KR101725150B1 - 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물 - Google Patents
브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물 및 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물은 항산화 작용, 지질과산화 억제작용 및 아세틸콜린 분해효소(AChE) 억제효과가 우수하여 뇌 신경세포를 효과적으로 보호하며, 알츠하이머 유도 동물모델에서 인지 및 학습 능력에 뛰어난 회복효과를 가지므로, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 건강기능식품 또는 약학 조성물로 이용될 수 있는 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물에 관한 것이다.
의학 기술의 발달과 생활수준의 향상으로 인간의 평균수명은 지난 반세기 동안 두 배 가까이 연장되었으며, 이로 인하여 전체인구에 대한 노인 인구의 비율이 급속하게 증가되었다. 통계청이 발표한 2005년 자료에 의하면, 현재 우리나라 사람의 평균수명은 78.5세이고 2000년도에 이미 65세 이상의 인구 비율이 약 7%에 달하는 등 급속하게 노령화 사회로 진입하고 있음을 알 수 있다. 또한, 우리나라는 2018년에는 고령사회, 2026년에는 노인 인구의 비율이 20% 이상인 초고령화 사회로 진입할 것으로 예측되고 있다. 그리고 2004년에 12.1%이었던 노년 부양비(65세 이상 인구수/15~64세 인구수)는 2020년에는 21.3%, 2030년에는 35.7%로 높아질 전망이며, 2004년에 생산 가능인구 8.2명당 노인 1명을 부양했다면, 2010년에는 6.8명당 노인 1명, 2020년에는 4.7명당 노인 1명, 2030년에는 2.8명당 노인 1명을 부양하는 셈이 된다. 이는 국가적으로 경제 성장 저하, 국가경쟁력 감소 및 세대간 갈등 심화로 인한 사회적 부담의 가능성이 커지는 것을 의미한다.
이러한 사회적 전망과 현실을 반영하듯 최근에는 노인들에게 많이 이환되는 질환에 관심이 집중되고 있다. 특히, 치매(dementia)는 고령일수록 발병률이 두드러지게 높아 75~84세의 노인의 경우 발병률이 약 20%, 85세 이상의 노인에게는 약 50% 정도에 육박하는 것으로 알려져 있고 질병의 특성상 타인의 보살핌에 절대적으로 의존하여야 하므로 중대한 사회적 관심사로 떠오르고 있다. 또한, 치매로 인한 경제적 손실액이 매우 커지고 있으며, 근로 손실 등의 제반 사항을 모두 고려할 때 우리나라의 경우 치매 치료로 인한 사회적 비용은 3조 4000억~4조 4000억 원으로 추산되고 있다. 그리고, 미국의 경우 치매 치료로 인한 손실 비용이 매년 약 1000~1200억 달러에 달하는 것으로 추정된다. 즉, 사회가 점차 고령화되면서 노인성 치매는 21세기 인류가 해결해야 할 최대의 보건문제로 등장하고 있다. 이에 따라, 치매를 비롯한 인지기능장애의 예방 및 치료가 가능한 기능성 물질 및 식품 등의 개발에 대한 요구가 커지고 있는 실정이다.
알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)는 점진적인 인지기능 및 기억능력의 상실을 초래하는 신경퇴행성 질환으로서, 대뇌 기저부의 아세틸콜린(Acethylcholine)성 신경세포의 손상에서 비롯된다는 연구결과에 의해 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarine acetylcholine receptor)에 대한 효능제(agonist), 아세틸콜린 생성촉진제, 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholinesterase, AChE) 저해제 등 여러 가지 작용기전에 따라 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 약물들이 개발되어 왔다. 실제로 현재 각국에서 사용되고 있는 알츠하이머병 치료제는 이러한 아세틸콜린 분해효소 억제제가 대부분이며, 타크린(tacrine)과 도네페질(donepezil) 등이 이에 속한다. 이 밖에도 리바스티그민(rivastigmin), 갈라타민(galatamine) 등이 사용되고 있다.
현재 퇴행성 뇌신경 질환으로서의 인지기능 또는 기억능력 저하 현상 개선을 위한 더욱 효과적인 제제(건강기능성 식품 소재 포함)의 개발 수요가 어느 때보다 높은 시기이다. 결국 치매 발병에 대한 뇌신경 세포의 기작을 대상으로 새로운 다중 기능성 효과(multi-functional effect)를 갖는 소개 개발을 위한 연구가 필요한 실정이다.
한편, 브로콜리(broccoli, Brassica oleracea var italica)는 십자화과에 속하는 채소로서 모란채라고도 하며, 꽃봉오리와 줄기를 식용으로 하는 것으로 양배추의 일종이다. 브로콜리는 영양학적으로도 중요한 작물로 전세계적으로 재배 및 식용되고 있으며, 뛰어난 항산화 작용을 가진 디티올치온(dithiolthione), 이소티오시아네이트(isothiocyanate)와 같은 유기 황 화합물(organosulfuric compound), 베타 카로틴(β-carotene), 루틴(rutin), 비타민 C, 셀레늄(selenium), 퀘르세틴(quercetin), 글루타치온(glutathione) 등이 다량 함유되어 있는 것으로 알려지고 있다. 현재의 관련 연구는 수용성 식이섬유에 의한 혈중 콜레스테롤 감소와 암 예방 및 돌연변이 억제 등의 생리활성 효과 및 브로콜리의 항산화성과 항균성 효과 등이 보고되어 있다. 이러한 생리학적인 효능으로 인해 브로콜리에 대한 소비자의 수요가 증가하고 있지만, 브로콜리에서 꽃봉오리 부위만 식용으로 활용되고 있으며, 그 외의 식용자원으로 활용 가능한 잎과 줄기 부분은 70% 이상이 버려지고 있는 실정이다.
