KR100926466B1

KR100926466B1 - 4-ｏ-메틸호노키올을 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제 조성물

Info

Publication number: KR100926466B1
Application number: KR1020080094320A
Authority: KR
Inventors: 김기호; 김기수; 김영희; 김진국; 김경태; 이상일
Original assignee: 주식회사 바이오랜드
Priority date: 2008-09-25
Filing date: 2008-09-25
Publication date: 2009-11-13

Abstract

본 발명은 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 4-O-메틸호노키올(4-O-Methylhonokiol)을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증 등 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 약제 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 본 발명의 4-O-메틸호노키올이 베타-아밀로이드 형성을 억제한다는 사실을 처음으로 밝혀내어 아밀로이드 관련 질환의 치료 및 예방에 사용될 수 있음을 확인하였으며, 실험쥐를 이용한 수중미로 시험, 수동적 회피 시험 등의 동물실험을 실시하여 4-O-메틸호노키올이 아밀로이드 관련 질환인 알츠하이머병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증 등에 효능이 있음을 확인하였고, 쥐의 뇌에서 피질과 해마조직을 이용한 아세틸콜린 분해효소 활성억제 시험을 통하여 아밀로이드 관련 질환 중에서도 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 더욱 효과적임을 추가적으로 확인하였다.

Description

4-Ｏ-메틸호노키올을 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제 조성물 {A pharmaceutical composition for treating or preventing amyloidosis diseases comprising 4-Ｏ-methylhonokiol}

본 발명은 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 4-O-메틸호노키올(4-O-Methylhonokiol) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 알츠하이머병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증(amyloidosis) 등의 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 유용한 약제 조성물에 관한 것이다.

최근 노인 인구의 급격한 증가로 인하여 노화와 관련된 알츠하이머의 발생이 심각한 사회 문제화 되고 있다. 알츠하이머 질환은 환자 자신의 인간적인 삶을 황폐화 시킬 뿐 아니라 가족들의 삶까지도 망가뜨리는 질환으로 심각한 사회적, 경제적 문제를 야기하고 있다. 미국치매협회의 자료에 의하면, 65세 이상 노인의 10.3%가 치매를 앓고 있으며, 치매를 치료하는데 연간 950억 달러의 비용이 소모되는 것으로 보고되고 있다. 우리나라의 경우도 한국보건산업진흥원의 보고에 의하면 2000년 치매 유병률이 65세 이상의 노인 중 8.3%인 34만 여명인 것으로 추정하고 있는 상황이다(서울신문 2005년 5월 10일자).

치매(Dementia)는 일상생활에 손상을 주는 기억과 인지능력의 악화로 정의되며, 크게 혈관성 치매와 노인성 치매로 나눌 수 있다. 혈관성 치매는 주로 혈관 내에 형성된 혈전에 의해 뇌출혈과 뇌졸증 등이 발생하는 경우에 해당되는 것으로, 출혈이 발생된 부위의 뇌세포가 상해를 입어 기억력 상실 등이 증상이 유발되는 것으로 알려져 있다. 반면, 혈관성 치매보다 훨씬 높은 발생빈도를 보이는 노인성 치매는 알츠하이머성 치매(Alzheimer disease)로 베타-아밀로이드(β-amyloid)의 뇌내 축적과, 그로 인한 독성으로 신경세포가 지속적으로 파괴되어 발생되는 것으로 알려져 있다(Gandy et al., J Clin Invest, 2005). 또 이 과정에서 활성산소종이 중요한 작용을 하는 것으로 보고되고 있다 (Zhu et al., Brain Research, 2004). 염증반응 역시 비스테로이드 항염제를 투여할 경우 알츠하이머병의 감소가 보고되는 (Gasparini et al., Brain Research Reviews, 2005) 등 알츠하이머병의 발병과 관련이 있는 것으로 보고되고 있다.

다운증후군(Down's syndrome)은 염색체 가운데서 21번째 염색체의 수가 1개 더 많아서 나타나는 유전성 질환이다. 다운증후군을 앓고 있는 환자의 뇌 내에서 아밀로이드 단백질의 축적이 다운증후군을 앓고 있지 않는 일반인에 비해 많다고 보고되어 있어 아밀로이드가 다운증후군의 발병과 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Crystal et al., Neurobiology of Aging, 1997, Yasuhiro et al., Brain & Development, 1997).

