CN103655654A - 一种竹节参皂苷及其制备方法与它的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及竹节参提取物及其制备方法与它的用途。本发明的方法包括竹节参原料液的制备、泡沫分离装置的组建、泡沫分离等步骤。本发明利用高脂饲料造模技术在动物体内对竹节参提取物的用途和效果进行了研究，实验结果表明竹节参提取物具有良好的护肝降脂活性，能够明显抑制肝纤维化的发生，对肝纤维化具有良好的治疗作用。

Description

一种竹节参皂苷及其制备方法与它的用途

【技术领域】

本发明属于具体的中药应用领域。更具体地，本发明涉及一种竹节参皂苷，还涉及所述竹节参皂苷的制备方法，还涉及所述竹节参皂苷的用途。

【背景技术】

肝纤维化是严重威胁人类健康的重要疾病之一，迄今没有满意的治疗方法。它是由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。肝纤维化的主要特征在于肝窦毛细血管化与肝小叶内以及汇管区纤维化，各种慢性肝损伤均可以导致肝脏细胞外基质成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构或(和)功能异常的病理变化，并最终导致肝纤维化。肝纤维化是纤维增生和纤维分解不平衡的结果，纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症，坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化。中药治疗慢性肝炎肝纤维化，在实验和临床研究中，显示出一定疗效，具有很大发展潜力。

肝纤维化动物模型应用较多的是四氯化碳(CCl₄)致肝纤维化模型，但在诱导模型产生时肝毒性较强，动物致死率较高；猪血清诱导的免疫性肝纤维化与人类肝纤维化的形成有一定相似之处，但异种血清后期注射容易导致动物的死亡；高脂饲料诱导的脂肪性肝纤维化单独应用时周期较长。联合高脂饲料喂养和异种血清腹腔注射建立起了小鼠的肝纤维化模型，既缩短了模型用时周期也避免了动物的死亡，该模型更好模拟临床主要病因产生的肝纤维化过程，可以为肝纤维化机制的研究以及临床各类护肝药物的筛选提供依据。

竹节参为多年生草本植物，茎高30-60cm，主根肉质，呈竹鞭状；掌状复叶，3-4片轮生茎顶，叶柄长7-15cm，小叶呈卵圆形至长卵圆形，通常5片，长5-12cm，宽2-4.5cm，两侧的稍偏斜，边缘呈细锯齿或重锯齿，两面沿脉上疏被刚毛，先端渐尖至长渐尖，稀为尾状渐尖，基部阔楔形至近圆形。开花顺序从边缘向中央，伞形花序单个顶生萼边缘有5齿；花瓣5；雄蕊5；下位子房，2-5室，离生花柱2-5；环状肉质花盘。竹节参的花期和果期一般在5一8月，开花30d后果实成熟，红色，顶端常为黑色，，呈浆果状，核果球形。种子2-3粒，坚硬，肾形，种皮乳白色。竹节参生长于荫蔽度较大的山坡沟边、阴湿地带或岩石沟涧旁，分布于湖北、云南、贵州、四川等地，常用于补虚强壮、散瘀止血、消肿止痛、祛痰止咳。其具有如下功效，1.抗炎、抗病毒作用：竹节参可减轻蛋清、甲醛或右旋糖酐等多种化学性致炎物质引起的大鼠炎症反应；对大鼠皮下埋藏棉球引起的肉芽肿形成也有明显的抑制作用；在佐剂型关节炎（AA）大鼠模型中，可通过抑制炎症因子TNF-α、IL-1β等的分泌对抗类风湿性关节炎；对弗氏完全佐剂所致大鼠足肿胀和角叉菜胶所致小鼠足肿胀和二甲苯、巴豆油所致的小鼠耳肿胀和具有明显抑制作用。2.抗氧化作用：竹节参可通过降低血清或组织中丙二醛的含量，升高血液或组织中的谷胱甘肽，超氧化物歧化酶活性提高机体清除自由基和增强机体抗氧化作用，对四氯化碳、酒精引起的小鼠急性肝损伤和冠脉结扎致大鼠心肌缺血、梗死起到保护作用；通过显著提高LDH的活性，使局灶性脑缺血大鼠和大鼠的神经症状得到改善。3.降血脂作用：竹节参降血脂和抑制肥胖的作用可能是通过抗脂质过氧化作用和抑制胰脂肪酶的活性延迟肠道对脂肪的吸收，因而常用作传统的降血脂的替代药品

