WO2016099056A2 - 복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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손미원
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조영웅
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Definitions

  • composition for preventing, ameliorating or treating neurodegenerative diseases containing extracts of Bokryeongpi
  • the present invention relates to a composition for preventing, ameliorating or treating degenerative neurological diseases containing Bokyeongpi extract.
  • Neurodegenerative disease is a degenerative disorder of mental function caused by the progressive structural and functional loss of neurons (neurons).
  • Degenerative neuropathy is a dementia due to the degeneration of nerve cells in certain parts of the nervous system. Extraordinarily abnormal. It is accompanied by symptoms such as cerebellar abnormalities, sensory disorders, and motor disorders, and at the same time, abnormalities may appear in various areas, and the symptoms may be complex. Diagnosing the disease according to the clinical manifestation of the patient, the symptoms are diverse, and different disease stones show common clinical symptoms, which makes it difficult to diagnose Sci. Med. Vol. 40. 6, pp. 847-858. 1995).
  • Degenerative neurological diseases show signs of disease slowly and often develop with aging. Once onset, the disease continues to progress for years or even decades until death, which is very social. It is known that the cause of the disease has a significant genetic effect according to family history, but acquired factors are also important.
  • Degenerative neuropathy is characterized by progressive clinical dementia (such as Alzheimer's disease), neurological abnormalities (Pick's disease, etc.), postural and motor abnormalities (such as Parkinson's disease), progressive ataxia, muscular dystrophy and placebo, sensory and motor disorders, depending on the clinical symptoms.
  • Cytotoxicity of ⁇ plaque and Tau superphosphorylated tangle has been attracting attention as a direct cause of Alzheimer's dementia, a representative degenerative brain disease.
  • ⁇ is generated from the precursor ⁇ , and ⁇ -secretase, When ⁇ - -secretase ( ⁇ - secret ase) and so on are made on the outside acts in the neurons of the enzyme eu ⁇ ⁇ concentration is above a predetermined level, combined with each other to ⁇ protein to form the insoluble noinban (senile plaque). Substances can cause inflammation and neurotoxicity to destroy surrounding nerve cells. For example, neuronal cell death and microglia have been known to be associated with senile plaques in Alzheimer's disease patients. In vitro experiments showed that ⁇ peptide could induce the activation of microglia (brain macrophages), a hypothesis that it is the cause of microglia and brain inflammation found in the brain of patients with Alzheimer's disease. Support. Once A ⁇ is made and senile plaques are formed, there are currently no widely accepted therapies or treatments that are expected to significantly dissolve or prevent the formation of deposits.
  • the tau consists of four parts, ⁇ —terminal projections, proline globule domains and microorganism binding domains and C—terminal (Mandelkow et al., Acta. Neuropathol., 103, 26-35, 1996 ), It connects the microtubules that form the physical structure of nerve cells.
  • Abnormal hyperphosphorylation or alteration of tau in nerve cells of the central nervous system is known to cause degenerative brain diseases such as tauopathy.
  • Alzheimer's dementia, Picks disease, and frontal temporal lobe dementia (FTDP-17) with chromosome 17 associated with Parkinson's disease are among the major tau diseases (Lee et al., Annu. Rev.
  • Neurotrophic factors have the potential to treat neurodegenerative diseases and have been raised in Alzheimer's experiments in the 1980s (Nature. 1987 Sep 3-9: 329 (6134): 65-8.Amelioration of cholinergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factor.).
  • NGF nerve growth factor
  • neuropathic factor family the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and neurotropin-3, after impaired motor function due to nodules of the facial and sciatic nerves.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-4 Neurotrophin-4
  • CNTF Ciliary neurotrophic factor
  • Poria cocos which belongs to the class of soothing biliary fungi, Dong-myun gangja, mother-of-law mushrooms, and fungi. It is a kind of fungi belonging to basidiomycetes, which are brown fungi, which are mainly parasitic in pine but are connected to the roots of live pine trees. Mycelia continue to branch and grow in white, and the mycelia stones start to entangle with each other. If proper environmental conditions are maintained, the mycelium becomes a durable lump-like mycelium. This is called 'Buryeongryeong', depending on the color of the interior, white baekbokyeong, and if it is pink, it is called red bokbokyeong.
  • Fukryeong is sweet and its nature is warm and its taste and nature are both light, so it is said to be a medicinal herb.
  • Past literature has quenched thirst, smoothed urine, dehumidified, moderated body condition, harmonized digestive function to energize and soften waist to circulate the blood of the abdomen, It has been mainly used, and anti-diabetic and anti-cancer effects have been reported in recent papers (Ling Hui, Evaluation of the chemotherapeut ic and chemopr event ive potential of tri terpenoids from Poria cocos, Ling Hui, doctoral thesis of department of pharmacy, National University of Singapore, 2010).
  • Bokryeongpi is the outer shell of the Bokyong fungal nucleus with the punctured mushrooms, and it is known as an medicinal herb that reduces the edema by releasing water. In particular, it is rich in poricoic acid, a lanostane-based triterpene, and used for opiic acid (Glpi, Daebokpi, Bokryeongpi, Gingerpi, Gyepipi, and Gyepipi), which is prescribed for edema in consent. Hyogo of palpation, edema reduction ⁇ 7 reported have.
  • Bokryeongpi extract was found to show a significant memory recovery action. '' Also, Bokyeongpi extract can be used to reduce the production of substances that cause nerve cell death in the brain.
  • the present invention has been demonstrated to protect neurons by promoting the expression of proteins that inhibit and promote neuronal regeneration and differentiation.
  • An object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative neurological diseases and a food composition for the prevention and improvement of degenerative neurological diseases containing Boknyeongpi (Hak: ⁇ -ia cocos) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological disease and a food composition for the prevention or improvement of degenerative disease.
  • Bokyeongpi extract of the present invention protects nerve cells by inhibiting the production of beta amyloid (Amyloid ⁇ ⁇ ; Abeta) and tau phosphorylation, which can cause neuronal cell death and cause degenerative brain diseases, and protect acetylcholinesterase (Acetylcholinesterase; AChE) suppresses the effect of increasing neuronal conduction and mediating memory enhancement bar barkpi extract of the present invention can be useful as a pharmaceutical composition or health food composition for the prevention and treatment of neurodegenerative diseases .
  • beta amyloid Amyloid ⁇ ⁇
  • tau phosphorylation which can cause neuronal cell death and cause degenerative brain diseases
  • acetylcholinesterase Acetylcholinesterase; AChE
  • 1 is a graph showing the results of a passive avoidance task in an experimental animal model in which memory formation was suppressed with scopolamine after treatment of Bokyeongpi extract.
  • Figure 2 is a graph showing the results of the Y-maze task in the experimental animal model that suppressed memory formation with scopolamine after treatment of the extract of Bokryeongpi.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the Novel object recognit ion (NOR) task in the experimental animal model in which memory formation was suppressed by scopolamine after treatment of the extract of Bokryeongpi.
  • Figure 4 is a Y-maze task when treated with Bokyeongpi extract in an animal model inducing beta amyloid in the brain causing Alzheimer's dementia symptoms
  • Figure 6 is a graph showing the results of neuronal staining when treated with Bokyeongpi extract in an animal model inducing beta amyloid in the brain infus i on Alzheimer's dementia.
  • Figure 7 is a graph showing the results of measuring beta amyloid after the treatment of the extract of Bokryeongpi in normal animals.
  • Figure 8 is a graph showing the results of measuring the NGF production after treatment of the extract of Bokryeongpi in normal animals.
  • Figure 9 shows the results of measuring AChE activity after the treatment of Bokryokpi extract to the SH-SY5Y cell line, a neuronal cell line.
  • Figure 10 shows the result of measuring the degree of apoptosis with ⁇ 1 " & 533 after treatment of the extract of Bokyeongpi in the neuronal cell line SH-SY5Y cell line.
  • Figure 11 shows the result of measuring the degree of phosphorylation of tau after the treatment of Bokyeongpi extract to the SH-SY5Y cell line, a neuronal cell line.
  • Figure 12 shows the results of measuring the degree of NGF production after the treatment of the extract of Bokyeongpi in the neuronal cell line SH-SY5Y cell line.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological diseases, which contains the extract of Bokryeongpi (Pak. Poria cocos) as an active ingredient.
  • Bokryeongpi extract of the present invention can be provided according to the conventional method for producing a herbal extract, specifically, it means an extract using water, alcohol, or a mixed solvent of water and alcohol as a crude extract.
  • the alcohol which is one of the extracting solvents, may be, but is not limited to, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms, preferably methanol, ethane, butane or alcohol. Preferably ethanol.
