KR101158835B1

KR101158835B1 - 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 의약조성물

Info

Publication number: KR101158835B1
Application number: KR1020090120711A
Authority: KR
Inventors: 김순배; 김광순; 김완배; 곽의종; 방성혜; 김현표; 손건호
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 주식회사파마킹
Priority date: 2009-12-07
Filing date: 2009-12-07
Publication date: 2012-06-27
Also published as: WO2011071296A3; US20120021011A1; JP2012506914A; JP5543979B2; CN102292095B; EP2352506A1; EP2352506A4; KR20110064212A; CN102292095A; EP2352506B1; WO2011071296A2

Abstract

본 발명은 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 경감 또는 치료를 위한 의약 조성물에 관한 것이다.

본 발명은, 꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물 및 인동의 에탄올 추출물의 병용 투여가 각각의 추출물을 단독 투여한 경우에 비하여 시험관 내 및 생체 내 시험에서 현저하게 우수하고 상승적인 항염증 및 진통효과를 보인다는 것을 밝힌 것을 기초로 한다.

본 발명의 의약조성물은 예를 들어, 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 호흡기계 염증성 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 다발성 관절염, 급성염증, 알러지성 염증, 건선 등의 피부질환, 요통, 발치후 동통, 두통, 수술 후 통증 및 염증, 치통, 생리통 등 소염진통효과를 필요로 하는 각종 질병의 치료에 사용될 수 있다.

꾸지나무, 인동, 항염증, 천식, 진통, 만성폐쇄성폐질환(COPD)

Description

꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증 의약조성물{Anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising the extracts from Broussonetia papyrifera and Lonicera japonica}

본 발명은 꾸지나무 추출물 및 인동추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 또는 통증의 예방, 경감 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.

염증은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 예를 들어 외상이나 화상, 세균 침입 따위에 대하여 몸의 일부에 충혈, 부종, 발열, 통증을 일으키는 증상이다. 염증 신호는 크게 사이클로옥시게나제(COX) 경로와 리폭시게나제(LOX) 경로를 통하여 만들어지며, 그 결과 프로스타글란딘, 류코트리엔, 트롬복산 등이 생성된다. 염증신호가 전달되면, 생체 내에서는 여러 가지 변화가 일어나는데, 염증이 필요한 부위의 혈관이 확장되어 혈액공급이 왕성하게 되도록 하여 세균을 잡아먹는 호중구 등 염증반응에 필요한 혈액세포를 공급한다. 그러나, 이러한 생체의 방어 반응이 비정상적으로 과도하게 일어나면 다양한 염증성 질환들이 나타나게 되므로, 염증신호를 만드는 경로의 효소(예를 들어 COX-1, COX-2, 5-LOX, 12-LOX 등)를 억제하여 경로를 차단함으로써 염증반응을 억제하는 약물 들이 개발되고 있다.

한편, LOX는 염증반응 외에 기관지 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 아토피성 피부염, 건선 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

현재까지 NSAID와 SAID를 비롯한 다양한 기전의 항염증 약물들이 개발되어 있으나, 이들 각각은 각각의 부작용이 있을 뿐 만 아니라, 만성폐쇄성폐질환, 아토피질환 등의 만성염증 및 알러지질환의 근본적인 치료에는 유효하지 않기에 좀 더 효과적이고 안전성이 있으며 경제적인 의약품의 개발이 필요하다.

꾸지나무 (Broussonetia papyrifera (L.) Vent. (Moraceae))는 중국, 일본, 한국에 분포하는데, 이의 껍질은 한방에서 항염증제, 항기관지염제, 진해제로 사용되어 왔다. 꾸지나무 뿌리(radix)의 PTP1B 및 티로시나제 저해활성이 보고된 바 있으며(Chen et al., 2002; Hwang and Lee, 2007), 최근에는 꾸지나무의 뿌리, 줄기(stem), 잎, 과일의 95% 에탄올 추출물이 생체 내에서 항진통(antinociceptive) 및 항염증활성을 보인다고 보고되었다(Lin et al., 2008). 꾸지나무 뿌리 껍질로부터 파피리플라보놀 A (papyriflavonol A) 및 broussochalcone A 를 포함하는 몇 가지 프레닐레이티드 플라보노이드(prenylated flavonoid)가 성공적으로 분리되었다 (Son et al., 2001).

