KR100470158B1

KR100470158B1 - 기린초 추출물, 이로부터 분리한 화합물 및 이들을유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물

Info

Publication number: KR100470158B1
Application number: KR10-2001-0076639A
Authority: KR
Inventors: 김현표; 장현욱; 강삼식; 배기환; 손건호; 김동선
Original assignee: 주식회사한국파마; 배기환; 강삼식; 손건호; 김현표; 장현욱
Priority date: 2001-12-05
Filing date: 2001-12-05
Publication date: 2005-03-08
Also published as: KR20030046182A

Abstract

본 발명은 기린초 추출물, 이로부터 분리한 화합물 및 이들을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 기린초 추출물, 이의 추출방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물 및 이로부터 분리한 신규한 화합물, 그의 분리방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 항염증 작용을 나타내는 기린초 추출물 및 상기 기린초 추출물로부터 얻은 신규물질 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

또한, 상기의 기린초 추출물, 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드와 메틸갈레이트 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 항염증제로서의 용도를 제공한다.

Description

기린초 추출물, 이로부터 분리한 화합물 및 이들을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물 {An extract of Sedum kamtschaticum Fisch. and a chemical compound isolated from the extract, and a pharmaceutical composition for anti-inflammatory containing them as an effective constituents}

기린초 (Sedum kamtschaticum Fisch.)는 쌍떡잎식물 이판화군 장미목 돌나물과에 속하고 한국, 일본, 사할린, 쿠릴, 캄차카, 아무르, 중국 등에서 산지의 바위 곁에 서식하는 5∼30cm 높이의 다년생 초본으로서, 한방에서는 기린초, 가는기린초 (Sedum aizoon L.) 및 속리기린초 (Sedum zokuriense Nakai)의 전초를 비채라하여 활혈, 지혈, 이수, 진정, 소종의 용도로 사용하고 있으나, 아직까지 항염증작용 기전 및 항염증력은 알려진 바가 없다.

현재까지 염증의 발현과 가장 관계가 깊은 효소는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, 이하 COX로 약칭함) 및 리폭시게나제 (lipoxygenase, 이하 LOX로 약칭함)로 알려져 있고, 최근까지의 연구결과 COX는 COX-1 및 COX-2의 2가지 이성체가 보고되었는데, 이중에서 유도성 효소인 COX-2가 염증의 발현을 주도하고 있다.

기린초 추출물에 관한 종래기술로는 물을 추출용매로 하여 추출한 기린초 추출물과 송이 추출물을 함유하는 미백 화장료 조성물이 개시되어 있으나(한국공개특허 제 1997-69024호), 유기용매를 추출용매로 하여 추출한 기린초 추출물을 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 알려지지 않았다.

또한, 천연물질로부터 추출하거나, 화학적으로 합성한 메틸갈레이트 (methyl gallate) 또는 그 유도체를 함유하는 정장보조식품(한국공개특허 제 1999-52996호), 미백화장품 조성물(한국특허출원 제 1998-32197호, 한국특허출원 제 1998-31122호) 등이 개시되어 있으나, 이를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물은 알려지지 않은 상태이다.

이에 본 발명자들은 여러가지 식물 추출물들의 항염증 작용을 연구하던 중, 기린초 추출물 및 이를 구성하는 성분들이 강력한 프로시타글란딘 (prostaglandin, PG) 생성억제능을 지니고 있음을 발견하고, 이들에 대한 동물실험에서도 강력한 항염증작용을 보이고 있음을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 기린초 추출물, 이의 추출방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 기린초 추출물로부터 분리한 신규한 화합물, 그의 분리방법과 이를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 기린초 추출물로부터 분리한 메틸 갈레이트를 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물을 제공함에 있다.

