KR101437883B1 - 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서 신규한 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따르면, 세포 독성 없이 신경세포의 염증유발 물질 생성 및 활성을 효과적으로 억제함으로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 치료 또는 예방 효과가 뛰어난, 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 이용할 수 있다.

Description

헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition containing hexacyclic diamine alkaloid compound as active ingredient for prevention or treatment of neurodegenerative disease}
본 발명은 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 신경세포의 염증유발 물질 생성을 억제하는 효과로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료하는, 신규한 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
1986년에 맨자민 A(manzamine A)가 발견된 이래, 수많은 매크로사이클릭 다이아민 알칼로이드가 해양해면류로부터 분리되어 연구되었다(Sakai, R.; Higa, T.; Jefford, C. W.; Benardinelli, G. J. Am . Chem . Soc ., 1986, 108, 6404-6405., Rodriguez, J. Studies in Natural Products Chemistry, Vol. 24; Elsevier, 2000, pp 573-681., Jimenez, J.; Goetz, G.; Mau, C. M. S.; Yoshida, W.; Scheuer, P. J.; Williamson, R. T.; Kelly, M. J. Org . Chem., 2000, 65, 8465-8469., Jang, K. H.; Kang, G. W.; Jeon, J.-E.; Lim, C.; Lee, H.-S.; Sim, C.-J.; Oh, K.-B.; Shin, J. Org . Lett., 2009, 1713-1716.). 대부분의 알칼로이드들은, 3-알킬피리딘 또는 환원된 3-알킬피리딘으로부터 생합성된 것으로 조사되었고, 다양한 구조를 가지며 생물적 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다. 이들이 나타내는 전례없던 스캐폴드(scaffold) 구조로 인한 생물적 활성은, 약리적 작용을 나타내는 새로운 치료제로서의 응용가능성을 시사하며, 따라서 이들의 활성과 반응기작을 연구함으로써 새로운 치료제로 응용하려는 노력이 끊임없이 경주되고 있다(Toma, T.; Kita, Y.; Fukuyama, T. J. Am . Chem . Soc ., 2010, 132, 10233-10235. , Garg, N. K.; Hiebert, S.; Overman, L. E. Angew . Chem ., Int . Ed., 2006, 45, 2978-2981. , Defant, A.; Mancini, I.; Raspor, L.; Guella, G.; Turk, T.; Sepcic, K. Eur . J. Org . Chem., 2011, 3761-3767.).
본 발명자는 해양해면류로부터 추출된 신규한 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체가 신경세포의 염증유발 물질 생성을 억제하는 효과로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 신경세포의 염증유발 물질 생성을 억제하는 효과가 뛰어난, 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 상기 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 세 번째 과제는 상기 약학적 조성물 또는 식품 조성물이 유효성분으로 포함하는, 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체의, 천연물로부터의 추출방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여,
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1] [화학식 2]
Figure 112012085234212-pat00001
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 약학적 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 경구용 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액체, 현탁제, 에멀젼 또는 캡슐제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 비경구용 제제는 주사제, 경직장용 제제 또는 경피용 제제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면,
상기 약학적 조성물에 포함된 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
δc 값 25 내지 32, 36 내지 39, 47 내지 50, 55 내지 57, 58 내지 60, 67 내지 69, 75 내지 77, 95 내지 97, 112 내지 114, 126 내지 128, 129 내지 133, 134 내지 136, 137 내지 139, 및 189 내지 191 ppm에서 피크가 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면,
상기 약학적 조성물에 포함된 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
δc 값 23 내지 30, 35 내지 37, 46 내지 48, 57 내지 59, 64 내지 68, 77 내지 79, 93 내지 97, 111 내지 113, 125 내지 127, 129 내지 132, 137 내지 139, 및 187 내지 190 ppm에서 피크가 나타날 수 있다.
본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여,
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는, 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
[화학식 1] [화학식 2]
Figure 112012085234212-pat00002
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 정제, 환제, 캡슐제, 또는 액제일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면,,
상기 식품 조성물에 포함된 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
δc 값 25 내지 32, 36 내지 39, 47 내지 50, 55 내지 57, 58 내지 60, 67 내지 69, 75 내지 77, 95 내지 97, 112 내지 114, 126 내지 128, 129 내지 133, 134 내지 136, 137 내지 139, 및 189 내지 191 ppm에서 피크가 나타날 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면,
상기 식품 조성물에 포함된 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
δc 값 23 내지 30, 35 내지 37, 46 내지 48, 57 내지 59, 64 내지 68, 77 내지 79, 93 내지 97, 111 내지 113, 125 내지 127, 129 내지 132, 137 내지 139, 및 187 내지 190 ppm에서 피크가 나타날 수 있다.