  • the extract of Bokryeongpi can be prepared using alcohol as an extraction solvent, where 'alcohol' refers to ethanol made by distillation after fermentation of starch raw material or sugar raw material.
  • 'alcohol' refers to ethanol made by distillation after fermentation of starch raw material or sugar raw material.
  • the mixed solvent of water and alcohol is not particularly limited, and may be used by mixing in any suitable ratio.
  • Bokryeongpi extract may be extracted with 60 to 80 (v / v) ethane, 65 to 75 (v / v) 3 ⁇ 4 ethanol or 70 ( ⁇ / ⁇ )% ethanol, but not limited to It doesn't happen.
  • Bokryeongpi extract of the present invention can be obtained as follows. First, after washing and drying the Bokyeongpi of the present invention, respectively, cutting the dried herbal medicine to obtain a cutting herbal medicine, 1 to 20 times (v / w), preferably 5 to 10 times (v / w) water, lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixture of water and lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, preferably 70 (v / v) ethanol, 10 o C to 100 ° C., preferably Is extracted for 1 hour to 72 hours, preferably about 48 hours at room temperature, steam extraction, hot water extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction, heating extraction, supercritical extraction, preferably cold extraction It can be concentrated to obtain Bokryeongpi extract.
  • the composition containing the extract of Bokryeongpi (/ 3 ⁇ 4r / a cocos peel) according to the invention as an active ingredient can be used for the treatment of degenerative neurological diseases. Therefore, the present invention includes a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative neurological disease, the use of the extract of Bokryeongpi for the preparation of a therapeutic agent for neurodegenerative diseases, and administering a therapeutically effective amount of the extract of Bokryeongpi to the subject. It provides a method for treating neurodegenerative diseases.
  • the neurodegenerative disease according to the present invention refers to a degenerative disorder of mental function caused by gradual structural and functional loss of neurons (neurons), and specifically, Alzheimer's and Creutzfeldt- Progressive dementia and progressive progression by progressive death of neurons, Jakob disease, Huntington's disease multiple sclerosis, Guillain-Barré syndrome, Parkinson's disease, Lou Gehrig's disease and neurons Diseases selected from ataxia, and the like.
  • the pharmaceutical composition for preventing and treating neurodegenerative diseases comprising the extract of Bokryeongpi as an active ingredient is from 01 to 90 parts by weight, 0.01 to 90 parts by weight of 100% by weight of the pharmaceutical composition It may include, but is not limited to, by weight, 1 to 90 parts by weight, or 10 to 90 parts by weight, and may vary depending on the type and progress of the disease and the condition of the patient. .
  • the degenerative neurological disease pretreatment and therapeutic composition comprising the extract of Bokryongpi as an active ingredient is a pharmaceutically acceptable carrier, a diluent or excipient, including the prevention of degenerative neurological disease and It can be formulated as a therapeutic pharmaceutical preparation.
  • the carrier, excipient, and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbbi, manny, xili, erysri, malty, starch, acacia rubber, alginate, gel.latin, calcium phosphate, and calum silicate. , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyridone, water, methyl hydroxy benzoate, propyl hydroxy benzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition according to the present invention may be prepared in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method for preparing pharmaceutical preparations. It may be formulated into a dosage form, and in general, it may be formulated using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. which are commonly used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in the pharmaceutical composition, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. Can be prepared by mixing. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid for oral The preparations include suspending agents, liquid solutions, emulsions, and syrups, and may include various excipients, for example, wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, etc. may be used.
  • base of the suppository wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition for the prevention and treatment of degenerative neurological disease which contains the bokyeongpa extract of the present invention as an active ingredient, may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, but is generally 0.01 to lOO tng / kg. Amounts, preferably 1 to 30 mg / kg, may be administered once to several times daily. Also, the dosage is route of administration, degree of disease, sex. It may also increase or decrease depending on congestion, age, health condition, diet, administration time, administration method, and excretion rate. Therefore, the above dosage does not limit the scope of the present invention in any aspect.
  • composition for the prevention and treatment of degenerative neurological diseases containing the extract of Bokryeongpi as an active ingredient can be administered to various mammals such as rats, mice, livestock, humans. All modes of administration can be expected, for example by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections.
  • Bokryeongpi extract of the present invention is a drug that can be used with confidence even for long-term administration for the purpose of prevention because there is little toxicity and side effects.
  • the present invention is the above. It provides a food composition comprising an extract of Bokryeongpi.
  • the extract of Bokryeongpi is a protein that inhibits the production of substances causing neuronal death in the brain and promotes neuronal cell regeneration and differentiation. It has the effect of protecting the neurons by promoting the expression, and can be particularly useful in the manufacture of dietary supplements and general foods that may have the effect of preventing and improving neurodegenerative diseases.
  • the health functional food defined in the present invention is newly defined through the "2002 Act on Health Functional Foods", and “Fully functional and safe for humans are sufficiently established, and the Korea Food and Drug Administration Notice 2004-12) "Health foods listed in the regulation list on the functional food ingredients or ingredients recognized in the”.
  • the food composition comprising the extract of Bokryeongpi according to the present invention can be used in various foods for the relief of symptoms of neurodegenerative diseases.
  • Foods to which the herbal extract of the present invention can be added include various foods, such as beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health supplements. Pills, powders, granules, acupuncture, tablets, and capsules Or in the form of a beverage.
  • the amount of the extract of Bokryeongpi in the food of the present invention in the case of a health food composition can be added to 0.1 to 15% by weight, preferably 0.2 to 10% by weight of the total food weight, in the case of a health beverage composition It may be added in a ratio of 1 to 30 g, preferably 0.2 to 100 ra £.
  • the food composition according to the present invention is prepared in the form of a beverage, there is no particular limitation on the liquid component except for containing the herbal extract as an essential ingredient in the indicated ratio, and various flavors or natural carbohydrates are used as in the general beverage. It may contain as an additional component.
  • Examples of the natural carbohydrates described above include monosaccharides; Disaccharides such as glucose and fructose; Polysaccharides such as maltose and sucrose; Ordinary sugars such as textrin, cyclodextrin and the like or sugar alcohols such as Xyl, sorby, and erytri.
  • natural flavoring agents tactin, stevia extract (for example rebaudioside A, Glycyrrhin)
  • synthetic flavoring agents K saccharin, aspartame and the like can be advantageously used.
  • the ratio of the natural carbohydrate is generally about 1 to 20 g, preferably about 5 to 13 ⁇ 4 per 100 m £ of the total health beverage composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors such as flavoring agents, coloring agents and neutralizing agents (such as cheese and chocolate).
  • the compositions of the present invention may also contain pulp for the production of natural fruit juices and fruit juice beverages and vegetable beverages. These components can be used independently or in combination.
  • the ratio of such additives is not particularly limited, but is generally selected from 0 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the total food composition of the present invention.
  • the present invention provides a method for preventing, improving or treating degenerative neurological disease or for preventing, improving or treating degenerative neurological disease, comprising administering a composition containing the extract as an active ingredient. It is about a use. Dosage, dosage form of the composition containing Bokryeongpi extract for such a method or use. The method of administration is the same as mentioned above.
  • Poria s) dried at the Chinese herbal medicine of Kyungdong Market was purchased to remove the contaminants and the well-dried herbal medicine was used for the experiment.
  • Crushed 1L of distilled water with LOOG of Bokryeongpi in the state. 30, 50, 70, 95 (v / v)% ethanol solution was added, cooled to room temperature for 48 hours, filtered, concentrated under reduced pressure, and lyophilized to obtain Bokyeongpi herb extract (crude extract). (See Table 1).
  • the animals treated with A ⁇ 42 were randomly divided to form experimental groups. Two days after the administration of A ⁇ 42 , the experimental drug and the positive control drug donepezil were administered once daily for 11 days.
  • Lyophilized ethanol extract and control drug lyophilized were suspended in 3% HPMC aqueous solution and all drugs were used on the day of the experiment.
  • Bokyeongpi extract on neuronal cell death-inducing substances or substances involved in cell protection
  • 6-week-old ICR mice were administered for 5 days. Four hours after the fifth day, the animals were sacrificed and the brains of the animals were sacrificed and the hippocampus area was separated and used for protein analysis. The protein assay was performed to quantify the total protein in the sample, and the measured value was expressed as the measured value per unit protein.
  • the two zones were separated by a guillotine ine door (5x5 cm) and the guillotine door was opened 30 seconds after placing the experimental animals in the bright zone. The animals were freely explored. When they crossed the dark area, the guillotine door was closed and the animals were taken out after 3 seconds.