또한, 본 발명은 상기의 항염증용 약제학적 조성물들을 염증질환에 투여하는 방법을 제공함을 그 목적으로 하고 있다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위한 수단으로 항염증 작용을 나타내는 기린초 추출물 및 상기 기린초 추출물로부터 얻은 신규물질 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드 (하기 화학식 1) 또는 그의 약제학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

<화학식 1>

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 기린초 추출물은 C1∼C4의 저급알코올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸, 에테르 또는 디클로로메탄으로 구성된 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합유기용매를 추출용매로 사용하여 기린초로 부터 추출한 것으로, 건조된 기린초를 잘게 절단하여 냉암소에서 상기의 유기용매에 5-10일간 침지한 후 추출하는 공정을 3회 반복하여 얻은 추출원액을 여과한 후 농축하여 얻을 수 있다.

상기 기린초 추출물에 증류수를 가한 후 에틸아세테이트, 또는 부탄올로 추출하여 각각의 분획물을 얻고, 부탄올 추출물로부터 실리카겔 컬럼분리법으로 각각의 순수한 물질인 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드(herbacetin 3-(6''-acetylglucosyl)-8-arabinoside)와 하기 화학식 2로 표시되는 메틸갈레이트(methyl gallate)를 얻는다.

<화학식 2>

신규물질 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드는 상기의 기린초 추출물에 증류수를 가한 후 다시 부탄올을 가하여 진탕하고 농축시켜 얻은 부탄올 분획물로부터 실리카겔 컬럼분리법으로 얻은 분획을 재결정하여 분리하는데, 부탄올 분획물을 실리카겔 컬럼을 이용하여 클로로포름(CHCl₃)_,15% 메탄올(MeOH)-클로로포름(CHCl₃), 20% 메탄올(MeOH)-클로로포름(CHCl₃)_,메탄올(MeOH)의 순서로 용출시켜 얻은 9개의 소분획들중 6번 소분획을 다시 실리카겔 컬럼을 이용하여 클로로포름-메탄올(7 : 2)로 용출시켜 얻은 분획을 재결정하여 얻는다.

메틸갈레이트는 상기에서 얻은 소분획들 중 9번 소분획을 실리카겔 컬럼을 이용하여 클로로포름-메탄올-물(8 : 2: 0.5)로 용출시켜 얻은 분획을 재결정하여 얻는다.

상기와 같은 방법으로 얻은 기린초 추출물, 그의 분획물 및 그로부터 분리한 화학식 1로 표시되는 신규물질 및 화학식 2로 표시되는 메틸갈레이트 화합물들의 항염증제로서의 효능을 조사하기 위하여, COX-2에 의한 프로스타그란딘 (prostaglandin)E₂(PGE₂) 생성 저해능 및 5-LOX에 의한 류코트리엔(leukotriene) C₄(LTC₄) 생성 저해능을 실험하였으며, 이외에 동물실험으로 이들 물질들의 항염증능 및 항알러지능을 시험하였다.

그 결과, 본 발명에 의한 기린초 추출물, 그의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 화학식 1의 신규물질과 메틸갈레이트가 PGE₂ 생성 저해능 및 LTC₄ 생성 저해능을 보였고, 각종 동물모델을 이용한 in vivo 실험에서도 급성염증, 만성염증, 알러지를 억제하여 유의성 있는 항염증능 및 항알러지능을 보임을 확인하였다.

본 발명에 의한 항염증용 약제학적 조성물은 기린초 추출물, 그의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 화학식 1의 신규물질 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염과 메틸갈레이트 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 하여 경구투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로치제 (troches), 로젠지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 (elixirs)로 제제화되는데, 상기에서 약제학적으로 허용되는 염으로는 포스페이트, 설페이트, 헤미쑥시네이드 염 등이 사용될 수 있다.

정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위하여 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제와 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제 및 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다.

캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명에 의한 항염증용 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부연고제, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다.

비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 이들 추출물 및 분획물 또는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알 단위의 투여형으로 제제한다.

본 발명에 의한 항염증용 약제학적 조성물은 기린초 추출물 및 분획물이 함유된 경우 유효성분을 기준으로 2-500 mg/kg/일의 양을 경구투여할 수 있고, 화학식 1로 표시되는 물질 및 메틸갈레이트가 함유된 경우 유효성분 기준으로 0.2-250 mg/kg/일의 양을 경구투여할 수 있다.