본 발명은 상기 세 번째 과제를 달성하기 위하여,
a) 해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라(Haliclona densaspicula)로부터 액상의 혼합물을 추출하는 단계; 및
b) 상기 혼합물을 분획하여 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표기되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 분리 및 정제하는 단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 추출방법을 제공한다.
[화학식 1] [화학식 2]
Figure 112012085234212-pat00003
본 발명의 일 실시예에 따르면,
상기 a)단계는,
동결 건조된 해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라를 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 1 내지 5 회 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면,
상기 b) 단계는,
추출된 혼합물을 다이클로로메탄 및 물이 섞인 용매로 분획하는 단계; 상기 분획된 용액 중 다이클로로메탄 용매를 증발시키는 단계; 남겨진 용액을 헥산 및 수성메탄올이 섞인 용매로 분획하는 단계; 및 수성메탄올로 분획된 잔류물로부터 크로마토그래피를 이용하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 분리 및 수득하는 단계;를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면,
상기 수성메탄올로 분획된 잔류물로부터 크로마토그래피를 이용하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 분리 및 수득하는 단계는,
상기 잔류물을 역상 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 상에서 물과 메탄올의 단계구배 용매시스템으로 분획한 뒤, 70% 메탄올 및 30% 물로 용출된 용액을 수득하는 단계;
상기 수득된 용액을, 100% 메탄올을 용출 용매로 사용하고 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH20)를 이용하여 다섯 개의 영역으로 다시 분획하여 그 중 네 번째로 용출된 용액을 분리 수득하는 단계; 및
상기 네 번째로 용출된 용액을, 농도 구배가 형성된 CH3CN - H2O 용매(CH3CN 20% 2 분; CH3CN 30% 8 분; CH3CN 30% 13 분; CH3CN 40% 20 분; CH3CN 40% 30 분; CH3CN 100% 35 분)를 이용하여 역상 고성능 액체크로마토그래피(C6-페닐 컬럼, 250 mm x 4.6 mm ID, 5mm; UV 디텍터 300nm, 용출 속도 1 mL/min)를 수행함으로써 상기 화학식 1(12 mg, t R 18 분) 또는 화학식 2(8 mg, t R 26 분)로 표시되는 황색 오일상의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 세포 독성 없이 신경세포의 염증유발 물질 생성을 효과적으로 억제함으로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 치료 또는 예방 효과가 뛰어난, 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물을 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예가 포함하는 하부구조(substructure)의 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예가 나타내는 HMBC(a) 및 NOE(b) 상호관계도이다.
도 3은 덴자닌 A의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 덴자닌 A의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 5는 덴자닌 A의 COSY, TOCSY, HSQC, HMBC 및 ROESY NMR 스펙트럼이다.
도 6은 덴자닌 B의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 7은 덴자닌 B의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 8은 덴자닌 B의 COSY, TOCSY, HSQC, HMBC 및 ROESY NMR 스펙트럼이다.
도 9는 본 발명의 실시예가 나타내는 신경세포 염증유발 물질 생성 억제효과를 측정하여 도시한 그래프이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물 또는 식품 조성물은, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표기되는 신규한 구조의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함한다.
[화학식 1] [화학식 2]
Figure 112012085234212-pat00004
상기 화학식 1 및 화학식 2의 화합물(해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라로부터 추출된 신규 화합물이라는 점으로써, 이하 화학식 1의 화합물을 "덴자닌(densanin) A", 화학식 2의 화합물을 "덴자닌(densanin) B"로 명명하여 통칭하기로 한다)은, 표시된 바와 같이 하부구조로써 트라이사이클릭 코어에 함입된 피롤 고리를 포함하고, 축합고리 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드로 분류될 수 있다.
