM 26
상기 표 1에 나타나 있듯이, 화학식 1로 표시되는 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 50 μM 및 100 μM 농도로 각각 처리한 세포의 PGE2생성율이 각각 62% 및 26%로 나타나 LPS로 염증반응을 유도한 세포에 비하여 현저히 감소되었으며, 상기 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물을 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 농도로 처리한 세포의 PGE2생성율이 각각 52% 및 42%로 나타나 LPS로 염증반응을 유도한 세포에 비하여 상당히 감소되었다. 따라서, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 모두 RAW 264.7 세포에서 PGE2의 생성을 저해하였다. 특히, 꾸지나무 추출물로부터 분리정제된 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물은 PGE2의 생성을 강력하게 저해하였다.
상기의 결과로부터, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 근피 추출물은 생체외에서 염증매개의 핵심물질인 PGE2의 생성을 강력하게 저해함으로써 염증질환 치료제로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
<실험예 2> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 사이클로옥시게나제-2에 대한 효소활성 저해효과 측정
실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 주요한 염증매개 물질로 알려진 에이코사노이드의 생성에 관여하는 사이클로옥시게나제-2의 활성을 저해하여 PGE2생성을 감소시키는 효과를 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 세포로부터 추출된 사이클로옥시게나제-2 효소원액을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였으며, 표준비교물질로 기존의 사이클로옥시게나제-2 저해제인 NS-398을 사용하였다.
먼저, RAW 세포에 아스피린(aspirin)을 10 ㎍/㎖농도로 첨가하고 3 시간 동안 전처리한 후, LPS를 1 ㎍/㎖ 농도로 첨가하여 사이클로옥시게나제-2의 발현을 유도시켰다. 24 시간 동안 발현을 유도한 후 배지를 버리고 세포만을 모아 테플론파쇄기(teflon homogenizer)로 파쇄한 후 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 이를 사이클로옥시게나제-2의 효소원액으로 사용하였다. 상기 효소원액에 You 등의 방법(You,et al., Arch. Pharm. Res.22, 18-24, 1999)을 이용하여14C-PGE2의 전구체인14C-아라키돈산 및 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 첨가한 실험군과 상기14C-아라키돈산 및 상기 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 포함하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물을 첨가한 실험군을 20 분간 반응시킨 후 클로로포름:메탄올(2:1) 용액으로 사이클로옥시게나제-2의 생성물인14C-PGE2를 추출하였다.
상기 추출액을 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography, 이하 "TLC"이라 약칭함)에서 전개한 후 오토레디오그래피(autoradiography)를 이용하여 PGE2의 표지물질인14C를 정량함으로써 PGE2의 생성량을 측정하고 이로부터 사이클로옥시게나제-2의 활성을 결정하였다. 사이클로옥시게나제-2에 대한 효소활성 저해율은 시험화합물을 첨가하지 않은 대조군의 사이클로옥시게나제-2에 대한 효소활성 저해효과를 기준으로 계산하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2> 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물(실시예 2의 화합물) 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물(실시예 1의 꾸지나무 추출물)의 사이클로옥시게나제-2에 대한 효소활성 저해효과
화합물 농도 PGE2생성율(%)
대조군 - 100
NS-398 0.1 μM 104
1 μM 95
10 μM 38
100 μM 5
실시예 1의 꾸지나무 추출물 10 ㎍/㎖ 108
50 ㎍/㎖ 97
100 ㎍/㎖ 99
200 ㎍/㎖ 101
실시예 2의 화합물 1 μM 96
10 μM 99
50 μM 98
100 μM 100
상기 표 2에 나타나 있듯이, LPS로 염증반응을 유도한 효소원액에 100 μM의 NS-398가 처리된 경우에 PGE2의 생성량이 급격히 감소된 반면, 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물이 100 μM의 농도까지 처리된 경우에 PGE2의 생성량이 감소되지 않았으며, 상기 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 200 ㎍/㎖ 농도까지 처리된 경우에도 PGE2의 생성량이 감소되지 않았다.