좀더 상세히 설명하면, 항염증제의 유효성분들의 유효량은 1주일 이내의 단기 경구투여의 경우 추출물 및 분획물일 때는 10 - 500 mg/kg/day에서, 단일물질의 경우는 1 - 250 mg/kg/day에서 유효하고, 1개월 이상의 장기 경구투여의 경우 추출물 및 분획물일 때는 2 - 100 mg/kg/day에서, 단일물질의 경우는 0.2 - 50 mg/kg/day에서 유효하고, 경구뿐만 아니라 주사제, 피부연고제 등으로 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예1 내지 실시예 14> (기린초 추출물의 제조)

건조된 기린초(전초) 5.6 kg을 잘게 썰어 냉암소에서 하기의 표 1과 같이 유기용매에 1주일간 침지시킨 후 추출하는 공정을 3회 반복하여 얻은 추출원액을 여과한 후 농축시켜 기린초 추출물을 얻었고, 이중 1g을 취하여 활성검색 시료로 하였다.

<표 1>. 사용한 유기용매의 종류, 사용량 및 기린초 추출물 수득량

구분	유기용매	사용량(ℓ)	기린초추출물 수득량(g)
실시예 1	메탄올	10	221
실시예 2	에탄올	10	215
실시예 3	프로판올	10	137
실시예 4	부탄올	10	142
실시예 5	글리세롤	10	76
실시예 6	프로필렌글리콜	10	89
실시예 7	1,3-부틸렌글리콜	10	98
실시예 8	에틸아세테이트	10	145
실시예 9	벤젠	10	121
실시예 10	헥산	10	136
실시예 11	디에틸에테르	10	108
실시예 12	디클로로메탄	10	145
실시예 13	메탄올-에탄올	10	230
실시예 14	메탄올-에탄올-헥산	10	192

<실시예 15> (에틸아세테이트 분획물의 제조)

상기에서 얻은 기린초 추출물을 분획여두에 취하고 여기에 적당량의 증류수를 가한 후 거의 동량의 헥산으로 2회 분획하고 수층을 다시 에틸아세테이트를 가하여 진탕한 후 방치하고 농축하여 에틸아세테이트 분획물 24.5 g을 얻었고, 이중 1 g을 취하여 활성검색 시료로 사용하였다.

<실시예 16> (부탄올 분획물의 제조)

실시예 15와 같이 실시하되, 수층에 다시 부탄올을 가하고 진탕하고 농축하여 부타올 분획물 89 g을 얻었고, 아중 1 g을 취하여 활성검색 시료로 사용하였다.

<실시예17> (기린초 추출물로부터 신규물질의 분리)

기린초의 부탄올 분획물을 취하여 실리카겔 컬럼에 걸고 CHCl_3,15% MeOH-CHCl_3, 20% MeOH-CHCl_3,MeOH의 순서로 용출시켜 9개의 소분획들을 얻었다. 이들 소분획들 중 6번 소분획을 다시 실리카겔 칼람에 걸어 CHCl₃-MeOH(7:2)으로 용출시켜 얻은 분획을 재결정하여 순수물질을 분리하였는데, 분리한 물질을 NMR 분석한 결과는 다음과 같다.

(헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드)

¹H-NMR (300 MHz, DMSO-d₆) δ 1.71(3H, s, OAc), 4.83(1H, d, J=5.4 Hz, anomeric H of arabinose), 5.35(1H, d, J=7.5 Hz, anomeric H of glucose), 6.30(1H, s, H-6), 6.85(2H, d, J=9.0 Hz, H-3' and 5'), 8.16(2H, d, J=9.0 Hz, H-2' and 6')

