CN101190246A - 中药刺五加治疗帕金森病有效部位提取方法 - Google Patents

Abstract

刺五加治疗帕金森病有效部位提取方法。本发明涉及中药刺五加有效部位的提取方法。该方法是采用水煎煮法，水提醇沉法，大孔吸附树脂法对刺五加进行提取分离，得到不同组分，通过药效学实验确定了刺五加治疗帕金森病的有效部位及其提取方法。

Description

中药刺五加治疗帕金森病有效部位提取方法

技术领域

本发明属于中草药刺五加提取工艺技术领域，具体是指一种以中草药刺五加治疗帕金森病有效部位的提取方法。

背景技术

来自世界帕金森病协会的统计数字表明，全球帕金森病患者超过400万人，其中我国有170万。研究表明，近20年来，我国大城市患此病的人数猛增。据估计，我国每年有近10万人成为新发的帕金森病患者。患者病后出现肢体震颤、僵直、行动迟缓和姿势平衡障碍以及植物神经症状，病情呈进行性加重，严重限制病人的活动能力及影响病人的生活质量，给病人造成极大的痛苦，也给社会和家庭带来严重的负担，所以迫切需求寻找预防和治疗帕金森病的有效中药，以延缓帕金森症的进程和防止病情的加重。刺五加为五加科植物刺五加(Acanthopanax senticosus(Rupr.et MaXim.)Harms.)的干燥根和根茎。主产于黑龙江省山区。味辛、微苦、性温、无毒，具有益肾健脾，补肾安神作用。目前刺五加复方和刺五加注射液已用于帕金森病的临床治疗，并取得了一定疗效，但是迄今为止，尚未见有刺五加治疗帕金森病有效部位的提取方法，也未见将该有效部位用于帕金森病的治疗，所以筛选刺五加有效部位治疗帕金森病具有广阔的市场开发前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种中草药刺五加治疗帕金森病的有效部位提取工艺方法。

本发明的目的是通过以下措施来实现的：本发明采用水煎煮法、水提醇沉法、大孔吸附树脂法对刺五加进行提取纯化，得到八个组分，通过药效学实验方法得到刺五加治疗帕金森病的有效部位，确定有效部位的提取方法。

本发明所要解决的技术问题是提供一种刺五加有效部位提取物的提取方法工艺及其药效学实验。

本发明通过以下技术方案实现的：

一、刺五加有效部位提取工艺

取刺五加药材，粉碎，用水提取，加水4-10倍量，煎煮1-4小时，水煎液浓缩。浓缩液置于塑料离心管，向其中缓慢加入50-95％乙醇，并不断搅拌，至一定醇浓度，0-20℃静置6-24h、于1500-5000转/分离心5-20min，分别收集上清液，上清液回收乙醇后上大孔吸附树脂柱，药液与树脂体积比(1∶1-1∶10)，依次用0-95％乙醇洗脱，分别收集乙醇洗脱液，回收乙醇，混合洗脱物，得到刺五加有效部位提取物。

二、药效学实验

本发明所述方法得到的八个组分分别做药效学实验。实验动物：C57小鼠，由黑龙江省肿瘤防治研究所提供。实验方法：MPTP造模，注射10-40mg/kg，连续5-20天。八个组分浓缩液连续灌胃10-30天，测定小鼠爬竿时间、中脑MAO-B活性、纹状体DA含量。统计学分析实验数据。结论：通过以上药效学实验可以得知，本发明所述方法得到的组分中有刺五加的有效部位，本发明的有效部位提取物对帕金森病有良好的药效。