상기 결과로부터 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물이 사이클로옥시게나제-2의 효소활성을 직접적으로 저해하여 PGE2의 생성을 감소시키는 것이 아니라 다른 간접적인 방법으로 PGE2의 생성을 저해함을 알 수 있었다.
<실험예 3> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 사이클로옥시게나제-2에 대한 발현 저해효과 측정
실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 사이클로옥시게나제-2의 발현을 저해하여 PGE2생성을 감소시키는 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 웨스턴 블러팅(western blotting)을 수행하였다.
먼저, RAW 세포에 LPS를 1 ㎍/㎖ 농도로 처리하여 사이클로옥시게나제-2의 발현을 24 시간 유도한 후 세포만을 모아 테플론 파쇄기를 이용하여 파쇄하고 12,000 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상등액을 얻은 후, 이를 이용하여PAGE(polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행함으로써 단백질을 그 크기에 따라 분리하였다. 상기 분리된 단백질들을 PVDF 막(polyvinylidene fluoride membrane)에 블러팅시키고, 항-사이클로옥시게나제-2 항체(anti-cyclooxygenase-2 antibody, Cayman Co.)를 처리하여 발현된 사이클로옥시게나제-2의 양을 측정하였다.
그 결과, 실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 추출물은 각각 100 μM 및 200 ㎍/㎖의 농도에서 사이클로옥시게나제-2 발현량을 대조군에 비하여 현저하게 저하시킴을 확인 할 수 있었으나 본 명세서에서는 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 이용한 결과만을 나타내었다(도 2). 상기 결과로부터, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 꾸지나무 추출물은 사이클로옥시게나제-2의 효소활성을 직접 저해하는 대신에 그 발현을 저해하여 PGE2생성량을 감소시킨다는 것을 확인하였다.
<실험예 4> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 사이클로옥시게나제-1, 5-리포옥시게나제 및 12-리포옥시게나제에 대한 효소활성 저해효과 측정
실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 염증을 매개하는 핵심물질로작용하는 트롬복산(thromboxane) B2및 HETE를 생성하는 사이클로옥시게나제-1, 5-리포옥시게나제 및 12-리포옥시게나제의 효소활성을 직접 저해할 수 있는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 생체외 실험을 수행하였다.
본 발명자들은 사이클로옥시게나제-1의 효소원액으로 인간혈액(human blood)으로부터 분리한 혈소판의 파쇄액을 사용하였고, 실험예 2의 방법을 이용하여 사이클로옥시게나제-1의 효소활성을 측정하였다. 이때14C-트롬복산 B2의 표지물질인14C를 정량하여 트롬복산 B2의 생성량을 측정하였다.
또한, 본 발명자들은 12-리폭시게나제의 효소원액으로 숫소의 혈액으로부터 분리한 혈소판 파쇄액을 이용하여 실험예 2와 동일한 방법으로14C-12-HETE의 생성량을 정량함으로써 12-리폭시게나제의 효소활성을 측정하였으며, 5-리폭시게나제의 효소원액으로 숫소의 혈액으로부터 분리한 호중구의 파쇄액을 이용하여 실험예 2와 동일한 방법으로14C-5-HETE의 생성량을 정량함으로써 5-리폭시게나제의 효소활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
<표 3> 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물(실시예 2의 화합물) 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물(실시예 1의 꾸지나무 추출물)의 5-리포옥시게나제에 대한 효소활성 저해효과 닥나무
화합물 농도 5-HETE 생성율(%)
대조군 - 100
NDGA 1 μM 33
10 μM 22
100 μM 22
실시예 1의 꾸지나무 추출물 10 ㎍/㎖ 92
50 ㎍/㎖ 80
100 ㎍/㎖ 61
200 ㎍/㎖ 49
실시예 2의 화합물 1 μM 83
10 μM 46
50 μM 25
100 μM 18
<표 4> 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물(실시예 2의 화합물) 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물(실시예 1의 꾸지나무 추출물)의 12-리포옥시게나제에 대한 효소활성 저해효과
화합물 농도 12-HETE 생성율(%)
대조군 - 100
NDGA 1 μM 62
10 μM 26
100 μM 18
실시예 1의 꾸지나무 추출물 10 ㎍/㎖ 103
50 ㎍/㎖ 90
100 ㎍/㎖ 72
200 ㎍/㎖ 57
실시예 2의 화합물 1 μM 92
10 μM 73
50 μM 71
100 μM 29
상기 표 3 및 표 4의 결과에 나타나 있듯이, 상기 실시예 2의 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 5-리폭시게나제에 대한 효소활성 저해농도(IC50, 50% 활성저해를 위한 농도)가 각각 7 μM 및 193 ㎍/㎖로 측정되고 12-리폭시게나제에 대한 효소활성 저해농도는 각각 69 μM 및 200 ㎍/㎖ 이상으로 측정되어, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물이 5-리폭시게나제 및 12-리폭시게나제의 효소활성을 강력하게 저해함을 확인하였다. 그러나, 사이클로옥시게나제-1에 대한 저해효과는 나타내지 않았다.
