KR101002215B1 - 해면동물 포바스 구쿨렌시스로부터 추출된 신규화합물인 구쿨레닌 ａ와 ｂ, 이의 분리방법 및 이를 이용한 항암제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해면동물인 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)로부터 추출된 하기 화학식 1로 표시되는 신규화합물 구쿨레닌(gukulenin)과 이들 물질의 추출 및 분리방법, 그리고 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

[화학식 1]

[상기 식에서, R은 C(=O)H 또는 CH₂OH 이다.]

구쿨레닌, 항암제, 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)

Description

해면동물 포바스 구쿨렌시스로부터 추출된 신규화합물인 구쿨레닌 Ａ와 Ｂ, 이의 분리방법 및 이를 이용한 항암제 {NOVEL COMPOUNDS, GUKULENIN A AND B FROM A MARINE SPONGE(PHORBAS GUKULENSIS) AND METHOD FOR ISOLATING THE SAME AND ANTICANCER CONTAINING THE SAME}

본 발명은 해면동물인 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)로부터 추출된 신규화합물 구쿨레닌 A 및 B와 이들 물질의 추출 및 분리방법, 그리고 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

미국 암학회는 2007년 보고서에서 2007년 한해동안 전세계적으로 1200만 명의 암환자가 새로 발생했으며, 760만명의 환자가 사망한 것으로 예상된다고 발표하였다. 이와 같이 암은 인간의 생명을 계속해서 위협하고 있다. [Global Cancer Facts & Figures 2007, American Cancer Society]

예를 들어 신장암은 선진국에서 여섯 번째로 빈번한 사망원인으로[Eur . J. Cancer, 2008. Sep 8. e-pub ahead of print], 신장암의 경우 미국에서만도 매년 3만8천 명의 환자가 새로이 보고되고 있다[CA . Cancer J. Clin . 2006, 56, 106]. 신장암이 발생하면 30% 이상이 전이가 되며, 수술로 절제를 하였다 해도 40% 이상의 환자에게서 재발한다[World J. Urol . 2005, 23, 202; N. Eng . J. Med . 1996, 335, 865; Urol. Clin . North Am . 2003, 30, 843]. 일단 전이가 된 환자의 경우 평균생존기간은 1년 남짓으로 매우 짧으며, 5년간 살 확률은 21% 밖에 되지 않는다[Eur . J. Cancer, 2008. Sep 8. e-pub ahead of print]. 신장암은 과거에 알려진 세포독성 화학적 요법에 저항성을 가지기 때문에, 인터류킨-2 또는 인터페론 알파를 이용한 면역적 요법을 사용했으나 이들 사이토킨들에 대한 반응은 5-20%로 매우 낮으며 환자들의 평균 생존기간도 12개월 정도에 불과하다[J. Clin . Oncol . 2005, 23, 2877]. 그러나 최근 신장암의 발병에 대한 연구가 진행됨에 따라 bevacizumab, sorafenib, sunitinib와 temsirolimus 등이 의학적으로 사용되고 있다[Eur . J. Cancer 2008, 44, 2152]. 직장암에 대한 처방으로 2004년에 미식약청에 승인을 받은 bevacizumab은 신장암에 대해 8.5개월 정도의 진행억제효과를 보였을 뿐이며 25.5% 정도의 환자만이 그 효과를 보였다. 또한 고혈압, 식욕부진, 피로, 단백뇨증의 부작용이 보고 되었다[Eur . J. Cancer 2008, 44, 2152]. 신장암과 간암에 대해 의학적 사용이 승인되어있는 sorafenib는 신장암에 대해 5.5개월의 진행억제효과를 보였으나, 갑상선 기능이상, 설사, 발진, hand-foot syndrome, 고혈압 등의 부작용이 보고 되었다[N. Eng . J. Med. 2007, 356, 125; J. Natl . Cancer Inst . 2007, 99, 81; Ann . Oncol . 2008, 19, 265]. Sunitinib는 신장세포암과 imatinib-resistant 위암에 대한 처방약으로 2006년 FDA에 의해 승인되었는데, 11개월의 진행억제효과만을 보였으며 좌심실기능이상, 타이로이드 기능이상, 설사, 고혈압, hand-foot syndrome, 호중구감소증, 혈소판감소증의 부작용이 보고되어 있다[N. Eng . J. Med. 2007, 356, 115; J. Natl . Cancer Inst . 2007, 99, 81; Ann . Oncol . 2008, 19, 265]. 2007년 FDA에 의해 승인된 temsirolimus는 대략 10.9 개월의 생명연장효과를 보였다. 하지만 7-11% 정도의 환자만이 이 약물에 반응을 보였다[N. Eng . J. Med. 2007, 356, 2271].이들 약물들은 극소수의 환자들에게만 효과가 있을 뿐 아니라 효과가 있어도 만족스럽지 못하고 부작용이 매우 커서 투약이 힘든 경우가 대부분이다.