现有技术并未提到竹节参提取物对于肝纤维化这一特定的病理过程具有抑制作用，竹节参提取物是否具有治疗肝纤维化的作用，现有技术亦未见报道。本发明应用竹节参提取物治疗肝纤维化，取得了良好的治疗效果。

【发明内容】

[发明所要解决的技术问题]

本发明的一个目的是提供一种竹节参皂苷

本发明的另一个目的是提供一种竹节参皂苷的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述竹节参皂苷用于治疗肝纤维化的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的，本发明所述的治疗肝纤维化的制备方法包括如下步骤：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5～20，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2～5h，再加热回流提取2～5次，每次1～4h，合并提取液，得到待处理的原料液，向原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.005mol·L^-1～0.025mol·L^-1，最后向原料液中加入HCl或NaOH调节PH至3～6；

所述的竹节参原料是目前我国市场上销售的竹节参中药材，例如湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参。通常，竹节参中药材需要进行常规挑选、清洗、干燥等预处理后，再使用在中药材加工技术领域中通常使用的粉碎机对干燥竹节参的进行粉碎，粉碎的竹节参再用标准筛进行筛分，收集20-40目竹节参粉作为本发明方法的处理原料。

根据本发明，用水提取竹节参的作用在于将竹节参的水溶性有效成分主要为皂苷、多糖、氨基酸、蛋白质等提取出来。在后续操作中，由于竹节参皂苷是一种优良的天然表面活性成分，在强烈搅拌或鼓气时就能产生稳定的泡沫，而多糖、氨基酸、蛋白质等杂质成分发泡能力较弱，因而利用泡沫分离装置可将提取物中皂苷与杂质成分分离，从而实现皂苷成分的提取与纯化。

在本发明中，1重量份竹节参使用5～20倍量乙醇水溶液提取竹节参粉，如果使用少于5倍量乙醇水溶液提取竹节参，会使提取物中皂苷、多糖、氨基酸、蛋白质含量过高，在后续的泡沫分离的过程中，在皂苷发泡分离的同时，多糖、氨基酸、蛋白质等其他物质竞争吸附作用也加强，泡沫带出的杂质较多，使皂苷的纯度降低。如果使用大于20倍量乙醇水溶液提取竹节参，则皂苷浓度过低，泡沫稳定性下降，吸附到气液界面的皂苷减少，使皂苷回收率降低；因此，使用5～20倍量乙醇水溶液提取竹节参是合适的，优选地为8～16倍量，更优选地是8～12倍量。

在本发明中，粉碎的竹节参需要提前加入乙醇水溶液中浸泡2～5h，使竹节参润湿，更易提取，更优选地是4h。

在水提取竹节参时，加热回流提取2～5次，每次1～4h较合适，更优选地是加热回流提取3次，每次2h。

用水提取竹节参所使用的设备是目前市场上普遍销售的圆底烧瓶，例如由蜀牛玻璃仪器公司以商品名圆底烧瓶销售的产品。

用水提取竹节参所使用的加热回流提取设备是目前市场上销售的加热套，例如由巩义市予华仪器有限责任公司以商品名销售的电热套产品。

在用乙醇水溶液提取后的原料液中，需要加入NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.005mol·L-1～0.025mol·L-1，因为合适的离子浓度能够降低临界胶束浓度，促进表面活性剂形成胶束，增加皂苷的起泡性。如果NaCl浓度低于0.005mol·L-1，则浓度太低，起不到促进发泡的作用；如果NaCl浓度高于0.025mol·L-1，则离子浓度太高，过高的离子浓度不但起不到促进发泡的作用，反而会起到消泡作用。因此选择NaCl浓度为0.005mol·L-1～0.025mol·L-1是合适的，更优选地是0.013mol·L-1～0.016mol·L-1。