한편 알츠하이머 증상 중 하나인 기억력 감퇴 현상은 콜린계 신경계와 밀접한 관련이 있는 것으로 보고되고 있다. 저농도의 유기인계 화합물에 노출되었을 때 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 비정상적인 활성을 유도하여 아세틸콜린의 양이 감소하여 결국 기억과 관련된 신경전달이 원활하지 않게 된다. 또 베타-아밀로이드(β-amyloid)의 축적으로 인해 뇌 신경세포에 독성을 나타내어 기억력에 영향을 준다고 보고되고 있다. (Small et al., Curr Alzheimer Res, 2004).

최소인지장애는 기억장애를 연구하는 신경 과학자들에 의해서 만들어진 용어로, 정상적으로 나이가 들어감에 따라 발생하는 생리적 건망증과 알츠하이머병에 의한 기억장애 사이의 중간 상태를 이야기하는 새로운 용어이다. 과학자들은 나이에 비해 건망증이 심하나, 알츠하이머병의 치매증상은 가지고 있지 않은 환자들을 따로 분류하였고, 여기에 해당하는 환자들이 보여주는 기억장애에 대한 용어가 최소인지장애이다. 이러한 최소인지장애가 나이에 따른 생리적인 기억장애와 치매에 의해서 나타나는 기억장애의 중간상태라는 것은 아직까지는 매우 주관적이고 결론적이지 못하다. 이 사람들에 대한 연구결과에 의하면 이러한 최소 인지장애를 보이는 환자들은 전문가를 통해서 보다 정확한 진단과 치료에 대해 조언을 받아야 하는데, 이들 중에는 알츠하이머병으로 발전할 가능성이 높은 환자들이 포함되어 있기 때문이다. 최근에는 이러한 최소인지장애를 보이는 환자를 대상으로 비타민 E와 아세틸콜린 분해효소 억제제에 대한 효과를 알아보기 위한 연구가 진행 중이다. 이 연구는 최소인지장애에 해당하는 환자들이 비타민 E나 아세틸콜린 분해효소 억제제를 복용했을 경우 알츠하이머병으로 발전하는 비율을 줄일 수 있는가를 보기 위한 것이다.

아밀로이드증은 아밀로이드변성(amyloid degeneration)이라고도 한다. 유녹말은 녹말과 같은 반응을 나타내므로 이렇게 부른다. 이것은 왁스 모양으로 반투명한데, 자색소(紫色素)로 염색하여도 붉게 물들어 이색반응(異色反應)을 나타낸다. 이 물질은 혈관벽 또는 주위의 섬유 사이에 나타나거나, 지라·간의 세포 사이나 심근(心筋)·설근(舌筋)의 간질조직 사이에 잘 출현한다. 소량의 경우는 유녹말변성이라고 하지만, 넓은 부위에 출현할 경우는 유녹말증 또는 아밀로이드증(amyloidosis)이라 한다.

이와 같은 병인을 기초로 지금까지 개발된 알츠하이머병의 치료 및 개선을 위한 약물로는 시냅스에서 콜린 분해를 감소시킴으로써 뇌내 작용하는 콜린의 양을 증가시키는 작용을 하는 타크린(Tacrine), 아리셉트(Aricept) 및 엑셀론(Exelon)과 같은 아세틸콜린 분해효소 억제제(cholinesterase inhibitor) 등이 사용되고 있으나, 단지 알츠하이머의 증상만을 완화시키는 효과를 가지며 효과가 크지 않고 일시적이며, 간독성 등의 부작용이 심해 폭넓은 사용이 어려운 현실이다(Forchetti et al., Prim Care Companion J Clin Psychiatry, 2005).

따라서 국내외의 많은 연구 기관에서는 근원적인 알츠하이머 등의 아밀로이드 관련 질환 치료제의 개발을 위해 베타-아밀로이드 형성억제 효능을 갖는 물질을 찾거나, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제시키는 약물의 탐색에 많은 노력을 기울여 왔다.