이에 새로운 구조를 가진 강력한 항암물질의 개발이 필요하다.

본 발명자들은 암세포에 대한 항암활성물질을 찾던 중, 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)에서 추출된 신규화합물 구쿨레닌 A와 B가 다양한 암세포주에 대해 항암활성을 가지는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규화합물 구쿨레닌 A와 B를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)로부터 신규화합물인 구쿨레닌 A와 B를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 구쿨레닌 A와 B를 함유하는 항암제를 제공하는 것이다.

본 발명은 신규화합물로 하기 화학식 1로 표시되는 구쿨레닌(gukulenin) A (R = C(=O)H) 및 B (R = CH₂OH), 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)로부터 신규화합물인 구쿨레닌을 분리하는 방법 및 이를 포함하는 항암제에 관한 것이다.

[화학식 1]

[상기 식에서, R은 C(=O)H 또는 CH₂OH 이다.]

본 발명에 따른 구쿨레닌 A 및 B는 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)로부터 분리되어지며, 상기 구쿨레닌은 해양에 서식하는 해면동물인 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)를 동결 건조하여 수분을 완전히 제거한 후, 메탄올로 추출하여 감압하에서 용매를 증발시킨 후, 그 잔류물을 디클로로메탄과 물로 분배추출하여 얻어진 디클로로메탄 층의 용매를 증발시킨 후 이를 다시 메탄올과 n-헥산으로 분배 추출하고 얻어진 메탄올 층의 용매를 다시 증발시킨 잔류물로부터 분리되는 것으로, 상기 잔류물은 메탄올과 물의 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 C18 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제된 후 아세토니트릴과 물의 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 2차 정제되어 구쿨레닌 A 및 B가 각각 수득되어진다.

본 발명에서 사용한 암세포주는 독소루비신과 같은 기존의 항암제에 대해 효 과를 보이는 경우가 아주 낮으며 치료효과 또한 크지 않다.

본 발명에 따른 활성화합물인 구쿨레닌 기준으로 통상 0.0001 mg/Kg 내지 1000 mg/Kg 정도이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 다양하게 조절될 수 있으며, 투여방법은 알약, 캡슐, 가루형태, 용액 및 항문투여가 가능한 좌약 형태로서, 경구(예, 정제, 캡슐, 파우더 및 물약), 주사(예, 정맥, 안구, 복강, 및 근육), 및 국소 투여(예, 팅크, 크림, 로션, 겔, 스프레이, 물약, 및 붕대)로 투여할 수 있으나, 경구투여가 더 바람직하다. 본 발명에 따른 항암제의 경구투여 경우 기존의 모든 다양한 형태로 제조가능하며 예를 들어 정제, 분말제, 건조시럽, 씹을 수 있는 정제, 과립제, 츄잉정, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 드링크제, 설하정 등의 여러 가지 형태로 존재할 수 있다. 분말제인 경우는 유효성분의 양이 0.01 내지 99.9중량% 등으로 본 조성물의 제형에 따라 합리적인 방법으로 함량을 적용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항암제는 제어된 방출을 위하여 임플란트, 경피패치, 또는 캡슐로 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 정제는 유효량으로 생체이용성이 있는 임의의 형태 또는 방식, 즉, 경구경로로 환자에게 투여될 수 있으며, 치료하려는 질병 상태의 특성, 질병의 단계, 및 그 밖의 관련 사정에 따라 적합한 투여 형태 또는 방식을 용이하게 선택할 수 있으며, 본 발명에 따른 항암제가 정제인 경우 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함 할 수 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정된다. 더욱 상세하게는, 본 발명에 따른 조성물은 치료적 유효량의 상기 기술된 활성성분을 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 필수 성분으로 포함할 수 있다. 부형제 물질은 활성성분의 비히클 또는 매체로서 기능할 수 있는 고형 또는 반고형 물질일 수 있으며, 적합한 부형제는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 부형제 물질은 의도된 투여 형태와 관련하여 선택될 수 있으며, 구체적으로는 정제, 분말제, 씹을 수 있는 정제, 과립제, 츄잉정, 캡슐제, 연질캡슐제, 환제, 설하정 또는 시럽형태의 경우, 치료학적 활성 약물 성분은 락토오스 또는 전분과 같은 임의의 경구 비독성의 약제학적으로 허용되는 비활성 부형제와 배합될 수 있다. 임의로, 본 발명의 약제학적 정제는 비정질 셀룰로오즈, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제, 알긴산과 같은 붕해제, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제, 콜로이드성 실리콘 디옥사이드와 같은 글라이던트(glidant), 수크로오즈 또는 사카린과 같은 감미제, 페퍼민트 또는 메틸 살리실레이트와 같은 착색제 또는 착향제를 또한 함유할 수 있다. 투여가 용이하기 때문에 정제는 가장 유리한 경구용 단위 제형이 될 수 있으며, 필요에 따라 정제는 표준 수성 또는 비수성 기술에 의해 당, 쉘락(shellac) 또는 그 밖의 장용 코팅제로 코팅될 수 있으며, 각각의 정제 또는 캡슐은 약 10 mg내지 200 mg의 유효성분을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 구쿨레닌 A 및 B는 신규화합물로, 해양해면류 포바스 구쿨렌 시스로부터 추출되며, 각종 암세포주에 대해 항암 활성을 가지므로, 새로운 항암제로서 유용하다.