인동(Lonicera japonica (Thunb.) (Caprifoliaceae))은 다른 것에 감겨 자라는 관목으로서, 해독제로서 그리고 비뇨기 장해, 고열, 두통의 치료에 사용되어 왔다(Shougakukan, 1985). 인동은 항염증제로 알려졌으며 상기도감염, 당뇨병, 류마티스성 관절염에 사용되었다(Lee et al., 1998). 인동의 전체 식물로부터 로니세로 시드(lonicerosides) 및 이리도이드(iridoids)를 포함하는 여러 가지 성분이 분리되었다(Lee et al., 1995; Kwak et al., 2003 Qian et al., 2007).

현재까지 다양한 기전의 항염증 약물들이 개발되어 있으나, 이들은 각각의 부작용이 있을 뿐 만 아니라, 어떤 질환의 경우에서는 근본적인 치료에 유효하지 않으므로 좀 더 효과적이고 안전성이 있으며 경제적인 의약품의 개발이 필요하다. 이의 방법 중의 하나는 둘 이상의 유효성분을 포함하는 복합제를 개발하는 것이나, 항염증, 진통 작용을 나타내는 물질들을 병용 투여할 경우 생체 내에서의 그 효과를 예측하는 것은 용이하지 않다. 본 발명은 병용 투여할 경우 항염증 효과가 상승적으로 증가하는 새로운 항염증 복합조성물을 찾아 제공하는 것을 목적으로 한다.

이에 본 발명자들은 연구를 거듭하여 수행한 결과, 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 병용하여 사용할 경우 각각의 추출물을 단독으로 사용하는 것보다 항염증 및 진통 효과가 우수하다는 것을 밝힌 것을 기초로, 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 예방, 경감 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 꾸지나무 추출물로는 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물 및 인동의 에탄올 추출물을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 꾸지나무의 추출물 및 인동의 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 각각의 개별 추출물보다 항염증 및 진통효과가 우수하므로 효과적인 항염증제, 소염제 또는 진통제로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 꾸지나무 및 인동의 2 가지 추출물 성분이 효과를 발휘하여 치료적 범위가 넓고, 상승작용으로 강력한 치료효과를 나타낸다. 이와 같이 두 가지 성분을 병용하면 치료 효과가 상승되므로 단독으로 사용할 때 보다 적은 양의 투여로 효과를 달성할 수 있으므로 부작용을 낮출 수 있다는 이점도 있다.

본 발명은 꾸지나무 추출물 또는 그의 분획물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 및/또는 통증의 경감 또는 치료를 위한 의약 조성물 및 이를 사용하여 염증및 통증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 꾸지나무의 프레닐화된 플라보노이드-농축 추출물 및 인동의 에탄올 추출물의 병용 투여는 이들의 단독 투여에 비하여 시험관 내 및 생체 내 시험에서 항염증 및 진통효과에 있어서 현저하게 우수한 상승효과를 보인다는 것을 밝힌 것을 기초로 한다.