한편, 1978년에 4-O-메틸호노키올이 처음으로 분리되었으며(El-Feraly, F. S. et al., Lloydia, 41, p493, 1978), 4-O-메틸호노키올은 마그놀올과 함께 항균효과가 있고, 모기유충 및 브라인슈림프(brine shrimp)에 살충효과가 있는 것으로 알려져 있으나 (Nitao J. K. et al., Phytochemistry, 30, p2193, 1991), 4-O-메틸호노키올에 대한 알츠하이머 등의 아밀로이드 관련 질환의 치료 혹은 예방에 대한 연구는 없다.

본 발명자들은 본 발명의 4-O-메틸호노키올이 베타-아밀로이드 형성을 억제한다는 사실을 처음으로 밝혀내어 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 확인하였으며, 실험쥐를 이용한 수중미로(water maze) 시험, 수동적 회피(passive avoidance) 시험 등의 동물실험을 실시하여 4-O-메틸호노키올이 아밀로이드 관련 질환인 알츠하이머 병, 인지장애 및 기억력 감퇴 등에 효능이 있음을 확인하였고, 쥐의 뇌에서 피질과 해마조직을 이용한 아세틸콜린 분해효소 활성억제 시험을 통하여 아밀로이드 관련 질환 중에서도 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 더욱 효과적임을 추가적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 인체에 부작용이 거의 없어 안전하면서도 알츠하이머병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증 등에 효과적인 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 및 예방용 약제조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 4-O-메틸호노키올(4-O-Methylhonokiol) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 아밀로이드 관련 질환은 아밀로이드의 축적, 변성 또는 그로 인한 독성에 의해 유발되는 모든 질환을 포함하나, 바람직하게는 알츠하이머병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증(amyloisosis)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하며 보다 바람직하게는 알츠하이머병(Alzheimer disease)이다.

본 발명에서는, 상기 4-O-메틸호노키올이 베타-아밀로이드 형성을 억제한다는 사실을 처음으로 밝혀내어 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 확인하였으며, 실험쥐를 이용한 수중미로(water maze) 시험, 수동적 회피(passive avoidance) 시험 등의 동물실험을 실시하여 4-O-메틸호노키올이 아밀로이드 관련 질환인 알츠하이머 병, 인지장애, 기억력 감퇴 및 아밀로이드증 등에 효능이 있음을 확인하였고, 쥐의 해마조직을 이용한 아세틸콜린 분해효소 활성억제 시험을 통하여 아밀로이드 관련 질환 중에서도 알츠하이머병의 치료 또는 예방에 더욱 효과적임을 추가적으로 확인하였다.

본 발명의 조성물에서, 상기 4-O-메틸호노키올은 하기 화학식을 갖는 것이 바람직하다.

[화학식]

상기 화학식에서 히드록시기는 약학적으로 허용 가능한 염을 포함할 수 있다. 상기의 화학식의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 화학식의 화합물에 존재할 수 있는 히드록시기의 염을 포함하며, 히드록시기의 염으로는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알카리 금속류염, 마그네슘, 칼슘 등의 알카리 토금속류염을 들 수 있다.

바람직하게는 생리학적으로 허용 가능한 나트륨, 칼륨, 칼슘과의 염 등을 들 수 있으며, 이들 염들은 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명에 사용된 4-O-메틸호노키올은, 상업적으로 정제된 4-O-메틸호노키올 화합물을 구입하거나 합성하여 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 4-O-메틸호노키올을 함유하는 식물, 특히 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)의 추출물에서 분리한 것을 사용할 수 있는데, 후박추출물로부터의 분리방법은 본 발명자들의 이전 출원된 특허(출원번호 10-2008-0019904)인 “후박 추출물 또는 이로부터 분리된 4-O-메틸호노키올을 함유하는 탈모 방지 또는 모발 생장 촉진용 조성물”에서 찾을 수 있다.

구체적으로, 먼저 후박 조추출물은 후박의 잎 또는 줄기껍질을 건조하여 그 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 2 내지 5배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 약 75 내지 100% 에탄올로 약 0 내지 100℃, 바람직하게는 약 10 내지 30℃의 추출 온도에서 약 1시간 내지 15일, 바람직하게는 약 2내지 7일 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출 방법, 바람직하게는 환류냉각추출 방법으로 추출한 추출액을 감압 여과하여 얻은 추출물을 약 20 내지 100℃, 바람직하게는 약 50 내지 70℃에서 감압 농축하여 후박 조추출물을 얻을 수 있다.

