KR102024200B1 - 쓴맛이 감소되고, 항염 효과가 증대된 발효 울금의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 쓴맛이 감소되고, 항염 효과가 증대된 발효 울금의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법으로 제조된 발효 울금은 쓴맛은 감소하면서도, 항염 효과가 뛰어나므로 특유의 쓴맛으로 인한 불쾌감 때문 식품에 활용하는데에 제한사항이 있는 종래의 울금의 기호도를 개량하고, 세포의 생존에 나쁜 영향을 미치지 않으면서도 염증관련 인자들의 저해 효과를 나타내므로 울금의 활용을 증대시킬 수 있다.

Description

쓴맛이 감소되고, 항염 효과가 증대된 발효 울금의 제조방법{Manufacturing method of Fermented Curcuma Longa L. with decreased bitterness and improved anti-inflammatory effect}

본 발명은 쓴맛이 감소되고, 항염 효과가 증대된 발효 울금의 제조방법에 관한 것이다.

울금(Curcuma longa L.)은 생강과(Zingerilberaceae)에 속하는 다년생 숙근성 초본식물로 고온다습한 남부아시아, 아프리카, 중남미에서 자생하고 있으며 국내에서는 진도 지방에서 울금의 대량재배가 성공하면서 최근에는 전국 각지로 재배 지역이 넓어고 있다. 울금은 커리와 머스터드 소스의 원료 중 하나로서, 향신료, 식품에 색깔을 내는 첨가물 및 일반 천연 염색료로 이용되는 것 외에도 한국을 비롯해 여러 나라들의 전통의학 또는 민간요법에서 항염, 항균 작용을 비롯한 다양한 용도의 약재로 이용되어왔다.

울금은 그 우수한 효능에도 불구하고 강한 향취와 쓰고 매운맛으로 인해 식품에서의 활용에 한계가 있다. 이때문에 대한민국 공개특허 제10-2013-0013686호와 같이 울금으로부터 커큐민과 같은 유효성분을 추출하여 사람이 섭취하기 편리한 형태로 가공하기 위한 방법들이 시도되고 있다. 그러나, 이러한 방법들은 공정의 복잡성과 수율이 낮은 문제를 갖고있어 울금의 기능성은 유지하면서도 강한 향취와 매운맛을 쉽게 완화시킬 수 있는 울금의 가공 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이에, 본 발명자들은 울금의 활용성을 넓히기 위해 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 이용하여 발효시킨 울금에서 쓴맛이 개선되고, 발효 전에 비해 항염활성이 개선되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2013-0013686호

본 발명의 목적은 쓴맛이 감소되고, 항염 효과가 증대된 발효 울금의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 발효 울금의 제조방법을 제공한다:

1) 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 배양된 리조푸스 오리재를 울금에 접종하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 리조푸스 오리재가 접종된 울금을 발효시키는 단계

또한 본 발명은 1) 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 배양된 리조푸스 오리재를 울금에 접종하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 리조푸스 오리재가 접종된 울금을 발효시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 항염증 효과가 개선된 발효 울금 추출물을 제공한다.

아울러 상기 방법으로 제공된 발효 울금 및 발효 울금의 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 발효 울금은 쓴맛은 감소하면서도, 항염 효과가 뛰어나므로 특유의 쓴맛으로 인한 불쾌감 때문 식품에 활용하는데에 제한사항이 있는 종래의 울금의 기호도를 개량하고, 세포의 생존에 나쁜 영향을 미치지 않으면서도 염증관련 인자들의 저해 효과를 나타내므로 울금의 활용을 증대시킬 수 있다.