한국공개특허 제2012-0054947호에는 브로콜리 유래 글루코시놀레이트 화합물 및 이를 포함하는 항산화 및 항균 활성을 갖는 조성물에 대해 개시되어 있고, 한국공개특허 제2013-0087174호에 브로콜리 열수추출물을 유효성분으로 함유하는 염증질환의 예방 또는 치료용 조성물에 대해 개시되어 있다. 하지만 본 발명의 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 알려진 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물은 아세틸콜린 분해효소(AChE) 억제효과, 뇌신경 스트레스 저해효과 및 신경세포 보호능력이 우수하여, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물은 항산화 작용, 지질과산화 억제작용 및 아세틸콜린 분해효소(AChE) 억제효과가 우수하여 뇌 신경세포를 효과적으로 보호하며, 알츠하이머 유도 동물모델에서 인지 및 학습 능력에 뛰어난 회복효과를 가지므로, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물들의 총 페놀 함량을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물들의 농도별 처리시 ABTS 라디칼 소거활성 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물들의 농도별 처리시 지질과산화 중간생성물인 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 억제활성을 나타낸 것이다.
도 4는 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 산화적 스트레스(oxidative stress) 저해활성을 나타낸 것이다.
도 5는 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 PC12 신경 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 6은 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 뇌신경 세포막 보호효과를 나타낸 것이다.
도 7은 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 산화적 스트레스 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 PC12 신경 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 9는 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 뇌신경 세포막 보호효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholnesterase, AChE) 저해활성을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 공간인지능력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다. (A)는 교체행동(Alternation behavior); (B)는 암(arm)을 통과한 횟수를 나타낸 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 단기 기억 및 학습력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 장기 기억 및 학습력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다. (A)는 마우스가 플랫폼(platform)을 찾는데 소요되는 시간 측정; (B)는 실험 5일째 플랫폼을 제거한 후 플랫폼이 있었던 구간(W zone)을 지나가거나 머무는 시간 측정을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholnesterase, AChE) 활성 측정 결과이다.
도 15은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD) 함량 측정결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 산화적 글루타치온(GSSH)/총 글루타치온(total glutathione) 함량 측정결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 함량 측정 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물들의 농도별 처리시 ABTS 라디칼 소거활성 측정결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물들의 농도별 처리시 지질과산화 중간생성물인 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 억제활성을 나타낸 것이다.
도 4는 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 산화적 스트레스(oxidative stress) 저해활성을 나타낸 것이다.
도 5는 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 PC12 신경 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 6은 과산화수소를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 뇌신경 세포막 보호효과를 나타낸 것이다.
도 7은 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 산화적 스트레스 생성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 8은 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 PC12 신경 세포의 세포생존율(cell viability)을 나타낸 것이다.
도 9는 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 뇌신경 세포막 보호효과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 농도별 처리시 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholnesterase, AChE) 저해활성을 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 공간인지능력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다. (A)는 교체행동(Alternation behavior); (B)는 암(arm)을 통과한 횟수를 나타낸 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 단기 기억 및 학습력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 아밀로이드 베타를 이용한 장기 기억 및 학습력 저하 마우스에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 회복 능력 평가시험 결과이다. (A)는 마우스가 플랫폼(platform)을 찾는데 소요되는 시간 측정; (B)는 실험 5일째 플랫폼을 제거한 후 플랫폼이 있었던 구간(W zone)을 지나가거나 머무는 시간 측정을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 아세틸콜린 분해효소(Acetylcholnesterase, AChE) 활성 측정 결과이다.
도 15은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase, SOD) 함량 측정결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 산화적 글루타치온(GSSH)/총 글루타치온(total glutathione) 함량 측정결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 뇌 조직 중의 말론디알데하이드(malondialdehyde, MDA) 함량 측정 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 브로콜리 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매의 추출물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 브로콜리 잎 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 조정제물 또는 정제물 중 어느 하나를 포함하는 것으로 한다.
또한, 본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 브로콜리 잎 추출물은 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 가열 추출, 초음파 추출, 냉각 추출 등의 다양한 추출법을 이용하여 추출할 수 있으나, 바람직하게는 환류 냉각 추출이 바람직하다. 상기 추출방법은 유효성분이 파괴되지 않고, 브로콜리 잎 추출물로부터 활성이 높은 분획물을 얻을 수 있다.
본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 분획물은 브로콜리 잎 에탄올 추출물로부터 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물을 이용하여 분획한 것일 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름을 이용하여 분획한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 인지기능 또는 기억능력을 개선 시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등),디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등), 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 인지기능 또는 기억능력의 퇴화로 인해 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 유발되는 질환은 퇴행성 뇌신경 질환으로, 대표적인 퇴행성 뇌신경 질환에는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨슨-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 또는 피크병(Pick's disease)이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 이의 분획물을 0.02 내지 80중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구용 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 텍스트로스 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 혼합물을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위탭솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우진지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다를 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물은 1일 기준으로 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 브로콜리 잎 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매의 추출물일 수 있고, 바람직하게는 에탄올 추출물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 상기 분획물은 브로콜리 잎 에탄올 추출물로부터 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물을 이용하여 분획한 것일 수 있으며, 바람직하게는 클로로포름을 이용하여 분획한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 익에게 있어 자명한 것이다.