상기 덴자닌 A 또는 덴자닌 B는 신경세포, 더욱 상세하게는 마이크로글리아 세포의 염증유발 물질인 NO 생성을 억제하는 효과를 나타내며, 이로써 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료 효과를 보인다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 조성물 내에서 덴자닌 A 또는 덴자닌 B은 예를 들어, 0.001 mg/kg 이상, 바람직하게는 0.1 mg/kg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg/kg 이상, 보다 더 바람직하게는 100 mg/kg 이상, 보다 더욱 더 바람직하게는 250 mg/kg 이상, 가장 바람직하게는 0.1 g/kg 이상 포함된다. 덴자닌 A 또는 덴자닌 B는 천연물에서 유래되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 성분의 하나로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10g/㎏이다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 덴자닌 A 또는 덴자닌 B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 덴자닌 A 또는 덴자닌 B 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 덴자닌 A 또는 덴자닌 B 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 덴자닌 A 또는 덴자닌 B를 유효성분으로 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 덴자닌 A 또는 덴자닌 B를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
이하, 도면, 실시예, 시험예 및 바람직한 형태의 제제예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 : 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 추출 및 정제
한국 남해 거문도 연안에서 채취한 해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라(Haliclona densaspicula)를 동결 건조함으로써 수분을 완전히 제거하여 시료를 제조하였다. 상기 시료는 실온에서, 메탄올로 두 번 추출되었다. 추출된 용액을 50% CH2Cl2와 50% H2O가 섞인 용매를 사용하여 분획한 뒤, 감압 하에서 다이클로로메탄 용매를 증발시켰다. 이후 남겨진 용액은 n-헥산과 15% 수성메탄올로 재분획되었다. 다음으로, 수성메탄올로 분획된 층을 선별하여 역상 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 상에서 물과 메탄올의 단계구배 용매시스템(MeOH / H2O = 50 / 50; 60 / 40; 70 / 30; 80 / 20; 90 / 10; 100% MeOH; 100% 아세톤, 차례대로 MR1 내지 MR7 층)으로 분획하였다. 이 중 MR3 층을 분리한 뒤, 100% 메탄올을 용출 용매로 사용하고 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH20)를 이용하여 다섯 개의 영역(차례대로 M1 내지 M5)으로 다시 분획하였다. 이 중 M4(82 mg)를 분리하고 이를 농도 구배가 형성된 CH3CN - H2O 용매(CH3CN 20% 2 분; CH3CN 30% 8 분; CH3CN 30% 13 분; CH3CN 40% 20 분; CH3CN 40% 30 분; CH3CN 100% 35 분)를 이용하여 역상 고성능 액체크로마토그래피(Gemini, C6-페닐 컬럼, 250 mm x 4.6 mm ID, 5μm; UV 디텍터 300nm, 용출 속도 1 mL/min)를 수행함으로써 순수한 덴자닌 A(12 mg, t R 18 분) 및 덴자닌 B(8 mg, t R 26 분)를 수득하였다.
실시예 : 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 평면구조 및 입체구조 결정
1. 덴자닌 A
도 2에는 덴자닌 A가 포함하는 구조의 HMBC(a) 및 NOE(b) 상호관계도, 도 3에는 덴자닌 A의 1H NMR 스펙트럼, 도 4에는 덴자닌 A의 13C NMR 스펙트럼, 그리고 도 5에는 덴자닌 A의 COSY, TOCSY, HSQC, HMBC 및 ROESY NMR 스펙트럼이 도시되어 있다.
덴자닌 A의 분자식은, HRFABMS 데이터([M]+ 이온피크 m/z = 521.3745, △ = 0.2 ppm)로부터 11의 불포화도를 갖는 C33H49N2O3 +인 것으로 결정되었다.
덴자닌 A 의 IR 스펙트럼은 하이드록실과 카보닐기의 흡수 밴드(각각 3400 및 1635 cm-1)를 나타냈다.
덴자닌 A의 13C NMR 스펙트럼은 8 개의 올레핀(ollefin) 공명(δc 112.9, 126.6, 126.8, 130.1, 130.4, 132.0, 135.1, 및 138.5), 1 개의 케톤(ketone) 공명(δc 190.0), 1 개의 메톡시(methoxy) 공명(δc 58.6), 1 개의 다운필드-쉬프트된 메틴(downfield-shifted methine) 신호(δc 96.1)를 나타내었는데, 상기 다운필드-쉬프팅은 두 개의 헤테로 핵과 결합한 탄소에 기인한 것으로 생각된다.
덴자닌 A에 대한 HSQC 스펙트럼으로, 17 개의 메틸렌(methylene) 그룹 및 6 개의 메틴(methine) 그룹이 관찰되었다. 메틸(methyl) 그룹은 관찰되지 않았다. 이러한 데이터와 상기 측정된 11의 불포화도로서, 덴자닌 A가 여섯개의 링을 포함함이 계산되었다.