本发明刺五加有效部位提取方法的有益效果体现在：

(1)提取工艺简单，不需高温高压和特殊设备，安全，易于操作且成本低。

(2)应用本发明，可以除去大量的蛋白质，糖类，淀粉等杂质。由于严格控制了提取和浓缩的浓度，其有效部位含量在60％以上。

(3)利用本发明得到的刺五加提取物质量稳定，富含活性成分，具有保护神经元的药理作用，因此可以用来制备疗效好，安全可靠的防治帕金森病的药物。

具体实施方式

一、提取工艺实施例

实施例1

将刺五加干燥根及根茎切片1000g，粉碎，浸泡30分钟，加水6倍量，煎煮1时，水煎液浓缩至1g/ml。浓缩液置于塑料离心管，向其中缓慢加入95％乙醇，并不断搅拌，至醇浓度达到70％，4℃静置12h，于3500转/分离心10min，收集上清液，上清液回收乙醇至尽，干燥、粉碎，与AB-8型大孔树脂混合，上AB-8型大孔吸附树脂柱，用蒸馏水洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，再用50％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，再用70％乙醇洗脱至无色，收集洗脱液，回收乙醇，将3种洗脱物混合，得到刺五加有效部位提取物。

实施例2

将刺五加干燥根及根茎切片1000g，粉碎，浸泡30分钟，加水8倍量，煎煮1小时，煎煮2次，水煎液浓缩至2g/ml。缩液置于塑料离心管，向其中缓慢加入75％乙醇，并不断搅拌，至醇浓度达到50％，20℃静置12h，于3000转/分离心20min，收集上清液，上清液回收乙醇至尽，干燥、粉碎，用水溶解至浓度为2g/ml，上D101型大孔吸附树脂柱，用6倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用8倍50％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，得到刺五加有效部位提取物。

实施例3

将刺五加干燥根及根茎切片1000g，粉碎，浸泡30分钟，加水10倍量，煎煮2时，煎煮2次，水煎液浓缩至3g/ml。浓缩液置于塑料离心管，向其中缓慢加入50％乙醇，并不断搅拌，至醇浓度达到30％，20℃静置24h，于1500转/分离心10min，收集上清液，上清液回收乙醇至尽，干燥、粉碎，与HZ-802型大孔树脂混合，上HZ-802型大孔吸附树脂柱，用10倍蒸馏水洗脱，洗脱液弃去，再用10倍20％乙醇洗脱，洗脱液弃去，再用10倍40％乙醇洗脱，洗脱液弃去，再用10倍60％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，再用10倍80％乙醇洗脱，收集洗脱液，回收乙醇，将两种洗脱物混合，得到刺五加有效部位提取物。

二、药效实施例

实施例1

实验药物：刺五加水煎液(I)和醇提液(II)

实验动物：C57小鼠，由黑龙江肿瘤防治研究所提供

实验方法：

①模型制备

模型组和给药组每日腹腔注射MPTP20mg·kg^-1体重，空白组以等量的生理盐水腹腔注射，共10天。观察模型小鼠行为改变、出现步长缩短、动作迟缓、震颤、竖毛、爬竿不能对外界刺激反应低下者作为衡量标准。

②行为学实验

将一直径为2cm的泡沫塑料小球固定于一根长50cm粗1cm的木杆顶端，木杆上缠2层纱布以防打滑。持小鼠尾部将其头向下置于竿顶(以小鼠双后肢至于球上为准)，让其自然爬下，小鼠自站于竿顶至双前肢接触竿底平台为爬完全长。记录爬竿时间。

③MAO-B检测及方法

冰上剥离中脑，称重，按1∶20(W/V)加入预冷的0.5mol/L蔗糖和0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.0)，置玻璃匀浆器内冰浴下匀浆，离心(4℃，1500r/min)10min，取上清液继续离心(4℃，1500r/min)10min，将沉淀用上述缓冲液重新悬浮，再离心(4℃，1500r/min)10min，所得沉淀用上述缓冲液稀释至蛋白质含量为10mg/mL(以小牛血清蛋白为标准蛋白)，采用考马斯亮蓝G250法测定酶液蛋白含量，于-20℃下储存备用。按照单胺氧化酶试剂盒操作方法进行，在520nm下测定其氧化产物的光密度值OD，以U/mg表示MAO的活性。