제조예
1. 브로콜리 잎 추출물 또는 이의
분획물의
제조
본 발명에 이용된 브로콜리 잎은 경기도 여주시 늘봄농장으로부터 제공받아 재료로 사용하였다. 40g의 브로콜리 잎을 동결건조 후, 분쇄하여 95%(v/v)의 에탄올 2ℓ를 첨가하여 2시간 동안 환류 냉각 추출하여 에탄올 추출물을 제조하였다. 이어서, 상기 에탄올 추출물을 No. 2 여과지(Whatman plc., Kent. UK)로 여과한 후 농축하였다. 브로콜리 잎의 에탄올 추출물을 n-헥산과 물을 1:1 비율로 분획깔때기에 넣고 n-헥산층과 물층으로 분획하였고, 물층을 다시 클로로포름과 1:1 비율로 분획 깔때기에 넣고 클로로포름과 물층을 분획하였다. 이 과정과 동일하게 에틸아세테이트를 추가하여 물층과 분획을 실시한 후 농축하여 동결건조기로 동결건조하였다.
실시예
1. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 용매
분획물들의
총 페놀성 화합물 측정
상기 제조예 1에서 제조한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 분획물(이하 '시료용액'이라 함) 1㎖에 증류수 9㎖를 첨가한 후 폴린-시오칼토 페놀 반응액(Folin & Ciocalteau's phenol reagent) 1㎖를 넣고 혼합하여 실온에서 5분간 반응시켰다. 반응용액에 7% 탄산나트륨(Na2CO3) 용액 10㎖를 넣어 다시 혼합한 다음, 증류수로 25㎖로 정용하였다. 이 혼합 용액을 실온에서 2시간 동안 정치한 후 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 갈산(gallic acid)을 이용하여 작성된 검량선으로 총 페놀성 화합물 함량을 계산하였다. 그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 브로콜리 잎(Broccoli leaf, BL)의 총 페놀성 화합물 함량은 건조된 브로콜리 잎(dried broccoli leaf)에서 95%(v/v) 에탄올 51.75, n-헥산 48.67, 클로로포름 206.75, 에틸아세테이트 175.50, 부탄올 111.75, 증류수 20.50mg GAE/g으로 클로로포름 분획물에서 가장 높은 총 페놀성 화합물 함량을 나타내었다. 이는 분획 전(95% 에탄올 추출물)과 후를 비교했을 때, 클로로포름 분획물에서 약 4배의 총 페놀성 화합물 함량이 증가한 것을 나타내었다.
실시예
2. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 용매
분획물들의
ABTS
라디칼
소거활성 측정
2.5mM ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티졸린-6-술폰산)디암모늄염)와 1.0mM AAPH(2,2'-아조비스-(2-아미디노프로판)염산염)을 100mM 인산 완충용액(pH 7.4)에 혼합하여, 734nm에서 대조군의 흡광도 값이 0.70±0.02가 되도록 조정한 ABTS 용액을 사용하였다. 시료용액 20㎕와 ABTS 용액 980㎕를 혼합하여 10분간 반응시키고, UV-형광광도계(UV-1601, Shimadzu Co., Japan)를 이용하여 734nm에서 흡광도를 측정하여 라디칼 소거활성을 계산하였다. 그 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 브로콜리 잎의 용매 분획물은 클로로포름 분획물에서 ABTS 라디칼 소거활성이 가장 높았으며, 특히 브로콜리 잎 클로로포름 분획물 1,000㎍/㎖에서는 양성 대조구(positive control)인 비타민 C(1,000㎍/㎖)와 통계적으로 유의적인 차이가 나타나지 않는 유사한 소거활성을 나타내었다.
실시예
3. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 용매
분획물들의
MDA
생성 억제 효과
마우스 뇌 세포막 지질과산화 억제활성을 살펴보기 위하여 지질과산화 생성물인 말론디알데하이드(MDA)의 생성 억제활성 측정을 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 마우스 뇌 부위 조직을 10배 부피의 Tris-HCl 완충액(20mM, pH 7.4)에 균질화시킨 후 4℃에서 15분간 12,000g으로 원심분리하였다. 상등액 0.1㎖에 10μM의 황산철 0.1㎖, 0.1mM의 비타민 C 1㎖ 및 시료용액 0.2㎖를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 반응액에 30% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 0.1㎖를 첨가하여 반응을 종결시키고, 1% 티오바르비튜릭산(thiobarbituric acid) 0.3㎖를 첨가하여 80℃에서 30분간 가열한 후, 532nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 ABTS 라디칼 소거활성 패턴과 유사하게 브로콜리 잎 추출물의 분획물의 농도가 증가함에 MDA 생성을 억제하는 경향을 나타내었다. 특히, 클로로포름 분획물은 양성 대조구로 사용된 카테킨(catechin)이 MDA 생성을 75.31% 억제하는 것과 비교하였을 때, 농도 500㎍/㎖ 이상의 농도에서 통계적으로 유의적인 결과를 나타내었다. 이러한 결과를 종합해본 결과, 최종적으로 브로콜리 잎의 용매 분획물 중에서 항산화 활성이 우수한 클로로포름 분획물을 이용하여 이하 실험들을 실시하였다.