본 발명의 발명자들은 꾸지나무 뿌리껍질 추출물의 에탄올 분획을 에틸아세테이트를 사용하여 분획화하여 소수성인 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 분획(prenylated flavonoid-enriched fraction)(EBP)을 만들었으며, 인동은 전체 식물의 에탄올 추출물(ELJ)을 제조하였다. EBP는 A23187 로 처리된 랫트 호염기성 백혈병 (rat basophilic leukemia; RBL-1) 세포의 5-리폭시게나제(5-lipoxygenase (5-LOX))를 강력하게 저해하였고 ELJ는 약한 저해작용을 나타내었으나, 이들의 혼합물은 명백하게 훨씬 강한 상승적인 저해활성을 나타내었다(도1). 이들은 또한 시 클로옥시게나제-2 로 촉매화된 PGE₂(cyclooxygenase-2-catalyzed PGE₂)생성을 저해하였다(도2). 아라키돈산으로 유발된 마우스의 귀 부종에 대해서는, EBP는 5-200mg/kg의 용량을 경구투여할 때 저해활성을 보였으며, EBP와 ELJ의 1:1 혼합물인 BL이 더 강력한 저해 활성을 보였다(표1). 카라기난으로 유도된 발부종(λ-carrageenan-induced paw edema)에 대해서 BL은 또한 강력하며 상승적인 항염증효과를 보였다(표2). 초산-유발 라이딩(writhing)테스트에서 BL은 50-400 mg/kg을 경구투여시 강력한 진통활성을 가졌다(표3). 이러한 결과들은 실험한 모든 제제들이 시험관 내 및 생체 내에서 항염증활성을 가지며, 특히 EBP 또는 ELJ 보다 이들의 혼합물이 항염증 효과가 훨씬 더 강력하고 상승적인 효과를 나타낸다는 것을 말해 준다.

상기 실험결과를 기초로 본 발명은 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 및/또는 통증의 예방, 개선 또는 치료용 의약 조성물, 이를 사용하는 염증 및/또는 통증의 예방, 개선 또는 치료방법을 제공한다.

꾸지나무 추출물은 예를 들어, 열수로 추출하거나, 수용성 알콜용액이나 소수성 용매를 이용하여 추출할 수 있으며, 수용성 알콜추출액을 다시 소수성용매로 추출하는 등의 방법으로 제조될 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 인동의 추출물은 예를 들어, 열수로 추출하거나, 수용성 알콜용액이나 소수성 용매 등을 사용하여 제조할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물로 꾸지나 무 뿌리껍질의 추출물로 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물을, 인동추출물은 에탄올 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물은 예를 들어, 꾸지나무를 에탄올로 추출하여 진공에서 건조시키고 에틸아세테이트로 분획화하는 등의 방법으로 제조할 수 있으며 , 그러나 이에 제한되는 것은 아니고 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물을 제조할 수 있는 방법이면 어떤 방법을 사용하여도 무방하다. 동추출물의 제조를 위하여 5 내지 100% 에탄올을 사용할 수 있으며 50-100% 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물의 유효성분으로서 포함되는 꾸지나무의 프레닐레이티드-농축 추출물 및 인동의 에탄올 추출물은 중량비로 1: 0.1 ~ 1:10, 바람직하게는 1:0.5 ~ 1:4, 더욱 바람직하게는 1:1로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 경구투여에 적합한 단위투여형의 제제 또는 주사제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 경구투여용 제형에는 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제, 산제, 서방형 제제, 장용성 제제, 과립제, 유당제, 세립제, 환제, 엑기스제, 액제, 방향수제, 유제, 시럽제, 엘릭실제, 유동엑시스제, 침전제, 틴크제, 주정제, 약유제 등이 포함된다. 이러한 경구투여용 제제에는 두 가지 또는 그 이상의 약물학적 활성 성분이외에 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 불활성인 통상적인 담체, 예를 들면 전분, 락토스, 카복시메틸셀룰로오즈, 카올린 등의 부형제, 물, 젤라틴, 알코올, 글루코즈, 아라비아 고무, 트라가칸타 고무 등의 결합제, 전분, 덱스트린, 나트륨 알기네이트 등의 붕해제, 탈크, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 유동 파라핀 등의 활탁제와 같은 추가의 첨가제 성분들이 포함될 수 있다. 본 발명에서는 또한 용해를 위한 용해보조제 등을 첨가할 수도 있다.

