CN103638141A - 木瓜提取物及其制备方法与它的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及木瓜提取物的制备方法，以及利用所述木瓜提取物治疗肝纤维化的新用途。本发明的制备方法包括木瓜提取、萃取分离和树脂吸附等步骤。本发明利用高脂饲料造模技术在动物体内对木瓜提取物的用途和效果进行了研究，实验结果表明木瓜提取物具有良好的护肝降脂活性，能够明显抑制肝纤维化的发生，对肝纤维化具有良好的治疗作用。

Description

木瓜提取物及其制备方法与它的用途

【技术领域】

本发明属于中药应用技术领域。更具体地，本发明涉及一种木瓜提取物，还涉及所述木瓜提取物的制备方法，还涉及所述木瓜提取物的用途。

【背景技术】

肝纤维化是指由各种致病因子所致肝内结缔组织异常增生，导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程，它不是一个独立的疾病，而是一个特定的病理发生发展阶段，许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化。肝纤维化的主要特征在于肝窦毛细血管化与肝小叶内以及汇管区纤维化，各种慢性肝损伤均可以导致肝脏细胞外基质成分过度增生与异常沉积，导致肝脏结构或(和)功能异常的病理变化，并最终导致肝纤维化。肝纤维化是纤维增生和纤维分解不平衡的结果，纤维增生是机体对于损伤的一种修复反应，各种病因所致反复或持续的慢性肝实质炎症，坏死可导致肝脏持续不断的纤维增生而形成肝纤维化。在实验和临床研究中，中药治疗慢性肝炎肝纤维化，显示出一定疗效，具有很大发展潜力。现有技术中已经报道了人参、三七等中药中所含有的皂苷具有治疗肝纤维化的作用。

木瓜以其丰富的营养成分、良好的保健功能，成为药食两用的保健食品。关于木瓜的营养保健作用流传已久，李时珍在《本草纲目》中记载“木瓜性温味酸，平肝和胃”。虽然现有技术已经公开木瓜具有保肝护肝作用，但现有技术所揭示的作用机理主要在于以下几方面。首先，木瓜营养价值丰富，富含维生素C、多种氨基酸、齐墩果酸等多种物质。其中，木瓜中的维生素C含量是苹果的48倍，而维生素C具有多种生理功能，能够清除氧自由基、增加肝细胞的抵抗力，稳定肝细胞膜，促进肝细胞再生和肝糖元合成，从而促进受损肝脏的修复。木瓜中含有的多种人体所必需的氨基酸成分，能够满足肝病患者营养需求。此外，其中含有的齐墩果酸是一种具有护肝降脂、抗炎抑菌等功效的化合物，以“齐墩果酸”为主要成分的齐墩果酸片，是一种常用的保肝药物。

肝纤维化动物模型应用较多的是四氯化碳(CCl4)致肝纤维化模型，但在诱导模型产生时肝毒性较强，动物致死率较高；猪血清诱导的免疫性肝纤维化与人类肝纤维化的形成有一定相似之处，但异种血清后期注射容易导致动物的死亡；高脂饲料诱导的脂肪性肝纤维化单独应用时周期较长。联合高脂饲料喂养和异种血清腹腔注射建立起了小鼠的肝纤维化模型，既缩短了模型用时周期也避免了动物的死亡，该模型更好模拟临床主要病因产生的肝纤维化过程，可以为肝纤维化机制的研究以及临床各类护肝药物的筛选提供依据。

虽然现有技术提到木瓜具有护肝作用，但现有技术仅笼统提到上述作用，并未提到木瓜提取物对于肝纤维化这一特定的病理过程具有抑制作用，木瓜提取物是否具有治疗肝纤维化的作用，现有技术亦未见报道。本发明应用木瓜提取物治疗肝纤维化，取得了良好的治疗效果。

【发明内容】

[要解决的技术问题]

本发明的目的是提供一种木瓜提取物的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述木瓜提取物，以及利用所述木瓜提取物治疗肝纤维化的用途。

[技术方案]

本发明是通过下述技术方案实现的。本发明首先采用萃取分离和树脂吸附的方式从木瓜中提取了木瓜提取物，然后利用高脂饲料造模技术在动物体内对木瓜提取物的用途和效果进行了研究，实验结果表明木瓜提取物具有良好的护肝降脂活性，能够明显抑制肝纤维化的发生，对肝纤维化具有良好的治疗作用。