실시예
4. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
과산화수소로 유도된
산화적
스트레스에 대한 신경세포 보호효과
브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물이 과산화수소(H2O2)에 의한 PC12 신경세포의 산화적 스트레스 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCF-DA(2',7'-디클로로플로오레산 디아세테이트) 방법을 실시하였다. 먼저 세포를 96웰 플레이트(well plate)에 2.5×104 세포/웰로 분주하고, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물을 농도별로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 200μM의 과산화수소(H2O2)를 가하고, 3시간 동안 배양한 후 10μM DCFH-DA를 가하고 50분 후 배지를 제거한 다음, PBS(phosphate buffered saline) 버퍼로 세척한 후, 형광 마이크로플레이트 리더(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 여기(excitation) 파장 485nm와 방출(emission) 파장 535nm에서 형광강도를 측정하였다. 과산화수소로 세포의 산화적 손상을 유도하여 형광 디클로로플루오레세인(fluorescent dichlorofluorescein, DCF) 형광강도를 관찰한 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 과산화수소를 단독 처리한 군에서는 132%로 대조구(control)에 대비하여 약 32%의 형광 강도 증가(pattern of oxidative stress)를 보인 반면, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물을 처리한 구에서는 농도가 증가함에 따라 산화적 손상에 대한 신경세포(PC12 cell) 보호 효과를 보였다. 특히, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 100㎍/㎖에서는 약 60%로 과산화수소대비 약 73% 정도의 ROS 감소율을 보여주어 뛰어난 신경세포 내 산화적 스트레스 생성 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 양성 대조구로 사용한 비타민 C와 비교하면, 모든 농도에서 양성 대조구인 비타민 C(200μM)보다 높은 스트레스 저해 효과를 보여주었다.
실시예
5. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
과산화수소로 유도된
산화적
스트레스에 대한
MTT
분석에 의한 세포 생존율 측정
과산화수소(H2O2)에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 보호효과는 MTT(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-데펜테르라졸리움 프로미드) 환원 측정방법으로 측정하였다. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 이용하여 농도별로 PC12 세포에 처리하여 48시간 동안 프리인큐베이션(pre-incubation)하였고, 그 후 과산화수소는 200μM의 농도로 증류수에 녹여 첨가한 후 3시간 동안 배양하였다. 이 상태의 PC12 세포에 MTT 저장 용액(10㎕/웰)을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 배지를 제거한 다음 MTT 가용화 용액(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마지막으로 흡광도는 마이크로플레이트 리더(680, Bio-rad, Japan)에서 570nm(determination wave)와 630nm(reference wave)에서 측정하였다. 양성 대조구(positive control)는 비타민 C(200μM)를 사용하였고, 세포 생존율(cell viability)은 대조구 그룹(control group)에 대한 % 농도로 나타냈다. 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 신경세포의 생존율을 MTT 분석방법로 측정한 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 과산화수소를 처리한 처리구에서는 대조구(control) 대비 77%의 세포 생존율을 나타냈고, 과산화수소와 비타민 C를 동시에 처리한 구에서는 106%로 약 29%의 신경세포 생존율을 보였다. 브로콜리 잎 클로로포름 분획물을 처리한 구의 5 및 10㎍/㎖에서는 양성 대조구인 비타민 C와 비교하여 유의적인 생존율을 나타내었으며, 20㎍/㎖ 이상에서는 비타민 C(200μM)와 유사한 신경세포 생존율을 나타내었고, 그 이상의 처리구에서는 농도가 증가함에 따라 생존율이 증가하는 것을 나타내었다.
실시예
6. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
과산화수소로 유도된
산화적
스트레스에 대한 세포막 손상 억제 효과
농도별 추출물을 48시간 동안 프리인큐베이션(pre-incubation)시킨 후, 200μM의 과산화수소(H2O2)를 처리하여 3시간 동안 배양한 후, 5분간 원심분리(400g)하여 침전시키고, 100㎕의 상등액을 새로운 웰(well)로 옮긴 후 세포막 손상효과 측정은 LDH(lactate dehydrogenase) 분석 키트(Sigma Chemical Co, St. Louis MO., USA)로 측정하였다. 과산화수소(H2O2)로 유도된 신경세포막 손상에 대한 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 세포막 손상 억제효과를 확인하기 위해 세포질 성분인 LDH 분석방법을 수행한 결과, 도 6에 개시된 바와 같이 대조구(control)의 LDH 방출량은 35% 정도인데 반해 과산화수소 처리한 시료에서는 52%의 방출량을 보여 과산화수소에 의해 LDH 방출량이 약 17% 정도 증가하였다. 양성 대조구로 쓰인 비타민 C(200μM) 처리군은 35% 정도의 LDH 방출량을 보였고, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 경우 5, 10, 20, 25, 50 및 100㎍/㎖로 처리했을 때 뛰어난 세포막 손상 억제 효과를 보였으며, 100㎍/㎖의 처리구에서는 비타민 C(200μM) 처리구와 유사한 세포막 손상 억제 효과를 나타내었다.
실시예
7. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
아밀로이드 베타(
Amyloid beta, Aβ)
1
-42
유도된
산화적
스트레스에 대한 신경세포 보호효과
브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물이 Aβ1-42에 의한 PC12 신경세포의 산화적 스트레스 손상을 보호하는 효과를 측정하기 위하여 DCF-DA(2',7'-디클로로플로오레산 디아세테이트) 방법을 실시하였다. 먼저, 세포를 96웰 플레이트(well plate)에 2.5×104 세포/웰로 분주하고, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물을 농도별로 처리한 후 37℃, 5% CO2의 조건에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 100㎍/㎖의 Aβ1-42을 가하고, 24시간 동안 배양한 후 10M DCFH-DA를 가하고 50분 후 배지를 제거한 다음, PBS(phosphate buffered saline) 버퍼로 세척한 후, 형광 마이크로플레이트 리더(Infinite 200, Tecan Co., San Jose, CA, USA)를 사용하여 여기(excitation) 파장 485nm와 방출(emission) 파장 535nm에서 형광강도를 측정하였다.