[실시예]

신규화합물 구쿨레닌 A 및 B는 하기 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리되었다. 동물시료는 한국 남해 가거도 해안 수심 30m 에서 채집되었다. 세포독성은 MTT 분석으로 측정되었고, 구쿨레닌 A 및 B는 다양한 암세포주에 대해 강력한 억제효과를 보였다.

[ 실시예 1] 구쿨레닌 A 및 B의 추출 정제

해양에서 채취한 즉시 냉동 보관된 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(1.2 kg, 습식무게)를 해동시키고 잘게 썰어 동결 건조하여 수분을 완전히 제거하였다. 상기 시료는 4 L의 메탄올로 12시간씩 3차례 추출하였다. 감압 하에서 용매를 증발시키고 140 g의 잔류물을 얻었다. 상기 잔류물을 물과 디클로로메탄 용매로 분배 추출하여, 이 중 디클로로메탄 층을 감압 하에 증발시킨 다음, 그 잔류물을 다시 85% 수성메탄올과 노말 헥산으로 분획하였다. 85% 수성메탄올 층은 C18 역상 플래시 칼럼 크로마토그래피 상에서 물과 메탄올의 단계구배 용매시스템으로 분획하였다. 이 중 90% 메탄올로 용출된 분획을 C-18 역상 고성능 액체크로마토그래피(YMC ODS-A C-18, 입자직경 5um, 250 × 10 mm, 굴절률검출기, 용출 속도 2.0 ml/min) 상에서 80% 수성 아세토니트릴을 용출용매로 사용하여 최종 정제하여 머무름시간 52 분에서 구쿨레닌 A 23mg와 머무름시간 43 분에서 구쿨레닌 B 7.0mg을 수득하였다.

[ 실시예 2] 구쿨레닌 A와 B의 평면구조 및 입체 구조 결정

상기 얻어진 신규화합물 구쿨레닌 A 및 B의 평면 화학구조는 HRFABMS 실험결과와 ¹H-NMR(Nuclear Magnetic Resonance;핵자기공명), ¹³C-NMR, DEPT, COSY, HSQC 및 HMBC 실험을 통하여 결정하였고, 상대적 입체화학구조는 ROESY 실험을 통해 결정하였다. 구쿨레닌 A의 절대적 입체화학구조는 모셔법(Mosher)을 통해 결정하였으며, 구쿨레닌 B의 절대적 입체화학구조는 구쿨레닌 A와 원이색성분광스펙트럼(circular dichroism spectroscopy)을 분석하여 결정하였다.