本发明所述的木瓜提取物的制备方法包括如下步骤：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：5～15，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为75～95%乙醇水溶液中，浸泡2～5h，再加热回流提取2～5次，每次1～5h，合并提取液，再减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

根据本发明，用乙醇水溶液处理木瓜的作用在于将木瓜的有效成分有机酸及三萜类提取出来。

在本发明中，使用体积分数为75～95%乙醇水溶液浸泡木瓜粉，如果乙醇水溶液的浓度超过95%，则会使提取物中有机酸含量降低；如果乙醇水溶液的浓度低于75%，则会使提取物中有机酸含量降低；因此，乙醇水溶液的浓度为75～95%是合适的，乙醇水溶液的浓度优选地是78～94%，更优选地是85～94%。

在用乙醇处理木瓜时，木瓜与乙醇水溶液的重量比优选地是1：6～14，浸泡2.6～4.2h，更优选地是1：8～12，浸泡3～4h。

在这个步骤中，每次加热回流提取时间优选地是2.8～4.2h，更优选地是3～3.5h。

用乙醇处理木瓜所使用的设备是目前市场上普遍销售的圆底烧瓶，例如由蜀牛玻璃仪器公司以商品名圆底烧瓶销售的产品。

用乙醇处理木瓜所使用的加热回流提取设备是目前市场上销售的加热套，例如由巩义市予华仪器有限责任公司以商品名销售的电热套产品。

根据本发明，在压力0.001～0.01MPa与室温的条件下进行减压浓缩。在减压浓缩时所使用的设备是目前市场上销售的旋转蒸发仪，例如由上海亚荣生化仪器厂公司以商品名RE-52AA型旋转蒸发仪销售的产品。

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:1～4的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:2～5用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着减压浓缩，真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

根据本发明，使用石油醚萃取的目的在于除去提取物中含有的脂溶性有机酸以及脂溶性色素等杂质。

根据本发明，使用正丁醇萃取的目的在富集木瓜中的有机酸及三萜类成分。

在本发明中，所述浓缩液与正丁醇的体积比优选地是1:1.9～3.0，更优选地是1:2.5～2.8。

在本发明中，在用正丁醇萃取时，让在萃取设备中的正丁醇与所述浓缩液充分混合，在这种混合过程中，所述浓缩液的有效成分在两相之间进行分配，即从所述浓缩液转移到正丁醇中，从而实现有效成分的分离。

在本发明中用正丁醇萃取时所使用的设备是目前市场上销售的分液漏斗，例如由四川蜀牛玻璃仪器公司以商品名分液漏斗销售的产品。

所述正丁醇相无色应该理解是在用正丁醇萃取所述浓缩液后，萃取后的正丁醇用眼观察是没有颜色的，或者是几乎没有颜色的。

在这个步骤中，减压浓缩如前面所述，在此不再赘述。

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱2-4h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱2-4h，水洗至中性备用；木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至4.0-7.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为70-95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min。得到的洗脱物进行减压浓缩，然后真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

D140大孔树脂是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。在聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大量孔穴。因此，大孔树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大（100～1000nm）。大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，以吸附为特点。它是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物。

本发明使用D140大孔树脂处理样品的目的是为了除去样品中混有的多糖与鞣质等杂质。

本发明使用的D140大孔吸附树脂例如是由上海紫一试剂公司以商品名D140大孔吸附树脂销售的产品。

由于D140大孔吸附树脂含有一些杂质，因此需要进行如下预处理：

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用5%HCL浸泡树脂柱2-4h，用水洗至中性，然后用2%NaOH浸泡树脂柱2-4h，水洗至中性备用。

本发明中使用乙醇浸泡D140大孔吸附树脂目的是除去树脂上吸附的醇溶性杂质；使用以重量计5%HCL水溶液浸泡树脂的目的是为了让树脂上吸附的碱性成分变成盐而冲洗出去；使用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂的目的是为了让树脂上吸附的酸性成分变成盐而冲洗出去；水洗至中性的目的是除去冲洗是残留的酸、碱及生成的盐类成分。

D140大孔吸附树脂吸附条件如下：

用HCL水溶液或NaOH水溶液将正丁醇萃取物溶液PH调节至4.0-7.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜。