브로콜리 잎의 클로로포름 분획물에 의한 PC12 신경세포에서의 Aβ1-42로 유도된 산화적 스트레스 생성 억제 효과를 DCF-DA 분석방법으로 측정한 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 Aβ1-42를 단독 처리한 군에서는 131.%로 대조구(control)에 대비하여 약 31%의 산화적 스트레스의 증가를 나타낸 반면, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물을 처리한 구에서는 10, 20, 50 및 100㎍/㎖에서는 약 78.75%로 Aβ1-42 처리군 대비 약 53% 정도의 ROS 감소율을 보여주어 뛰어난 신경세포 내 산화적 스트레스 생성 억제효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예
8. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
아밀로이드 베타(
Amyloid beta, Aβ)
1
-42
유도된
산화적
스트레스에 대한
MTT
분석에 의한 세포 생존율 측정
Aβ1-42에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 보호효과는 MTT(3-(4,5-디메틸디아졸-2-일)-2,5-데펜테르라졸리움 프로미드) 환원 측정방법으로 측정하였다. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 이용하여 농도별로 PC12 세포에 처리하여 3시간 동안 프리인큐베이션(pre-incubation)하였고, 그 후 100㎍/㎖의 Aβ1-42를 첨가한 후 24시간 동안 배양하였다. 이 상태의 PC12 세포에 MTT 저장 용액(10㎕/웰)을 처리하여 37℃에서 3시간 동안 배양한 후, 배지를 제거한 다음 MTT 가용화 용액(dimethyl sulfoxide, DMSO) 100㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 마지막으로 흡광도는 마이크로플레이트 리더(680, Bio-rad, Japan)에서 570nm(determination wave)와 630nm(reference wave)에서 측정하였다. Aβ1-42로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 신경세포의 생존율을 MTT 분석방법으로 측정한 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 Aβ1-42를 단독 처리군에서는 대조구(control) 대비 69%의 세포 생존율을 나타내었고, Aβ1-42와 비타민 C를 동시에 처리한구에서는 94%로 약 25%의 증가된 신경세포 생존율을 보였다. 브로콜리 잎 클로로포름 분획물 처리구의 모든 농도(5, 10, 20, 50 및 100㎍/㎖)에서 대조구(contorl)와 대비하여 높은 생존율을 나타내었다. 특히, 5㎍/㎖에서 비타민 C(200μM)보다 높은 세포 생존율을 나타내었다.
실시예 9. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 세포막 손상 억제 효과
농도별 추출물을 3시간 동안 프리인큐베이션(pre-incubation)시킨 후, 100㎍/㎖의 Aβ1-42를 처리하여 24시간 동안 배양한 후, 5분간 원심분리(400g)하여 침전시키고, 100㎕의 상등액을 새로운 웰(well)로 옮긴 후 세포막 손상효과 측정은 LDH(lactate dehydrogenase) 분석 키트(Sigma Chemical Co, St. Louis MO., USA)로 측정하였다. Aβ1-42로 유도된 신경세포막 손상에 대한 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 세포막 손상 억제효과를 확인하기 위해 세포질 성분인 LDH 분석방법을 수행한 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 대조구(control)의 LDH 방출량은 11% 정도인데 반해 Aβ1-42 처리구에서는 37%의 방출량을 보여 Aβ1-42에 의해 LDH 방출량이 약 26% 정도 증가하였다. 양성대조구로 쓰인 비타민 C(200μM) 처리군은 28% 정도의 LDH 방출량을 보였고, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 경우, 농도가 증가함에 따라 뛰어난 신경세포막 손상에 대한 보호효과를 보였으며, 100㎍/㎖ 처리시 24%의 LDH 방출량을 나타내었으며, 양성대조구인 비타민 C(200μM) 처리구보다 낮은 뛰어난 세포막 손상 억제 효과를 나타내었다.
실시예
10. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
AChE
저해
활성
아세틸콜린 분해효소 저해활성 측정은 아세틸콜린 요오드화물(acetylcholine iodide)을 기질로 사용하여 측정하였다. 효소는 PC12 세포배양액 1㎖에 균질화를 위한 용액(1M NaCl, 50mM MgCl2, 1% Triton X-100 혼합액에 10mM Tris-HCl로 pH 7.2로 조정) 5㎖를 첨가하여 글라스-콜 균질기(Glass-Col homogenizer)로 균질화한 후 균질화된 세포배양액을 10,000rpm에서 30분 동안 원심분리하였으며, 그 상등액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4℃에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Quant-iTTM 단백질 분석 키트(Invitrogen, St. Oregon, Eugene, USA)를 이용하여 측정하였다. 10㎕의 정제효소에 10㎕의 추출물을 넣어 37℃에서 15분간 프리인큐베이션(pre-incubation) 시킨 후, 반응 혼합물에 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 8.0)에 용해시킨 70㎕의 Ellman's 반응 혼합물[0.5mM acethylthiocholine, 1mM 5,5'dithiobis(2-nitro benzoic acid)]을 첨가한 후 405nm에서 10분 동안 2분 간격으로 흡광도를 측정하였다.
알츠하이머성 치매로부터 유발되는 기억력 상실 및 학습력 저하 등 각종 인지장애는 주로 대뇌기저부의 아세틸콜린 신경세포의 손상으로부터 기인한다는 가설을 바탕으로 본 발명에서는 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 아세틸콜린 분해효소(AChE) 저해활성을 살펴보았으며, 결과는 도 10에 개시한 바와 같이 양성 대조구로서 1μM의 타크린을 처리한 군의 아세틸콜린 분해효소 저해활성은 73% 정도였으며, 브로콜리 잎 추출물의 클로로포름 분획물에서는 AChE 저해활성이 농도가 증가함에 따라 증가하는 그래프를 나타내었다. 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 AChE 저해활성(IC50)은 75.01㎍/㎖로 나타내었다.