또한, 상기 후박 조추출물에서 후박 비극성용매 가용 추출물을 얻을 수 있는데, 이는 상기에서 얻은 후박 조추출물 중량의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 1 내지 10배 부피의 물을 분산시킨 후, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 글리세린 또는 프로필렌글리콜, 바람직하게는 헥산, 클로로포름 또는 에틸아세테이트, 보다 바람직하게는 헥산을 물의 0.1 내지 0.5배 정도의 부피를 가하여 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 4회 분획하여 후박 비극성용매 가용 추출물을 수득할 수 있다.

다음으로, 본 발명의 4-O-메틸호노키올 화합물은 하기와 같이 분리될 수 있다.

상기 수득 방법으로 얻어진 비극성용매 추출물 중 헥산 용매 추출물을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올에 녹이고, C18 컬럼에 흡착시킨 후 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 바람직하게는 메탄올 : 물이 약 10:1 내지 4:1이 되도록 혼합하여 분획물을 얻어 실리카겔에 흡착시킨 다음, 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 2회 내지 5회 수행하여 활성분획을 분리하고, 최종적으로 고성능액체크로마토그래피를 이용하여 본 발명의 4-O-메틸호노키올을 수득할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 아밀로이드 관련 질환에 대한 개선 또는 예방효과를 갖는 4-O-메틸호노키올 화합물은 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여 얻을 수 있다. 또한 상업적으로 구입 가능한 호노키올(Honokiol, Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., CN)을 통상적인 메틸화반응을 통해 4-O-메틸호노키올을 합성하여 얻을 수 있다 (Yoshiyasu F. et al., Tetrahedron, 48(3), p277-392, 1992; James K. N. et al., Phytochemistry, 30(7), p2193-2195, 1991; Shoji Y. et al., Chem. Pharm. Bull., 39(8), p2024-2036, 1991; Herbert O. House, Modern Synthetic Reactions, 2nd ED., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).

또한, 본 발명의 4-O-메틸호노키올 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 무독성염 및 용매화물로 제조될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트 (토실레이트) 염이 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 바람직하게는 조성물 총중량에 대하여 상기 4-O-메틸호노키올을 0.0001 내지 90 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 바람직하게는 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제 또는 연고제 제형 제형을 가질 수 있다.

본 발명의 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 약제 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

상기 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 약제조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 제형 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 상기 4-O-메틸호노키올 유효성분으로 함유하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 l00 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.001 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 후박 극성용매 가용 조추출물의 제조

경동시장에서 구입한 후박나무(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)를 건조 및 세절하여 얻은 줄기껍질 3kg에 95% 에탄올 9L를 가하여 실온에서 3회 반복 추출한 후 여과하여 얻은 여과액을 감압농축기(EYELA사, N-1000, 일본)로 감압농축하여 건조된 조추출물 450g을 얻었고, 하기 실시예에 사용하였다.

실시예 2. 후박 비극성 용매 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 수득한 후박 조추출물 중 200g을 2L 증류수로 현탁시킨 다음, 500ml의 헥산을 가하여 용해한 다음, 이를 분별 추출하였고, 이러한 과정을 2회 반복 수행하여 헥산층에 녹는 부분을 모은 뒤 헥산층을 감압농축하여 후박 헥산 가용 추출물 70g을 수득하였고, 하기 실시예에 사용하였다.

실시예 3. 후박 추출물로부터 4-O-메틸호노키올의 분리

상기 실시예 2에서 수득한 후박 헥산 가용 추출물 70g을 300ml의 메탄올에 녹이고 300g의 C18 컬럼에 흡착시킨 후, 메탄올:물=4:1(v/v)의 혼합용액을 사용하여 분획물을 수득하였으며, 용리액을 감압농축하여 황갈색의 농축액 40g을 얻었고, 이것을 메틸렌클로라이드에 용해시켰다. 그런 후, 헥산:초산에틸=9:1인 혼합 용액을 사용하여 칼럼(4.5x40cm)에 충진한 실리카겔(머크사, 상품명: 9385) 1kg에 분획물을 흡착시키고 헥산과 초산에틸의 비율을 9:1에서 6:4로 변환시키면서 총 2회의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 분리한 다음, 최종적으로 하기 표 1에 기재된 조건의 고성능 액체크로마토그래피를 이용하여 하기 물성치를 갖는 4-O-메틸호노키올 2g을 수득하였고, 하기 실시예에 사용하였다.