本发明中，需要用HCL水溶液或NaOH水溶液将正丁醇萃取物溶液PH调节至4.0-7.0，因为我们木瓜提取物的有效成分有机酸及三萜类均为弱酸性成分，调节PH为酸性的目的是为了让这些物质维持游离状态，利于同大孔树脂吸附。

本发明中，填充大孔吸附树脂的径高比为1：10，是为了保持合适的流速。上样量选择为0.1g生药/毫升柱体积，如果过低，木瓜成分与树脂死吸附严重，影响有效成分得率；如果上样量过大，会造成过载，影响分离质量。上样后静置过夜，是为了让木瓜有效成分与大孔吸附树脂充分吸附。

D140大孔吸附树脂洗脱条件如下：

洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为70-95%的乙醇水溶液，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min。

本发明中，首先使用水冲洗至流出液无色，目的是洗去与大孔吸附树脂吸附能力较弱的多糖、鞣质类杂质。再用体积分数为70-95%的乙醇水溶液洗脱较适宜，因为如果使用乙醇水溶液浓度小于70%，则极性较小，洗脱能力较弱，对于有效成分的洗脱不完全；如果选择乙醇水溶液的浓度大于95%，则效果与95%乙醇没有明显差异，且配制较困难。更优选地为乙醇体积分数为75-85%。

在这个步骤中，所述的干燥是在压力0.01～0.1MPa与温度30～50℃的条件下进行干燥。

本发明使用的真空干燥设备是目前市场上销售的产品，例如由上海一恒科学仪器有限公司以商品名真空干燥箱销售的产品。

所得到的木瓜提取物进行了HPLC分析，其HPLC分析条件如下：

色谱柱：YMC-packODS-AQ柱（250×4.6mm，粒径5μm）；

流动相：甲醇（A）-1%冰醋酸水溶液（B）；

柱温：30℃；

洗脱方式：梯度洗脱(0～20min，5～35%A；20～30min，35～46%A；30～40min，46～75%A；40～50min，75～85%A；50～60min，85～85%A)；

检测波长：210nm；进样量：10μl；流速：1.0ml·min-1。

所用检测器：紫外检测器

所得HPLC-UV图谱见附图1，在图中已经将较大的几个色谱峰进行标注，通过标准品对照的方式，已经（确定1号峰为咖啡酸）、2号峰为绿原酸，4号峰为齐墩果酸，5号峰为熊果酸。

本发明还涉及采用所述木瓜提取物制备方法所制备得到的木瓜提取物。

本发明还涉及所述的木瓜提取物在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途，其中所述的肝纤维化是高脂饮食诱导的肝纤维化。

[积极效果]

本发明提供了一种新颖的从木瓜中获取木瓜提纯物的方法，所述方法具有提纯效率高、能够获取多种丰富的活性物质，如齐墩果酸、熊果酸及绿原酸等的优点。利用所述的提纯物，能够有效防治肝纤维化的发生发展。

【附图说明】

图1.木瓜正丁醇萃取物的HPLC指纹图谱。

图2实验动物肝脏的大体观察图；

    图中：A:正常对照组，B:模型组，C:木瓜低剂量组，D:木瓜高剂量组。

图3实验动物肝脏的HE染色观察图；

    图中：A:正常对照组，B:模型组，C:木瓜低剂量组，D:木瓜高剂量组。

图4实验动物肝脏的Masson染色观察图；

    图中：A:正常对照组，B:模型组，C:木瓜低剂量组，D:木瓜高剂量组。

图5实验动物肝组织纤维化相关基因mRNA检测图；

    图中：正常对照组、模型组、木瓜提取物低剂量组（100mg/kg）和木瓜提取物高剂量组（300mg/kg）的肝组织匀浆，RT-PCR测定纤维化相关基因。与模型组相比，*p<0.05,**p<0.001.