상기 결과로부터, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 사이클로옥시게나제-1의 효소활성은 저해하지 않고, 5-리폭시게나제 및 12-리폭시게나제의 효소활성을 강력하게 저해함으로써 항염증 활성을 나타내어 핵심적인 염증매개 물질인 에이코사노이드의 생성을 억제함을 알 수 있었다.
<실험예 5> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 생체내 항염증 효과 측정
실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 생체내에서 항염증 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 숫쥐를 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
SD계 숫쥐를 이용하여 Winter 등의 카라지난-유도 포에데마(carageenan-induced paw edema ) 방법(Winteret al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 111, 544-547, 1962)으로 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물을 경구투여한 후 생체내 항염증 효과를측정하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
<표 5> 생체내에서의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물(실시예 2의 화합물) 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물(실시예 1의 꾸지나무 추출물)의 항염증 효과
화합물 양 저해율(%)
인도메타신(indomethacin) 1 mg/kg 52
실시예 1의 꾸지나무 추출물 50 mg/kg 18
100 mg/kg 32
200 mg/kg 43
실시예 2의 화합물 10 mg/kg 38
50 mg/kg 54
100 mg/kg 69
상기 표 5에 나타나 있듯이, 실시예 2의 플라보노이드 화합물을 10 mg/kg 용량으로 경구투여할 경우에는 38%, 50 mg/kg의 용량으로 경구투여할 경우에는 54%, 100 mg/kg 용량으로 경구투여할 경우에는 69%의 염증 저해율을 나타내었다. 또한, 실시예 1의 꾸지나무 추출물을 50 ㎎/kg 용량으로 경구투여할 경우에는 18%, 100 ㎎/kg의 용량으로 경구투여할 경우에는 32%, 200 ㎎/kg 용량으로 경구투여할 경우에는 43%의 염증 저해율을 나타내었다. 따라서, 실시예 2에서 제조된 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 포함하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 생체외에서 뿐만 아니라 생체내에서도 우수한 항염증 효과를 나타냄을 확인하였다.
<실험예 6> 실시예 2의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물의 생체내 항알러지 활성 측정
실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물이 생체내에서 항알러지 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 본 발명자들은 수동 피부 아나필라시스 반응실험(passive cutaneous anaphylaxis test)을 수행하였다.