NMR 기기로 ¹H-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 400 MHz), ¹³C-NMR은 바리안사(Varian, GEMINI, 100 MHz)로 그 구조를 분석하였으며, CDCl₃(Chloroform-d, 알드리치사)를 용매로 사용하였고, 내부표준물질로는 트리메칠실란을 사용하여 δ값(ppm)으로 나타내었으며, NMR 결과는 이미 발표된 자료와 일치함을 확인할 수 있었다(Shoji Y. et al., Chem. Pharm. Bull. 39, p2024, 1991).

¹H-NMR (400MHz, CDCl₃): δ ppm 3.45(2H, d, J=6.0Hz, H-7'), 3.45(2H, d, J=6.0Hz, H-7), 3.90(3H, s, OMe), 5.10(4H, m, H-9 and H-9'), 6.01(2H, m, H-8 and H-8'), 6.95(1H, dd, J=8, 1.5Hz, H-3'), 6.97(1H, dd, J=8.0, 1.5Hz, H-3), 7.05(2H, m, H-2 and H-6'), 7.23(1H, dd, J=8.5, 1.6Hz, H-6), 7.30(1H, dd, J=8.5, 1.6Hz, H-4');

¹³C-NMR (100MHz, CDCl₃): δ ppm 34.22(C-7), 39.36(C-7'), 55.47(OMe)110.88(C-3'), 115.47(C-9), 115.53(C-9'), 115.77(C-5), 127.83(C-1'), 127.86(C-6), 128.67(C-3), 129.09(C-1), 129.64(C-4'), 130.46(C-6'), 130.67(C-2), 132.09(C-5'), 136.48(C-8), 137.77(C-8'), 150.79(C-2'), 156.94(C-4),

4-O-메틸호노키올

[표 1]

실험예 1. 공간학습능력 평가를 위한 수중미로(water maze)

4-O-메틸호노키올이 스코폴라민(scopolamine)으로 뇌손상을 유발시킨 실험쥐의 학습능력에 미치는 영향을 평가하기 위해, 기존 문헌에 기재된 수중미로 실험동물 모델을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(한국보건공정서연구회, 건강기능식품의 기능성식품 가이드, 663-701, 2004; Widy-Tyszkiewicz et al., Biol Pharm Bull, 2002). 5-6주령의 ICR계 수컷 마우스(20-28g)(대한바이오링크, 한국)를 적당한 온도(22±2℃)와 일주기(12시간)를 유지하는 동물실에서 키웠고, 10마리를 1군으로 하여 케이지에서 물과 먹이를 자유 공급하였다. 실험 마우스는 실험 전에 1주일간 순화시켜 사용하였다.

직경 180㎝, 높이가 50㎝인 원통형 수조에 수온이 22±3℃로 조절된 물을 30㎝의 높이로 채웠다. 도피대는 직경이 12㎝인 원형 투명아크릴에 받침대를 부착하고 수면보다 1.5㎝ 낮게 위치하였다. 실험쥐는 하루에 180초간 6일간의 적응훈련(acquisition test)을 받았으며, 7일째 자유수영검사(retention test)를 실시하였는데 이때 실험쥐들은 도피대가 제거된 채로 60초간 수영을 하게 하였다. 모든 실험쥐의 행동은 비디오카메라를 이용해 녹화하여, 실험쥐가 도피대에 올라가는 시간과 거리를 측정하였다.

실험동물의 처리로서, 스코폴라민(Wako사, 일본) 0.1mg을 0.1 ml의 에탄올에 녹였고, 실험동물 몸무게 10g당 0.1ml의 양을 투여하기 위하여 0.1%의 트윈-80(Tween-80)으로 희석하여 최종 농도를 1mg/kg로 복강 투여를 실시하였다. 4-O-메틸호노키올(0.5, 1 및 1.5 mg/kg)은 음용수에 녹여 실험동물에 일주일간 투여하였다. 비교예는 스코폴라민만을 처리한 군이며 대조군은 스코폴라민을 처리하지 않은 무처리군이다. 각 군을 평가하여 그 평균값 결과를 하기 표 2에 나타냈다.