(1) 구쿨레닌 A

구쿨레닌 A는 노란빛의 가루 형태이며, HRFABMS([M+H]⁺ 이온피크 m/z = 719.3792)를 이용하여 분자식 C₄₂H₅₄O₁₀을 결정하였다. 디메틸설폭사이드-d ₆ 을 이용한 구쿨레닌 A의 ¹³C NMR 스펙트럼과 DEPT 실험으로부터 42개의 탄소피크들을 확인하였다. 이들은 각각 9개의 메틸(methyl), 5개의 메틸렌(methylene), 12개의 메틴(methine), 12개의 치환된 이중결합 탄소 및 4개의 완전히 치환된 단일결합 탄소로 밝혀졌다. 구쿨레닌 A의 수소 NMR 스펙트럼(아세톤-d ₆ )에서 총 4개로 적분되는 세 개의 수산기의 수소 신호가 나타났으며, 수산기의 존재는 IR 스펙트럼에서 나타 난 3375 cm^-1로 입증되었다. 또한 구쿨레닌 A는 IR 스펙트럼 1616 cm^-1과 1723 cm^-1에서 확인된 바와 같이 카르보닐기를 가지고 있음을 확인하였다. 그 외 COSY, HSQC, HMBC 실험결과를 분석하여 사중 고리 A-D에 대한 부분구조를 결정하였다.

화학구조 분석에 대하여 간단히 살펴보면, 다음과 같다. 수소 NMR 스펙트럼 (DMSO-d₆) 상의 0.20 ppm과 0.56 ppm에서 나타나는 두 개의 메틸 수소의 신호로부터 시작하여 COSY 스펙트라 상의 연속된 수소-수소 간의 교차피크를 해석하여 고리 A 부분구조를 밝혔다. 또한 COSY 실험 결과 1,2-디옥시젠 에틸 부분구조 (C-1～C-2 부분구조)가 존재함을 밝혔다. H-15/C-2의 HMBC 상관관계로부터 1,2-디옥시젠 에틸 부분구조가 C-3 탄소에 연결되었음을 확인하였다. 이 부분구조와, HMBC 상관관계의 조합을 통해 7개의 사차탄소를 가진 고리 B-D도 결정되었다. H-1로부터 두 개의 사차 sp² 탄소인 C-8, C-13으로의 HMBC 상관관계와 H-7로부터 세 개의 사차 sp² 탄소인 C-8, C-9, C-14로의 HMBC 상관관계의 분석을 통해 육각형 고리 B를 결정하였다. 또한, H-19와 C-8, C-9, C-10의 HMBC 상관관계, H-12'에서부터 C-10, C-11, C-14로 연결되는 HMBC 상관관계로부터 고리 B에 메틸 트리폴론 기가 혼합된 고리 C가 연결되어 있음을 알 수 있다. 이는 H-20에서 C-12, C-13, C-14로의 HMBC 상관관계와 ¹³C NMR 스펙트럼에서 C-10과 C-11의 화학적 이동이 각각 168.1 ppm, 167.8 ppm인 것을 통해서도 입증된다. 에테르 결합을 통한 4.75 ppm의 H-1 옥시메틴의 수소와 97.4 ppm(C-21)의 헤미케탈기 사이의 HMBC 상관관계도 관찰되었다. 이 모든 상관관계와 함께 부가적으로 7.13 ppm(OH-21)의 수소로부터 47.2 ppm의 C-20의 메틸렌 탄소를 잇는 상관관계로부터 사중 고리 A-D의 부분구조를 완성할 수 있었다. 다른 사이클로펜탄과 메틸 트리폴론 고리는 남은 신호들 간의 COSY와 HMBC를 통해 확정하였다. 이 경우, H-7'은 HMBC 스펙트라 상에서 C-8'과 C-9'에 위치한 두 개의 sp² 사차탄소와, 그리고 C-14' 위치에 있는 한 개의 메틴 sp² 탄소와 상관관계를 가지고 있으며, 이로부터 칠각형 고리 E 의 C-8' 과 사이클로펜탄의 C-7'을 서로 연결지을 수 있었다. 고리 E-F의 C-13'과 앞에서 언급한 고리 A-D의 C-21과의 연결은 7.45 ppm 위치의 H-12'와 6.82 ppm 위치의 H-14', 두개의 수소들로부터 97.4 ppm 의 C-21과 147.9 ppm의 C-13'에 위치한 탄소들을 잇는 HMBC 상관관계를 통해 확인되었다. 마지막으로, 하나 남은 1.05 ppm의 H-15'는 고리 F에 있는 C-2'의 옥시메틴 탄소와 C-3', C-4', C-7' 세 개의 탄소와 상관관계를 하고 있었다. 이로부터 구쿨레닌 A의 평면구조를 결정하였다.