  • the experimental animals were placed in the light zone and the time to enter the dark zone was measured for the Retential trial.
  • the time required for the mice to move all four feet from the light room to the dark room was measured.
  • Equation 1 Y-maze experiments were performed to determine the effect on short-term spatial memory. The animals were placed on one arm of Y-maze and left for 8 minutes to roam freely. The spontaneous al ternat ions and the total number of entry were measured. When three arra were entered in succession, actual alternation was defined, and the alternation ratio was calculated by Equation 1 below.
  • Recognition rate of new objects time spent on new objects / (time spent on new objects + time spent on experienced objects) X 100
  • Oral administration of 95% ethanol extract at a 100 mg / kg dose resulted in improved cognitive memory in the scopolamine-induced memory formation suppression model, and also in Alzheimer's dementia model due to A ⁇ 42 administration as shown in FIG. was restored (FIGS. 3, 5).
  • Immunohistologic staining was performed with the hippocampal region, and the tissues washed with PBS were treated with 1% 3 ⁇ 40 2 for 15 minutes and then nonspecific. 0.05MPBS to prevent reaction.
  • the tissue was reacted with a peroxidase-linked secondary antibody (1: 200) for 90 minutes, and then diluted with ABC to complete solution for about 1 hour at room temperature.
  • After washing three times with PBS, and then developed with 0.02% DAB and 0.01% 3 ⁇ 40 2 was subjected to ethanol and xylene dehydration process to make a slide sample. .
  • the beta amyloid concentration in the brain was significantly decreased when orally administered the 0, 30, 50, 70, 95 (v / v) ethanol extract of Bokryeongpi at 100 mg / kg (FIG. 7).
  • Bokryeongpi extract causes Alzheimer's dementia. It was confirmed to remove the etiology beta amyloid.
  • SH-SY5Y cells (lxlO 6 cells / well) were seeded in 6-well culture plates and incubated for 48 hours in DMEM / F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium containing .10% FBS (fetal bovine serum). After 5 days of differentiation using DMEM / F12 medium containing 10 ⁇ M retinoic acid and 3% FBS, the extracts were treated at concentrations of 10 and 100 g / ral.
  • DMEM / F12 Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Phosphorylated tau levels were measured to confirm the inhibitory effect of tau hyperphosphorylation of Bokyeongpi extract. Inoculate SH-SY5Y cells (lxlO 6 cells / well) into 6-well culture plates and for 48 hours in DMEM / F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium containing 10% FBS (fetal bovine serum) Incubated. After 5 days of differentiation using DMEM / F12 medium containing 10 ⁇ retinoic acid and 3% FBS, Bokyeongpi extract was treated with a concentration of 10 or 100 ⁇ ⁇ / ⁇ 1, 6 hours later, and treated with A ⁇ 42 for a total of 48 hours. Incubated.
  • DMEM / F12 Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • tau phosphorylation induced by ⁇ 42 was inhibited when 0, 30, 50, and 70.
  • 95 (v / v)% ethanol extract was treated at 10 yg / ml of the neuronal cell line. It returned to normal level.
  • Donepezil which is widely used for dementia, a representative degenerative brain disease, did not show tau phosphorylation inhibitory effect (FIG. 11). '
  • NGF Neve growth factor
  • NGF levels were measured to confirm the mechanism of the cognitive abilities of the extracts.
  • SH-SY5Y cells IxlO 6 cells / well
  • DMEM / F12 Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the extracts were treated with a concentration of 10 or 100 Mg / nil.
  • BCA reagent purchased from Pierce.
  • NGF levels were measured using beta Nerve growth factor human Enzyme-linked i® unosorbentassay (ELISA) KIT purchased from Abeam.
  • the capsules are prepared by mixing the above components and layering the gelatine capsules according to a conventional method for producing a capsule.
  • Formulation Example 4 Preparation of Liquid
  • the above components are mixed according to a conventional method for preparing a liquid, layered and sterilized in 100 brown bottles to prepare a liquid.

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Abstract

본 발명의 복령피 (학명: Poria cocos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 복령피 추출물은 베타아밀로이드 생성 및 타우 인산화 억제, NGF 생성 촉진작용을 통한 신경세포 보호작용, 신경세포 보호 및 아세틸콜린에스터라제 억제를 통한 기억력 개선작용을 가짐으로써, 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 또는 상기 목적의 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
[발명의 명칭】
복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
【기술분야】
본 발명은 복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
【배경기술]
퇴행성 신경질환은 신경세포 (뉴런)의 점진적인 구조적， 기능적인 손실로 인해 발생하는 정신적 기능의 퇴화 질환을 의미한다. 퇴행성 신경질환은 신경계의 특정부위에 신경세포 퇴화가 진행되어 치매. 추체외로 이상. 소뇌 이상， 감각 장애, 운동 장애 등의 증상을 동반하며， 동시에 여러 부위에 이상이 나타나 증상이 복합적으로 나타날 수도 있다. 환자가 보이는 임상 양상에 따라 질환을 진단하는데， 증상이 다양하게 나타나고 서로 다른 질환돌이 공통적인 임상 증상을 보이는 경우가 많아 진단에 어려움이 있다 Sci. Med. Vol. 40. No. 6， pp. 847-858. 1995) .
퇴행성 신경질환은 질환 징후가 서서히 나타나며, 노화와 함께 발병되는 경우가 많다. 일단 발병하면 사망까지 수년 혹은 수십년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행되어 사회적 부담이 매우 크다. 발병원인에 가족력에 따른 유전적 영향이 상당히 있는 것으로 알려져 있으나 후천적인 요인도 증요하게 작용하는 것으로 판단된다. 퇴행성 신경질환은 그 임상 증상에 따라 크게 진행성 치매 (알츠하이머병 등), 및 신경학적 이상 (픽병 등)， 자세 및 운동 이상 (파킨슨병 등)， 진행성 실조증, 근위축 및 위약, 감각 및 운동 장애 등으로
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Journal of Engineer ing and Technology7, Vol.2, No.4, August 2010 Classification of Neurodegenerative Disorders Based on Major Risk Factors Employing Machine Learning Techniques) .
대표적인 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 치매의 직접적인 발병 원인으로 Αβ plaque와 타우 (Tau) 과인산화 tangle의 세포독성이 주목 받고 있다.
Αβ는 전구체인 ΑΡΡ로부터 생성되며 β-세크레타아제 (β-secretase), γ-세크레타아제 (γ— secret ase) 등 효소의 작용으로 신경세포 바깥쪽에서 만들어진다ᅳ Αβ 농도가 일정 수준 이상이 되면 Αβ 단백질끼리 결합해 불용성인 노인반 (senile plaque)가 형성된다. 아 물질은 염증 및 신경독성을 유발해 주위 신경세포를 파괴할 수 있다. 예를 들면， 알츠하이머 치매 질환 환자에게서 관찰되는 신경세포의 사멸과 미세신경아교증이 노인반과 연관된 것으로 알려져 있다. 시험관 내 실험결과에서， Αβ 펩티드는 미세아교세포 (뇌 대식세포)의 활성화를 유발할수 있는 것으로 나타났으며， 이는 알츠하이머 질환이 있는 환자의 뇌에서 발견되는 미세신경아교증 및 뇌 염증의 원인이라는 가설을 지지해준다. 한번 Αβ가 만들어지고 노인반이 형성되면 이를 현저하게 용해시키거나 또는 침착물의 형성을 방지할 것으로 기대되는 널리 용인되는 요법 또는 치료제는 현재까지 없다.
타우는 Ν—말단돌출 부분, 프를린 (proline) 웅집 도메인ᅳ 미세소기관 결합 도메인 및 C—말단의 4부분으로 구성되어 있으며 (Mandelkow et al .， Acta. Neuropathol. , 103, 26-35， 1996) , 신경세포의 물리적 구조를 형성하는 미세소관 (microtubule)을 연결하는 역할을 한다. 중추신경계의 신경세포 속에서 타우가 비정상적으로 과인산화되거나 변형되는 경우 타우병증 (tauopathy)와 같은 퇴행성 뇌질환을 유발한다고 알려져 있다. 알츠하이머 치매 (Alzheimers disease) , 픽병 (Picks disease) , 17번 염색체연관 파킨슨병 수반 전두측 두엽성 치매 (FTDP-17) 등이 대표적인 타우병증에 속한다 (Lee et al. , Annu. Rev. Neurosci. , 24, 1121-1159, 2001； Bergeron et al., J. Neuropathol . Exp. Neurol . , 56, 726-734 , 1997； Bugiani et al .， J. Neuropathol . Exp. Neurol . , 58, 667-677, 1999; Delacourte et al . , Ann. Neurol. , 43, 193—204, 1998； Ittner and Got z, Nat. Rev. Neurosci. , 12, 65-72, 2011).