더욱 상세한 해석이 1D 및 2D NMR(COSY, TOCSY, HSQC, 및 HMBC)로 수행되었다. 이들로부터의 데이터는, 덴자닌 A가 도 1A로 표기되는 테트라사이클릭 코어, 도 1B 및 도 1C로 표기되는 선형 탄소 사슬을 포함함을 시사한다. 질소 원자 및 큰 단일결합 커플링 상수(1 J C2H2 = 183 및 1 J C3H3 = 174 Hz)가 동반된 13C NMR 화학 전이(chemical shift)는 피롤(pyrrole) 링의 존재를 암시하며, 이는 4차 탄소인 C-4(δC 138.5) 및 C-5(δC 126.8) / H-2(δH 7.15) 및 H-3(δH 6.35)의 HMBC 상호관계에 의해 더욱 뒷받침된다.
피롤 링에 포함된 모든 탄소는, N-메틸렌 양성자 / 피롤 탄소 C-2 (δC 132.0) 및 C-5 (δC 126.8)의 HMBC 상호작용에 의해 명료하게 위치적으로 특정될 수 있다. 게다가, 더블릿(doublet) 메틴 양성자인 H-7(δH 3.75) / 4차 탄소 C-5(δC 138.5) 및 C-6(δC 126.8))의 HMBC 상호관계에 의해 C-5를 통한 피롤과 케토 그룹의 컨쥬게이션이 드러난다. 이러한 현상은 α, β-불포화 케톤의 303 nm에서의 강력한 UV 흡수와 13C 화학 전이로부터 더욱 증빙된다.
반면, C-10 탄소로 지지되는 AB-스플릿된(splitted) 메틸렌 양성자는 다섯개의 인접한 탄소들과의 폭넓은 HMBC 상호관계를 보여준다. 이는 사차 탄소인 C-11과 2 개의 메틴이 질소 원자와 연결되어 있음을 증명한다 (하기 표 1). 또한, 메틴 탄소인 C-7은 하나의 질소를 지지하는 메틴 탄소 C-8 및 H-7과 직접적으로 연결된다. 이러한 연결구조는 이들에 대응되는 양성자들의 COSY 상호관계에 의해 더욱 입증되었다. 따라서, 이들은 피롤리딘 특성을 나타낸다고 결정할 수 있다.
덴자닌 A 및 덴자닌 B의 1H 및 13C NMR 데이터(CD3OD)
No. 덴자닌 A 덴자닌 B
δC δH(mult, JHz) HMBC δC δH(mult, JHz)
2 132.0, CH 7.15, d (2.5) C-3, 4, 5, 1' 131.8, CH 7.13, d (2.5)
3 112.9, CH 6.35, d (2.5) C-2, 4, 5, 13 112.7, CH 6.35, d (2.5)
4 138.5, C 138.9, C
5 126.8, C 126.9, C
6 190.0, C 189.7, C
7 58.7, CH 3.75, d (5.9) C-5, 6, 8, 11, 12, 10', 1" 58.5, CH 3.68, d (5.9)
8 76.4, CH 3.87, d (5.9) C-6, 7, 10, 14 78.5, CH 4.08, d (5.9)
10a 68.8, CH2 3.43, dd (10.5, 1.5) C-11, 12, 14 68.5, CH2 3.37, dd (10.5, 2.0)
10b 3.60, dd (10.5, 1.0) C-7, 8, 12 3.55, dd (10.5, 0.7)
11 47.7, C 47.9, C
12a 38.5, CH2 2.25, d (13.9) C-4, 10, 11, 13, 14 38.8, CH2 2.23, d (13.9)
12b 2.33, dd (13.9, 6.1) C-7, 10, 11, 13, 14 2.31, dd (13.9, 6.1)
13 37.3, CH 3.73, d (6.1) C-3, 4, 5, 11, 14 37.7, CH 3.73, d (6.1)
14 96.1, CH 4.85, br s C-4, 10, OCH3 96.2, CH 4.86, br s
OCH3 58.6, CH3 3.74, s C-14 59.0, CH3 3.75, s
1'a 47.9, CH2 3.90, dt (13.5, 5.6) C-2, 5, 2', 3' 48.1, CH2 3.87, dt (13.5, 5.6)
1'b 5.17, ddd (13.5, 9.1, 4.9) 5.14, ddd (13.5, 9.1, 4.9)
2' 30.4, CH2 1.76, m ; 1.89, m C-1', 3' 30.4, CH2 1.73, m ; 1.88, m