실시예
11. 아밀로이드
베타(Amyloid beta, Aβ)
1
-42
로 인한
공간인지능력
저하에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
회복 능력 평가
본 실험에 사용된 동물은 4주령의 ICR-수컷 마우스를 사용하였으며, 5일간의 환경 적응기간을 거치게 하였고, 2마리씩 한 개의 사육케이스에 넣고 항온(22±2℃), 항습(50~55%)이 유지되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 동일한 실험실 환경에서 사육하였다. 이들 흰쥐들은 정상 대조구 그룹(Control), Aβ1-42 주입 그룹, 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물(chlorofrom fraction of broccoli leaf, CBL)을 5, 10 및 20mg/kg body weight(이하 CBL 5, CBL 10 및 CBL 20 이라 함)로 처리한 그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. Aβ1-42 주사 3일 후 Y-maze 실험을 실시하였고, 실험에 사용되는 Y-maze는 검은색 플라스틱 재질로 3개의 암(arm)으로 구성되어 있으며, 각 암(arm)의 길이, 높이 및 너비는 33cm, 15cm 및 10cm이다. 각 암(arm)을 A, B, C로 정한 후 한쪽 암(arm)에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 마우스가 들어간 암(arm)의 이동경로를 스마트 3.0 비디오 추적 시스템(Panlab, Barcelona, Spain)을 이용하여 기록하였다. 3개의 서로 다른 암(arm)에 차례로 들어간 경우 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하고, 교체 행동(alternation behavior)은 총 통과횟수(Number of arm entries)와 점수를 이용하여 다음의 식을 통해 계산하였다.
교체 행동(%) = (실제변경/최대변경)×100, (최대변경 = 총 통과횟수 - 2)
Aβ1-42를 이용하여 기억력과 학습능력을 감퇴한 마우스 모델을 대상으로 Y-maze를 실시하였으며 결과는 도 11과 같다. 8분 동안 Y-maze에서 마우스의 행동을 관찰한 결과, Aβ1-42 그룹은 대조구(62%) 대비 47%로 공간 인지기능에 대한 기억력 저하를 나타내었다(도 11A). 이에 반해 브로콜리 잎 클로로포름 분획물의 경우, CBL 5, 10 및 20 그룹은 각각 49, 52, 및 63%로 Aβ1-42 그룹과 비교하였을 때, 농도가 증가함에 따라 유의적으로 기억력이 개선되는 것을 확인하였고, 특히 CBL 20 그룹의 경우, 대조구와 유의적인 결과를 나타내었다. 도 11B는 8분 동안 마우스들이 Y-maze의 각 암(arm)을 통과한 총 횟수를 나타낸 것으로 마우스의 기본적인 운동능력에는 큰 차이를 나타내지 않았다. 따라서, 도 11A에서 보여준 결과는 Aβ1-42 주사에 의한 인지결함으로부터 유도된 행동 장애에 의한 것임을 나타내었다.
실시예
12. 아밀로이드
베타(Amyloid beta, Aβ)
1
-42
로 인한 단기 기억 및 학습력 저하에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
회복 능력 평가
브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 인지기능 및 단기 기억력 회복능력을 확인하기 위해 수동회피시험(Passive avoidance test)을 실시하였다. 수동회피 실험기구는 조명이 있는 밝은 챔버와 어두운 챔버, 2개의 구역으로 구분되어 있으며 바닥은 철망으로 이루어져 있다. A1-42 주입 4일 후 수동회피 학습 시험(Passive avoidance training trial)을 실시하였다. 각 마우스는 조명이 있는 챔버에서 조명을 켜지 않은 채 1분 동안 적응시킨 후 조명을 켜고 2분 동안 적응시킨 다음 마우스가 어두운 챔버로 이동하자마자 전기충격을 0.5 mA, 3초 동안 가하였다. 학습 시험을 시킨 다음날 각 마우스들을 대상으로 기억 시험(test trial)을 실시하였고, 조명을 켠 챔버에 마우스의 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다.
브로콜리 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스의 인지 기능 및 단기 기억력 측정을 위해 수동회피 학습시험 결과는 도 12와 같다. Aβ1-42 그룹은 대조구(300 초) 대비 38 초로 현저한 단기 기억력 저하(88% 감소)를 나타냈다. 이에 반해 CBL5, 10 및 20은 각각 72, 91, 및 229초로 Aβ1-42 그룹과 비교하였을 때, 유의적으로 기억력을 개선시키는 것으로 나타났다. 특히 CBL 20에서 대조구와 유의적인 결과를 나타내었으며, 뛰어난 인지기능 및 단기기억력 회복 능력을 보여주는 것으로 나타내었다.
실시예 13. 아밀로이드 베타(Amyloid beta, Aβ)
1-42
로 인한 장기 기억 및 학습력 저하에 대한 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물의
회복 능력 평가
원형 수조(직경 150cm, 높이 60cm) 안에 물을 30cm 높이로 채우고(23±2℃), 수조 4분면의 한 구역에 도피대(platform)를 설치하고 식용 오징어 먹물(Cebesa, Valencia, Spain)을 풀었다. 실험 첫날은 수조에서 실험동물이 도피대 없이 60초간 자유롭게 수영하도록 하여 적응훈련을 시킨 후, 4일 동안은 도피대를 수면 아래로 1cm로 놓고 보이지 않게 설정한 수조에서 매번 입수하는 위치(N, S, E, W 구역)를 다르게 하고 하루 4번씩 반복하여 훈련시켰으며 스마트 3.0 비디오 추적 시스템 (Panlab, Barcelona, Spain)을 이용하여 기록하였다(hidden trial). 실험동물이 60초 안에 도피대에 도달하는 경우에는 10초 동안 도피대에 머물게 하였으며, 도피대를 찾지 못할 경우에는 손으로 위치를 안내해주어 도피대에 위치하도록 하고 20초 동안 있도록 하였다. 실험 5일째(probe trial)에는 도피대를 제거하고 장기 학습 및 기억력을 측정하기 위하여 60초 동안 대피대가 있었던 구역(W 구역)에 머무르는 시간(초)을 기록하는 프로브 실험(probe trial)을 실시하였다.