신경영양인자 (Neurotrophic factor)들이 퇴행성 신경질환의 치료 가능성을 가지고 있다는 것은 1980년대의 알츠하이머 실험에서 제기되었다 (Nature. 1987 Sep 3-9:329(6134)： 65-8. Amelioration of cholinergic neuron atrophy and spatial memory impairment in aged rats by nerve growth factor.). 알츠하이머의 병인으로 알려진 노화로 인하여 손실된 기저 전뇌의 콜린성 뉴런이 신경성장인자 (NGF)의 측뇌실 투여로 인하여 복구되며, 이로 인한 실험동물의 기억 능력 향상이 보고되면서 신경영양인자를 이용하여 퇴행성 신경질환을 치료하고자 하는 연구들이 계속 진행되었다. 후속 연구로서 안면 신경과 좌골 신경의 결절로 운동 신경의 기능을 손상시킨 뒤， 신경영양인자 패밀리 (neurotrophic factor family)인 뇌유래신경영야인자 (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) , 뉴로트로핀 -3(Neurotrophin-3, NT-3), 뉴로트로핀 -4(Neurotrophin-4, NT— 4)， 섬모 향신경성 인자 (Ciliary neurotrophic factor, CNTF)등으로 손상된 운동신경의 기능을 복구시킨 연구가 진행되어 긍정적인 결과를 얻었다 ( Na t ur e · 1992 Dec 24-31； 360 ( 6406 )： 757-9. Br a i n-der i ved neur 01 r oph i c factor prevent s the death of motoneurons in newborn rats after nerve section.). 또한, 노화에 따라 점진적으로 운동 뉴런의 수와 기능이 상실되는 질병을 '앓는 유전자 재조합 마우스 (wobbler)를 이용한 실험에서는 BDNF와 CNTF롤 투여하여 운동 뉴런의 수를 증가시키며 그 기능올 향상시켰다 (Science. 1994 Aug 19； 265(5175)： 1107-10. Arrest of motor neuron disease in wobbler mice cotreated with CNTF and BDNF) . 위에서 언급한 연구결과 외에도 신경영양인자들이 다양한 감각, 운동 신경 병태 모델에서 뉴런의 수와 기능을 증가시켜, 실험동물의 기억. 인지， 행동 등의 장애를 개선시킴이 다수의 연구에서 보고되고 있다.
복령 (茨)의 학명은 Poria cocos 로서 분류학적으로 진정담자균강， 동담자균아강 (모균아강)， 민주름버섯목， 구멍장이버섯과에 속한다. 주로 소나무에서 사물기생을 하지만 살아있는 소나무의 뿌리와 연결되어 활물기생을 하기도 하는 갈색 부후균으로 담자균류에 속하는 균류의 일종이다. 균사는 백색으로 분지하면서 계속 생장하다가 균사돌끼리 서로 엉기기 시작하고, 은도 습도 둥 알맞은 환경조건이 지속되면 되면 내구체인 단단한 덩어리 형태의 균핵이 형성된다. 이것을 복령이라 하며, 내부의 색깔에 따라서 백색이면 백복령, 담홍색이면 적복령이라하며 외피를 복령피라고 한다.
복령은 주요. 성분으로 복령산 (Parchymic acid, C33H52O5), 송령산 (Pinicolic acid, C30H1803), 송령신산 (3β— Hyderoxy— lanosta-7.9(ll) , 24-Tr ien-2 l-o ic acid와 Tumulosic acid(C3iH500) Ebricoic acid(C31H5o03)등을 함유하고 있으며 복령과 복령피에서 트리테르펜 (triterpene) 류인 poricoic acid와 그 유도체가 분리되어 보고된 바 있다. 이 외에도 파기민산， 에브리코산, 폴리포텐산 A, C, 트리테르페노이드 등이 들어 있으며 에르고스테를， 레시틴, 아데닌, 콜린, 포도당, 과당 및 단백질과 많은 양의 무기 물질이 들어있다.
복령은 맛이 달며 성질은 따뜻하고 그 맛과 성질이 모두 가벼워서 양성에 속하는 약재라고 전해지고 있다. 과거 문헌에서는 갈증을 내리고 소변을 원활하게 하며 습기를 제거하고 몸의 상태를 적당히 조정해 주고, 소화기 기능을 조화시켜 기운을 돋우며 허리를 부드럽게 해줌으로써 복부의 어혈을 잘 순환시키며 기억력과 관련된 처방에 주로 사용되었고 최근 논문에서 항당뇨효과， 항암효과 등이 보고된 바 있다 (Ling Hui, Evaluation of the chemotherapeut ic and chemopr event ive potential of tri terpenoids from Poria cocos , Ling Hui , doctoral thesis of department of pharmacy , National University of Singapore, 2010) .
복령피는 구멍장이버섯과의 복령균핵의 바깥 껍질로, 수 (水)를 배출시켜서 부종 (浮腫)을 가라앉히는 효능이 있는 약재로 알려져 있다. 특히 라노스탄 (lanostane)계 트리테르펜 (triterpene)인 poricoic acid가 풍부하며 동의보감에서 부종에 처방되는 오피산 (글피， 대복피， 복령피， 생강피， 상백피)에 사용되는 생약으로 최근 논문에서 이뇨， 배뇨 촉진， 부종 감소 号의 효고 7 보고된
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있다. (Triterpenes from the surface layer of Poria cocos . Takaaki tai , Phytochem, 39.5,1995; Urinary raetabonomic study of the surface layer of Poria cocos as an effect ive treatment for chronic renal injury in rats , ying yong zhao et al , J of Ethnopharmacology, 148,2,2013) 이러한 배경하에서， 효과적인 퇴행성 신경질환의 예방， 개선 및 치료에 대한 의약 및 식품 조성물에 관한 소재에 대해 예의 연구한 결과， 본 발명자는 복령피의 신경계 활성 연구 중 복령피 추출물이 다양한 뇌 신경 상해 또는 기억력 형성 억제 약물에 의해 유발되는 뇌 신경 질환 모델에서 복령피 추출물이 유의적인 기억력 회복 작용을 나타냄을 확인하였다. '또한 복령피 추출물이 뇌 내에서 신경세포 사멸을 일으키는 물질의 생성을 억제하고 신경세포 재생 및 분화를 촉진하는 단백질의 발현을 촉진해 신경세포를 보호함을 증명해 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 복령피 (학명 : Ρω—ia cocos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학적 조성물과 퇴행성 신경질환 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 퇴행성 잘환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. .