3' 25.3, CH2 0.64, m ; 1.22, m C-1', 2', 4' 25.4, CH2 0.69, m ; 1.21, m
4' 26.7, CH2 1.06, m ; 1.51, m 26.8, CH2 1.07, m ; 1.47, m
5' 28.9, CH2 0.99, m ; 1.29, m 28.8, CH2 1.00, m ; 1.29, m
6' 27.2, CH2 1.21, m 27.2, CH2 1.20, m
7' 28.8, CH2 1.22, m 28.9, CH2 1.21, m
8' 29.8, CH2 1.20, m 29.9, CH2 1.21, m
9' 26.7, CH2 1.51, m 26.6, CH2 1.51, m
10' 36.7, CH2 1.56, m ; 1.69, m C-11, 12, 8', 9' 36.8, CH2 1.55, m ; 1.68, m
1" 67.9, CH 4.45, dd (9.5, 6.9) C-7, 8, 2" 66.0, CH 3.93, d (9.8)
2" 31.8, CH2 2.06, m ; 2.39, m C-8, 1" 31.4, CH2 1.26, m ; 1.51, m
3" 126.6, CH 4.93, m 21.2, CH2 1.38, m ; 1.69, m
4" 135.1, CH 5.46, td (11.3, 4.7) 24.1, CH2 1.52, m
5" 27.4, CH2 2.60, m ; 3.08, m 21.1, CH2 1.37, m
6" 130.4, CH 5.64, m 24.8, CH2 1.47, m
7" 130.1, CH 5.61, m 25.0, CH2 1.50, m ; 1.73, m
8" 25.5, CH2 2.18, m ; 2.27, m 19.4, CH2 1.63, m ; 1.84, m
9"a 26.6, CH2 1.27, m 57.0, CH2 2.95, dd (13.9, 8.6)
9"b 2.03, m 4.05, m
10"a 55.5, CH2 3.06, dd (13.7, 8.6) C-14
10"b 3.94, m C-8, 9"
※ 500 MHz (1H) 및 125 MHz (13C)로 측정됨
H-12 및 H-13 / C-11 및 C-14 사이의 HMBC 상호관계로부터 1-아자비사이클로[3. 2. 1] 옥탄 구조가 도출되었다(도 2). 또한, 피롤 내부의 H-13 / C-3 및 C-4 사이의 HMBC 상호관계로부터 테트라사이클릭 구조가 도출되었다.
도 1A는, 상기 메톡시 양성자(δH 3.74)의 HMBC 상호관계로부터 증명된 바와 같이, 메톡시 그룹의 C-14로의 부착으로부터 도출되었다. 도 1B의 경우, H-1으로부터 시작되어 연속적으로 이어지는 원자들의 COSY 커플링과 TOCSY 상호관계로서, 데카-3,6-다이엔-1-올(deca-3,6-dien-1-ol)의 구조가 도출된 것이다. 분석되지 않은 신호들은 메틸렌 그룹의 9 개의 업필드-쉬프트에 기인한 것으로 보이며, 더불어 도 1C는 COSY, TOCSY, HMBC 데이터 조합에 의해 선형 노네인 사슬 구조인 것으로 결정되었다.
도 1A, 도 1B 및 도 1C의 구조는 HMBC 및 COSY 상호관계에 의하여 조립될 수 있다. 먼저, 도 1A 구조의 양 말단에 있는 옥시메틴 C-1" 및 메틸렌 C-10"은 C-8 및 1-아자비스사이클로[3.2.1] 옥테인의 질소에 각각 연결된다.
유사하게, 말단의 메틸렌 양성자들(δH 1.76 및 1.89)과 H-1' 사이의 COSY 상호관계, 그리고 또 다른 말단 양성자들 / 사차 탄소 C-10 사이의 HMBC 상호관계에 의해, 결정된 부분적 구조와 포화 탄소 사슬의 연결이 입증되었다. 따라서, 양으로 하전된, 분자식 C33H49N2O3 +에 일치하는 덴자닌 A의 구조가 결정된다.
1H 커플링 상수와 ROESY 데이터에 기반하여, 덴자닌 A의 상대적 입체화학구조가 규명되었다. H-8 및 H-14 / Hb-10 및 Hb-12 사이의 NOE 상호관계는 1-아자비스사이클로[3.2.1] 옥테인 구조의 배열을 결정하였고, 또한 C-14를 포함하는 메톡시 그룹의 광학 특성을 결정하였다.