브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 장기 기억 및 학습력 회복능력을 알아보기 위한 모리스 수중 미로(Morris water maze) 실험의 결과, 도 13에 개시된 바와 같이 히든 시험(Hidden trial)의 경우, 브로콜리 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물의 모든 그룹에서 도피대를 찾아가는 시간이 감소되는 것을 확인할 수 있었으며, 마지막 4일 차에서는 Aβ1-42 그룹은 대조구(29초) 대비 41초로 현저한 장기기억 및 학습력이 저하됨을 나타내었다. 이에 반해 CBL 5, 10 및 20 그룹은 각각 28, 31, 25 초로 Aβ1-42 그룹과 비교하였을 때, 유의적으로 기억력을 개선시키는 것으로 나타내었다. 특히, CBL 20 그룹의 경우, 대조구와 유의적인 결과를 나타냄에 따라 뛰어난 장기 학습 및 기억력을 나타내었다(도 13A). 뿐만 아니라, 프로브 시험(Probe trial)에서 나타내는 도피대가 존재하였던 W 구역에서의 마우스의 움직임을 비교하였을 때, Aβ1-42 그룹에서는 움직임이 적을 것을 확인할 수 있었다. 이러한 움직임을 나타낸 결과는 도 13B에 개시된 바와 같이, 대조구(44%) 대비 Aβ1-42 그룹(26%)이 현저한 저하를 다시 한번 나타내었으며, 특히 CBL 20 그룹(48%)은 대조구와 유의적인 결과를 나타내었다. 따라서, 브로콜리 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물은 20mg/kg of body weight에서 뛰어난 기억 및 학습 능력 회복능력을 나타내었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease, AD)와 같은 신경 퇴행성 질환에 대한 뛰어난 기능성 소재가 될 것이라고 사료된다.
실시예
14. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물을
섭취한 마우스 뇌 조직 중의
AChE
활성 측정
상기 모리스 수중 미로(Morris water maze) 실험 종료 후, 마우스의 뇌를 적출하여 10배 부피의 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 넣고 글라스-콜 균질기(Glass-Col homogenizer)로 균질화한 후 12,000rpm에서 30분 동안 원심 분리하였으며, 그 상등액을 효소실험을 위하여 사용하였다. 모든 추출공정은 4℃에서 수행하였으며, 추출한 효소액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Quant-iTTM 단백질 분석 키트(Invitrogen Co., Carlsbad, Ca., USA)를 이용하여 측정하였다. 효소 5㎕에 50mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer) 65℃을 넣고 37℃에서 15분간 프리인큐베이션(pre-incubation) 시킨 후, 반응 혼합물에 엘만 반응 혼합액(Ellman's reaction mixture) 70㎕를 첨가한 후 405nm에서 10분 동안 2분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 마우스 뇌 조직중의 AChE 활성은 단백질 mg당 대조구(control) 대비 % 활성으로 나타내었다.
마우스의 뇌를 적출하여 AChE 활성 측정한 결과, 도 14에 개시된 바와 같이 Aβ1-42 그룹에서의 AChE 활성은 대조구(100%) 대비 121%으로 나타나, Aβ1-42가 마우스 뇌 조직에 존재하는 AChE의 활성을 증가시키는 것으로 나타내었다. 이와 대조적으로 CBL 5, 10 및 20에서는 평균 약 99%으로 나타났으며, 모든 그룹에서 Aβ1-42 그룹 대비 AChE 활성이 감소하는 것을 나타내었다. 본 실험 결과는 브로콜리 잎 클로로포름 분획물은 Aβ1-42로 유도된 학습 및 인지기능 결함 마우스에서 효과적으로 AChE의 활성을 감소시키는 것으로 판단된다. 따라서, 실험 결과 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물은 Aβ1- 42 로 유도된 학습 및 기억력 결함 마우스 뇌 조직에서 효과적으로 AChE의 활성을 감소시키는 것으로 생각된다.
실시예
15. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물을
섭취한 마우스 뇌 조직 중의 SOD(
superoxide
dismutase
) 함량 측정
적출한 마우스의 뇌 무게의 10배 볼륨의 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS)를 넣고 Glass-Col 균질기(Glass-Col homogenizer)로 균질화한 후 12,000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 버리고 펠렛을 취하였다. 1X 세포 추출 용액 [10X SOD 용액 1㎖, 20% triton X-100 0.2㎖, 증류수 8.8㎖, 200mM PMSF 10 L]을 넣고 30 분간 5분 단위로 볼텍싱(vortexing) 해준 후, 1,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액을 실험에 이용하였다. 모든 과정은 4℃를 유지하였으며 추출한 상등액의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Quant-iT 단백질 분석 키트(Invitrogen Co)를 이용하였다. SOD 활성을 측정하기 위하여 SOD 측정 키트 (Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하였으며 측정된 흡광도 값을 계산하여 SOD(U/mg of protein)로 나타내었다.