在本发明中，最后需要向原料液中加入HCl或NaOH调节pH至3～6，因为竹节参皂苷主要为五环三萜类齐墩果烷型皂苷，主要为酸性皂苷，当pH值大于6时，酸性皂苷生成钠盐，表面活性大大降低，从而使皂苷的回收率降低；当pH值小于3时，药液起泡性增强，回收率增加，但纯度降低，因而pH为3～6是合适的，更优选地是pH为4.5～5.5。

B.泡沫分离装置的组建

组建的泡沫分离装置有空气压缩机1、玻璃转子流量计2、气体分布器3、鼓泡区4、泡沫区5、收集弯管6、泡沫收集器7七部分组成；空气压缩机1的压缩空气通过玻璃转子流量计2计量后送到气体分布器3下部，所述的压缩空气通过气体分布器3，均匀分配到鼓泡区4形成泡沫，这些泡沫上升到泡沫区5，再经收集弯管6送到泡沫收集器7，最后收集在样品容器8中，具体结构参见附图6。

本装置所使用的空气压缩机为常用的微型空气压缩机，例如由北京成萌伟业科技有限公司生产的KY-Ⅳ型空气压缩机。

本装置所使用的玻璃转子流量计也为常用的微型转子流量计，例如由常州宏峰热工仪器有限公司生产的LZB-4DK型玻璃转子流量计。

本装置所用的气体分布器为自制装置，是按照3根/cm²的标准在橡胶板上插入不同直径不同的毛细管。

本装置所标示的鼓泡区及泡沫区均为常见的玻璃色谱柱，例如由蜀牛玻璃仪器公司销售的色谱柱。

本装置所标示的收集弯管为常用的玻璃仪器75度蒸馏弯头，例如上海禾汽化工科技有限公司生产的蒸馏弯头75度

本装置所标示的泡沫收集器为常用的玻璃仪器玻璃棒、漏斗及1000ml烧杯组合而成的，例如由蜀牛玻璃仪器公司销售的玻璃制品。

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:5～15，然后从塔底以流速200～700mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在0.1～1.5mm，连续鼓气1～6小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫进入泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，减压浓缩，真空干燥，即得所述的竹节参皂苷。

在本发明中，将所述的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区，使所述原料液的直径高度比达到1:5～15较为合适，若直径高度比小于1:5，则液面高度太低，泡沫区太高，部分泡沫在泡沫区上升过程中易发生破裂，影响泡沫回收率。若直径高度比大于1:15，则液面太高，泡沫上升距离过短，造成皂苷纯度降低；更优选地是直径高度比为1:9～10。

在本发明中，空气流速为200～700mL·min-1比较合适，因为若空气流速小于200mL·min-1，则空气流速太慢，泡沫生成太慢，浪费时间，增加能耗；若空气流速大于700mL·min-1，则空气流速太快，生成泡沫较快，但夹带液量大，所含杂质较多；更优选地是空气流速为400～500mL·min-1。

在本发明中，气泡直径需要维持在0.1～1.5mm。因为若气泡小于0.1mm，气泡过小，夹带杂质太多，会降低皂苷的纯度比。若气泡大于1.5mm，气泡过大，则生成泡沫较不稳定，回收率大大下降。更优选地是气泡直径为0.2～0.6mm。

在本发明中，泡沫分离皂苷需要连续鼓气1～6小时。若鼓气时间低于1小时，则鼓气时间太短，皂苷分离不完全，造成皂苷回收率过低；若鼓气时间大于6小时，则鼓气时间太长，在鼓气的后期，皂苷已经基本分离完成，杂质含量显著增加，并浪费能耗与时间，因而选择鼓气1～6小时较为合适。更优选地是鼓起时间为2～4h。