구쿨레닌 A의 키랄 중심들의 상대적 입체화학구조는 ROESY 스펙트라 분석을 통해 결정하였다. ROESY 스펙트라 상의 H-15/H-7과 H-15/H-2 간 교차피크와 H-4β/H-1의 교차피크는 A/B 고리 연결이 cis 형태임을 입증하였다. 또한 ROESY 스펙트라 상의 H-1/H-20β, H-1/OH-21, H-20β/OH-21의 교차피크는 고리 A-D의 이 세 개의 수소들이 같은 방향으로 있다는 것을 나타내었다. 이는 ROESY 스펙트라 상의 H-20α/H-12 간 교차피크에 의해서도 입증되었다. 고리 E와 고리 F사이의 배열은 공간적 방해로 인해 회전이 자유롭지 못하여 각 고리들 간의 ROESY 스펙트라 상의 교 차피크를 분석하여 결정할 수 있었다. ROESY 스펙트라 상에서 고리 E에 있는 H-14'는 고리 F에 있는 H-2', H-4'β, H-5'β와 교차피크가 있는 것으로 관찰되었고, H-7'/H-6', H-7'/H-1', H-7'/H-19'의 ROESY 교차피크가 관찰된 것으로부터 H-6', H-7', H -15'는 고리 F의 반대쪽 면에 있다는 것을 입증하였다. 또한 ROESY 상의 H-2'/H-1', H-2'/H-4'β, H-2'/H-14'가 보이는 교차피크와 H-1'/H-4'α, H-1'/H-15'가 보이는 교차피크는 C-2'의 상대적 입체화학구조를 결정하는데 도움을 주었다.

C-2의 키랄 중심의 절대적 입체화학구조는 모셔법을 통해 결정할 수 있었다. 모셔법에 의거하여, 구쿨레닌 A를 R/S-MTPA-Cl을 이용하여 에스테르화 반응을 시키고 각 반응물인 구쿨레닌A 의 S-tri-MTPA 에스테르 유도체와 R-tri-MTPA 에스테르 유도체의 ¹H NMR 스펙트럼을 측정하여 각 수소의 화학적 이동 차이를 도 3과 같이 계산하였다. 이 결과로부터 C-2 위치의 절대적 입체화학구조가 R 에 해당한다는 것을 밝혔다.

구쿨레닌 A : ¹H NMR (500 MHz, 디메틸설폭시드-d ₆) δ 9.43 (s, 1H), 7.45 (s, 1H), 7.13 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 5.16 (d, 1H, J = 3.4 Hz), 4.75 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 4.29 (s, 1H), 3.69 (d, 1H,J = 9.3 Hz), 3.39 (dd, 1H, J = 9.3, 3.4 Hz), 3.35 (m, 1H), 3.27 (d, 1H, J = 15.2 Hz), 3.11 (d, 1H, J = 15.2 Hz), 2.43 (s, 3H), 2.41 (s, 3H), 2.39 (m, 1H), 2.33 (m, 1H), 2.14 (ddd, 1H, J = 12.7, 6.4, 6.4 Hz), 2.08 (m, 1H), 1.94 (m, 1H), 1.88 (s, 3H), 1.67 (dddd, 1H, J = 12.7, 6.4, 6.4, 6.4 Hz), 1.60 (ddd, 1H, J = 13.7, 9.3, 3.4 Hz), 1.38 (m, 1H), 1.31 (s, 3H), 1.29 (m, 1H), 1.14 (m, 1H), 1.05 (s, 3H), 1.02 (m, 1H), 0.56 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.52 (m, 1H), 0.39 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.37 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.20 (d, 3H, J = 6.9 Hz). ¹³C NMR (125 MHz, 디메틸설폭시드-d ₆) δ 199.2, 175.6, 168.7, 168.0, 167.7, 162.1, 149.3, 147.9, 147.3, 141.0, 140.4, 139.0, 132.4, 124.5, 123.6, 115.6, 97.4, 82.4, 75.6, 72.4, 56.2, 55.5, 51.0, 49.9, 49.7, 47.2, 43.8, 33.7, 33.3, 30.4, 29.9, 29.6, 26.5, 26.4, 24.6, 23.9, 22.3, 21.3, 20.0, 18.8, 18.6, 18.1