¹³C-NMR(75.5 MHz, DMSO-d₆) δ 20.3(OAc), 62.9(C-6''), 64.8(C-5'''), 66.3(C-4'''), 70.0(C-4''), 70.8(C-3'''), 71.8(C-2'''), 74.0(C-2''), 74.2(C-5''), 76.3(C-3''), 99.0(C-6), 101.4(C-1''), 103.9(C-10), 104.5(C-1'''), 115.2(C-3', 5'), 120.9(C-1'), 123.9(C-8), 131.3(C-2', 6'), 133.2(C-3), 148.6(C-9), 156.6(C-7), 156.7(C-5), 157.1(C-2), 160.3(C-4'), 170.0(O=CO), 177.7(C-4)

<실시예18> (기린초 추출물로부터 메틸갈레이트의 분리)

실시예 17과 동일하게 실시하되, 소분획들 중, 9번 소분획을 실리카겔 컬럼 에 걸어 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:2:0.5)로 용출시켜 얻은 분획을 재결정하여 순수물질을 분리하였는데, 분리한 물질을 NMR 분석한 결과는 다음과 같다.

(메틸 갈레이트)

¹H-NMR (300 MHz, CD₃OD) δ7.04(2H, s, H-2 and H-6), 3.81(3H, s, O=COCH₃)

¹³C-NMR (75.5 MHz, CD₃OD)δ121.45(C-1), 110.04(C-2, 6), 146.48(C-3, 5), 139.74(C-4), 169.02(O=CO), 52.26(OCH₃)

<실시예 19> (경구형 정제의 제조)

실시예 1 내지 실시예 16에서 얻은 기린초 추출물, 그의 분획물 또는 실시예 17 내지 실시예 18에서 얻은 순수물질 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다.

이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제하여 유효성분 15 mg이 함유된 정제를 제조하였는데, 상기 정제의 구성성분은 다음과 같다.

유효성분 ............................250 g

락토오스 ............................175.9 g

감자전분 ............................180 g

콜로이드성 규산 ......................32 g

10% 젤라틴 용액 감자전분 ............160 g

활석 .................................50 g

스테아르산 마그네슘 ...................5 g

<시험예 1> (RAW 264.7 세포주에서의 COX-2에 의한 PGE₂ 생성억제 효과)

상기 실시예 1 및 실시예 17 내지 실시예 18에서 얻은 검색시료로 Chi등의 방법 (Biochem. Pharmacol. 61, 1195-1203 (2001))에 따라 ATCC로 부터 구입한 마우스 마크로파지 세포주(mouse macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 1 ug/ml의 리포폴리싸카라이드(lipopolysaccharide ; LPS)와 동시에 검색시료를 첨가하고 24시간 후 유도된 COX-2에 의하여 생성되는 PGE₂의 양을 ELISA법으로 검정하였는데, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

<표 2>. (LPS 처리된 RAW 264.7 세포주에서의 PGE₂ 생성억제 효과)

항 목	농도(㎍/㎖)	저해(%, PGE2)	세포독성
LPS	-	-	-
NS-398	10μM	94*	NC
기린초 메타놀 추출물	5	50*	NC
기린초 메타놀 추출물	25	82*	NC
헥산분획	1	NA	NC
헥산분획	10	7	NC
에틸아세테이트 분획	1	NA	NC
에틸아세테이트 분획	10	26*	NC
부타놀 분획	1	NA	NC
부타놀 분획	10	34*	NC
수용성 분획	1	NA	NC
수용성 분획	10	5	NC
메틸갈레이트	1	30*	NC
메틸갈레이트	10	66*	NC
화학식 1의 유도체	1	3	NC
화학식 1의 유도체	10	37*	NC

n = 3,

NA = Not active,

NT = Not tested,

NC = Not cytotoxic,

* : p < 0.005 에서 LPS-처리군과 유의차 있음

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 기린초 메탄올추출물, 에틸아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물은 PGE₂의 생성을 유의성 있게 억제하였으며, 순수분리된 유도체들도 억제능을 보였는데, 이와 같은 결과는 이들 물질이 COX-2를 저해한다는 것을 의미함을 알 수 있다.