H-8 시그널은 H-7과의 명백한 커플링(J HH = 5.9 Hz), 그리고 0에 가까운 H-1"과의 커플링으로 인하여 더블릿으로 관찰되었다. 이러한 관찰은 H-8이 H-7의 반대 방향으로 향한 것을, 그러나 H-1"에 대해서는 수직인 것을 입증한다. H-10', Ha-10 및 H-7의 NOE 상호관계로부터, H-7의 방향 또한 결정되었다. 더불어, H-1", H-8, H-8" 및 Ha-10"들의 NOE 상호관계는 H-1"의 방향이 도 1B로 표시되는 하부구조의 내부를 향한다는 점을 시사한다. 결론적으로, 알릴 탄소의 화학 전이와 양성자들의 NOE 상호관계로부터, 덴자닌 A가 2 개의 2가 치환 이중결합으로부터의 Z-이성질성을 나타냄이 해석되었다.
C-1"에 대한 모셔법(Mosher)으로, 덴자닌 A의 절대적 광학 이성질성이 해석되었다. 덴자닌 A의 MTPA 에스터 내 페닐 그룹의 가림 효과는, C-1" 중심의 MTPA에 공간적으로 가까운 각각의 양성자에 따라(H-2" 및 Ha-10의 전하에 따라) 각각 다른 △δSR 신호를 결과하였다. 따라서, C-1"의 절대적 입체화학구조는 R에 해당한다는 것을 밝혔다.
2. 덴자닌 B
도 2에는 덴자닌 B가 포함하는 구조의 HMBC(a) 및 NOE(b) 상호관계도, 도 6에는 덴자닌 B의 1H NMR 스펙트럼, 도 7에는 덴자닌 B의 13C NMR 스펙트럼, 그리고 도 8에는 덴자닌 B의 COSY, TOCSY, HSQC, HMBC 및 ROESY NMR 스펙트럼이 도시되어 있다.
덴자닌 B는, 13C NMR과 HRFABMS 데이터([M]+ 이온피크 m/z = 511.3898)에 의하여 C32H51N2O3 +의 분자식으로 표현되는 것으로 밝혀졌다.
1H 및 13C NMR 스펙트럼을 비교한 바에 의하면, 덴자닌 B는 덴자닌 A에 비해 4 개의 올레핀 시그널과 1 개의 카본 시그널이 부족한 것으로 관찰되었다. COSY, HSQC, HMBC 데이터의 조합에 의하여, 덴자닌 B는 도 1A의 부분 구조를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 1H 및 13C NMR에 의하여, 16개의 메틸렌 그룹 중 9 개의 메틸렌 업필드-쉬프트가 덴자닌 A와 일치하였고, 이는 덴자닌 B 역시 도 1C의 구조를 포함함을 시사한다.
COSY와 TOCSY 스펙트럼, 그리고 HMBC 상호관계는 또한 직선 옥테인 사슬이, 일곱 개의 메틸렌을 남겨둔 채 덴자닌 A와 같이 도 1A의 구조와 연결된다는 것을 입증한다. 상기 사슬의 각 탄소 말단은 도 1A 구조의 질소 및 옥시메틴 탄소에 각각 연결되고, 따라서 덴자닌 B는 평면 구조를 나타낸다.
덴자닌 A 및 덴자닌 B는 1-아자비사이클로[3.2.1] 옥테인 유닛과 피롤 링을 포함하는 신규 화합물이다. 상기 두 화합물은 두 개의 긴 직선 사슬을 포함하는 헥사사이클릭 다이아민 구조로 특정되고, 또한 해양해면으로부터 생합성된, 3-알킬피리딘으로부터 유도된 매크로사이클릭 알칼로이드의 일종인 것으로 추측된다.