泡沫分离是一项利用物质在气泡表面上吸附性质的差异进行分离的技术，主要用于含表面活性物质的中药皂苷类成分的分离，具有操作简单、能耗低、分离效率高、无有机溶剂污染等优点。本发明在实施泡沫分离时，所采用的最佳提取工艺为：气体流速为400mL·min^-1，pH5.5，气泡直径0.4～0.5mm，原料液温度65℃，，电解质NaCl摩尔浓度0.015mol·L^－1，进料质量浓度约为0.17mg·mL^-1，进料体积为600m。此时，总皂苷富集比2.1，纯度比2.6，回收率98.33%。实验结果证明泡沫分离法分离竹节参总皂苷方法稳定可靠，产品收率高，可获得稳定的竹节参皂苷成分（附图1图谱）。

在泡沫收集器中收集的液体需要在压力0.001～0.01MPa下进行减压浓缩，在压力0.01～0.1MPa与温度30～50℃的条件下真空干燥，

本发明还涉及采用所述制备方法得到的竹节参皂苷。

本发明还涉及所述的竹节参皂苷在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途。

根据本发明，所述的肝纤维化是高脂饮食诱导的肝纤维化。

所得到的竹节参皂苷进行了HPLC-UV指纹图谱的研究，其HPLC分析条件如下：

色谱柱：YMC-packODS-AQ柱（250×4.6mm，粒径5μm）；

流动相：乙腈（A）-0.1%KH2PO4（B）；

柱温：30℃；

洗脱方式：梯度洗脱(0～5min，5～5%A；5～20min，5～30%A；20～30min，30～30%A；30～50min，30～85%A；50～60min，85～85%A)；

检测波长：203nm；进样量：10μl；流速：1.0ml·min-1。

所得HPLC-UV图谱见附图1，从图中我们可以看出，在保留时间为23.138min出现一个较大色谱峰，在36.343min-37.903min共出现四个较大的色谱峰，我们对以上五个色谱峰进行了结构鉴定，我们把五个色谱峰的成分按照从前到后的顺序定义为化合物1、化合物2、化合物3、化合物4及化合物5，鉴定结果如下：

化合物1：白色粉末，1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ6.44(1H，d，J=7.2Hz，Rha-H-1)，5.57(1H，brs，H-24)，5.23(1H，d，J=6.5Hz，Glc-H-1)，5.15(1H，J=7.7Hz，Glc-H-1)，2.01(3H，s，H-21)，1.75（3H，d，J=6.2Hz，H-6)，1.60(6H，s，H-26，H-27)，1.58，1.35，1.18，0.97，0.95（each3H，s，5×CH3）。根据化合物1的1H-NMR、13C-NMR数据，鉴定为人参皂苷Re。

化合物2：白色粉末，ESI-MSm/z：955[M-H]-。1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ6.34（1H，d，J=7.8Hz，Glc-H-1），5.42（1H，brs，H-12），5.41（1H，s，Glc-H-1），5.02(1H，d，J=6.6Hz，GlcA-H-1)，3.28（1H，dd，J=11.4，4.2Hz，H-3），3.18（1H，dd，J=13.2，2.4Hz，H-18），1.28，1.26，1.11，1.09，0.91，0.88，0.83（each3H，s，7×CH3)。13C-NMR(C5D5N，150MHz)。根据化合物1的1H-NMR、13C-NMR数据，鉴定为竹节参皂苷Ⅴ。