<시험예 2> (마우스 골수유래 비만세포에서의 COX-2에 의한 PGE₂ 생성억제 효과)

문등의 방법(대한약학회지 42, 214-219 (1998))에 따라 숫컷의 BALB/cJ 마우스로부터 골수를 채취하고, 골수유래 비만세포(BMMC)를 분리하였다.

COX-2를 유도하기 위하여 싸이토카인(cytokine)용액을 처리함과 동시에 기린초 메탄올추출물을 12.5 g/ml의 농도로 처리하고 24시간 후 생성되는 PGD₂를 ELISA법으로 측정한 결과, 70%의 저해능을 보여 시험예 1과 유사한 결과를 보이고 있음을 알 수 있었다.

<시험예 3> (s-포스포리파제 A₂에 대한 저해효과)

Horigome등의 방법(J. Biochem. 101, 53-61 (1987))에 따라 랫트(rat) 혈소판으로부터 분리한 s-포스포리파제 A₂(s-Phospholipase A₂; s-PLA₂)에 대하여 기린초 메탄올 추출물 2.5 g/ml의 농도에서 86%의 저해능을 보였다.

<시험예 4> (마우스 BMMC에서의 COX-2 및 5-L0X에 의한 단일분리물질들의 PGD₂ 및 LTC₄ 생성억제능)

시험예 2의 방법에 따라, 실시예 17 내지 실시예 18에서 분리된 유도체들의 저해능을 측정한 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.

<표 3>. 순수분리 물질들의 에이코사노이드(eicosanoid) 생성저해능

구분	COX-2 저해능(%)125 ㎍/㎖	5-LOX 저해능(%)25 ㎍/㎖
메틸 갈레이트	77	98
화학식 1의 유도체	21	19

n = 3,

* : P < 0.005 에서 대조군과 유의차 있음

상기의 표 3에서 보는 바와 같이, 이들 유도체들은 작용의 강도는 다르나, 각각 COX-2 및 5-LOX에 의한 PGD₂ 및 LTC₄의 생성을 억제하고 있음을 알 수 있다.

이상과 같은 결과로 기린초 추출물, 그의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물 및 분리된 유도체들이 세포수준에서 COX-2 및 5-LOX의 작용을 억제하는 것을 확인하였는 바, 이 결과를 바탕으로 다음의 동물 실험을 행하였다.

<시험예 5> (마우스 귀부종 저해능)

Kim등의 방법(Arch. Pharm. Res. 16, 18-24 (1993))에 따라, 숫컷 ICR 마우스의 귀에 2.5% 크로톤유(croton-oil)을 처리하여 부종(edema)를 일으키는 급성염증 모델에서 5시간 후 귀두께를 측정한 검체의 효과는 하기의 표 4와 같다. 이때 검체는 크로톤유 처리 1시간 전에 경구투여하였다.

<표 4>. 마우스 귀부종(Mouse ear edema) 억제효과

항목	귀부종 억제(%)
항목	30 mg/kg	90 mg/kg	270 mg/kg
크로톤유	-	-	-
기린초 메탄올 추출물	13	28*	39*
기린초 에틸아세테이트 분획물	28*	26*	23
기린초 부탄올 추출물	23	29*	30*
화학식 1의 유도체	32*	35*	43*
프레드니솔론(Prednisolone)(10 mg/kg)	54*

n = 5,

* : P< 0.01 에서 크로톤유 처리군과 유의차 있음

상기의 표 4에서 보는 바와 같이, 기린초 추출물 및 분획물과 화학식1의 유도체는 유의성 있는 항염증작용을 보이고 잇음을 알 수 있다.

<시험예 6> (랫트 발부종 저해능)

Winter등의 방법 (Pro. Soc. Exp. Biol. Med. 111,544 (1962))에 따라, SD 랫트의 오른쪽 발에 1% 카라기난(carrageenan) 용액을 투여하고 부종을 5시간 후에 플레씨스모미터(plethysmometer)로 측정하였는데, 그 결과는 하기의 표 5와 같다. 이때 검체는 카라기난 용액투여 1시간 전에 경구로 투여하였다.