시험예 : 덴자닌 A 또는 덴자닌 B의 효과 및 세포독성 측정
BV-2 마이크로글리아 세포는 10%의 FBS, 페니실린(100 IU / mL), 스트렙토마이신(10 mg / mL)을 포함하는 DMEM에서 37 ℃, 95% 공기 및 5%의 대기 환경에서 가습 보존되던 것을 사용하였다. 상기 마이크로글리아 세포를 사용하기 하루 전에, 포함된 페놀 레드의 흔적을 제거하기 위해서, 세포는 세척된 뒤 페놀 레드를 포함하지 않는 배지로 옮겨졌다. 또한, 트립신을 처리하고 48-well 배양 접시에 1 x 104 cells / well 의 밀도로 분배하였다. 이렇게 준비된 BV-2 마이크로글리아 세포는, LPS(100 ng / mL)에 노출되기 약 1 시간 전에 덴자닌 A 또는 덴자닌 B로 처리하였다. 이후 각 세포는 24시간 동안 배양되었으며, 이후 그리스(Griess)법을 이용한 NO 농도의 측정이 시행되었다.
또한 마이크로글리아 세포의 활성을 억제하는 효과가 세포독성에 의한 것이 아님을 확인하기 위하여, 그리스(Griess)법에 따라, 부분 표본에 MTT 용액 (0.2 mg / mL)을 적가하여 37 ℃의 환경에서 2 시간 동안 배양하였다. 상청액을 제거한 뒤 100 μL의 DMSO를 적가하였고, 이로써 포르마잔 또한 용해되었다. 비용해성의 결정질이 이러한 단계 뒤에 완전히 용해된 뒤, 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 통해 시료의 540 nm 광흡수도가 측정되었다. 결론적으로, 덴자닌 A 또는 덴자닌 B는 세포독성 없이 마이크로글리아 세포의 NO 생성 활성만을 억제한다는 사실이 밝혀졌다.
도 9에는 리포폴리사카라이드-비활성화된 상태(Control); 리포폴리사카라이드-활성화된 상태(LPS); 및 리포폴리사카라이드-활성화되고 덴자닌 A 또는 B의 농도가 부여된 상태(1, 2, 5, 10 및 20);에 따른 BV-2 마이크로글리아 세포의 배지 중 NO (Nitrite) 생성 농도가 측정된 그래프가 도시되어 있다.
도시된 바와 같이, 덴자닌 A 및 B가 존재하지 않는 환경에서, 100 ng/mL 농도의 LPS에 노출된 마이크로글리아 세포로부터 배지에 방출되는 NO의 양은 14.55 ± 1.26에서 48.25 ± 2.88 μmol로 세 배 증가되었다. 이러한 LPS-유발 NO 생성은, 덴자닌 A 또는 덴자닌 B에 의해 성공적으로 억제되는 것이 관찰되었다(IC50 값, 각각 1.05 및 2.14 μM). 따라서, 덴자닌 A 또는 덴자닌 B는 세포 독성 없이, 리포폴리사카라이드(LPS)-활성화된 BV-2 마이크로글리아 세포의 염증유발 물질인 NO 생성 작용을 억제하는 효과가 있음이 규명되었다.
마이크로글리아 세포(microglial cell, 소신경교세포)는 중추 신경계에 포함되고, 소신경교세포는 중추신경계 신경교세포의 10-12%를 차지하는 세포로서 조직 내에서 변성된 뉴런(neuron)과 이물질 등을 잡아먹는 작용을 하여 물질의 운반과 파괴, 제거 및 병적 대사 물질의 청소 등 중요한 역할을 하여 일반적으로 중추신경계에 존재하는 대식세포(macrophage)로 여겨진다. 또한, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron)와 다른 신경교세포들(astrocytes, oligodendrocytes)과 구별되는 특징적인 세포표면 항원을 발현하고, 탐식작용 등 대식세포와 유사한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 소신경교세포는 발생과정 중에 이들 세포의 전구 세포로 여겨지는 단핵구세포(monocyte)들이 중추신경계에 들어와 분화한 것으로 알려져 있는데, 중추신경계 내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하며, 이때 감염 장소로 이동하거나 국소적인 증식을 통해 감염미생물을 탐식하고 손상된 신경세포들의 잔유 물질들을 소화하게 된다. 소신경교세포는 중추신경계에서 자기방어라는 본래의 기능을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β, 반응성 산소 (ROS) 혹은 질소 화합물(NO) 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래하게 된다. 알츠하이머(Alzheimer), 파킨슨병(Parkinson), 뇌졸중 및 다발성 경화증 등의 퇴행성 신경질환뿐 아니라 외상 및 허혈 상태에 따른 신경세포 손상에도 이러한 소신경교세포의 과민 활성화가 관련되어 있고, 이들 활성화된 소신경교세포를 억제하거나 활성화된 소신경교세포가 분비하는 염증유발 물질들의 작용을 막으면 상기 퇴행성 신경질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 덴자닌 A 또는 덴자닌 B는, 세포 독성 없이 소신경세포의 염증유발 물질인 NO 분비를 억제함으로써 이러한 소신경교세포의 염증 활성화를 저해하여 신경조직손상을 억제한다. 따라서, 전술한 바와 같이 퇴행성 뇌질환 및 세포염증을 포함하는 신경세포 관련질환 치료 및 예방용 물질로 응용될 수 있다.