化合物3：白色粉末，ESI-MSm/z：925[M-H]-。1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ6.33（1H，d，J=8.4Hz，Glc-H-1），5.42（1H，brs，H-12），5.28（1H，d，J=6.0Hz，xyl-H-1），4.99(1H，d，J=3.0Hz，GlcA-H-1)，3.29（1H，brd，J=8.4Hz，H-3），3.20(1H，brd，J=10.8Hz，H-18），1.29(6H，s，2×CH3)，1.10，1.10，0.92，0.89，0.85（each3H，s，5×CH3)。13C-NMR(C5D5N，150MHz)。根据化合物2的1H-NMR、13C-NMR数据，鉴定为pjs-2。

化合物4：白色粉末，ESI-MSm/z：925[M-H]-。1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ6.33（1H，d，J=8.4Hz，Glc-H-1），6.17（1H，brs，1H，Araf-H-1），5.42（1H，s，H-12），5.02(1H，d，J=3.6Hz，GlcA-H-1)，3.33（1H，dd，J=10.8，3.6Hz，H-3），3.19（1H，dd，J=13.8，3.6Hz，H-18），1.29(6H，s，2×CH3)，1.09，0.98，0.92，0.89，0.83（each3H，s，5×CH3），13C-NMR(C5D5N，150MHz)。根据化合物3的ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR数据，鉴定为竹节参皂苷Ⅳ。

化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z：793[M-H]-。1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ6.34（1H，d，J=7.8Hz，Glc-H-1），5.42（1H，brs，H-12），5.04(1H，d，J=7.8Hz，GlcA-H-1)，3.37（1H，brd，J=9.9Hz，H-3），3.19（1H，dd，J=10.2，2.4Hz，H-18），1.31，1.28，1.06，1.00，0.91，0.89，0.83（each3H，s，7×CH3）。13C-NMR(C5D5N，150MHz)。根据化合物4的1H-NMR、13C-NMR数据，鉴定为竹节参皂苷Ⅳa。

因此，通过本发明，得到所述竹节参皂苷的五种主要成分为人参皂苷Re、竹节参皂苷Ⅴ、pjs-2、竹节参皂苷Ⅳ及竹节参皂苷Ⅳa，人参皂苷Re为达玛烷型皂苷，后四种皂苷均为齐墩果烷型皂苷，根据文献报道，竹节参皂苷兼有达玛烷型皂苷及齐墩果烷型皂苷，且以齐墩果烷型皂苷为主。因此，本发明的结果与文献报道相符，本方法可实现竹节参总皂苷的分离。

[有益效果]

本发明的有益效果是：本发明利用高脂饲料造模技术在动物体内对本发明竹节参提取物的用途和效果进行了研究，实验结果表明竹节参提取物具有良好的护肝降脂活性，能够明显抑制肝纤维化的发生，对肝纤维化具有良好的治疗作用。

【附图说明】

图1是竹节参提取物的HPLC-UV图谱。

图2是实验动物肝脏的大体观察图；

图中：A:正常对照组，B:模型组，C:竹节参皂苷低剂量组，D:竹节参皂苷高剂量组。

图3是实验动物肝脏的HE染色观察图；

图中：A:正常对照组，B:模型组，C:竹节参皂苷低剂量组，D:竹节参皂苷高剂量组。

图4是实验动物肝脏的Masson染色观察图；

图中：A:正常对照组，B:模型组，C:竹节参皂苷低剂量组，D:竹节参皂苷高剂量组。

图5是实验动物肝组织纤维化相关基因mRNA检测。

图中：正常对照组、模型组、竹节参皂苷低剂量组（100mg/kg）和竹节参皂苷高剂量组（300mg/kg）的肝组织匀浆，RT-PCR测定纤维化相关基因。与模型组相比，*p<0.05,**p<0.001.