<표 5>. (랫트 발부종(rat paw edema) 억제효과)

항목	발부종 억제(%)
항목	10 mg/kg	200 mg/kg	400 mg/kg
카라기난 용액	-(a)	-	-
기린촌 메타놀 추출물		-	24*
프레드니솔론	36*

n = 5,

* : P < 0.01 에서 카라기난 처리군과 유의차 있음,

(a) : Not active

<시험예 7> (아급성 피부염증 모델에서의 저해능)

Park 등의 방법 (Eur. J. Pharmacol. 425, 153-157 (2001))에 따라 아급성 피부염증 모델인 마우스 다중 TPA성 귀부종(multiple-TPA induced ear edema)에 검체를 1일 1회 경구투여하고 저해능을 마우스 귀두께로 측정한 결과는 표 6과 같다.

<표 6>. 아급성 피부염증 억제효과.

항 목		시간(hr)
항 목		12	24	36	48	60
TPA 기린초 메타놀 추출물	50 mg/kg	2	8	-	3	8
	100 mg/kg	17	19*	9	14	11
	200 mg/kg	26*	32*	23*	24*	23*
프레드니솔론	2 mg/kg	25*	10	16	19*	24*

n = 5,

* : P <0.01에서 TPA 처리군과 유의차 있음

<시험예 8> (알러지 모델에서의 저해능)

인 비보(in vivo) 항알러지활성의 검색은 PCA법(Passive Cutaneous Anaphylaxis)으로 행하였다. 이때 항원은 DNP-Ascais 나 DNP-BSA를 Hayashi의 방법으로 만들어 사용하였으며, 항체인 IgE 단일항체(monoclonal antibody)는 Miles사로부터 구입하여 사용하였다.

SD 랫트 (250-300g)의 등에 있는 털을 털깍기로 제거한 후, 항체 (256-520배 희석 용액)를 100 ℓ씩 진피층에 주사한 후 30분 후에 꼬리정맥으로 1 ㎖의 항원함유 0.1% 에반스 블루(Evans blue) 용액을 주사한 다음, 30분 후에 유출된 색소량을 1N-KOH액 1㎖를 가하여 37℃ 에서 하루동안 방치한 후 0.6N 포스페이트 아세톤(phosphate-acetone) 용액(5/13 혼합액) 9㎖를 가하여 진탕한 후 620 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 ** 표시는 p<0.001임을 의미한다.

도 1과 같이 DMSO만 처리한 쥐의 경우 색소유출이 약 42 g/spot이었으나, 본 발명에 의한 기린초 메탄올 추출물을 100 mg/kg의 용량으로 복강 투여한 경우 색소 유출은 25 g/spot로 약 40%의 억제율을 나타내었으며, 200 mg/kg의 용량으로 복강 투여한 경우의 색소유출은 15 g/spot로 약 64%의 억제율을 나타내었다. 따라서, 본 발명에 의한 기린초의 메탄올추출물은 항알러지 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.

<시험예 9> (만성 류마티스 관절염 모델에서의 저해능 (AIA법))

Kim등의 방법 (Planta Med. 65, 465(1999))에 따라, SD 랫트의 오른쪽 발에 마이코박테리움 부티리쿰(Mycobacterium butyricum)을 0.6 mg씩 주사하고 18일 동안 발의 부종을 plethysmometer로 측정하였다. 이때 기린초 메탄올추출물은 매일 1회 50 mg/kg/day의 용량으로 경구투여하였는 바, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 기린초 메타놀추출물은 대조군에 비하여 현저히 낮은 이차감염을 보이고 있어서, 본 발명에 의한 기린초 추출물이 만성염증을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

<시험예 10> (in vivo 급성 독성시험)

본 발명에 의한 기린초 추출물, 그의 분획물 및 상기 추출물로부터 얻은 화학식 1의 화합물과 메틸갈레이트의 독성을 측정하기 위하여 식품의약품안전청 (KFDA)의 규정에 따라 ICR 마우스 및 SD 랫트을 대상으로 경구투여하여 급성독성을 검정하였다.