본 발명의 약학조성물은 또한 약물의 투여 형태와 치료학적 유효량에 적합한 방법으로, 예를 들어 경구, 비강 내, 정맥 내, 복강내, 피하 또는 국소 투여한다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 사용할 수도 있다. 예를 들어 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액 (Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리식염완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 용액은 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 또는 본 발명의 조성물은 분말형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체와 함께 사용될 수 있다. 또는 리포좀이나 현탁액, 서방성 제제 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 종양의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 의약조성물은 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 염증성 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 다발성 관절염, 급성염증, 알러지성 염증, 건선 등의 피부질환, 요통, 발치후 동통, 두통, 수술 후 통증 및 염증, 치통, 생리통 등 소염진통효과를 필요로 하는 각종 질병의 치료에 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량 및 투여시기는 투여대상의 나이, 성별, 상 태, 체중, 투여경로, 투여 횟수, 약의 형태에 따라서 달라진다. 일일 투여량은 약 0.01 ug/kg 내지 10g/kg이고, 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100mg/kg 이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예

시약 및 동물

A23187, N-[2-cyclohexyloxy-4-nitrophenyl]methane sulfonamide (NS-398) 는 Biomol (Plymouth Meeting, PA)로부터, 2-Amino-5,6-dihydro-6-methyl-4H -1,3-thiazine hydrochloride (AMT) 는 Tocris Cookson Ltd. (UK), 아라키돈산(AA, 99%), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), nordihydroguaiaretic acid (NDGA), 프레드니솔론, 인도메타신, 아스피린 및 리포폴리사카라이드 (LPS, Escherichia coli 0127:B8)는 Sigma Chem. (St. Louis, MO), DMEM 및 FBS 등의 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, NY), 단백질정량키트는 Bio-Rad Lab. (Hercules, CA)으로부터 구입하였다.

실험동물은 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트 및 ICR 마우스(4주령, 특정병원 균부재) 를 오리엔트-바이오(Korea)로부터 구입하였으며, 동물들은 표준 식이(standard lab. chow (Purina Korea))와 물을 자유로이 공급하였으며, 실험하기 적어도 7일 이전부터 동물사육장(KNU) 에서 20 - 22^oC, 상대습도 40 - 60%, 12시간/12시간 (명/암) 주기로 순화시켰다. 동물실험디자인은 KNU 동물실험위원회의 승인을 받았으며(KIACUC-09-0012), 실험은 실험동물의 보호 및 사용에 관한 한국식품의약품안전청의 가이드라인에 기재된 윤리규정을 따라 시행되었다.

통계분석

실험값은 산술평균± SD로써 나타내었다. 통계적 유의성 결정은 ANOVA test 로 실시하였다.

<실시예 1> 꾸지나무 및 인동 추출물의 제조

꾸지나무는 한국의 남부지방(안동부근 지역)에서 수집하였다. 꾸지나무의 뿌리의 말린 껍질을 잘게 잘라 100% 에탄올로 추출하였다. 에탄올 추출물을 진공에서 건조시켜 최종 추출물을 물에 분산시키고 에틸아세테이트로 분획화한 후, 에틸아세테이트 분획을 건조시키고 건조된 분획(EBP)을 시험에 사용하였다. 이 분획으로부터 Papyriflavonol A 및 broussochalcone A 를 Son et al.(2001)에 기재된 방법으로 분리하여 확인하였다.

인동은 생약재 시장에서 구입하여 사용하였다. 건조된 인동을 잘게 자른 후 70% 에탄올로 추출하였다. 에탄올 추출물을 진공하에 건조시켜 건조된 에탄올 추출물(ELJ)을 시험에 사용하였다. 에탄올 추출물로부터 로가닌(Loganin) 및 스웨로시 드(Sweroside)를 (Kawai et al.,1988)에 기재된 방법에 따라 분리하였다.

EBP의 프레닐레이티드 플라보노이드(papyriflavonol A and broussochalcone A) 및 ELJ의 이리도이드(loganin and sweroside)의 함량은 HPLC 분석으로 확인하였다.

실험에 사용된 BL은 EBP 및 ELJ의 1:1 (w/w) 혼합물이다.