항원으로는 DNP-BSA를 이용하였고, 항체로는 밀레스사(Miles Co.)로부터 구입한 IgE 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 사용하였다. 먼저, 체중이 250 내지 300 g인 SD계 렛트(rat)의 등털을 털깍기로 제거한 후 항체 DNP-BSA를 100 ㎕씩 피내 주사하였다. 이로부터 48 시간이 경과한 후 20 및 40 ㎎/㎏의 실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물과 이를 주성분으로 함유하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물 50 및 100 ㎎/㎏을 복강내로 투여하였다. 투여한지 30 분 경과 후 꼬리정맥으로 항원을 함유하는 0.5% 에반스 블루(Evans blue)용액 200 ㎕를 주사하고 30 분이 경과된 후 피부에 유출된 색소에 1 N 수산화칼륨액(KOH) 1 ㎖을 첨가하여 37℃에서 하루동안 방치하였다. 상기 피부색소에 0.6 N 포스페이트 아세톤(phosphate acetone)용액을 첨가하여 진탕한 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 실시예 2에서 얻은 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 20 ㎎/㎏의 용량으로 투여했을 때 대조군에 비하여 약 40%의 생체내 항알러지 활성을 나타내었고, 40 ㎎/㎏의 용량으로 투여했을 때 대조군에 비하여 약 72%의 생체내 항알러지 활성을 나타었다(도 6). 또한, 상기 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 포함하는 실시예 1의 꾸지나무 추출물은 50 ㎎/㎏의 용량으로 투여했을 때 대조군에 비하여 약 28%의 생체내 항알러지 활성을 나타내었고, 100 ㎎/㎏의 용량으로 투여했을 때 대조군에 비하여 약 52%의 생체내 항알러지 활성을 나타었다. 따라서, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물이 생체내 항알러지 활성을 나타냄을 확인하였다.
<실험예 7> 마우스 및 렛트에 대한 경구투여 급성독성 실험
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물이 생체내에서 독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 하기와 같은 독성실험을 수행하였다.
식품의약 안정청의 공고에 따라, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물을 암수의 ICR 마우스 및 SD계 렛트에 0.1 내지 300 mg/kg의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 2 주동안 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 실험동물에서300 ㎎/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD50)은 300 ㎎/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.
상기에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타내어 염증질환의 치료를 위한 약학적 조성물로 제제화될 수 있다.
<제제예 1> 시럽제의 제조방법
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물 및 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효성분 2%(중량/부피)으로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조한다.
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물의 산부가염, 사카린, 당을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린, 사카린, 향미료, 에탄올, 소르브산 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다. 상기 부가염은 실시예에 의한 다른 염으로 대치시킬 수 있다.
상기 시럽제의 구성성분은 다음과 같다.
플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나 무 추출물·염산염···················2 g
사카린 ······················· 0.8 g
당 ························ 25.4 g
글리세린······················ 8.0 g
향미료 ······················ 0.04 g
에탄올 ·······················4.0 g
소르브산 ······················0.4 g
증류수 ·······················정량
<제제예 2> 정제의 제조방법
유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조한다.
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물·염산염 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.
플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물·염산염··············· 250 g
락토오스 ···················175.9 g
감자전분 ····················180 g
콜로이드성 규산 ················ 32 g
10% 젤라틴 용액
감자전분 ····················160 g
활석 ······················ 50 g
스테아르산 마그네슘 ··············· 5 g
<제제예 3> 주사액제의 제조방법
유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물·염산염 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 또는 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나 무 추출물·염산염················1 g
염화나트륨···················0.6 g
아스코르브산··················0.1 g
증류수·····················정량
상기에서 살펴본 바와 같이, 화학식 1로 표시되는 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 5-리폭시게나제 및 12-리폭시게나제의 효소활성을 직접적으로 저해할 뿐만 아니라 사이클로옥시게나제-2의 발현을 저해하여 염증매개 물질인 에이코사노이드의 생성을 억제함으로써 생체외 및 생체내에서 우수한 항염증 효과를 나타내며, 독성을 보이지 않아 급성염증을 비롯하여 류마티스 관절염과 같은 관절내 질환, 건선등의 피부질환, 기관지 천식 등의 알러지성 염증질환 등의 다양한 염증질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로 함유하는 꾸지나무 추출물은 생체내에서 우수한 항알러지 활성을 나타내어 항알러지제로도 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (7)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드(prenylated flavonoid) 화합물.