과산화물 음이온(Superoxide anions)와 같은 자유 라디칼들을 과산화수소로 변화시킴으로써 조직을 보호하는 항산화 효소인 SOD의 함량을 측정한 결과, 도 15에 개시된 바와 같이 대조구(control)는 단백질 mg당 1.77 U이었으며, Aβ1-42 그룹은 이보다 감소한 단백질 mg당 0.91 U로 뇌 조직에서의 SOD 함량이 감소시키는 것으로 나타났다. 반면에, CBL 5, 10 및 20 그룹에서는 단백질 mg당 0.99, 1.14 및 1.54 U로서, 모든 그룹에서 농도가 증가함에 따라 Aβ1-42 그룹 대비 SOD 함량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 브로콜리 잎 클로로포름 분획물은 Aβ1-42에 산화적 스트레스에 대한 뇌 조직중의 항산화제로서 작용을 한다는 것을 나타내었다.
실시예
16. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물을
섭취한 마우스 뇌 조직 중의
GSSG
/
total
GSH
함량 측정
일정량의 마우스 뇌에 10배 볼륨의 5% 메타 인산(metaphosphoric acid)을 넣고 균질화한 후 15 분간 원심분리(14,000g)하여 상등액을 얻어 실험에 사용하였으며, 2M 4-비닐피리딘 10㎕를 더하여 산화적 글루타치온(GSSG) 측정에 사용하였다. 모든 과정은 4℃를 유지하였으며 추출한 GSSG의 단백질 함량을 측정하기 위하여 Quant-iT 단백질 분석 키트(Invitrogen사)을 이용하였다. 글루타치온(glutathione)의 함량을 측정하기 위하여 글루타치온(GSSG/GSH) 측정 키트(Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY, USA)를 이용하여 측정하였으며, 측정된 총 글루타치온(total GSH), 산화적 글루타치온(GSSG)의 흡광도 값을 각 표준곡선에 대입하여 GSSG/총 GSH로 나타내었다.
미토콘드리아 산화적 글루타치온(GSSG)은 미토콘드리아 DNA의 산화와 연관되어 세포의 노화나 아포토시스(apoptosis)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 즉, 뇌 조직의 산화적 스트레스에 대한 산화적 지표로써 GSSG/총 GSH 함량을 측정한 결과, 도 16에 개시된 바와 같이 대조구(control)는 19%였으며, Aβ1-42 그룹은 이보다 증가한 28%로 상대적으로 GSSG의 함량을 증가하였으며, Aβ1-42에 의하여 뇌 조직 중 산화적 스트레스를 유발시키는 것으로 나타내었다. 반면, CBL 5, 10 및 20 그룹에서는 29, 22 및 24%로, 특히 CBL 10 및 20 그룹에서 Aβ1-42 그룹 대비 GSSG 함량이 감소하는 것을 확인할 수 있었으며, 대조구(control)와 유의적인 결과를 나타내었다.
실시예
17. 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름
분획물을
섭취한 마우스 뇌 조직 중의
MDA
함량 측정
인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)를 이용하여 추출한 마우스 뇌조직 균질액 160㎕에 1% 인산 960㎕을 혼합한 후 0.67% 티오바르비튜릭산(thiobarbituric acid) 320㎕을 넣고 95℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액은 5,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 532nm에서 상등액의 흡광도를 측정하였다.
뇌 조직에 존재하는 지질과산화 중간생성물인 MDA의 함량을 측정한 결과, 도 17에 개시된 바와 같이 대조구(cotnrol)는 3.72 nmole/mg 단백질이었으며, Aβ1-42 그룹은 이보다 증가한 4.47 nmole/mg으로 Aβ1-42의 주사가 뇌 조직에서의 MDA 함량을 증가시키는 것으로 확인되었다. CBL 5, 10 및 20 그룹에서는 4.38, 4.26 및 3.33 nmole/mg 단백질로서, 특히 CBL 20 그룹은 대조구(cotnrol)보다 낮은 MDA 함량을 나타내었다.
이러한 뇌조직 중의 생화학물질 분석(SOD, GSSG/total GSH 및 MDA) 결과들을 종합해볼 때, 브로콜리 잎 추출물로부터 얻은 클로로포름 분획물을 섭취한 마우스 뇌 조직에서도 Aβ1-42로 유발된 산화적 스트레스에 대한 뛰어난 항산화 활성을 나타내는 것으로 사료된다.
Claims (11)
- 브로콜리 잎 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물.
- 브로콜리 잎 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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| KR1020150118751A KR101725150B1 (ko) | 2015-08-24 | 2015-08-24 | 브로콜리 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물 |
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Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170023512A KR20170023512A (ko) | 2017-03-06 |
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| KR20200066120A (ko) | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 푸른여름팩토리 주식회사 | 홍삼 추출물, 석창포 추출물 및 원지 추출물을 유효성분으로 함유하는 인지기능장애 개선용 조성물 |
| KR20220017060A (ko) | 2020-08-04 | 2022-02-11 | 대구한의대학교산학협력단 | 목화씨 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| EP3862011A4 (en) * | 2018-10-01 | 2022-06-08 | Astrogenesis Co., Ltd. | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES, CONTAINING AN EXTRACT OF ANGELICA GIGAS NAKAI OR A MIXTURE OF EXTRACTS OF ANGELICA GIGAS NAKAI AND BROCCOLI |
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| 김은지 외 1명, ‘식물공장에서 재배한 브로콜리 새싹 용매 분획물의 항산화 활성’, 한국식품영약학회지 제28권제1호, 1-8쪽, 2015년 02월.* |
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