도 1은 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 이용한 발효 전(상)과 발효 후(하)의 울금을 나타낸 것이다.
도 2는 발효 0일, 1일, 2일 및 3일차 울금 추출물의 맛 분석 결과이다.
도 3은 발효 울금 추출물을 RAW264.7 세포에 처리시 세포의 생존에 미치는 영향을 나타낸 결과이다. (FCL: 발효울금 추출물)
도 4는 염증반응이 유도된 RAW264.7 세포에 발효 울금 추출물의 처리시 NF-kB, TNF-α 및 IL-6의 억제 효과를 나타낸 결과이다. (A: NF-kB, B: TNF-α, C: IL-6, FCL: 발효울금 추출물)
도 5는 염증반응이 유도된 RAW264.7 세포에 발효 울금 추출물의 처리시 NO 및 iNOS의 억제 효과를 나타낸 결과이다. (A: NO, B: iNOS, FCL: 발효울금 추출물)
도 6은 염증반응이 유도된 RAW264.7 세포에 발효 울금 추출물의 처리시 PGE2 및 COX-2의 억제 효과를 나타낸 결과이다. (A: PGE-2, B: COX-2, FCL: 발효울금 추출물)

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 단계를 포함하는 발효 울금의 제조방법을 제공한다:

1) 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 배양하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 배양된 리조푸스 오리재를 울금에 접종하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 리조푸스 오리재가 접종된 울금을 발효시키는 단계.

상기 단계 1)의 리조푸스 오리재(R. oryzae)는 울금 중량의 1 내지 5%(w/w)로 접종되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3%로 접종되는 것일 수 있다.

상기 단계 2)의 울금은 분말 상태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 3)의 발효는 1 내지 5일, 구체적으로는 2 내지 4일간 수행하는 것일 수 있다. 발효 기간이 1일보다 짧을 경우 울금의 발효가 출분히 일어나지 않아 쓴맛의 감소와 항염효과의 증진이 충분치 못할 수 있으며, 5일보다 길 경우 생성된 유용 성분이 대사되어 감소하여 경제성에 있어 불리할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 R. oryzae를 이용하여 제조된 발효 울금은(도 1) 쓴맛의 감소(도 2) 및 유효성분의 증가(표 1 및 2)가 나타났으며, 세포 독성이 없으면서도(도 3) 염증관련 인자의 저해 효과를 지니는 것으로 나타나(도 4 내지 6) 특유의 쓴맛으로 인한 불쾌감 때문 식품에 활용하는데에 제한사항이 있는 종래의 울금의 기호도를 개선하고 활용 대상 분야를 넓힐 수 있다.

또한 본 발명은 1) 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 배양하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 배양된 리조푸스 오리재를 울금에 접종하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 리조푸스 오리재가 접종된 울금을 발효시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 항염증 효과가 개선된 발효 울금을 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 발효 울금 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 발효 울금 추출물은 하기의 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:

1) 발효 울금 에 추출용매를 가하여 추출물을 제조하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과된 여과물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

상기 제조방법에서, 발효 울금은 울금의 잎, 줄기, 뿌리, 열매, 껍질로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 추출용매는 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 추출용매는 80% 에탄올일 수 있다.

상기 추출용매는 추출에 사용되는 발효 울금의 중량 1 g당 1 내지 50 ㎖의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 추출방법은 침지, 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 시간은 0.5 내지 96시간일 수 있다. 상기 추출은 1 내지 5회 반복 추출할 수 있다.

아울러 본 발명의 상기 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어진 추출물 내지 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다.

본 발명의 발효 울금 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물은 투여를 위해서는 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 추출물을 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 산제, 정제, 캡슐제, 환, 과립 또는 주사액제로 제제화 할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 19th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 발효 울금 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물은 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립제, 현탁제, 유제, 시럽제, 기타 액제로 제형화될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 경구 투여용 제형은 정제, 구내정(troche), 함당정제(lozenge), 수용성 또는 우성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제(elixir)로 제제화 될 수 있다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 소르비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕해제, 스테아르산 마르네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유할 수 있다. 이외에도 제형으로 제제하기 위해 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일을 추가 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다

또한 본 발명의 발효 울금 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 복강내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물과 함께 물에서 혼합하여 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