[표 2]

상기 표 2에 나타나는 바와 같이, 스코폴라민만을 처리한 실험쥐는 도피대에 올라가는 동안의 거리, 즉 도피거리(escape distance, ㎝)가 증가한 반면, 스코폴라민과 시험물질인 4-O-메틸호노키올을 동시 처리한 실험쥐의 경우 농도-의존적으로 유의성 있게 도피거리가 감소해, 대조군과 유사한 수준으로 개선됨을 확인하였다.

실험예 2. 명시적 기억능력 시험을 위한 수동적 회피 (passive avoidance)

4-O-메틸호노키올이 스코폴라민으로 뇌손상을 유발시킨 실험쥐의 기억능력에 미치는 영향을 평가하기 위해, 기존 문헌에 기재된 수동적 회피(passive avoidance) 실험동물 모델을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다 (한국보건공정서연구회, 건강기능식품의 기능성식품가이드 663-701,2004; Rho et al., Biol Pharm Bull, 2005).

수동적 회피를 위한 시험장치는 전기충격발생기와 회피 장치로 구성되어있다. 회피상자는 검은 아크릴로 만들어진 어두운 상자(30×30×30㎝)와 동일한 크기의 조명을 가할 수 있는 밝은 구획, 그리고 두 공간 사이를 연결하는 문으로 구성되어 있으며, 어두운 상자의 바닥에는 알루미늄 막대가 일정한 간격으로 깔려 있어, 이를 통해 동물의 발바닥에 전기충격을 가할 수 있도록 하였다. 실험쥐를 밝은 구획에 위치시킨 후 상자부위에 위치시킨 후 조명을 키고 문을 열어 실험쥐가 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이러한 시행을 3회 반복한 후 3번째 시행에는 어두운 곳으로 들어가는 순간 바닥에 깔려있는 알루미늄 격자를 통해 전기충격(0.1mA, 5초)을 가하였다. 24시간 경과 후 동일한 절차를 사용해 기억검사를 실시하였다. 문이 열린 후 어두운 구획으로 들어가는 시간을 측정해 도달시간이 길수록 학습과 기억이 좋음을 의미한다. 각 군당 10마리를 평가하여 그 평균값 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

상기 표 3에 나타나는 바와 같이, 스코폴라민만을 처리할 경우 문이 열린 후 어두운 구획으로 들어가는 시간, 즉 수동회피반응시간(step through latency; sec)이 감소한 반면, 스코폴라민과 함께 시험물질인 4-O-메틸호노키올을 동시 투여할 경우 농도-의존적으로 수동회피반응시간이 증가하여 대조군과 유사하게 개선됨을 확인하였다.

실험예 3. 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholinesterase)의 활성억제

행동약리 실험 후 생쥐의 뇌의 피질(cortex)과 해마(hippocampus)를 각각 분리한 뒤 PRO-PREP 단백질 추출용액(Protein Extraction Solution, iNtRON Bio technology co., Ltd)으로 균질 분쇄하고, 4℃에서 15,000rpm으로 2시간 원심분리하여 상등액만 취하고, 최종 추출물의 단백질양을 Bio-Rad 단백질 분석키트(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 아세틸콜린 분해효소 활성은 엘만(Ellman) 방법을 변형하여 실시하였다.

96-웰 플레이트에 세포 용해물(cell lysate)을 웰당 10㎕씩 넣고 반응완충액[0.01% DTNB, 0.02% 아세틸티오콜린(Acetylthiocholine) 및 0.1mM isoOMPA를 포함하는 50 mM Tris-HCl(pH 8.0, 0.1M NaCl, 20 mM MgCl₂)]를 190㎕ 넣고 37℃에서 5분간 405nm 1차 측정하였다. 반응 10분 후 405nm에서 2차 측정하였다. 아세틸티오콜린 분해효소 검량은 시료 대신 아세틸콜린 분해효소를 농도별로 넣고 표준 완충액[0.01 % DTNB 및 0.02% 0.1mM isoOMPA를 포함하는 50mM Tris-HCl(pH 8.0, 0.1M NaCl, 20 mM MgCl₂)]을 처리하여 5분간 37℃에서 405nm 측정하였다. 시료에 1차와 2차 흡광도 차이에 대한 단위시간 당 변화를 검량선에 대입하여 활성도로 나타내었다. 3번 평가하여 평균값 결과는 각각 하기 표 4와 표 5에 나타냈다.