<실시예 2> Rat basophilic leukemia-1 (RBL-1) 세포 배양 및 류코트리엔(leukotrienes (LT))의 측정

5-LOX 저해 활성을 측정하기 위하여, American Type Culture Collection (ATCC, Rocksville)로부터 입수한 RBL-1 세포를 RPMI 1640에서 10% FBS, 2 mM glutamine 및 1% 항생제와 함께5% CO_2,37^oC에서 배양하였다. 세포를 96-well plates에 2시간 동안 두었으며, 시험물질과 10분 동안 미리 인큐베이션시켰다. 시험물질은 DMSO에 녹여 serum-free DMEM으로 적절한 농도로 희석하였다. DMSO의 최종농도는 0.1% (v/v)로 조절되었다. 세포 생존능을 Mossman(1983)의 방법에 의하여 MTT assay로 측정하였다. 5-LOX 를 활성화시키기 위하여 A-23187 (ionophore, 3 μM) 을 첨가하고 Tries 등(2002)의 방법을 약간 수정한 방법에 의하여 세포를 15분간 인큐베이션하였다. 배지를 수거하여 5-LOX 산물인 시스테이닐 류코트리엔 cysteinyl leukotrienes (LTC₄/D₄/E₄)의 농도를 ELISA 키트(Cayman Chem.)를 사용하여 제조자가 권고한 방법에 의하여 측정하였다.

RBL-1 세포가 A23187 (calcium ionophore)로 활성화되면 5-LOX 에 의하여 많 은 양의 cysteinyl-LTs 이 생산된다는 것이 잘 알려져 있다. 본 실험에서 RBL-1 세포는 15 분간 (n = 3) 기저수준(basal level) 4.2 ± 1.2 pg/ml 로부터 1,109.5 ± 93.6 pg/ml의 LTC₄/D₄/E₄ 을 생산하였다. 이러한 조건하에서, 꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물 분획(EBP)은 1μg/ml, 2μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml 및 100μg/ml을 처리할 경우 각각 5%, 24%, 96%, 99% 및 99%의 저해활성을 보여 농도 의존적으로 5-LOX을 저해하였다(도1). 선형회귀분석 결과, IC₅₀ 값은 3.1 μg/ml 이었다. 한편, ELJ는 10μg/ml, 20μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml 및 250μg/ml을 처리할 때 각각 1%, 6%, 18%, 74% 및 99%의 저해활성을 보여 5-LOX을 약하게 저해하였다 (IC₅₀ = 78.7 μg/ml). EBP 및 ELJ 혼합물의 경우는 각각을 개별적으로 사용한 경우보다 훨씬 강력한 저해활성을 보여, EBP의 중량을 기초로 할 때 IC₅₀ < 1μg/ml 이었다. 동일양의 각 물질의 저해활성을 더한 것과 비교할 때, 혼합물이 5-LOX에 대한 효과가 훨씬 더 강력하여, 혼합물이 상승효과가 있음을 알 수 있다. 구체적으로, EBP 1μg/ml 및 ELJ 4μg/ml을 각각 개별적으로 처리할 경우 류코트리엔 생성에 대한 저해활성이 나타나지 않으나, 각 추출물을 병용처리(중량비로 1:4 혼합물)할 경우 (61%) 저해활성을 보여 예측할 수 없는 상승효과를 보였다. EBP 2μg/ml 및 ELJ 3μg/ml을 각각 개별적으로 처리할 경우 류코트리엔(LT) 생성에 대한 저해활성이 각각 24% 및 0% 이었으나 각 추출물을 병용처리(중량비로 1:1.5 혼합물)할 경우(92%) 저해활성효과를 보여 역시 예측할 수 없는 상승효과를 보였으며, EBP 및 ELJ를 각각 2.5μg/ml 씩 혼합할 경우(중량비 1:1)도 5-LOX-매개 LT 생 산을 거의 완전하게 저해하여 (96%) 예측할 수 없는 상승효과를 나타내었다. 실험에 사용된 ELJ의 양은 단독으로는 전혀 류코트리엔 생성 저해 활성이 없는 농도에 해당함에도 불구하고 EBP과 병용처리될 경우 EBP의 5-LOX 저해활성은 ELJ 를 첨가함으로써 상당히 증강되어 혼합물은 놀라운 저해 효과를 나타내었다. 이러한 결과로부터, 혼합물의 다양한 비율 중 EBP 및 ELJ의 중량비 1:1인 혼합물(BL)을 선택하여 추가의 실험을 하였다. 비교화합물로 사용한 LOX 저해제인 NDGA(nordihydroguaiaretic acid) 역시 5-LOX을 강력하게 저해하였다 (1 μM 에서 99% 저해).