【具体实施方式】

以下通过实施例来进一步阐述本发明，

实施例1：木瓜提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：8，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为80%乙醇水溶液中，浸泡4h，再加热回流提取2次，每次4h，合并提取液，再在压力0.001MPa与室温的条件下进行减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:3的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:2用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.001MPa减压浓缩，在0.001MPa与温度36℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱2h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱2h，水洗至中性备用；所述木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至4.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为70%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min；得到的洗脱物在压力0.001MPa进行减压浓缩，然后在0.001MPa与温度36℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

实施例2：木瓜提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：5，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为90%乙醇水溶液中，浸泡3h，再加热回流提取2次，每次1h，合并提取液，再在压力0.008MPa与室温的条件下进行减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:4的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:5用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.008MPa减压浓缩，在0.008MPa与温度45℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱3.2h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱2.6h，水洗至中性备用；所述木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至5.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为80%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min；得到的洗脱物在压力0.008MPa进行减压浓缩，然后在0.008MPa与温度45℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

实施例3：木瓜提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：12，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为75%乙醇水溶液中，浸泡5h，再加热回流提取4次，每次3h，合并提取液，再在压力0.01MPa与室温的条件下进行减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:1的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:3用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.01MPa减压浓缩，在0.01MPa与温度30℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱2.6h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱3.2h，水洗至中性备用；所述木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至6.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为86%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min；得到的洗脱物在压力0.01MPa进行减压浓缩，然后在0.01MPa与温度30℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

实施例4：木瓜提取物的制备

该实施例的实施步骤如下：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：15，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为95%乙醇水溶液中，浸泡2h，再加热回流提取5次，每次5h，合并提取液，再在压力0.004MPa与室温的条件下进行减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:2的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:4用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.004MPa减压浓缩，在0.004MPa与温度50℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱4h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱4h，水洗至中性备用；所述木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至7.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为70808695%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min；得到的洗脱物在压力0.004MPa进行减压浓缩，然后在0.004MPa与温度50℃的条件下真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

试验实施例1：动物实验

2.1原材料来源

BABL/C小鼠，雌雄各半，购自湖北省实验动物中心（SPF级）。

试剂：胆固醇，国药集团化学试剂有限公司；猪油、白砂糖，湖北宜昌市北山超市；猪血购自宜昌市屠宰场。将购买的新鲜猪血置于37℃半小时后4℃存放1小时后，取上清离心2000rpm，5min，重复3次，取上清过滤除菌收集放置于-80℃备用。

药物：木瓜提取物。木瓜采自湖北长阳国家GAP基地，由三峡大学三级药理实验室鉴定和提取制备。

2.2动物实验方法

取雌雄各半BABL/C小鼠48只，4～6周龄，随机分成四组，每组12只，即正常对照组，模型对照组和木瓜提取物低、高剂量组。除正常对照组给与普通饲料外，其余各组均给与高脂饲料（猪油（16%）、胆固醇(1%)、白砂糖(4%)、普通饲料(79%)，将以上成分混匀后压制成条状烘干备用），于第5周同时腹腔注射0.2mL/只的血清，每周一次，共3周进行造模，同时木瓜提取物低、高剂量组分别给与100mg/kg、300mg/kg的木瓜提取物灌胃，持续10W。观察上述各组小鼠造模前后体重变化、行为和形态变化。按常规将上述各组小鼠分别用乙醚麻醉后眼球取血，常规分离血清，测定丙氨酸氨基转移酶（ALT）、等生化指标；分离肝脏，肉眼观察各组小鼠肝纤维化的程度，取相同部位肝组织置于4%中性多聚甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，进行HE和Masson染色，光镜下观察肝组织炎症及肝纤维化情况；取同样大小的肝组织，提取RNA，RT-PCR测定肝组织中胶原蛋白I型1α（COLL），α-SNA，基质金属蛋白酶抑制因子（TIMP）及内质网应激蛋白GRP78的mRNA表达情况。

2.3动物实验结果

2.3.1木瓜提取物(BECS)的指纹图谱

木瓜提取物正丁醇部位，通过二极管阵列检测器全波长扫描，在254nm处有最大吸收波长，共分离出特征性的七个主要化合物峰，其中主要的峰1号峰为绿原酸，2号峰为咖啡酸，4号峰为齐墩果酸，5号峰为熊果酸。

2.3.2动物活体动物观察

1)正常对照组小鼠饮食，活动正常，反应灵敏，毛发有光泽；模型组小鼠毛发凌乱，无光泽，活动减少并精神萎靡；木瓜提取物低、高剂量组总体状况明显好于模型对照组。

2)与正常对照组相比，模型对照组小鼠体重显著增加，木瓜提取物低、高剂量组总体状况明显好于模型对照组。

2.3.3肝脏大体观察：

正常对照组小鼠肝脏颜色鲜亮，表面光滑，质地柔软而富有弹性；模型对照组小鼠肝脏颜色呈土黄色，表面被突起于肝表面的颗粒所覆盖，肝纤维化症状明显；木瓜提取物低、高剂量组明显较模型组对照组小鼠肝脏有所改善，表面光滑。