발명의 상기 발효 울금 추출물을 유효성분으로 포함하는 항염증용 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 인체에 사용시 안전성 및 효율성을 함께 고려하게 되며, 동물 실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 조성물을 0.0001 ~ 500 mg의 양으로 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있으며, 바람직하게는 0.001 ~ 100 mg의 양으로 투여하고, 더욱 바람직하게는 30 내지 500 mg/kg이다. 그러나 투여 경로, 관절염질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 NO 및 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; PGE2)의 생성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 NF-kB, TNF-α 및 IL-6의 생성을 억제하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 Cox-2 및 iNOS의 발현을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서 R. oryzae를 이용하여 제조된 발효 울금 추출물은(도 1) 세포 독성이 없으면서도 염증관련 인자인 NF-kB, TNF-α 및 IL-6, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 및 이를 생성하는 iNOS와 염증반응 유발인자인 PGE2 및 Cox-2의 저해 효과를 지니는 것으로 나타나 항염증용 약학적 조성물로 사용될 수 있다(도 3 내지 도 6).

이하, 본 발명을 실시예에 의해서 상세히 설명한다.

단 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 발효 울금 및 추출물의 제조

본 발명의 실시예에 사용된 울금은 전라남도 진도군에서 재배 수확된 울금을 세척 후 동결건조기(Bondiro, 일신)로 건조하여 사용하였다. 건조 울금을 분쇄하고10배에 해당하는 증류수(w/v)를 가하여 고압멸균기(Autoclavev 80L, 한양사이언스)에서 1.5기압 및 121℃로 15분 동안 멸균하고, 2%의 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae; RO)를 접종 후 30℃에서 1 내지 3일간 발효시켰다. 발효 울금 추출물은 상기 발효 울금을 동결건조 후, 건조울금 5 g에 80% 에탄올 수용액 100 ml을 가하고 초음파분쇄기(ultrasonicator, Power Sonic 420, 50/60 HZ, 700W, Hwashin Co.)로 1시간씩 2회에 걸쳐 초음파 처리(sonication)시켰다. 상기 초음파 처리물을 Whatman No. 2(Whatman) 여과지로 여과하여 얻은 여액 200ml을 회전 진공 증발 농축기(rotary vacuum evaporator, EYELA)로 감압농축 한 후, 동결건조기로 건조하여 준비하였다.

< 실험예 1> 발효 울금 추출물의 맛 비교

실시예 1에 의한 발효 울금 추출물의 발효기간별 맛의 차이를 객관적으로 측정하기 위하여 맛 분석기(taste sensing system)를 사용하였다.

미각 센서(taste sensor)로 TS5000Z(Insent corp.)을 이용하였으며, 동결건조물을 5배 증류수에 희석하여 맛을 4회 측정한 후 1회 차 측정값을 제외한 나머지 측정값으로 평균을 구하였다. 각 시료의 분석이 끝난 후에는 센서를 표준용액(30 mM KCl + 0.3 mM tartaric acid)으로 세척하였고, 보정액으로는 10 mM KCl 용액을 사용하였다. 측정결과는 분석 소프트웨어(Taste analysis application, Insent)를 이용하여 센서의 전극을 이용한 측정값을 맛의 수치로 변화시켜 나타내었다. 표시 단위인 미각정보 단위(taste information unit)는 업계에서 보편적으로 쓰이고 있는 Kobayahi등이 2010년에 제안한 단위를 이용하였다.

그 결과, 쓴맛의 경우 울금 발효가 진행할수록 유의미하게 감소하는 경향을 보여 발효를 이용한 울금의 기호도가 향상 가능한 것으로 나타났다(도 2).

< 실험예 2> 발효 울금 추출물의 커큐미노이드 함량 비교

울금의 발효기간에 따른 울금의 대표적 활성 성분중 하나인 커큐미노이드(curcuminoid; 커큐민 및 커큐민 유도체 등)의 추출물 내 함량을 비교하였다.