[표 4]

상기 표 4에 나타나는 바와 같이, 피질에서 스코폴라민만을 처리할 경우 효소활성도가 증가된 반면, 스코폴라민과 함께 시험물질인 4-O-메틸호노키올을 동시 처리할 경우 농도 의존적으로 효소활성도가 감소되어 유의성 있게 대조군과 유사한 수준으로 개선됨을 확인하였다.

[표 5]

상기 표 5에 나타나는 바와 같이, 해마에서도 피질과 마찬가지로 농도의적으로 효소활성도가 감소되어 대조군과 유사한 수준으로 개선됨을 확인하였다.

실험예 4. 아밀로이드-베타 1-42 (amyloid-β)의 생성 억제

행동약리 실험 후 생쥐의 뇌의 피질(cortex)과 해마(hippocampus)를 분리해 PRO-PREP 단백질 추출용액으로 균질 분쇄하고 4℃에서 15,000rpm로 2시간 원심분리하여 상등액만 취하고, 최종 추출물의 단백질양을 Bio-rad 단백질 분석키트(Bio-rad Co.)를 사용하여 측정하였다. 아밀로이드-베타 1-42의 정량은 아밀로이트-베타 1-42 분석키트 (Amyloid beta 1-42 assay kit; immuno-Biological Co., td., Japan)를 이용하여 실시하였다.

뇌를 피질과 해마로 나누어 얻은 단백질 추출물 100㎕를 코팅된 96웰 플레이트에 넣고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨다. 그 후, 세척 용액으로 세척한 후 표지된 항체 용액을 넣고 4℃에서 1시간 동안 어두운 곳에서 반응시킨다. 다시 세척 후, 크로모겐(chromogen)을 첨가하고 실온에서 30분 동안 어두운 곳에서 반응시킨다. 그 후 반응정지 용액을 넣고 450nm에서 흡광도를 측정한다. 3번 수행하여 그 평균값 결과를 하기 표 6과 7에 나타냈다.

[표 6]

상기 표 6에 나타나는 바와 같이, 피질에서 베타-아밀로이드만을 처리할 경우 베타 아밀로이드 양이 증가되었고, 베타-아밀로이드와 함께 시험물질인 4-O-메틸호노키올을 투여할 경우 농도 의존적으로 베타-아밀로이드의 생성이 감소되어, 유의성 있게 개선됨을 확인하였다.

[표 7]

상기 표 7에 나타나는 바와 같이, 뇌의 해마에서도 피질에서와 마찬가지로 베타-아밀로이드(β-amyloid)만을 처리할 경우 베타 아밀로이드 양이 증가되었고, 베타-아밀로이드와 함께 시험물질인 4-O-메틸호노키올을 투여할 경우 농도 의존적으로 베타-아밀로이드의 생성이 감소되어, 유의성있게 개선됨을 확인하였다.

제제예 1. 산제

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 4-O-메틸호노키올을 유효성분으로 함유하는 약제 조성물은 베타-아밀로이드 형성에 관여하여 베타 아밀로이드의 형성을 억제함으로써 알츠하이머 병, 기억력 감퇴, 인지장애 및 아밀로이드증 등과 같은 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식을 갖는 4-O-메틸호노키올(4-O-Methylhonokiol) 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, 알츠하이머병, 인지장애(cognitive disorder) 및 기억력 감퇴로 이루어진 군으로부터 선택된 아밀로이드 관련 질환의 치료 또는 예방용 약제 조성물:

[화학식]
삭제
제 1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 상기 4-O-메틸호노키올의 히드록시기의 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘의 금속염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 4-O-메틸호노키올은 후박(Magnolia officinalis Rehd. et Wils.)추출물로부터 분리된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 4-O-메틸호노키올은 호노키올의 메틸화반응을 통해 화학적으로 합성된 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 조성물 총중량에 대하여 상기 4-O-메틸호노키올 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 0.0001 내지 90 중량%로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 주사제, 크림, 젤, 패취, 분무제 또는 연고제 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.