【유리한 효과】
본 발명의 복령피 추출물은 신경세포 사멸을 유발해 퇴행성 뇌 질환의 원인이 될 수 있는 베타아밀로이드 (Amyloidᅳ β; Abeta)의 생성 및 타우의 인산화를 억제해 신경세포를 보호하고， 아세틸콜린에스터라제 (Acetylcholinesterase; AChE)를 억제하여 신경전도를 증가시키고 기억력 향상 작용을 매개하는 효과를 보이는 바， 본 발명의 복령피 추출물은 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물 또는 건강식품 조성물로 유용하게 이용될 수 았다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 복령피 추출물을 처리한 후， 스코폴라민으로 기억력 형성을 억제한 실험동물모델에서의 수동회피시험 (Passive avoidance task)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 복령피 추출물을 처리한 후， 스코폴라민으로 기억력 형성을 억제한 실험동물모델에서의 Y-maze task의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 복령피 추출물을 처리한 후， 스코폴라민으로 기억력 형성을 억제한 실험동물모델에서의 Novel object recognit ion(NOR) task의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 베타아밀로이드를 뇌에 infusion 시켜 알츠하이머 치매 증상을 유발시킨 동물모델에서 , 복령피 추출물을 처리했을 때 Y-maze task의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 베타아밀로이드를 뇌에 infus i on .시켜 알츠하이머 치매 증상을 유발시킨 동물모델에서, 복령피 추출물을 처리했을 때 Novel obj ect recogni t i on task(NORT)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 베타아밀로이드를 뇌에 infus i on 시켜 알츠하이머 치매 증상을 유발시킨 동물모델에서， 복령피 추출물을 처리했을 때 신경세포 염색 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 정상 동물에 복령피 추출물을 처리한 후 베타아밀로이드를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 정상 동물에 복령피 추출물을 처리한 후 NGF 생성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 신경세포주인 SH— SY5Y 세포주에 복령피 추출물을 처리한 후 AChE 활성을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10는 신경세포주인 SH-SY5Y 세포주에 복령피 추출물을 처리한 후 ^1" &533 로 세포사멸 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 11는 신경세포주인 SH-SY5Y 세포주에 복령피 추출물을 처리한 후 타우의 인산화 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 신경세포주인 SH-SY5Y 세포주에 복령피 추출물을 처리한 후 NGF 생성을 측정한 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 복령피 (학명 : Poria cocos) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 복령피 추출물은 통상의 생약 추출물의 제조방법에 따라 제공될 수 있지만, 구체적으로는, 조추출물로써 물, 알코올, 또는 물과 알코올의 흔합한 용매를 사용한 추출물을 의미한다. 상기 추출 용매 중 하나인 알코올은 이에 한정되는 것은 아니지만 탄소수 1 내지 4의 저급 알코을， 바람직하게는 메탄올， 에탄을, 부탄을 또는 주정일 수 있으며， 더욱 바람직하게는 에탄올일 수 있다. 상기 복령피 추출물은 추출용매로서 주정을 사용하여 제조될 수 있는데 , 여기서 '주정 '이란 전분질 원료 또는 당질 원료를 발효시킨 후 증류하여 만든 에탄올을 의미한다. 또한 상기 물과 알코올의 흔합용매는 특별히 한정됨이 없이, 임의 적량 비율대로 흔합하여 사용할 수 있다ᅳ
본 발명의 한 구체예에서， 복령피 추출물은 60내지 80(v/v)%에탄을， 65 내지 75(v/v)¾ 에탄올 또는 70(ν/ν)% 에탄올로 추출된 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적인 일 실시 양태로서, 본 발명의 복령피 추출물은 하기와 같이 수득될 수 있다. 먼저， 본 발명의 복령피를 각각 세척 및 건조한 후, 건조 생약을 절단하여 절단 생약을 얻고, 상기 건조 절단 생약 중량의 1에서 20배 (v/w) , 바람직하게는 5배 내지 10배 (v/w)의 물， 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올， 또는 물과 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올의 흔합물， 바람직하게는 70(v/v) 에탄올을 넣어， 10oC 내지 100°C , 바람직하게는 상온의 추출 온도에서 1시간 내지 72시간， 바람직하게는 약 48 시간 동안 넁침 추출， 열수추출, 초음파추출, 환류냉각추출, 가열추출, 초임계추출， 바람직하게는 냉침 추출로 1회 추출하여 감압농축하여 복령피 추출물을 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 복령피 (/¾r/a cocos peel ) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 퇴행성 신경질환의 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학 조성물， 퇴행성 신경질환 치료제의 제조를 위한 복령피 추출물의 용도, 그리고 치료상 유효량의 복령피 추출물을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환의 치료 방법을 제공한다. 앞서 언급된 바와 같이， 상기 본 발명에 의한 퇴행성 신경질환은 신경세포 (뉴런)의 점진적인 구조적， 기능적인 손실로 인해 발생하는 정신적 기능의 퇴화 질환을 의미하는 것으로， 구체적으로는， 알츠하이머， 크로이츠팰트-야콥병， 헌팅튼병 다발성경화증, 길랑 -바레 증후군， 파킨슨병， 루게릭병， 신경 세포의 점차적인 사멸에 의한 진행성 치매 및 진행성 실조증으로부터 선택된 질환 등을 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서， 상기 복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 전체 약학 조성물 100 중량부에 대하여 복령피 추출물을 으 01 내지 90 중량부, 0. 1 내지 90 중량부， 1내지 90중량부， 또는 10내지 90중량부로 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고， 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 달라질 수 있다. . - 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예빙ᅳ 및 치료용 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체., 희석제 또는 부형제를 포함하여 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 의약 제제로 제제화 할 수 있다.
상기 담체， 부형제 및 희석제로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로스， 솔비를, 만니를, 자일리를， 에리스리를， 말티를， 전분， 아카시아고무， 알지네이트， 젤.라틴， 칼슘포스페이트, 칼슴실리케이트, 셀롤로즈, 메틸셀롤로즈, 미정질셀를로스, 폴리비닐피를리돈, 물， 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크， 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 의약 제제로 제조되기 위해 통상의 방법에 따라 산제， 과립제ᅳ 정제， 캡슐제, 현탁액， 에멀견, 시럽， 에어로졸 등의 경구형 제형， 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 제형으로 제제화될 수 있는데， 일반적으로, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제, 과립제， 캡슐제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분,칼슘카보네이트,수크로스， 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슴 스테아레이트， 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제， 유제， 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제， 현탁제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르ᅵ 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골, 트원 ( tween) 61 , 카카오지， 라우린지， 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. ᅳ 본 발명의 복령파 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물의 투여량은 환자의 나이， 성별， 체중에 따라 달라질 수 있으나， 일반적으로 0. 1내지 lOO tng/kg의 양，바람직하게는 1내지 30 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로,질병의 정도，성별. 체증，나이，건강상태，식이,투여시간, 투여방법， 배설율 등에 따라서도 증감될 수 있다. 따라서， 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료용 약학 조성물은 쥐， 생쥐， 가축， 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데， 예를 들면， 경구， 직장 또는 정맥， 근육， 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 복령피 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다. 또한 본 발명은 상기. 복령피 추출물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 복령피 추출물은 뇌 내에서 신경세포 사멸을 일으키는 물질의 생성을 억제하고 신경세포 재생 및 분화를 촉진하는 단백질의 발현을 촉진해 신경세포를 보호하는 효과가 있어 특히 신경퇴행성 질환의 예방 및 개선 효과를 나타낼 수 있는 건강기능식품 및 일반 식품의 제조에 유용하게 사용될 수 .있다. 본 발명에서 정의되는 건강기능식품은 구체적으로는，" 2002년 건강기능식품에 관한 법률' '을 통하여 새롭게 정의된 "인체에 대한 기능성 및 안전성이 충분하게 확립되어 식품의약품 안전청 식약청 고시 2004-12호에 규정된 건강기능식품원료 또는 성분 인정에 관한 규정 목록집에 수재된 건강식품"이다. 본 발명에 따른 복령피 추출물을 포함하는 식품 조성물은 퇴행성 신경질환의 증상 완화를 위한 식품에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 생약 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류， 예를 들어, 음료. 껌，차, 비타민 복합제， 건강보조 식품류 등이 있으며，환제，분말,과립, 침제， 정제， 캡술 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.
이때， 본 발명의 식품 중의 상기 복령피 추출물의 양은, 일반적으로 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0. 1 내지 15 증량 %， 바람직하게는 0.2 내지 10중량 %로 가할 수 있으며， 건강음료 조성물의 경우 100ra£를 기준으로 으 1 내지 30g, 바람직하게는 0.2 내지 의 비율로 가할 수 있다. 본 발명에 따른 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우， 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생약 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드; 포도당, 과당 등 디사카라이드; 말토스， 수크로스 등 폴리사카라이드; 텍스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 또는 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴， 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진둥) ) 및 합성 향미저 K사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 전체 건강음료 조성물 100 m£당 일반적으로 약 1 내지 20g , 바람직하게는 약 5 내지 1¾이다. 상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러가지 영양제， 비타민， 광물 (전해질)， 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제， 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등) . 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제， pH조절제， 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜， 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 특별히 제한이 없으나， 본 발명의 전체 식품 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또 다른 하나의 양태로서， 본 발명은 복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는， 퇴행성 신경질환 예방, 개선 또는 치료방법 또는 퇴행성 신경질환 예방， 개선 또는 치료를 위한 복령피 추출물의 용도에 관한 것이다. 이러한 방법 또는 용도를 위한 복령피 추출물을 함유하는 조성물의 투여량， 투여형태. 투여방법 등은 상기에서 언급된 것과 같다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
〈실시예 1>본 발명에 따른복령피 추출물의 제조
경동시장의 한약재상에서 건조된 복령피 Poria s)를 구입하여 협잡물을 제거하고 잘 건조된 상태의 생약을 실험에 사용하였다. 분쇄한 상태의 복령피 lOOg을 1L의 증류수. 30, 50, 70， 95 (v/v)% 에탄올 수용액을 가해 상온에서 48시간 동안 냉침한 후 여과하고 이를 감압농축한 후， 동결 건조시켜 복령피 생약 추출물 (조추출물)을 수득하고 실시예 1로 하였다 (표 1 참조).