제제예 1. 산제의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강기능식품의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 mg
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
덴자닌 A 또는 덴자닌 B 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (15)

  1. 생체 외에서 리포폴리사카라이드로 처리된 마이크로글리아(microglia) 세포에 처리했을 때 염증 유발 물질인 일산화질소의 생성을 억제하는 활성을 갖는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물.
    [화학식 1] [화학식 2]
    Figure 112014017503522-pat00005
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
    δc 값 25 내지 32, 36 내지 39, 47 내지 50, 55 내지 57, 58 내지 60, 67 내지 69, 75 내지 77, 95 내지 97, 112 내지 114, 126 내지 128, 129 내지 133, 134 내지 136, 137 내지 139, 및 189 내지 191 ppm에서 피크가 나타나는 것을 특징으로 하는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 125 MHz 13C NMR(CD3OD) 스펙트럼은,
    δc 값 23 내지 30, 35 내지 37, 46 내지 48, 57 내지 59, 64 내지 68, 77 내지 79, 93 내지 97, 111 내지 113, 125 내지 127, 129 내지 132, 137 내지 139, 및 187 내지 190 ppm에서 피크가 나타나는 것을 특징으로 하는 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물.
  7. 생체 외에서 리포폴리사카라이드로 처리된 마이크로글리아(microglia) 세포에 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 처리하여 염증 유발 물질인 일산화질소의 생성을 억제하는 방법.
    [화학식 1] [화학식 2]
    Figure 112014017503522-pat00006
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. a) 해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라(Haliclona densaspicula)로부터 액상의 혼합물을 추출하는 단계; 및
    b) 상기 혼합물을 분획하여 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표기되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물을 분리 및 정제하는 단계;
    를 포함하고,
    상기 a)단계는, 동결 건조된 해양해면류 할리클로나 덴사스피큘라를 메탄올로 1 내지 5 회 추출하는 단계를 포함하며,
    상기 b) 단계는, 추출된 혼합물을 다이클로로메탄 및 물이 섞인 용매로 분획하는 단계; 상기 분획된 용액 중 다이클로로메탄 용매를 증발시키는 단계; 남겨진 용액을 헥산 및 수성메탄올이 섞인 용매로 분획하는 단계; 및 수성메탄올로 분획된 잔류물로부터 크로마토그래피를 이용하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 분리 및 수득하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 추출방법.
    [화학식 1] [화학식 2]
    Figure 112014017503522-pat00007
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제12항에 있어서,
    상기 수성메탄올로 분획된 잔류물로부터 크로마토그래피를 이용하여 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 분리 및 수득하는 단계는,
    상기 잔류물을 역상 실리카겔 플래시 칼럼 크로마토그래피 상에서 물과 메탄올의 단계구배 용매시스템으로 분획한 뒤, 70% 메탄올 및 30% 물로 용출된 용액을 수득하는 단계;
    상기 수득된 용액을, 100% 메탄올을 용출 용매로 사용하고 세파덱스 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH20)를 이용하여 다섯 개의 영역으로 다시 분획하여 그 중 네 번째로 용출된 용액을 분리 수득하는 단계; 및
    상기 네 번째로 용출된 용액을, 농도 구배가 형성된 CH3CN - H2O 용매(CH3CN 20부피% 2 분; CH3CN 30 부피% 8 분; CH3CN 30 부피% 13 분; CH3CN 40 부피%% 20 분; CH3CN 40 부피% 30 분; CH3CN 100% 35 분)를 이용하여 역상 고성능 액체크로마토그래피(C6-페닐 컬럼, 250 mm x 4.6 mm ID, 5mm; UV 디텍터 300nm, 용출 속도 1 mL/min)를 수행함으로써 상기 화학식 1(12 mg, t R 18 분) 또는 화학식 2(8 mg, t R 26 분)로 표시되는 황색 오일상의 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 헥사사이클릭 다이아민 알칼로이드 유도체 화합물의 추출방법.
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