<실시예 3> RAW 264.7 세포에서 PGE ₂ 생산에 미치는 영향

염증반응의 매개인자인 PGE₂의 생성에 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물의 효과에 대하여 알아 보았다.

American Type Culture Collection (ATCC, Rocksville)로부터 입수한 RAW 264.7 세포를 10% FBS 및 1% 항생제(100 U/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)으로 보충된 DMEM 으로 5% CO₂, 37^oC 조건에서 배양하였다. 세포를 Chi et al.(2001)의 방법으로 리포폴리사카라이드(LPS)로 활성화 시켰다. 세포를 96-well plates (2x10⁵ cells/well)에 첨가하고 2시간 pre-incubation 한 후, 시료물질 및 LPS (1 μg/ml)를 첨가하고 달리 규정하지 않는 이상 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배지 중의 PGE₂ 농도를 PGE₂용ELISA 키트(Cayman Chem. Co.) 을 사용하여 제조 자의 권고에 따라 측정하였다.

EBP 및 BL은 LPS-처리된 마우스 마크로파지 세포주인 RAW 264.7 세포로부터 COX-2-촉매된 PGE₂의 생산을 50 ug/ml까지의 농도에서 통계적으로 유의성 있게 저해하였다 (도2a 및 2b). EBP 및 BL 의 IC₅₀값은 PGE₂ 생산에 대해서는 각각 21.4 μg/ml 및 29.0 μg/ml 이었다.

<실시예 4> 아라키돈산(AA)-유발 마우스 귀 부종에 대한 효과

항염증 동물모델에서의 생체 내 항염증활성을 확인하기 위하여 AA-유발 마우스 귀 부종 측정방법을 채용하였다. Kim et al.(1993)의 방법에 따라, 2% AA 아세톤용액을 마우스의 귀에 바르고(20 μl/ear), 1시간 후 귀의 두께를 dial thickness gauge (Mitutoyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. AA 처치 1시간 전에 DMSO:물 (1:1)에 녹인 시험물질을 경구로 투여하였다(0.1 ml/mouse). 각 군당 5마리를 사용하였으며 측정값은 산술평균± S.D로 나타내었고(표1의 a)), 표1의 b는 AA처리된 대조군과 비교한 저해 %이다. *는 AA처리 대조군과 비교하여 P<0.05로 유의하게 차이가 있음을 나타낸다.

AA 처리를 하지 않은 네가티브 대조군은 0.003± 0.001mm 증가를 보였다. EBP 및 ELJ 는 50 - 200 mg/kg 를 경구로 투여하였을 때 부종반응을 저해하였으며, ELJ보다 EBP가 더 강력하였다(표1). EBP 및 ELJ의 1:1 중량비 혼합물인 BL을 투여한 경우, EBP 및 ELJ 각각을 투여한 경우보다 염증억제효과가 상승적으로 증가하였다. 구체적으로 살펴보면, EBP 50 mg/kg을 투여한 경우 귀 부종을 28.6% 저해하였으며, ELJ를 50mg/kg 투여한 경우 저해효과가 없었으나, EBP 50mg/kg 및 ELJ 50mg/kg의 혼합물인 BL 100mg/kg에서는 34.4%의 저해효과를 보여 혼합물을 투여할 경우 예측할 수 없는 상승효과를 보였다. 또한, EBP 200 mg/kg을 투여한 경우 귀 부종을 45.7%, ELJ를 200mg/kg 투여한 경우 25.0%, BL 200mg/kg의 경우 60.0% 저해되어 BL을 투여한 군이 가장 저해 효과가 높았으며, EBP 200mg/kg 및 ELJ 200mg/kg의 혼합물인 BL 400mg/kg에서는 78.6%의 저해효과를 보여 각 추출물의 저해백분율을 더한 값보다 더 높은 저해활성을 보여 두 추출물의 혼합으로 상승효과를 갖는다는 것을 알 수 있다. 특히, 400 mg/kg에서 BL 은 인도메타신(20 mg/kg)이 70% 저해를 보인 것 보다 더 강력하게 부종반응을 저해하였다.