실시예 1의 80% 에탄올 추출물을 시료로 Waters HPLC를 이용하여 분석하였다. 검출은 UV 검출기를 이용하여 254nm에서 측정하였고, 컬럼은 YMC-pack pro C18 (5 ㎛, 4.6×250 mm)을 이용하였다. 이동상(mobile phase) 조성은 증류수/0.1% 아세트산(용매 A)와 아세토니트릴(acetonitrile)/0.1% 아세트산(용매 B)를 이용하여 시간에 따른 농도 기울기 방법을 이용하였으며 분당 1mL의 속도로 용출시켰다. 농도 기울기는 시간에 따른 용매 A 와 B의 부피비를 달리하여 설정했다.

발효일	80% 에탄올 추출물 (mg%)
	BMC		DMC	커큐민
0	18.08		75.21	315.91
1	16.85		69.97	287.31
2	22.31		101.01	418.99
3	19.27		102.56	399.00

그 결과, HPLC(High-performance liquid chromatography) 분석을 통해 커큐민의 유도체인 BMC(bisdemethoxycurcumin) 및 DMC(demethoxycurcumin)가 커큐민 피크의 앞쪽에서 분리됨을 확인하였으며, 발효 1일차에 일시적으로 커큐미노이드의 함량이 감소했으나, 2일차부터는 발효전보다 그 함량이 증가한 것으로 나타났다(표 1).

< 실험예 3> 발효 울금 추출물의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 비교

식물계에 널리 분포되어 있는 페놀계 화합물은 페놀 하이드록실(phenolic hydroxyl)기를 통해 항산화, 항암 및 항염 등의 생리활성 기능을 갖는 것으로 알려져 있으며, 폴리페놀 함량이 높을수록 전자공여능이 높은 밀접한 관련이 있다고 알려져 있다. 이에, 실시예 1에 의한 발효 울금의 발효기간별 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량 및 항산화 활성을 비교하였다.

구체적으로 총 폴리페놀의 함량 측정을 위해 Folin-Denis법을 응용하였다. 실험예 1의 발효울금 추출물 100㎕에 Folin 시약을 1 ml씩 가한 후 실온에 3분간 정치하고 10% Na₂CO₃ 용액 1 ml를 가해 실온에 1시간 정치한 후 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 갈릭 산(gallic acid)을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 총 페놀 함량을 계산하였다.

아울러 플라보노이드 함량 측정을 위해 Moreno법을 이용하였다. 실험예 1의 발효울금 추출물 0.5 ml에 10% 질산알루미늄(aluminium nirate) 0.1 ml과 1 M 초산칼륨(potssium acetate) 0.1 ml 및 에탄올 4.3 ml를 차례로 가하여 혼합하여 실온에서 30분간 정치한 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 케르세틴(Quercetin)을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 총 플라보노이드 함량을 계산하였다. 또한 항산화 활성은 DPPH 소거능을 통해 관찰하였다. DPPH는 화학적으로 안정된 자유 라디칼(free radical)을 가지고 있는 수용성 물질로 아스코브산(ascorbic acid), 토코페롤(tocopherol), 폴리하이드록시(polyhydroxy) 방향족 화합물 등에 의해 환원되어 노란색으로 탈색되며, 식물 또는 식품에서 추출물 또는 특정 혼합물의 자유 라디칼 소거능의 평가에 이를 이용한 시험이 널리 이용되고 있다. 실험예 1의 발효울금 추출물 20㎕에 0.2mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, Sigma-Aldrich Co.)용액 180㎕를 가한 후 혼합하여 상온에서 10분간 정치한 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 80% 에탄올 20㎕에 DPPH용액 180㎕를 가한 후 상온에서 10분간 정치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거 활성능은 다음 식에 의해 계산하였다.