    화학식 1
  2. 1) 꾸지나무 근피에 메탄올(methanol)을 첨가하고 환류시킨 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻는 단계(단계 1);
    2) 상기 메탄올 추출물을 증류수 녹인 후 에틸아세테이트(ethylacetate) 용매로 분획추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계(단계 2);
    3) 상기 에틸아세테이트층을 감압증류하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 3); 및
    4) 상기 에틸아세테이트 추출물을 크로마토그래피를 수행하여 항염증 활성물질을 얻는 단계(단계 4)로 이루어지는 제 1항의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물의 제조방법.
  3. 1) 꾸지나무 근피에 메탄올(methanol)을 첨가하고 환류시킨 후 감압증류하여 메탄올 추출물을 얻는 단계(단계 1);
    2) 상기 메탄올 추출물을 증류수에 녹인 후 에틸아세테이트(ethylacetate) 용매로 분획추출하여 에틸아세테이트층을 얻는 단계(단계 2); 및
    3) 상기 에틸아세테이트층을 감압증류하여 에틸아세테이트 추출물을 얻는 단계(단계 3)에 의하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항염증 효과를 나타내는 꾸지나무 추출물.
  4. 제 1항의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물.
  5. 제 1항의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 항알러지제용 약학적 조성물.
  6. 제 3항의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 함유하는 제 2항의 꾸지나무 추출물 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 염증질환 치료제용 약학적 조성물.
  7. 제 3항의 신규한 플레닐레이티드 플라보노이드 화합물을 주성분으로 함유하는 제 2항의 꾸지나무 추출물 및/또는 약학적으로 허용되는 그의 염을 유효 성분으로 함유하는 항알러지제용 약학적 조성물.
KR1020000044891A 2000-08-02 2000-08-02 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물 KR100361090B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000044891A KR100361090B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020000044891A KR100361090B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020011553A true KR20020011553A (ko) 2002-02-09
KR100361090B1 KR100361090B1 (ko) 2002-11-18

Family

ID=19681472

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020000044891A KR100361090B1 (ko) 2000-08-02 2000-08-02 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100361090B1 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100470158B1 (ko) * 2001-12-05 2005-03-08 주식회사한국파마 기린초 추출물, 이로부터 분리한 화합물 및 이들을유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물
WO2011071296A3 (en) * 2009-12-07 2011-10-13 Pharmaking Co., Ltd. Anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising extracts from broussonetia papyrifera and lonicera japonica
CN103037880A (zh) * 2010-07-02 2013-04-10 株式会社爱茉莉太平洋 含有构树的提取物的组合物
CN108524605A (zh) * 2018-06-15 2018-09-14 青岛农业大学 一种构树叶黄酮的提取方法及提取物的应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101049973B1 (ko) * 2007-07-09 2011-07-15 김미숙 항염 및 항아토피용 분말, 이를 이용하여 제조된 약제, 비누 및 인테리어용 자재
KR101681683B1 (ko) * 2010-07-02 2016-12-01 (주)아모레퍼시픽 닥나무의 꽃과 열매 추출물을 함유하는 피부 미백용 피부 외용제 조성물

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS61291526A (ja) * 1985-06-19 1986-12-22 Osaka Chem Lab 桑及び／又はこの近縁種を原料とする成人病予防食品
JPH0368515A (ja) * 1989-08-08 1991-03-25 Tsumura & Co 抗アレルギー剤
KR101237431B1 (ko) * 2011-02-25 2013-02-26 민병수 망형 접지판

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100470158B1 (ko) * 2001-12-05 2005-03-08 주식회사한국파마 기린초 추출물, 이로부터 분리한 화합물 및 이들을유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물