<실시예 5> 람다-카라기난 유발 (λ-Carageenan (CGN)-induced) 마우스 발 부종에 대한 효과

항염증활성을 측정하기 위하여 마우스 CGN-induced 발 부종 어세이를 실시하였으며, Winter et al. (1962)의 방법을 약간 수정하여 실시하였다. 시험물질을 마우스에 경구투여하고, 1 시간 후 pyrogen-free 멸균 생리식염수에 녹인 1% CGN (w/v) 용액 (0.05 ml/paw)을 발에 주사하고 5시간 후 발의 부피를 plenthysmometer (Ugo Basil, Italy)로 측정하였다. 카라기난 투여 전의 발의 부피보다 증가하면 부종으로 간주하였다.

모든 물질들은 DMSO:물 (1:1)에 녹여 경구투여하였다. CGN 투여8가 되지 않은 네가티브 대조군의 발의 부피는 0.149± 0.025ml 이었다. 각 군은 각각 5마리의 마우스를 사용하였으며, 측정값은 산술평균± S.D로 나타내었고(표2의 a)), 표2의 b는 CGN 처리된 대조군과 비교한 저해 %이다. *는 CGN 처리 대조군과 비교하여 P<0.05로 유의하게 차이가 있음을 나타낸다.

CGN-유도 발 부종에 대해서, BL은 50 - 400 mg/kg 경구투여에서 역시 용량 의존적인 저해활성을 보였다 (표 2). EBP 또는 ELJ을 개별적으로 각각 200 mg/kg 투여할 경우 각각 23.7% 및 11.8% 저해를 보여 두 추출물을 더한 저해 백분율을 더한 값이 35.5%가 되는 반면, EBP 및 ELJ 200 mg/kg 씩을 구성된 BL 400 mg/kg 을 투여한 경우 각각의 저해 백분율을 더한 것 보다 큰 47.4% 저해를 보여 두 가지 추출물을 병용투여할 경우 상승적인 저해 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.

<실시예 6> 마우스에서 초산유발 롸이딩 테스트(Acetic acid-induced writhing test) 에 대한 효과

진통활성을 측정하기 위하여, 1% 초산(100 μl)을 쥐의 복강 내에 투여하였다. 초산주사 후 10분 후부터 10분간 롸이딩(writhings) 횟수를 세었다. 초산을 주사하기 전에 DMSO:물(1:1) 에 녹인 시험물질을 경구투여 (0.1 ml/mouse) 하였다.

각 군은 각각 6마리의 마우스를 사용하였으며, 측정값은 산술평균± S.D로 나타내었고(표3의 a)), 표3의 b는 초산 처리된 대조군과 비교한 저해 %이다. *는 초산 처리 대조군과 비교하여 P<0.05로 유의하게 차이가 있음을 나타낸다.

진통활성 조사 결과, 50 - 400 mg/kg 경구투여시 ELJ의 진통활성은 EBP 보다 더 강력한 것으로 나타났으며, BL이 강력하고 용량 의존적으로 마우스에서 초산-유발 writhing 저해하였다(표 3).

앞선 다른 연구팀의 연구결과 꾸지나무의 몇몇 부분이 진통 및 항염증활성이 있는 것으로 평가되었다 (Lin et al., 2008). 뿌리, 잎, 열매의 에탄올 추출물이 생체 내에서 600 - 2000 mg/kg 경구투여 투여로 마우스에서 초산-유발 writhing 저해활성을 나타냈다. 이러한 결과와 비교할 때, 본 실험의 조성물은 50 - 400 mg/kg 농도에서 훨씬 더 강력한 생체 내 진통 및 항염증 활성을 보였다.

본 발명의 꾸지나무 추출물 및 인동 추출물을 유효성분으로 함유하는 다양한 형태의 제제를 하기와 같이 제조하였다.