④纹状体多巴胺含量测定

断头取脑，剥离双侧纹状体，称重，液氮保存。样品处理：取各组小鼠纹状体，加入0.05mol/l的高氯酸0.1ml制备匀浆，离心10000r/min，20min，取上清再离心10000r/min，10min，取上清液20μl进样。色谱条件：色谱柱15cm×0.5cmID，填料Lichrosorbe RP(10μm)，流动相6％甲醇-0.15mol/l氯乙酸缓冲液，内含0.1mol·l^-1乙二胺四乙酸二钠，125mg/L辛烷磺酸钠，超声脱气，流速1.0ml/min。柱温：室温。

实验结果：

表1爬竿时间、MAO-B活性和纹状体多巴胺含量测定

注：与模型组比较^*P＜0.01，^**P＜0.05。

结果表明，组(I)和组(II)均能改善帕金森病小鼠的运动协调能力和MAO-B活性，说明对帕金森病小鼠有治疗作用。其中组(I)作用显著。

实施例2

实验药物：刺五加上清液(III)和沉淀(IV)

实验动物：C57小鼠，由黑龙江肿瘤防治研究所提供

实验方法：

①模型制备

模型组和给药组每日皮下注射MPTP30mg·kg^-1体重，空白组以等量的生理盐水腹腔注射，共5天。观察模型小鼠行为改变、出现步长缩短、动作迟缓、震颤、竖毛、爬竿不能对外界刺激反应低下者作为衡量标准。

②行为学实验

将一直径为2cm的泡沫塑料小球固定于一根长50cm粗1cm的木杆顶端，木杆上缠2层纱布以防打滑。持小鼠尾部将其头向下置于竿顶(以小鼠双后肢至于球上为准)，让其自然爬下，小鼠自站于竿顶至双前肢接触竿底平台为爬完全长。记录爬竿时间。

③MAO-B检测及方法

冰上剥离中脑，称重，按1∶10(W/V)加入预冷的0.32mol/L蔗糖和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)，置玻璃匀浆器内冰浴下匀浆，离心(4℃，600r/min)10min，取上清液继续离心(4℃，600r/min)10min，将沉淀用上述缓冲液重新悬浮，再离心(4℃，600r/min)10min，所得沉淀用上述缓冲液稀释至蛋白质含量为1mg/mL(以小牛血清蛋白为标准蛋白)，采用考马斯亮蓝G250法测定酶液蛋白含量，于-20℃下储存备用。按照单胺氧化酶试剂盒操作方法进行，在520nm下测定其氧化产物的光密度值OD，以U/mg表示MAO的活性。

④纹状体多巴胺含量测定

断头取脑，剥离双侧纹状体，称重，液氮保存。样品处理：取各组小鼠纹状体，加入0.4M高氯酸除蛋白，制备匀浆，12000/min 4℃离心15min，取上清液50μl进样。色谱条件：色谱柱Nova-Pak C₁₈柱(150mm×4.0mm)，RF-474荧光检测器，流动相0.1mol·l^-1 NaAc，0.1mol·l^-1乙二胺四乙酸二钠，10％甲醇，HAc调PH5.1，超声脱气，流速1.0ml/min。发射波长330nm，激发波长290nm。柱温：室温。

实验结果：

表2爬竿时间、MAO-B活性和纹状体多巴胺含量测定

注：与模型组比较^*P＜0.01，^**P＜0.05。

结果表明，组(III)有效。

实施例3

实验药物：刺五加不同梯度乙醇洗脱液(V)、(VI)、(VII)、(VIII)

实验动物：C57小鼠，由黑龙江肿瘤防治研究所提供

实验方法：

①模型制备

模型组和给药组每日腹腔注射MPTP40mg·kg^-1体重，空白组以等量的生理盐水腹腔注射，共10天。观察模型小鼠行为改变、出现步长缩短、动作迟缓、震颤、竖毛、爬竿不能对外界刺激反应低下者作为衡量标准。