2.4病理学观察：

正常对照组小鼠肝小叶结构清楚，肝细胞索排列整齐，肝细胞正常，核结构清晰，肝窦正常；模型对照组小鼠肝细胞结构紊乱，肝细胞普遍出现明显的脂肪变性、坏死，汇管区纤维组织增生和炎性细胞浸润，说明肝纤维化造模成功；竹木瓜提取物低、高剂量组明显较模型组对照组小鼠肝脏有所改善，可明显遏制纤维的生成。

2.5Masson染色观察：

与正常对照组相比，模型对照组小鼠肝脏多处出现胶原纤维的产生；与模型对照组相比，木瓜提取物低、高剂量组明显抑制胶原纤维的产生。

2.6血清生化指标测定

与正常组相比，模型对照组小鼠血清中ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）、LDL（低密度低蛋白）、甘油三酯（TG）、血清胆酸(TBA)明显升高，而HDL（高密度脂蛋白）含量明显降低，反映模型成功建立；与模型对照组相比，木瓜提取物防治组均明显逆转这些生化指标，提示木瓜提取物具有良好的护肝降脂活性。

表1.肝脏生化指标测定

●vs正常组，p<0.05;^Δvs模型组，p<0.05,^ΔΔp<0.01

2.7肝组织中COLL，α-SMA，TIMP，GRP78的mRNA表达

在高脂和炎症刺激下，损伤的肝细胞活化TLR4受体，释放的炎性因子活化肝间质细胞大量增殖，产生COLL，α-SMA，TIMP，使肝脏发生纤维化，因此本研究检测实验动物肝组织的COLL，α-SMA，TIMP，反映肝脏纤维化状况。与正常组相比，模型组小鼠肝脏中COLL，α-SMA，TIMP，TLR4的mRNA的表达明显升高（p<0.01）；与模型组相比，不同剂量的木瓜提取物治组COLL，α-SMA，TIMP，TLR4的mRNA的表达明显降低，提示木瓜提取物具有良好的抗肝纤维化作用。

Claims (10)

1.一种木瓜提取物的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：

A、木瓜提取

将木瓜原料粉碎，按照木瓜与乙醇水溶液的重量比1：5～15，将粉碎木瓜浸泡在体积分数为75～95%乙醇水溶液中，浸泡2～5h，再加热回流提取2～5次，每次1～5h，合并提取液，再减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；

B、萃取分离

将步骤A得到的浓缩液按照所述浓缩液与石油醚体积比1:1～4的比例混合进行多次萃取与两相分离，直至石油醚层无色，弃去石油醚层，并合并水层；再将合并水层与正丁醇按体积比1:2～5用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着减压浓缩，真空干燥，于是得到所述的木瓜正丁醇萃取物；

C、树脂吸附

D140大孔吸附树脂预处理：将D140大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱2-4h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH水溶液浸泡树脂柱2-4h，水洗至中性备用；所述木瓜正丁醇萃取物的上样条件为：用HCL或NaOH将正丁醇萃取物溶液PH调节至4.0-7.0，柱径高比为1：10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在D140大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱，洗脱条件为：先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为70-95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为1mL/min；得到的洗脱物进行减压浓缩，然后真空干燥，于是得到所述的木瓜提取物。

2.根据权利要求1所述的一种木瓜提取物的制备方法，其特征在于在步骤A中，乙醇水溶液的浓度是体积分数85～94%。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，木瓜与乙醇水溶液的重量比是1：6～14。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，浸泡3～4h。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，每次加热回流加热回流提取时间是3～3.5h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，在压力0.001～0.01MPa与室温的条件下进行减压浓缩。

7.根据权利要求1所述的一种木瓜提取物的制备方法，其特征在于在步骤B中，所述浓缩液与正丁醇的体积比是1:2.5～2.8。

8.根据权利要求1-7中任一项权利要求所述木瓜提取物制备方法所制备得到的木瓜提取物。

9.根据权利要求8所述的木瓜提取物在制备用于治疗肝纤维化的药物中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于其中所述的肝纤维化是高脂饮食诱导的肝纤维化。

Images