【표 1]
본 발명에 따른 복령피 추출물의 제조
Figure imgf000014_0001
<실험예 1>복령피의 기억력 향상효능 및 신경보호작용 확인
<1-1>실험동물 준비
스코폴라민 유도 기억력 억제 (Scopolamine induced rnonory impairment) 모델
6주령 ICR raouse* 실험에 사용하였으며 각 실험군은 8마리의 동물로 구성하였다ᅳ 복령피 추출물 및 대조약물을 투약하고 30분 후에 1 mg/kg 스코폴라민을 복강투약 (i.p) 하였다. 정상 (Norraal) 동물에는 동량의 생리식염수를 주사하였다.
스코폴라민 투약 30분 후에 행동실험을 수행하였다.
Αβ infusion모델
실험에 6주령 ICR mice를 사용하였다. 실험동물을 마취시키고 stereotaxic apparatus (Stoelting)에 고정시킨 후 Hamilton micro syr inge(f itted with 26— gauge needle)를 이용해 3 μΐ의 vehicle(artif icial CSF) 또는 Αβ42을 6분 동안 주입하였다.
Αβ42를 투여한 동물을 무작위로 나누어 실험군을 구성하였다. Αβ42 투여 2일.후부터 실험약물 및 양성대조 약물인 도네페질을 11일간 1일 1회 투약하였다.
동결건조한 복령피 에탄올 추출물 및 대조약물을 3% HPMC 수용액에 현탁하여 사용하였으며 약물은 모두 실험 당일에 조제하여 사용하였다.
Brain내 단백질 측정
신경세포 사멸 유발 물질 또는 세포보호에 관여하는 물질 생성에 대한 복령피 추출물의 효능을 알아보기 위해 6주령 ICR 마우스에 복령피 추출물 및 대조약물을 5일간 투여하였다. 5일째 투약 4시간후에 실험동물을 희생시켜 동물의 뇌를 취하였으며 해마 (hippocampus) 영역을 분리하여 단백질 분석에 사용하였다. protein assay를 수행하여 샘플 내 총 단백질량을 정량하였으며, 측정 수치를 단위 단백질 당 측정물질 값으로 나타내었다.
<1-2>수동회피실험 (Passive avoidance task)
수동회피 실험은 두 개의 독립적으로 분리된 밝고 어두운 정사각형 상자에서 시행하였다. 밝은 구역 (20 20 20 cm)은 50 W 백열전구로 조명하였다. 밝은 구역 및 어두운 구역 (20 X 20 X 20 cm)은 1 cm 간격으로 떨어져 2隱 스테인리스 스틸 봉 (stainless steel rods)을 설치하였다.
Habi tuat ion 단계에서는 두 개 구역을 길로틴 문 (gui l lot ine door) (5x5 cm)로 분리하고 실험 동물을 밝은 구역에 넣은 후 30초 후에 길로틴 문을 열었다. 실험동물이 자유롭게 탐색.하도록 하였으며 어두운 구역에 넘어가면 길로틴 문을 닫고 3초 후 실험동물을 꺼내었다.
24시간 후 어큐지션 트라이얼 (Acqui si t ion tr i al )을 진행하였다. 약물 및 대조약물 투여 30분 후에 1 mg/kg스코폴라민을 복강 투약하고 다시 30분 후에 행동실험을 진행하였다. 실험쥐를 처음에 밝은 구역에 놓고 구역 사이에 있는 문을 30초 후에 열었다. 실험쥐가 어두운 구역에 들어가면 길로틴 문을 닫고， 스테인리스 스틸 봉을 통해 즉시 전기 충격 (electr ical foot shock)을 0.5 mA 강도로 2초간 주었다. 실험동물이 어두운 구역에 들어간 시간을 특정하였다.
어큐지션 트라이얼을 시행하고 24시간 휴식시간을 준 후 리텐설 트라이얼 (Retential trial) 측정을 위해 실험동물을 밝은 구역에 놓았고 어두운 구역으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다. 어큐지션 트라이얼 및 리텐셜 트라이얼 모두 실험쥐가 밝은 방에서 어두운 방으로 네 발이 모두 들어갔을 때까지 걸린 시간을 측정하였다.
그 결과， 도 1에 나타난 바와 같이， 복령피 0， 30， 50, 70， 95(v/v)% 에탄올 추출물을 100 mg/kg용량으로 경구투여 시 통계적으로 유의적인 공간 기억력 증진 .효과가 나타나는.것을 확인하였다. 가장 효능이 높은 복령피 70% 에탄올 추출물은 아세틸콜린에스터라제 저해제로 알려진 도네페질 (Donepezii, DPZ) 1 mg/kg와 비슷한 정도의 효능을 나타내었다 (도 1). <1-3> Y-maze test
단기 공간 기억력에 대한 영향을 알아보기 위해 Y-maze 실험을 수행하였다. 실험동물을 Y— maze 한쪽 arm에 놓고 자유롭게 돌아다닐 수 있게 8분간 방치하였으며 자발적 변경행동 (spontaneous al ternat ion)과 총 진입 흿수를 측정하였다. 연속해서 3개의 arra에 진입했을 때를 actual alternation으로 정의하였으며 alternation 비율을 다음 수학식 1로 계산하였다.
[수학식 1]
변경행동 (Spontaneous alternat ion)비율 (%) = [(변경흿수) / .(총 arm 진입 횟수 -2)] X 100
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 복령피 0， 30， 50， 70. 95(v/v)% 에탄을 추출물을 100 mg/kg 용량으로 경구 투여 시 스코폴라민으로 유도한 기억력 형성 억제 모델에서 공간 기억력 향상 효능을 보였으며 도 4에 나타난 바와 같이 Αβ42 투여로 인한 알츠하이머 치매 모델에서도 공간 기억력이 회복되었다 (도 2， 4). <1一4> Novel object recognit ion (NOR) task
가로 45cm， 세로 45cm , 높이 50cm의 검은색 상자에 크기는 같지만 모양이 다른 2개의 플라스틱으로 만든 물체를 상자 안에 넣었다. 실험동물이 8분간 자유롭게 돌아다니도록 방치하고 각 물체에서 소비하는 시간을 측정하였다 (training session) . 24시간 후 tra ining sess ion에서 경험한 물체 1개와 새로운 물체 1개가 있는 상자 안에 실험동물을 넣고 각 물체에서 소비하는 시간을 측정하였다 (test session) . 기록한 수치를 다음 수학식 2를 이용하여 계산한 결과를 새로운 물체의 인식 시험 결과로 나타내었다.
[수학식 2]
새로운 물체의 인식율 (%) = 새로운 물체에 소비한 시간 /(새로운 물체에 소비한 시간 + 경험한 물체에 소비한 시간) X 100 그 결과 도 3에 나타난 바와 같이 복령피 0， 30 , 50 , 70 , 95% 에탄올 추출물을 100 mg/kg 용량으로 경구 투여 시 스코폴라민으로 유도한 기억력 형성 억제 모델에서 인지 기억력을 향상 효능을 보였으며 도 5에 나타난 바와 같이 Αβ42 투여로 인한 알츠하이머 치매모델에서도 인지 기억력을 회복시켰다 (도 3 , 5) .
<1-5> 면역조직화학염색
면역조직화학염색을 위하여 상기 실험예 <1ᅳ1>에서 기술한 Αβ42 infus i on실험동물을 IX PBS(phosphate buf fer sal ine)로 심장관류 시키고 4% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)로 고정시킨 후 뇌를 적출하였다. 같은 용액에 하루를 고정시키고 30% 수크로스 (sucrose) 용액에 넣어 40C에서 동결 절편히-기 전까지 이를에 한 번씩 용액을 갈아주면서 보관하였다. 그 후， 동결 절편기 (cryostat )에서 뇌 조직을 -20°C에서 0CT(opt imal cutt ing temperature) 화합물을 떨어뜨려 층분히 얼린 후， 30 ΛΙΙ 두께의 절편으로 만들어 보존액에 넣어 4°C에서 보관하였다. 면역조직 염색은 해마 영역을 가지고 수행하였고, PBS로 세척한조직을 1 % ¾02로 15분간 처리 후 비특이적 반웅을 막기 위하여 0.05MPBS. 1.5%정상 염소혈청 (normal goat serum) , 0.5 mg/ml 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin), 0.3 ¾트리톤 (triton) X— 100과 일차 항체 (goat NeuN primary antibody, 1:500)를 24시간 동안 4°C에서 반웅시켰다. 일차 항체를 제거한 후, 조직을 페록시다아제 (peroxidase)가 연결된 이차 항체 (1:200)에 90분 동안 반웅시킨 다음， ABC를 완층액에 희석하여 상온에서 약 1시간 동안 반웅시켰다. PBS로 3회 세척한 다음, 0.02 % DAB와 0.01 % ¾02로 발색시킨 것을 에탄올과 자일렌 (xylene) 탈수과정을 거쳐 슬라이드 샘플을 만돌었다..