(2) 구쿨레닌 B

구쿨레닌 B는 노란색 가루형태로, HRFABMS ([M+H]⁺ 이온 피크 m/z = 721.3956) 결과로부터 분자식이 C₄₂H₅₆O₁₀으로 결정되었다. UV, 1차원과 2차원 NMR 결과 분석을 통해, 구쿨레닌 B는 구쿨레닌 A와 구조적 유사성을 보였으며, 단 하나의 작용기가 다름을 보였다. 구쿨레닌 A의 ¹H NMR 스펙트럼 상에서 확인되었던 9.43 ppm의 알데히드 피크의 소실, 보이지 않았던 3.41 ppm 과 3.30 ppm, 그리고 ¹³C NMR 스펙트럼 상의 61.1 ppm 피크의 출현을 통하여, 고리 F의 1'위치에 있는 알데히드기가 히드록시메틸렌기로 환원된 것임을 확인되었다. 구쿨레닌 B의 상대적 입체화학구조는 구쿨레닌 A와 동일한 방법으로 ROESY 스펙트라 결과분석을 통해 결정하였으며, 두 물질이 유사한 원이색성분광스펙트럼을 보이는 것으로부터 절대 입체 화학구조가 같음을 확정하였다.

구쿨레닌 B : ¹H NMR (500 MHz, 디메틸설폭시드-d ₆) δ 7.37 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.80 (s, 1H), 4.97 (d, 1H, J = 3.4 Hz), 4.72 (d, 1H, J = 9.3 Hz), 4.20 (dd, 1H, J = 6.4, 4.4 Hz), 3.67 (d, 1H, J = 9.8 Hz), 3.41 (dd, 1H, J = 12.2, 4.4 Hz), 3.37 (dd, 1H, J = 9.3, 3.4 Hz) 3.30 (dd, 1H, J = 12.2, 6.4 Hz), 3.26 (d, 1H, J = 7.8 Hz) 3.23 (d, 3H, J = 15.2 Hz), 3.07 (d, 1H, J = 15.2 Hz), 2.41 (s, 3H), 2.34 (s, 3H), 2.32 (m, 1H), 2.11 (ddd, 1H, J = 12.7, 6.4, 6.4 Hz), 2.07 (m, 1H), 1.92 (m, 1H), 1.79 (m, 1H), 1.76 (s, 3H), 1.65 (dddd, 1H, J = 12.7, 6.4, 6.4, 6.4 Hz), 1.43 (ddd, 1H, J = 13.2, 9.3, 3.4 Hz), 1.38 (m, 1H), 1.29 (s, 3H), 1.26 (m, 1H), 1.17 (s, 3H), 1.05 (m, 1H), 0.54 (d, 3H, J = 6.9 Hz), 0.52 (m, 1H), 0.38 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.36 (d, 3H, J = 6.4 Hz), 0.19 (d, 1H, J = 6.4 Hz). ¹³C NMR (125 MHz, 디메틸설폭시드-d ₆) δ 175.7, 168.8, 168.1, 167.8, 162.0, 150.5, 147.6, 147.5, 141.0, 140.4, 138.9, 132.8, 125.5, 123.6, 115.4, 97.5, 77.4, 75.7, 72.4, 61.1, 56.3, 55.6, 51.5, 51.1, 50.7, 47.4, 44.0, 34.9, 33.4, 30.4, 29.9, 29.2, 26.7, 26.6, 24.3, 24.0, 22.5, 21.4, 21.1, 19.0, 18.7, 18.3.