②行为学实验

将一直径为2cm的泡沫塑料小球固定于一根长50cm粗1cm的木杆顶端，木杆上缠2层纱布以防打滑。持小鼠尾部将其头向下置于竿顶(以小鼠双后肢至于球上为准)，让其自然爬下，小鼠自站于竿顶至双前肢接触竿底平台为爬完全长。记录爬竿时间。

③MAO-B检测及方法

冰上剥离中脑，称重，按1∶5(W/V)加入预冷的0.30mol/L蔗糖和0.01mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)，置玻璃匀浆器内冰浴下匀浆，离心(20℃，3500r/min)15min，取上清液继续离心(20℃，3500r/min)15min，将沉淀用上述缓冲液重新悬浮，再离心(20℃，3500r/min)15min，所得沉淀用上述缓冲液稀释至蛋白质含量为1mg/mL(以小牛血清蛋白为标准蛋白)，采用考马斯亮蓝G250法测定酶液蛋白含量，于-20℃下储存备用。按照单胺氧化酶试剂盒操作方法进行，在242nm 下测定其氧化产物的光密度值OD，以U/mg表示MAO的活性。

④纹状体多巴胺含量测定

断头取脑，剥离双侧纹状体，称重，液氮保存。样品处理：取各组小鼠纹状体，加入0.4M高氯酸(每100ml含L-半光氨酸)0.4ml，制备匀浆，12000/min 4℃离心15min，取上清液50μl进样。色谱条件：Beckman C18色谱柱(15cm×0.46cm ID)，电化学检测器，工作电压0.7V，流动相100Mm磷酸氢二钠，0.5mM乙二胺四乙酸二钠，1mM辛烷磺酸钠，10％甲醇，HAc调PH3.85，超声脱气，流速1.0ml/min。柱温：37℃。

实验结果：

表3爬竿时间、MAO-B活性和纹状体多巴胺含量测定

注：与模型组比较^*P＜0.01，^**P＜0.05。其中在爬竿时间和MAO-B活性中组(VI)与组(VII)之间无显著性差异(P＞0.05)。

药效学实验结果表明，组(VI)和组(VII)均能显著改善帕金森病小鼠的运动协调能力、降低MAO-B活性、提高中脑纹状体DA含量，且在爬竿实验和MAO-B活性测定中，两组之间无显著性差异，因此确定组(VI)和组(VII)为刺五加治疗帕金森病的有效部位。

Claims (5)

1.刺五加有效部位的提取方法，该方法采用水煎煮法、水提醇沉、大孔吸附树脂法对刺五加进行提取分离，得到所述有效部位。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：

(1)将刺五加药材，粉碎后水煎，浓缩干燥，得棕黑色粉末(I)，备用；

(2)将刺五加药材，粉碎后乙醇回流提取，1-3次，回收乙醇，干燥，得棕黄色粉末(II)，备用；

(3)将(1)中药液置于塑料离心管中，向其中缓缓加入50％-95％乙醇，并不断搅拌，至醇浓度达到50-90％，静置，于1500-5000转/分离心5-20min，分别收集上清液和沉淀，上清液回收乙醇，浓缩干燥，得棕黄色粉末(III)，备用；

(4)将(3)中沉淀洗涤，加水溶解过滤，浓缩干燥，得棕黑色粉末(IV)，备用；

(5)将(2)中浓缩液上大孔吸附树脂柱，依次用0-95％乙醇洗脱，洗脱至无色，分别收集乙醇洗脱液，回收乙醇至尽，浓缩干燥，得粉末(V)、(VI)、(VII)、(VIII)，备用。

3.根据权利要求2所得组分分别做药效学实验，确定刺五加有效部位。

4.利用权利要求2至3所述方法得到的刺五加有效部位的提取方法。

5.根据权利要求1至4所述刺五加有效部位提取物的药用用途，该提取物用于治疗帕金森病。