图6是泡沫分离装置结构示意图；

图中：1-空气压缩机、2-玻璃转子流量计、3-气体分布器、4-鼓泡区、5-泡沫区、6-收集弯管、7-泡沫收集器、8-样品容器。

【具体实施方式】

以下通过实施例来进一步阐述本发明，

实施例1：竹节参提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎至20目，按照竹节参与体积分数62%乙醇水溶液的重量比1：12，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中浸泡3h，再加热回流提取4次，每次1h，合并提取液，得到待处理的原料液，向所述的原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.010mol·L^-1，最后向原料液中加入HCl或NaOH调节PH至5；

B.泡沫分离装置的组建

泡沫分离装置由空气压缩机1、玻璃转子流量计2、气体分布器3、鼓泡区4、泡沫区5、收集弯管6与泡沫收集器7七部分组成，它的结构见附图6；

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:12，然后从塔底以流速500mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在0.6mm，连续鼓气2小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，在压力0.001MPa下进行减压浓缩，在压力0.01MPa与温度30℃的条件下进行真空干燥，即得到竹节参皂苷提取物。

采用香草醛-高氯酸法测定了所得到竹节参皂苷提取物的竹节参皂苷含量，由其含量计算得到竹节参总皂苷得率与纯度。

具体测定步骤如下：

A供试品溶液的制备:分别移取原料液、分离所得的泡沫液10mL，用水饱和正丁醇萃取4次，每次10mL，合并正丁醇萃取液，用正丁醇饱和水20mL洗涤，合并正丁醇萃取液，挥干，残渣用甲醇溶解，转移至25mL容量瓶中，并加至刻度。

B对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Re对照品10.4mg，置10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

C检测波长的确定：精密吸取A40ul和B50ul，分别置于10ml试管中，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，高氯酸0.8ml，摇匀，60℃水浴加热15min，取出，冷却，加冰醋酸稀释至刻度，摇匀，用空白试剂在波长400～700nm处扫描，确定波长在552nm为待测波长。

D标准曲线的制备:精密吸取对照品溶液100、120、180、200、240μL置10mL具塞试管中，挥干溶剂后，分别加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，加塞，摇匀，于60℃水浴加热15min，取出，置冰水浴中冷却3min,分别加入冰乙酸5mL，摇匀，静置8min后，在552nm处测吸光度值。以测定样品质量对吸光度进行回归，得标准曲线：A=0.0025X-0.0418，R2=0.9993。

E测定方法:精密移取供试品溶液0.5mL或1mL置10mL具塞试管中，挥干溶剂，分别按标准曲线制备项下方法操作，于552nm处测定吸光度。由标准曲线给出样品溶液相当于人参皂苷Re对照品溶液的浓度，根据回归方程，计算样品中皂苷的含量。并根据皂苷含量计算得率及皂苷纯度。

本实施例的竹节参总皂苷得率为92.9%，纯度为95.0%。

实施例2：竹节参提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎至30目，按照竹节参与体积分数66%乙醇水溶液的重量比1：8，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中，浸泡4h，再加热回流提取2次，每次4h，合并提取液，得到待处理的原料液，向所述的原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.018mol·L^-1，最后向所述原料液中加入HCl或NaOH调节PH至3；

B.泡沫分离装置的组建

本实施例泡沫分离装置结构与实施例1的相同。

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:15，然后从塔底以流速200mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在0.1mm，连续鼓气4小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，在压力0.04MPa下进行减压浓缩，在压力0.04MPa与温度36℃的条件下进行真空干燥，即得所述的竹节参皂苷提取物。

按照与实施例1同样方法测定得到，本实施例的竹节参总皂苷得率为96.7%，纯度为69.9%。

实施例3：竹节参提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎至40目，按照竹节参与体积分数70%乙醇水溶液的重量比1：5，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2h，再加热回流提取5次，每次2h，合并提取液，得到待处理的原料液，向原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.025mol·L^-1，最后向原料液中加入HCl或NaOH调节PH至4；

B.泡沫分离装置的组建

本实施例泡沫分离装置结构与实施例1的相同。

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:5，然后从塔底以流速400mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在1.0mm，连续鼓气6小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，在压力0.06MPa下进行减压浓缩，在压力0.06MPa与温度44℃的条件下进行真空干燥，即得所述的竹节参皂苷。