[ 실험예 1] 다양한 암세포주에 대한 항암활성과 정상세포주에 대한 세포독성 측정

암세포주에 대한 항암활성 측정을 위해 SN12C(신장암세포주), SK-N-SH(뇌암세포주), MKN-45(위암세포주), HepG2(간암세포주), KB(상피암세포주), FaDu(근육암세포주), A549(폐암세포주), AML12(쥐류 간암세포주), DU145(전립선암세포주), HCT116(결장암세포주) 세포주를 이용하였다. 세포는 5% 이산화탄소가 포함된 37℃ 세포 배양기에서 DMEM 배지에 배양되었다. 배지에는 10% 우태아혈청(FBS), 100 μg/ml의 페니실린 그리고 100 mg/ml의 스트렙토마이신이 포함되었다. 실험 첫날 해당 세포를 96 웰(well) 플레이트(plate)에 접종하였다. 둘째 날 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹아있는 구쿨레닌 A와 B를 배지를 이용하여 희석한 후, 접종된 세포에 0.1, 1.0, 10, 100, 1000, 10000, 50000 nM의 농도로 처리하였다. 음성대조군으로서는 디메틸설폭시드를 최종농도 1%가 되도록 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후, 엠티티(MTT) 시약을 세포에 최종농도 1 mg/ml로 첨가하였다. 엠티티(MTT)는 물에 용해되는 노란색의 물질이나, 살아있는 세포에 유입될 경우 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 물에 용해되지 않는 보라색의 결정으로 변성된다. 1시간 후, 생성된 보라색의 결정을 디메틸설폭시드(DMSO)에 용해시킨 다음, 엘라이자 리더(ELISA reader)를 사용하여 570 nm의 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 살아있는 세포수를 나타내어 이를 통해 구쿨레닌 A와 B, 그리고 상용화된 항암제인 액티노마이신 D, 파클리타셀 및 독소루비신의 항암활성을 확인하였으며, 그 일부에 대하여 하기 표 1에 IC₅₀값을 나타내었다.

[표 1] 구쿨레닌 A 및 B의 암세포에 대한 항암활성

본 발명에서 얻어진 구쿨레닌 A 및 B에 대한 항암활성에 대한 측정실험 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 상용화된 항암제인 독소루비신에 비해 뛰어난 활성을 지니고 있었다. 특히 구쿨레닌 A는 독소루비신에 비해 신장암세포주에 대해 우수한 항암활성을 보였다.

또한, 구쿨레닌 A는 상용화된 항암제인 액티노마이신 D에 비해 신장암세포주 및 결장암세포주에 대한 우수한 항암활성을 보였으며, 구쿨레닌 B는 상용화된 항암제인 파클리타셀에 비해 FaDu(근육암세포주)에 대하여 우수한 항암활성을 보였다.

도 1은 구쿨레닌 A의 COSY 및 HMBC 상관관계와 그 평면구조를 나타낸다.

도 2는 구쿨레닌 A의 ROESY 상관관계와 상대적 입체화학구조를 나타낸다.

도 3은 구쿨레닌 A의 S/R-tri-MTPA 에스테르 유도체의 수소들이 ¹H NMR 스펙트럼에서 보이는 화학적 이동 차이를 나타낸다.

도 4. 구쿨레닌 A(-)와 구쿨레닌 B(··)의 원이색성분광 스펙트럼(c=0.0005 gcm^-3)을 나타낸다.

Claims (4)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 구쿨레닌(gukulenin).

   [화학식 1]

   

   [상기 식에서, R은 C(=O)H 또는 CH₂OH 이다.]
2. 동결 건조된 해양해면류 포바스 구쿨렌시스(Phorbas gukulensis)을 메탄올로 추출하여 감압하에서 용매를 증발시킨 후, 디클로로메탄과 물로 분배추출하여 얻어진 디클로로메탄 층의 용매를 증발시킨 후 이를 다시 메탄올과 n-헥산으로 분배 추출하고 얻어진 메탄올 층의 용매를 다시 증발시킨 잔류물로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1로 표시되는 구쿨레닌의 추출방법.

   [화학식 1]

   

   [상기 식에서, R은 C(=O)H 또는 CH₂OH 이다.]
3. 제 2항에 있어서,

   상기 잔류물은 90% 메탄올 및 물 10%로 이루어진 용리액을 사용하여 C18 역상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제된 후, 용출속도 2 mL/분 기준으로 80% 아세토니트릴 및 20% 물로 이루어진 용리액을 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 2차 정제되어 머무름 시간 52 분에 구쿨레닌 A(R = C(=O)H) 및 머무름 시간 43 분에 구클레닌 B(R = CH₂OH)가 수득되는 것을 특징으로 하는 구쿨레닌의 추출방법.
4. 하기 화학식 1로 표시되는 구쿨레닌(gukulenin)을 유효성분으로 함유하는 항암제.

   [화학식 1]

   

   [상기 식에서, R은 C(=O)H 또는 CH₂OH 이다.]

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