WO2011071296A3 (en) * 2009-12-07 2011-10-13 Pharmaking Co., Ltd. Anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising extracts from broussonetia papyrifera and lonicera japonica
KR101158835B1 (ko) * 2009-12-07 2012-06-27 강원대학교산학협력단 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 의약조성물
CN103037880A (zh) * 2010-07-02 2013-04-10 株式会社爱茉莉太平洋 含有构树的提取物的组合物
CN108524605A (zh) * 2018-06-15 2018-09-14 青岛农业大学 一种构树叶黄酮的提取方法及提取物的应用
CN108524605B (zh) * 2018-06-15 2021-04-13 青岛农业大学 一种构树叶黄酮的提取方法及提取物的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR100361090B1 (ko) 2002-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Stanikunaite et al. Cyclooxygenase‐2 inhibitory and antioxidant compounds from the truffle Elaphomyces granulatus
Perera et al. Perspectives on geraniin, a multifunctional natural bioactive compound
Yang et al. New constituents with iNOS inhibitory activity from mycelium of Antrodia camphorata
JP2000239297A (ja) 薬効を有する梅抽出物およびそれを含有する組成物
US8362034B2 (en) Quinoline compound, and composition containing centipede extract or compounds isolated therefrom for prevention and treatment of cardiovascular disease
KR101535662B1 (ko) 천연 식물성 소재를 이용한 항염증 활성 조성물 제조방법 및 그 조성물
KR100361090B1 (ko) 꾸지나무로부터 분리한 항염증 활성을 나타내는 신규한플레닐레이티드 플라보노이드 화합물 및 이를 주성분으로함유하는 꾸지나무 추출물, 이들의 제조방법 및 이들을함유하는 약학적 조성물
JP2007526299A (ja) 新規なアビエタンジテルペノイド系化合物、及び榧抽出物、またはそれから分離したアビエタンジテルペノイド系化合物またはテルペノイド系化合物を有効成分とする心臓循環系疾患の予防及び治療用組成物
KR101348729B1 (ko) 유데스만계 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물
EP2007408B1 (en) Preventative treatment and remission of allergic diseases
KR101317668B1 (ko) 멀꿀 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 치료 또는 예방용 약학 조성물
KR20210052377A (ko) 캠퍼롤 및 에티카테킨 갈레이드를 포함하는 홍경천 추출물을 포함하는 전립선 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물
Ben Sghaier et al. In vitro and in vivo immunomodulatory and anti-ulcerogenic activities of Teucrium ramosissimum extracts
KR100416482B1 (ko) 항염증 작용을 하는 곰취 추출물 및 그 분획물
KR100778373B1 (ko) 상표초 추출물, 이로부터 분리된 아세틸도파민계 화합물또는 바이페놀 화합물을 유효성분으로 함유하는 심장순환계질환의 예방 및 치료제
KR100963643B1 (ko) 손바닥선인장 열매의 종자 추출물 또는 이로부터 분리된화합물을 함유하는 간독성 질환 예방 및 치료용 조성물
KR100836941B1 (ko) 차가버섯으로부터 분리된 항산화 화합물 및 이를 포함하는 조성물
Bukhari et al. A novel compound isolated from Sclerochloa dura has anti-inflammatory effects
KR100726281B1 (ko) 신규 지방산 에스테르 화합물 및 이를 유효성분으로함유하는 당뇨 및 비만치료용 조성물
KR100765419B1 (ko) 삼백초 추출물에서 분리된 사우세르네올 ｂ 화합물을함유하는 염증, 알러지 및 천식 질환의 예방 및 개선용건강기능식품
KR100926466B1 (ko) 4-ｏ-메틸호노키올을 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제 조성물
KR101837477B1 (ko) 뽕나무 잎으로부터 분리된 화합물을 포함하는 비만의 예방 또는 치료용 조성물
KR101841541B1 (ko) 황기 추출물 및 지치 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20070000663A (ko) 신규한 아세틸도파민계 화합물, 및 선퇴 추출물 또는이로부터 분리된 아세틸도파민계 화합물을 유효성분으로함유하는 심장순환계 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20200008425A (ko) 플라보노이드 8-o-글루쿠로니드 화합물을 포함하는 항당뇨 및 항산화용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120928

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130927

Year of fee payment: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141006

Year of fee payment: 13

LAPS Lapse due to unpaid annual fee