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 복령피 0, 30, 50, 70， 95(v/v)% 에탄올 추출물을 100 mg/kg 용량으로 경구 투여 시 베타아밀로이드 독성에 의해 감소된 신경세포 (NeuN 양성)가 유의적으로 증가하였다 (도 6). 복령피 추출물은 신경세포 보호작용이 있으며 이를 통해 기억력을 증가시킬 수 있음을 확인하였다ᅳ <1-6> brain내 Αβ 생성 측정
알츠하이머 발병의 주요원인으로 알려진 베타아밀로이드 생성에 대한 복령피 추출물의 억제 효능을 확인하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다.
실험예 <1-1>의 정상 동물의 뇌를 적출한 후 Ripa buffer를 가하고 이를 기계적으로 균질하게 분쇄하였다. 원심분리를 통해 상등액을 취한 후 이를 베타아밀로이드 분석 kit (IBL)를 이용해 뇌에 분포하는 베타아밀로이드 농도를 측정하였다.
그 결과， 도 7에 나타낸 바와 같이 복령피 0, 30， 50， 70, 95(v/v) 에탄올 추출물을 100 mg/kg 용량으로 경구 투여 시 뇌 내 베타아밀로이드 농도가 유의적으로 감소하였다 (도 7). 이상의 결과를 통해 복령피 추출물은 알츠하이머 치매를 유발하는 . 병인인 베타아밀로이드를 제거함을 확인하였다.
<1-7> NQ nerve growth factor； 신경성장인자) 레벨 측정
신경세포 재생 및 분화작용이 있다고 알려진 NGF 생성에 대한 복령피의 효능을 확인하기 위해 ELISA 실험을 수행하였다. 상기 실험예 <1— 1>의 정상 동물의 뇌를 적출한 후 해마 영역을 분리하고, Ripa buffer를 가하고 이를 기계적으로 균질하게 분쇄하였다. NGF 측정을 위해 각 뇌의 ' 증량에 대웅되는 high salt high detergent buffer를 가하고 이를 기계적으로 균질하게 분쇄하였다. 4N HC1을 ΙΟμΙ 가하고 15분간 방치해 수용체와 결합한 NGF를 해리시키고 4Ν NaOH를 가하고 다시 15분간 방치하였다. 원심분리를 통해 상등액을 취한 후 이를 NGF 측정 kit (Millipore)를 이용해 뇌에 분포하는 NGF농도를 측정하였다.
그 결과， 도 8에 나타낸 바와 같이 복령피 0， 30, 50, 70, 95%에탄올 추출물을 100 mg/kg 용량으로 경구 투여 시 뇌 내 NGF 농도가 유의적으로 감소하였다 (도 8). 이상의 결과를 통해 복령피 추출물은 NGF 생성촉진을 통해 신경세포 보호작용을 나타냄을 확인하였다.
<실험예 2>복령피의 시험관 내 (in vitro) 신경세포 보호효과 확인 <2-1>신경세포주에서의 Acetylcholinesterase (AChE) 활성 측정 아세틸콜린에스터라제 억제제는 신경절 내 신경전달물질인 아세틸콜린 농도를 높여 콜린성 신경세포를 활성화함으로써, 기억 능력의 개선 및 치매 개선을 매개하므로 현재 다양한 아세틸콜린에스터라제 억제제들이 개발되어 사용되고 있다. 복령피 흔합 추출물의 아세틸콜린에스터라제 저해 효과를 확인하기 위하여 아세틸콜린에스터라제 활성을 측정하였다. 신경세포주인 SH-SY5Y 세포는 KCLB (한국세포주은행)으로부터 구입하였다. SH— SY5Y 세포 (lxlO6세포 /well)을 6— well 배양플레이트에 접종하고,.10 % FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 10 μΜ retinoic acid와 3 % FBS 를 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 5 일간 분화시킨 후， 복령피 추출물을 10, 100 g/ral의 농도로 처리하였다. RIPA buffer (150 niM NaCl . 0.5 % Triton X-100, 50 πιΜ Tris-HCl, H 7.4, 25 raM NaF, 20 mM EGTA. 1 mM DTT, 1 mM Na3V04, protease inhibitor cocktail)를 사용하여 세포용해시킨 후， 단백질 함량을 Pierce 사에서 구입한 BCA 시약으로 정량하였다. 아세틸콜린에스터라제의 효소활성은 Ellman 방법에 따라 아세틸콜린을 기질로 사용하였으며 아세틸콜린에스터라제에 의해 생성되는 thiocholine을 DTNB와 반웅시켜 그 결과 생성되는 5— thio— 2-nitrobenzoate를 405 nm에서 흡광도 변화를 측정하여 수행하였다.
그 결과 도 9에 나타난 바와 같이 복령피 0, 30, 50, 70， 95(v/v)% 에탄올 추출물을 10 yg/ml 농도로 신경세포주에 처리 했을 때 Αβ42에 의해 유도되는 아세틸콜린에스터라제 활성이 억제되어 정상수준으로 회복되었다 (도 9).
<2-2>신경세포주에서의 세포보호효과
Αβ42를 인위적으로 집합 (aggregate) 시킨 물질을 이용하여 신경세포주에 대한 독성을 일으켜 복령피 추출물의 세포보호효과를 MTT (3-(4, 5— D imethylthiazol -2-y 1)-2, 5-D i heny ltetrazol ium Br om i de ) as say를 이용하여 측정하였다. SH— SY5Y 세포 ( 104세포/\ 11)를 96— well 배양플레이트에 접종하고， 10 % FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium', nutrient mixture Fᅳ 12) 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 10 μΜ retinoic acid와 3 % FBS 를 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 5 일간 분화시킨 후 복령피 추출물을 0.01, 0.1, 1, 10， 100 또는 200 yg/ml의 농도로 처리 6 시간 후， Αβ42를 처리하여 총 48 시간 배양하고, 2 mg/ml MTT 처리 4 시간 후， DMS0로 Formazon을 녹여 590 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 10에 나타난 바와 같이 복령피 0, 30， 50， 70， 95(v/v)% 에탄올 추출물을 10 g/ml 농도로 신경세포주에 처리했을 때 Αβ42에 의해 유도되는 세포독성이 농도의존적으로 억제되어 세포 수가 증가되는 것이 관찰되었다 (도 10).
<2-3>신경세포주에서의 인산화된 타우측정
복령피 추출물의 타우 과인산화 저해 효과를 확인하기 위하여 인산화된 타우 레벨을 측정하였다. SH-SY5Y 세포 (lxlO6세포 /well)을 6-well 배양플레이트에 접종하고， 10 % FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 48 시간 동안 배양하였다. 10 μΜ retinoic acid와 3 % FBS 를 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 5 일간 분화시킨 후， 복령피 추출물을 10또는 100 μ§/ηι1의 농도로 처리 6 시간 후， Αβ42를 처리하여 총 48 시간 배양하였다. RIPA buffer를 사용하여 세포용해시킨 후 단백질 함량을 Pierce 사에서 구입한 BCA 시약으로 정량하였다. Invitrogen에서 구입한 human Tau[pS199] Enzyme- linlced immunosorbentassay (ELISA) KIT를 이용하여 인산화된 타우를 측정하였다.
그 결과 도 11에 나타난 바와 같이.복령피 0, 30， 50， 70. 95(v/v)% 에탄올 추출물을 10 yg/ml 농도로 신경세포주에 처리 했을 때 Αβ42에 의해 유도되는 타우 인산화가 억제되어 정상수준으로 회복되었다. 대표적인 퇴행성 뇌질환인 치매에 널리 사용되고 있는 도네페질에서는 타우 인산화 억제 효능이 나타나지 않았다 (도 11). '
<2-4>신경세포주에서의 NGF (Nerve growth factor：신경성장인자)레벨 측정
복령피 추출물의 인지능력 개선 효과의 기전을 확인하기 위해 NGF 레벨을 측정하였다. SH-SY5Y세포 (IxlO6세포 /well)을 6-well 배양플레이트에 접종하고, 10 % FBS (fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM/F12 (Dulbecco's modified Eagle' s medium)배지에서 48시간 동안 배양하였다. 10 μΜ retinoic acid와 3 % FBS를 포함하는 DMEM/F12 배지를 사용하여 5 일간 분화시킨 후, 복령피 추출물을 10 또는 100 Mg/nil의 농도로 처리하였다. RIPA buffer를 사용하여 세포용해시킨 후， 단백질 함량을' Pierce 사에서 구입한 BCA 시약으로 정량하였다. Abeam에서 구입한 beta Nerve growth factor human Enzyme- linked i誦 unosorbentassay (ELISA) KIT를 이용하여 NGF 레벨을 측정하였다.