按照与实施例1同样方法测定得到，本实施例的竹节参总皂苷得率为89.4%，纯度为91.4%。

实施例4：竹节参提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎至30目，按照竹节参与体积分数75%乙醇水溶液的重量比1：20，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中，浸泡5h，再加热回流提取3次，每次3h，合并提取液，得到待处理的原料液，向原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.005mol·L^-1，最后向原料液中加入HCl或NaOH调节PH至6；

B.泡沫分离装置的组建

本实施例泡沫分离装置结构与实施例1的相同。

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:8，然后从塔底以流速700mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在1.5mm，连续鼓气1小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，在压力0.01MPa下进行减压浓缩，在压力0.1MPa与温度50℃的条件下进行真空干燥，即得所述的竹节参皂苷。

按照与实施例1同样方法测定得到，本实施例的竹节参总皂苷得率为91.1%，纯度为93.1%。

试验实施例1：动物实验

2.1原材料来源

BABL/C小鼠，雌雄各半，购自湖北省实验动物中心（SPF级）。

试剂：胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；猪油、白砂糖，湖北宜昌市北山超市；猪血购自宜昌市屠宰场。将购买的新鲜猪血置于37℃半小时后4℃存放1小时后，取上清离心2000rpm，5min，重复3次，取上清过滤除菌收集放置于-80℃备用。

药物：竹节参总皂苷，采自湖北恩施州GAP基地的竹节参，由三峡大学三级药理实验室鉴定和提取制备，具体制备方法如实施例1所示。

2.2动物实验方法：取雌雄各半BABL/C小鼠48只，4～6周龄，随机分成四组，每组12只，即正常对照组，模型对照组和竹节参总皂苷低、高剂量组。除正常对照组给与普通饲料外，其余各组均给与高脂饲料（猪油（16%）、胆固醇(1%)、白砂糖(4%)、普通饲料(79%)，将以上成分混匀后压制成条状烘干备用），于第5周同时腹腔注射0.2mL/只的血清，每周一次，共3周进行造模，同时竹节参总皂苷低、高剂量组分别给与100mg/kg、300mg/kg的竹节参总皂苷灌胃，持续10W。观察上述各组小鼠造模前后体重变化、行为和形态变化。按常规将上述各组小鼠分别用乙醚麻醉后眼球取血，常规分离血清，测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、等生化指标；分离肝脏，肉眼观察各组小鼠肝纤维化的程度，取相同部位肝组织置于4%中性多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，进行HE和Masson染色，光镜下观察肝组织炎症及肝纤维化情况；取同样大小的肝组织，提取RNA，RT-PCR测定肝组织中胶原蛋白I型1α（COLL），α-SNA，基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）及内质网应激蛋白GRP78的mRNA表达情况。

2.3动物实验结果

2.3.1动物活体动物观察

1)正常对照组小鼠饮食，活动正常，反应灵敏，毛发有光泽；模型组小鼠毛发凌乱，无光泽，活动减少并精神萎靡；竹节参总皂苷低、高剂量组总体状况明显好于模型对照组。

2)与正常对照组相比，模型对照组小鼠体重显著增加，竹节参总皂苷低、高剂量组总体状况明显好于模型对照组。

2.3.2肝脏大体观察：

正常对照组小鼠肝脏颜色鲜亮，表面光滑，质地柔软而富有弹性；模型对照组小鼠肝脏颜色呈土黄色，表面被突起于肝表面的颗粒所覆盖，肝纤维化症状明显；竹节参总皂苷低、高剂量组明显较模型组对照组小鼠肝脏有所改善，表面光滑。

2.4病理学观察：

正常对照组小鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索排列整齐，肝细胞正常，核结构清晰，肝窦正常；模型对照组小鼠肝细胞结构紊乱，肝细胞普遍出现明显的脂肪变性、坏死，汇管区纤维组织增生和炎性细胞浸润，说明肝纤维化造模成功；竹节参总皂苷低、高剂量组明显较模型组对照组小鼠肝脏有所改善，可明显遏制纤维的生成。