그 결과 화학식 1의 화합물 및 메틸갈레이트의 경우 500 mg/kg 까지, 기린초 추출물 및 그의 분획물들은 1 g/kg 까지 어떠한 급성독성도 보이지 않았기 때문에, 이들은 상용량에서 무독하다고 판정되었다.

본 발명에 위한 기린초 추출물, 그의 분획물 및 그로부터 얻은 화학식 1 및 메틸갈레이트을 포함한 그의 염들은 COX-2 및 5-LOX에 의해 생성되는 프로스타그란딘 (PG) 및 류코트리엔(LT)의 생성을 억제하여 항염증 효과를 지니고 있다.

본 발명에 의한 물질들은 in vivo에서도 유의적으로 항염증 효과를 나타내기 때문에, 본 발명에 의한 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드, 메틸갈레이트 및 그의 염들과 이들을 함유하는 기린초 추출물 및 그의 분획물과 약제학적 조성물은 급성염증, 류마티스 관절염과 같은 만성염증 및 알러지성 염증질환에 유의적으로 사용할 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드, 메틸갈레이트 및 그의 염들과 이들을 함유하는 기린초 추출물 및 그의 분획물은 화장품의 원료로도 사용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 기린초 추출물의 항알러지 활성,

도 2는 본 발명에 의한 기린초 추출물의 만성염증 억제효과를 나타낸 것이다.

Claims

기린초를 유기용매로 추출하여 얻은 항염증용 기린초 추출물.
제 1항에 있어서,

유기용매는 C1∼C4의 저급알코올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸, 에테르 또는 디클로로메탄으로 구성된 군에 서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합용매 임을 특징으로 하는 항염증용 기린초 추출물.
건조된 기린초를 잘게 절단하여 냉암소에서 유기용매에 5-10일간 침지시킨 후 추출하는 공정을 3회 반복하여 얻은 추출원액을 여과한 후 농축시킴을 특징으로 하는 항염증용 기린초 추출물의 추출방법.
제 3항에 있어서,

유기용매는 C1∼C4의 저급알코올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸아세테이트, 벤젠, 헥산, 디에틸, 에테르 또는 디클로로메탄으로 구성된 군에 서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합용매 임을 특징으로 하는 항염증용 기린초 추출물의 추출방법.
제 1항에 의한 기린초 추출물을 유효성분으로 하는 함유하는 항염증용 약제학적 조성물.
제 1항에 의한 항염증용 기린초 추출물을 증류수로 현탁한 다음 에틸아세테이트 또는 부탄올로 추출하여 얻은 에틸아세테이트 또는 부탄올 분획물.
제 1항에 의한 기린초 추출물로부터 분리한 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염.

<화학식 1>
제 1항에 의한 기린초 추출물에 증류수를 가한 후 다시 부탄올을 가하여 진탕하고 농축시켜 얻은 부탄올 분획물로부터 실리카겔 컬럼분리법으로 얻어진 분획을 재결정함을 특징으로 하는 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드 또는 그의 염의 분리방법.
제 8항에 있어서,

부탄올 분획물을 실리카겔 컬럼을 이용하여 클로로포름_,15% 메탄올-크로로포름_, 20% 메탄올-클로로포름_,메탄올의 순서로 용출시켜 얻은 9개의 소분획들중 6번 소분획을 다시 실리카겔 컬럼을 이용하여 클로로포름-메탄올(7:2)로 용출시켜 얻은 분획을 재결정함을 특징으로 하는 헤르바세틴 3-(6''-아세틸글루코실)-8-아라비노사이드 또는 그의 염의 분리방법.
제 7항에 의한 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약제학적 조성물.
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제5항 또는 제10항의 약제학적 조성물을 포함하는 염증질환치료제.
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