[계산식 1]

DPPH 라디칼 제거 활성(%) =[1-(시료 흡광도/대조군 흡광도)] ×100

발효일	80% 에탄올 추출물 (mg%)
	총 폴리페놀 (mg/g)	총 플라보노이드 (mg/g)	DPPH(%)
0	27.05±0.38C	7.47±0.57C	87.23±1.14C
1	42.91±0.47a	10.33±0.01a	92.47±0.24a
2	23.25±0.16d	6.47±0.36d	89.48±1.64b
3	33.14±0.19b	8.40±0.08b	91.97±0.58a

그 결과, 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량은 발효되지 않은 울금에 비해 발효 1, 3일차에 함량이 증가한 것으로 나타났다. DPPH 소거능도 이와 유사하게 발효 1일차에 92.47%로 가장 높았고, 전체적으로 발효 울금이 비발효 울금보다 높았다(표 2).

< 실험예 4> 발효 울금의 세포 독성 비교

실시예 1에 의한 발효 울금의 발효기간별 세포 독성을 MTT 분석법으로 측정하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소 효소작용에 의하여 MTT tetrazolium이 MTT formazan[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide]으로 환원되는 정도를 측정하는 검사법으로, 본 실시예에서는 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포를 이용하였다.

구체적으로 세포의 밀집도가 80% 이상인 RAW264.7 세포에 발효 실시예 1에 의해 제조된 발효 울금 추출물(FCL)의 최종 농도를 10, 50 및 100 ㎍/mL로 24시간 처리하였다. 처리 후 MTT(Sigma-Aldrich Co.)를 200㎍/ml의 농도로 포함하는 10% FCS(calf serum; GE Healthcare Bio-Sciences Co.)와 100 unit/ml의 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptommycin)이 함유된 DMEM 배지로 교환하여 추가로 37℃ 항온배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 반응이 끝난 후 배지를 완전히 제거한 후 DMSO 300 ㎕를 첨가하여 보라색의 포르마잔(formazan)을 용해시켰다. 용해된 포르마잔은 96웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주해 마이크로플레이트 판독기(microplate reader, Molecular Devices)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다. 처리하지 않은 RAW264.7 세포의 흡광도를 대조군으로 하여 세포 생존율을 계산(% of Control)하고 울금 추출물의 세포독성을 평가하였다.

그 결과, 발효 울금 추출물이 처리된 군은 세포에 대한 유의미한 수준의 독성이 나타나지 않는 것으로 나타났다(도 3).

< 실험예 5> 발효 울금 추출물의 염증인자에 대한 영향 비교

실시예 1에 의한 발효 울금의 발효기간별 추출물이 염증인자의 발현에 미치는 조사하였다.

실험예 5-1. 발효 울금 추출물이 NF - kB , IL-6 및 TNF -α 분비에 미치는 영향

대식세포는 LPS(lipopolysaccharide)로 자극시키면 다양한 염증인자들이 증가되는데 그 중 전사인자 NF-kB의 활성과 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6의 생성 정도를 조사하였다.

구체적으로는, 발효 울금 추출물을 RAW264.7 세포에 각각 10, 50 및 100 ㎍/ml씩 전처리하고 4시간 동안 정치한 다음 LPS(1 ㎍/mL)로 20시간 동안 자극하고, 그 배지를 원심분리(2,000 g, 4℃, 10분)하여 회수하였다. 배지 중의 IL-6 및 TNF-α의 양은 enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA, R&D Systems)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였으며, NF-κB의 활성을 관찰하기 위해 SEAP(secreted alkaline phosphatase) 리포터 유전자가 안정적으로 형질주입(transfection)된 RAW-Blue™ Cell(InvitroGen) 배양액 20 ㎕와 검출용 배지인 QUANTI-Blue (InvivoGen) 200 ㎕를 37℃에서 15분간 암실에서 반응시키고, 620 nm 파장에서 측정하였다. 모든 시료는 3회 반복으로 측정되었다.

그 결과, 발효기간에 따른 울금 추출물 처리에 따른 NF-kB, TNF-α와 IL-6 생성량을 측정한 결과, LPS 처리시 NF-kB, TNF-α 및 IL-6의 생성이 발효 울금 처리군에서 감소되는 것으로 나타났다. NF-kB 활성은 농도 의존적 감소를 나타내 시료 100 ㎍/㎖ 농도로 처리되었을때 유의미한 억제 효과를 보였으며, TNF-α는 농도와 무관하게 전체적으로 큰 억제 효과를 보였고, IL-6는 시료 100 ㎍/㎖ 농도로 처리되었을때 유의적으로 억제되었다. 이를 통해 발효 울금이 염증 관련 사이토카인의 발현을 억제하는 것으로 나타났다(도 4).