그 결과 도 12에 나타난 바와 같이 복령피 0, 30, 50， 70， 95(v/v)% 에탄올 추출물을 10 g/ral 농도로 신경세포주에 처리했을 때 NGF 생성의 유의적인 증가가 관찰되었다. 대표적인 퇴행성 뇌질환인 치매에 널리 사용되고 있는 도네페질에서는 NGF 생성 관련 효능이 나타나지 않았다 (도 12) . 이상과 같이, 본 발명에 따른 복령피 추출물은 신경세포 사멸을 일으켜 퇴행성 뇌질환을 유발하는 베타아밀로이드 생성과 타우의 인산화를 억제해 병의 발병 또는 진행을 억제시키고 아세틸콜린에스터라제를 저해시켜 기억력을 향상시킨다. 또한 신경세포 보호작용 및 신경분화를 촉진하는 NGF와 생성을 촉진해 알츠하이머 치매는 물론 크로이츠펠트—야콥병, 헌팅튼병, 다발성경화증， 길랑 -바레 증후군. 파킨슨병， 루게릭병 등 신경 세포의 점차적인 사멸에 의한 진행성 치매， 진행성 치매 및 신경학적 이상， 자세 및 운동 이상. 진행성 실조증, 근위축 및 위약, 감각 및 운동 장애 등을 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 실시예 1의 생약 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나， 이는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하는 것에 불과하며 , 이로 한정되는 것은 아니다. 제제예 1. 주사제제의 제조
실시예 1 추출물
소디움 메타비설파이戶
메틸파라벤
프로필파라벤
주사용 멸균증류수
상기의 성분을 흔합하고 통상의 주사 제제 제조 방법으로 2mf,로 한 후， 2m.e 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다. 제제예 2. 정제의 제조
실시예 1 추출물 200mg
유당 lOOmg
전분 lOOmg
스테아린산 마그네슴 적량 상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다. 제제예 3. 캡슐제의 제조
실시예 1 추출물 lOOmg
유당 50mg
전분 50mg
탈크 2mg
스테아린산 그네슘 적량
상기의 성분을 흔합하고 통상의 캡술제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 층전하여 캡슐제를 제조한다. 제제예 4. 액제의 제조
실시예 1 에탄올추출물 lOOOmg
설탕 20 g
이성화당 20 g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 100 m£
상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 흔합하고 100 의 갈색병에 층전하고 멸균시켜서 액제를 제조한다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
복령피 C/¾/"/a cocos pee l ) 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 샨경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 치매， 크로이츠펠트—야콥병 헌팅튼병, 다발성경화증, 길랑 -바레 중후군, 파킨슨병， 루게릭병, 신경 세포의 점차적인 사멸에 의한 진행성 치매 및 진행성 실조증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 1항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 물， 탄소수 1내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 흔합물로 추출된 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 60 내지 80(v/v)¾ 에탄을로 추출된 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물ᅳ
【청구항 5】
복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
【청구항 6】
제 5 항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머 치매, 크로이츠펠트—야콥병， 헌팅튼병, 다발성경화증, 길랑 -바레 증후군， 파킨슨병， 루게릭병, 신경 세포의 점차적인 사멸에 의한 진행성 치매 및 진행성 실조증으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
【청구항 7】
제 5항에 있어서 , 상기 복령피 추출물은 물， 탄소수 1내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 흔합물로 추출된 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
【청구항 8】
제 5 항에 있어서, 상기 복령피 추출물은 60 내지 80(v/v)% 에탄올로 추출된 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물. '
【청구항 9】
제 5 항 내지 제 8 항 증 어느 한 항에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능식품 또는 건강기능음료인 퇴행성 신경질환 예방 또는 개선용 식품 조성물.
【청구항 10]
복령피 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는， 퇴행성 신경질환 예빙-， 개선 또는 치료방법.
【청구항 11】
퇴행성 신경질환 예방， 개선 또는 치료를 위한 복령피 추출물의 용도.
PCT/KR2015/013136 2014-12-19 2015-12-03 복령피 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 WO2016099056A2 (ko)

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DK15870223.3T DK3235502T3 (da) 2014-12-19 2015-12-03 Sammensætning indeholdende poria cocos-barkekstrakt til forebyggelse, forbedring eller behandling af neurodegenerative lidelser
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CY20201100474T CY1123293T1 (el) 2014-12-19 2020-05-25 Συνθεση που περιεχει εκχυλισμα του φλοιου poria cocos για την προληψη, τη βελτιωση ή τη θεραπευτικη αντιμετωπιση των νευροεκφυλιστικων διαταραχων
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018011557A (ja) * 2016-07-21 2018-01-25 日本メナード化粧品株式会社 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107789373A (zh) * 2016-09-06 2018-03-13 杏辉天力（杭州）药业有限公司 茯苓萃取物及其活性成分于保养肌肤及／或促进伤口愈合的用途

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ192673A (en) * 1979-02-02 1984-07-06 Merck & Co Inc Ophthalmic compositions for lowering intraocular pressure
AU1672397A (en) 1996-02-15 1997-09-02 Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. Brain activators
KR100615389B1 (ko) * 2002-08-23 2006-08-25 (주)헬릭서 다래 추출물을 함유하는 알러지성 질환 및 비알러지성염증 질환의 예방 및 개선용 건강 기능 식품
KR100526628B1 (ko) 2003-03-21 2005-11-08 주식회사 에스티씨나라 모노아민산화효소 저해활성을 갖는 상심자 추출물을함유한 조성물
KR20050092292A (ko) * 2004-03-15 2005-09-21 주식회사 크라우젠 기억력 증강 효과가 있는 생약재 조성물
KR100779179B1 (ko) * 2006-05-19 2007-11-28 충북대학교 산학협력단 토복령의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제
KR100847343B1 (ko) * 2006-12-08 2008-07-21 경희대학교 산학협력단 생약복합재 추출물을 함유하는 골길이 성장 촉진용 조성물
CN101152554A (zh) 2007-09-24 2008-04-02 徐大洋 治疗荨麻疹既泄热消疹的中药
KR20090071704A (ko) 2007-12-28 2009-07-02 퓨리메드 주식회사 치매 예방 및 치료용 조성물
KR101072662B1 (ko) * 2008-12-18 2011-10-11 대구한의대학교산학협력단 복신 건조분말 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는건망증 및 기억력 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물
KR101064258B1 (ko) 2008-12-29 2011-09-14 한국과학기술연구원 벤조아릴우레이도 화합물, 및 이를 함유하는 퇴행성 뇌질환예방 또는 치료용 조성물
KR20100083632A (ko) * 2009-01-14 2010-07-22 울산대학교 산학협력단 표적 단백질 분해효소 감응형 항암제 전구체
KR20110119983A (ko) 2010-04-28 2011-11-03 순천대학교 산학협력단 뽕나무 열매 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스테라제 억제용 조성물
CN102133351B (zh) 2011-03-04 2012-05-09 费萍 一种治疗阿尔茨海默病的药物组合物及其制备方法
CN102133242B (zh) 2011-03-07 2013-12-11 北京中医药大学 一种茯苓提取物及其制备方法
JP6108452B2 (ja) * 2012-04-12 2017-04-05 クラシエ製薬株式会社 細胞死抑制組成物
KR101251866B1 (ko) 2012-07-12 2013-04-10 순천대학교 산학협력단 뽕나무 열매 추출물을 함유하는 아세틸콜린에스테라제 억제용 조성물
KR101577392B1 (ko) * 2012-12-06 2015-12-17 한국식품연구원 복령피 추출물을 유효성분으로 포함하는 Ｔｈ1-매개 면역 질환 또는 Ｔｈ2-매개 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2014088200A1 (ko) * 2012-12-06 2014-06-12 한국식품연구원 복령피 추출물, 백미 추출물 또는 남성 추출물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
CN103393809B (zh) * 2013-07-24 2015-01-07 张立东 治疗帕金森的药物
CN104013891A (zh) * 2014-05-28 2014-09-03 高益槐 一种益智健脑的复方制剂及其制备方法
KR101671437B1 (ko) 2014-12-19 2016-11-01 동아에스티 주식회사 상심자 및 복령피 혼합 추출물을 함유하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018011557A (ja) * 2016-07-21 2018-01-25 日本メナード化粧品株式会社 幹細胞の未分化状態維持剤及び増殖促進剤

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