2.5Masson染色观察：

与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝脏多处出现胶原纤维的产生；与模型对照组相比，竹节参总皂苷低、高剂量组明显抑制胶原纤维的产生。

2.6血清生化指标测定

与正常组相比，模型对照组小鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、LDL（低密度低蛋白）、甘油三酯（TG）、血清胆酸(TBA)明显升高，而HDL（高密度脂蛋白）含量明显降低，反映模型成功建立；与模型对照组相比，不同剂量的竹节参皂苷治组均明显逆转这些生化指标，提示竹节参皂苷具有良好的护肝降脂活性。

表1：肝脏生化指标测定

●*vs正常组，p<0.05;^Δvs模型组，p<0.05,^ΔΔp<0.01

2.7肝组织中COLL，α-SMA，TIMP，GRP78的mRNA表达

在肝纤维化进展中，肝细胞损伤，发生内质网应激，GRP78表达增加，损伤的肝细胞活化肝间质细胞大量增殖，产生COLL，α-SMA，TIMP，使肝脏发生纤维化，因此本研究检测实验动物肝组织的COLL，α-SMA，TIMP，GRP78，反映肝脏纤维化状况。与正常组相比，模型组小鼠肝脏中COLL，α-SMA，TIMP，GRP78的mRNA的表达明显升高（p<0.01）；与模型组相比，不同剂量的竹节参皂苷治组COLL，α-SMA，TIMP，GRP78的mRNA的表达明显降低，提示竹节参皂苷具有良好的抗肝纤维化作用。

Claims (9)

1.一种竹节参皂苷的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

A.竹节参原料液的制备

将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1：5～20，将粉碎竹节参浸泡在乙醇水溶液中，浸泡2～5h，再加热回流提取2～5次，每次1～4h，合并提取液，得到待处理的原料液，向原料液中加入适量NaCl，使原料液中NaCl浓度达到0.005mol·L^-1～0.025mol·L^-1，最后向原料液中加入HCl或NaOH调节PH至3～6；

B.泡沫分离装置的组建

泡沫分离装置由空气压缩机(1)、玻璃转子流量计(2)、气体分布器(3)、鼓泡区(4)、泡沫区(5)、收集弯管(6)与泡沫收集器(7)七部分组成，空气压缩机(1)的压缩空气通过玻璃转子流量计(2)计量后送到气体分布器(3)下部，所述的压缩空气通过气体分布器(3)均匀分配到鼓泡区(4)中形成泡沫，这些泡沫上升到泡沫区(5)，再经收集弯管(6)送到泡沫收集器(7)中，最后收集在样品容器(8)中；

C.泡沫分离

将步骤A得到的含NaCl的原料液加入在步骤B组建的泡沫分离装置的鼓泡区中，使所述的原料液在鼓泡区的直径高度比达到1:5～15，然后从塔底以流速200～700mL·min^-1通入空气，并调节气体分布器使气泡直径维持在0.1～1.5mm，连续鼓气1～6小时，富集得到的泡沫通过收集弯管排入泡沫收集器，所述的泡沫在泡沫收集器中会发生液化，收集泡沫收集器中的液体，减压浓缩，真空干燥，即得所述的竹节参皂苷。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述竹节参粉碎粒度是20-40目。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，竹节参与乙醇水溶液的重量比是1：8～12。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述的乙醇水溶液是体积分数62～75%。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的减压浓缩是在压力0.001～0.01MPa下进行浓缩。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的干燥是在压力0.01～0.1MPa与温度30～50℃的条件下进行干燥。

7.根据权利要求1-6中任一项权利要求所述制备方法得到的竹节参皂苷。

8.根据权利要求1-7所述的竹节参皂苷在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途。

9.根据权利要求1-8所述的竹节参皂苷在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途，其特征在于其中所述的肝纤维化是高脂饮食诱导的肝纤维化。

Images