제제예 1: 정제의 제조

꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드 농축 추출물 100mg

인동의 에탄올 추출물 100mg

유당 50 ㎎

전분 10 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 2: 산제의 제조

꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드 농축 추출물 100mg

인동의 에탄올 추출물 400mg

유당 30 ㎎

전분 20 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분들을 긴밀히 혼합한 후 폴리에틸렌이 코팅된 포에 충진하고 밀봉하여 산제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드 농축 추출물 200mg

인동의 에탄올 추출물 100mg

유당 150 ㎎

전분 28 ㎎

탈크 2 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

제제예 4: 연질캅셀제의 제조

꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드 농축 추출물 200mg

인동의 에탄올 추출물 200mg

폴리에틸렌글리콜 400 400 ㎎

농글리세린 55 ㎎

정제수 35 ㎎

폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 후 정제수를 첨가한 혼합물을 약 60℃로 유지한 상태에서 플라본을 넣고 교반기로 약 1,500 rpm으로 교반하면서 균일하게 혼합하였다. 상기 혼합액을 서서히 교반하면서 실온으로 냉각하고 진공펌프로 기포를 제거하여 연질캅셀의 내용물을 준비하였다.

연질캅셀의 피막은 당분야에 공지된 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1캅셀당 젤라틴 132 ㎎, 농글리세린 52 ㎎, 70% 디솔비톨액 6 ㎎ 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상적인 제조방법으로 제조하였다.

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도1은 A23187로 처리된 RBL-1 세포로부터 생산되는 5-LOX가 매개된 류코트리엔에 대한 꾸지나무추출물 및 인동 추출물의 효과를 나타낸 것이다. * 및 **는 각각 A23187로 처리된 대조군과 비교하여 P<0.05 및 P<0.01로 유의성 있음을 나타낸다.

도2는 LPS로 처리된 RAW 264.7 세포로부터 PGE₂ 의 생산에 대한 꾸지나무의 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물 및/또는 인동의 에탄올 추출물의 효과를 나타낸 것이다. LPS-처리군은 120± 8.0nM PGE₂를 생산하였다(기저수준은 각각 1.2± 0.4nM PGE₂, 0.8± 0.3μM NO 이었음). n=3. * 및 ** 는 각각 LPS-처리 대조군과 비교하여 p<0.05 및 p<0.01 로 유의한 차이가 있음을 나타낸 것이다.

Claims

꾸지나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 선택되는 제1물질 및 인동 추출물인 제2물질을 1:1~4 중량비로 유효성분으로 포함하며, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 및/또는 통증의 예방, 경감 또는 치료용 의약 조성물.
꾸지나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물로부터 선택되는 제1물질 및 인동 추출물인 제2물질을 1:1~4 중량비로 유효성분으로 포함하며, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 호흡기계 염증성 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 다발성 관절염, 급성염증, 알러지성 염증, 건선 등의 피부질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 꾸지나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물이 꾸지나무를 수용성 알콜로 추출하고 이어 소수성용매로 분획한 분획물 또는 프레닐레이티드 플라보노이드-농축 추출물이며, 인동추출물은 에탄올 추출물인 것인 의약 조성물.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 꾸지나무 추출물의 에틸아세테이트 분획물 및 인동추출물이 1:1 중량비로 포함되는 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물로 제조되는 경구투여용 제제, 점막적용제제, 주사제, 흡입제 및 외용제로 구성된 군으로부터 선택되는 염증, 통증, 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 호흡기계 염증성 질환, 류마티스성 관절염, 골관절염, 퇴행성 관절염, 다발성 관절염, 급성염증, 알러지성 염증, 건선 등의 피부질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 의약제제.
제6항에 있어서, 경구 투여용 제제가 경질 및 연질 캅셀제, 정제, 현탁제, 시럽제, 산제, 서방형 제제, 장용성 제제, 과립제, 유당제, 세립제, 환제, 엑기스제, 액제, 방향수제, 유제, 시럽제, 엘릭실제, 유동엑시스제, 침전제, 틴크제, 주정제, 약유제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 의약제제.