실험예 5-2. 발효 울금 추출물이 NO 생성 및 iNOS 발현에 미치는 영향

염증 관련 분자인 NO 생성 및 iNOS 단백질 발현에 있어서 발효 울금 추출물의 효과를 조사하였다.

구체적으로 실험예 5-1에서와 같이 발효 울금 추출물을 4시간 동안 전처리 후, LPS를 20시간 동안 처리하여 활성화된 RAW264.7 세포에서 생성되는 NO의 농도를 Griess 분석(Griess assay)을 이용하여 검출하였다. 또한 iNOS의 생성량은 상기 실험예 5-1과 같이 발효울금으로 4시간 전처리 후, LPS로 20시간 처리한 RAW264.7 세포에 대해 웨스턴 블롯을 시행하여 조사하였으며, 1차 항체로는 항-iNOS 항체(ab3523, Abcam)를 1:200으로 사용하고, 대조군은 베타-액틴에 대한 항체 (ab8227, Abcam)를 1:500으로 사용하였다.

그 결과, RAW264.7 세포에서 LPS 처리로 인해 증가된 NO 생성량이 발효 울금 100 ㎍/mL을 처리한 실험군에서 억제되는 것을 관찰할 수 있었다(도 5A).

또한, RAW264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현은 발효 울금 추출물을 100 ㎍/mL의 농도로 함께 처리한 경우 현저히 감소됨을 확인하였다(도 5B).

실험예 5-3. 발효 울금 추출물이 PGE2 생성 및 Cox-2 발현에 미치는 영향

발효 울금 추출물이 LPS 처리시 유도되는 염증 유발 인자인 PGE2 생성을 억제할 수 있는지 조사하였다.

세포배양액으로부터 PGE2 enzyme immunoassay(EIA) kit (Cayman Chemical Company)를 이용하여 표준용액의 농도를 기준으로 환산하여 PGE2 생성량을 측정하였다. 또한 실험예 5-1에서와 같이 LPS를 처리하여 염증이 유발된 RAW264.7 세포에서 염증 유발에 관여하는 단백질 COX-2의 발현에 미치는 효과를 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였다. 1차 항체로는 COX-2(ab15191, Abcam)를 1:200으로 사용하고, 대조군으로는 실험예 5-2와 같이 베타-액틴에 대한 항체를 1:500으로 사용하였다.

그 결과, 발효 울금 추출물 처리군은 LPS에 의해 증가된 PGE2 생성을 유의적으로 억제하였으며(도 6A), LPS에 의해 발현이 유도된 COX-2는 발효 0일 및 1일차 처리군에서 감소되는 것을 확인하였다(도 6B).

Claims (8)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
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5. 1) 리조푸스 오리재(Rhizopus oryzae)를 배양하는 단계;
   2) 상기 단계 1)의 배양된 리조푸스 오리재를 울금에 접종하는 단계; 및
   3) 상기 단계 2)의 리조푸스 오리재가 접종된 울금을 1일간 발효시키는 단계;를 포함하는 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증대되고, 항염증 효과가 개선된 발효 울금 추출물의 제조방법으로 제조된, 발효 울금 추출물을 유효성분으로 100 μg/ml 이상 포함하는 항염증용 약학적 조성물.
   
6. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 NO 및 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2)의 생성을 억제하는 것인, 항염증용 약학적 조성물.
   
7. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 NF-kB, TNF-α 및 IL-6의 생성을 억제하는 것인, 항염증용 약학적 조성물.
   
8. 제 5항에 있어서, 상기 조성물은 Cox-2 및 iNOS의 발현을 억제하는 것인, 항염증용 약학적 조성물.
   

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